Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation reports the standardization of a monoclonal antibody (MAb)-based immunoenzymatic test (ELISA) for detection of antibodies to bovine herpesvírus types 1 and/or 5 (BoHV-1 and BoHV-5). The initial steps involved the determination of the most suitable MAb, the appropriate dilutions of viral antigen and test sera; and the cut-off value of the assay. After standardization, the ELISA was validated by testing 506 cattle serum samples previously tested for neutralizing antibodies to BoHV-1 and BoHV-5 by virus neutralizing (VN) assay. Comparing to the VN for BoHV-1 antibodies, the ELISA presented sensitivity and specificity of 96.6% and 98.3%, respectively. Positive and negative predictive values were 97.6%, the concordance between the tests was 97.6% and the coefficient of correlation k (kappa) was 0.95, demonstrating an excellent correlation. Comparing to the VN for BoHV-5 antibodies, the ELISA presented 94.3% of sensitivity, 97.9% of specificity, 97.1% of positive predictive value, 95.9% negative predictive value, concordance of 96.4% and kappa coefficient of 0.92. These results demonstrate that the ELISA presents suitable specificity and sensitivity to be used for individual and herd serological diagnosis of BoHV-1 and BoHV-5, thus, representing an alternative for VN assays and imported ELISA kits. / Essa dissertação relata a padronização de um teste imunoenzimático do tipo ELISA, com base em anticorpo monoclonal (AcM), para a detecção de anticorpos séricos que reagem contra herpesvírus bovino tipos 1 e/ou 5 (BoHV-1, BoHV-5). Inicialmente, determinou-se o AcM mais adequado para a sensibilização das placas, as diluições apropriadas do antígeno e dos soros-teste e o ponto de corte do ensaio. Após a padronização, o ensaio foi validado testando-se 506 amostras de soro bovino, previamente testadas para anticorpos neutralizantes contra o BoHV-1 e/ou BoHV-5 pela técnica de soroneutralização (SN). Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-1, o teste de ELISA apresentou sensibilidade e especificidade de 96,6% e 98,3%, respectivamente. Os valores preditivos positivo e negativo foram de 97,6%, a concordância foi de 97,6% e o índice de correlação (kappa) entre os testes foi de 0,95, o que indica uma excelente concordância. Comparando-se com os resultados da SN frente ao BoHV-5, o ELISA apresentou 94,3% de sensibilidade; 97,9% de especificidade; 97,1% de valor preditivo positivo e 95,9% de valor preditivo negativo. Para o BoHV-5, a concordância entre os testes foi de 96,4% e o índice de correlação foi de 0,92, também excelente. Esses resultados demonstram que o teste padronizado apresenta sensibilidade e especificidade adequados para o diagnóstico sorológico das infecções pelo BoHV-1 e BoHV-5 em nível individual e de rebanho. Dessa forma, o ensaio pode se constituir em alternativa para o teste de SN e para os kits de ELISA importados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed at reproducting and characterizing the virological and clinico-pathological aspects of acute and latent genital infection by bovine herpesvirus type 1.2 (BoHV-1.2) in heifers. Four heifers were inoculated intravaginally with a Brazilian BoHV-1.2 isolate (SV-56/90) recovered from an outbreak of balanoposthitis. Virus inoculation (108.1TCID50/animal) resulted in efficient virus replication in the genital mucosa and the development of moderate to severe vulvovaginitis. The inoculated heifers shed virus in genital secretions in titers up to 107.3TCID50/mL until day 10 post infection (pi). Hyperemia, edema of vulvar and vestibular mucosa, vesicles, pustules and scabs were observed between days 1 and 10 pi. The vesicles and pustules increased in size and eventually coalesced and became covered with a mucopurulent and fibrinous exsudate. These signs increased in severity up to days 5 8 pi and progressively subsided thereafter. Dexamethasone administration at day 55 pi resulted in virus shedding in vaginal secretions of all heifers for up to 10 days. Virus reactivation was accompanied by genital signs resembling those observed during acute infection, yet less severe. Examination of the lumbar sacral ganglia and lymph nodes by PCR at day 36 postreactivation revealed the presence of latent viral DNA in the pudendal (4/4), genito-femoral, sciatic and rectal caudal (3/4) and obturator nerve ganglia (1/4); and in the sacral (3/4), deep inguinal, pre femoral, supramammary (2/4) and medial iliac lymph nodes (1/4). These results demonstrate that BoHV-1.2 DNA persists in sacral ganglia and regional lymph nodes during latency, and help in understanding the pathogenesis of acute and latent genital infection by BoHV-1.2. / O presente estudo teve como objetivos reproduzir e caracterizar os aspectos virológicos e clinico-patológicos da infecção genital aguda e latente pelo herpesvírus bovino tipo 1.2 (BoHV-1.2) em bezerras. Quatro bezerras foram inoculadas no trato genital com um isolado brasileiro de BoHV-1.2 (SV-56/90) oriundo de um surto de balanopostite. A inoculação do vírus (108,1TCID50/animal) resultou em replicação viral eficiente na mucosa genital e no desenvolvimento de vulvovaginite moderada a severa. As bezerras inoculadas excretaram vírus nas secreções genitais em títulos de até 107,3TCID50/mL por até 10 dias pós-inoculação (pi). Hiperemia, edema das mucosas vulvar e vestibular, vesículas, pústulas e crostas foram observados entre os dias 1° e 10° dia pi. As vesículas e pústulas aumentaram de diâmetro, eventualmente coalesceram e tornaram-se recobertas com um exsudato mucopurulento e fibrinoso. Os sinais aumentaram em severidade do 5° ao 8° dia pi e regrediram a partir de então. Administração de dexametasona dia 55 pi resultou em excreção viral nas secreções vaginais por até 10 dias. A reativação viral foi acompanhada de sinais genitais semelhantes aos observados durante a infecção aguda, porém com menor severidade. A análise dos gânglios lombo-sacral e linfonodos regionais por PCR no dia 36 pós-reativação demonstrou a presença de DNA viral latente nos gânglios pudendo (4/4), genito-femural, ciático, retalcaudal (3/4) e obturador (1/4); e nos linfonodos sacral (3/4), inguinal profundo, pré-femural, supramamário (2/4) e ilíaco medial (1/4). Esses resultados demonstram que o DNA do BoHV-1.2 persiste nos gânglios sacrais e em linfonodos regionais durante a latência, e contribuem para o conhecimento da patogenia da infecção genital aguda e latente pelo BoHV-1.2.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 258964 bytes, checksum: 135e6be4766beec15d819dd30575f517 (MD5) Previous issue date: 2006-07-28 / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is the etiological agent of the bovine meningoencephalitis that presents high morbidity in young bovine. Due to the similarity in the morphology of the virion, cytopathic effect in cell culture and antigenic properties, the BoHV-5 was classified erroneously as BoHV-1 in the past. BoHV-1 is responsible for respiratory and genital diseases, however the disease caused by BoHV-5 presents neurological clinical signs. This virus has been considered a variant of the same agent (BoHV-1) with neuropathogenic characteristics. Comparative studies among isolates of BoHV-5 revealed 97% of proteic similarity. However, the amino-terminal region of the most abundant glycoprotein of the viral envelope, the gC, differs substantially. This glycoprotein is involved in the initial interactions of the virus with the cellular surface besides of presenting as target for antibodies with neutralizing activities. This study aimed at to select an isolate of BoHV-5, among 5 isolates collected in outbreaks in different properties in Brazil, presenting higher antigenicity in vaccinated animals. Vaccines were formulated using isolates ISO9898292, SV507, SV163, 1807 and EVI145 and administered to 5 groups of 10 sheeps, which have received two intramuscular doses on days 0 and 21. Collections of blood were accomplished for analysis of production of antibodies by virus-neutralization and attendance of possible clinical signs to the 63rd day after the first vaccination. Antibodies titers averages ranged from 6,85 and 14,92 on the day 0 before the first vaccination. Antibody peak were on day 14, ranged from 4,50 (isolated ISO9898292) to 138,63 (isolated SV163). A second peak was observed 14 days after the booster ranged from 7,77 (ISO9898292) to 1017,54 (1807). In the 42nd day after the booster, it was observed titers variation from 3,84 (ISO9898292) to 305,97 (1807). The discrepancy among titers of antibody of each group of animals suggests a smaller antigenicity of isolated ISO9898292 in relation to the others, demonstrating a possible variation among the isolates, what results in antigenic differences. All isolates, with exception to ISO9898292, were effective in the induction of antibodies. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é o agente etiológico da menigoencefalite bovina que apresenta alta morbidade em bovinos jovens. Devido à similaridade na morfologia do virion, efeito citopático na cultura de células e propriedades antigênicas, o BoHV-5 foi classificado erroneamente como herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Este vírus é responsável por doenças respiratórias e genitais, porém a doença causada pelo BoHV-5 apresenta sinais clínicos neurológicos, com isso o vírus foi considerado uma variante do mesmo agente com características de neuropatogenicidade. Estudos comparativos entre isolados de BoHV-5 revelaram 97% de similaridade protéica. No entanto, a região amino terminal da glicoproteína mais abundante do envelope viral, a gC, difere substancialmente. Esta glicoproteína está envolvida nas interações iniciais do vírus com a superfície celular, além de se apresentar como alvo para anticorpos com atividades neutralizantes. Este estudo objetivou selecionar um isolado do vírus BoHV-5, entre 5 isolados coletados em surtos da doença em diferentes propriedades, que confira maior antigenicidade em animais vacinados. As vacinas foram formuladas com os isolados ISO9898292, SV507, SV163, 1807 e EVI145 e administradas a 5 grupos de 10 ovelhas, as quais receberam duas doses vacinais por via intramuscular nos dias 0 e 21. Foram realizadas coletas de sangue para análise de produção de anticorpos por virusneutralização e acompanhamento de possíveis sinais clínicos até o 63º dia após a primo-vacinação. Foram observados dois picos na curva de anticorpos, o primeiro no dia 14, após a vacinação, onde os títulos de anticorpos variaram entre 4,50 (isolado ISO9898292) a 138,62 (isolado SV163). O segundo pico foi observado 14 dias após a revacinação onde os títulos variaram entre 7,77 (ISO9898292) a 1017,54 (1807). No 42º dia após a revacinação observou-se variação de título entre 3,84 (ISO9898292) a 305,97 (1807). A discrepância entre as médias de título de anticorpo de cada grupo de animais sugere uma menor antigenicidade do isolado ISO9898292 em relação aos demais, demonstrando uma possível variação entre os isolados, o que resulta em diferenças antigênicas. Todos os isolados, com exceção ao ISO9898292, mostraram-se eficazes na indução de anticorpos.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2016-09-21T16:14:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_daiana_medeiros.pdf: 661783 bytes, checksum: b730e6b69207fcfbd6fb978846974286 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-21T16:46:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_daiana_medeiros.pdf: 661783 bytes, checksum: b730e6b69207fcfbd6fb978846974286 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T16:46:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_daiana_medeiros.pdf: 661783 bytes, checksum: b730e6b69207fcfbd6fb978846974286 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Infecções pelo herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) têm sido amplamente detectadas em rebanhos bovinos brasileiros, e são responsáveis por grandes prejuízos econômicos na bovinocultura. Entre as doenças causadas por esse vírus estão a Rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), Vulvovaginite Pustular Infeciosa (IPV) e Balanopostite Pustular Infecciosa (IBP). O impacto econômico dessa enfermidade é devido principalmente a falhas reprodutivas, como retorno ao estro e abortamentos. A espécie bovina é hospedeira natural do BoHV-1, no entanto, estudos sorológicos realizados em diversos países têm sugerido que búfalos (Bubalus bubalis) podem ser suscetíveis ao herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), e outros alfaherpesvirus geneticamente relacionados. Apesar de os bovinos se infectarem naturalmente pelo BoHV-1, a distribuição dessa enfermidade na espécie bubalina não tem sido estudada no Brasil, e as informações são limitadas e suportadas apenas por inquéritos sorológicos. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi detectar a presença de DNA viral de BoHV-1 em 202 gânglios trigêmeos de bubalinos coletados em um abatedouro localizado no município de Pelotas através de uma Semi-Nested PCR (SN-PCR) para detecção parcial do gene da glicoproteína D (gD) do envelope do BoHV-1. Além disso, 242 amostras de soro foram testadas pela técnica de soroneutralização (SN) para a detecção de anticorpos neutralizantes frente a diferentes amostras de herpesvírus de ruminantes: BoHV-1 (cepa Los Angeles), BoHV-5 (cepa Riopel - RP), e BuHV (cepa B6). O DNA de BoHV-1 foi detectado em 30,1% dos animais, e os resultados da SN mostraram que 27,6% dos animais apresentaram anticorpos neutralizantes contra, pelo menos, um dos vírus testados. Os resultados demonstram que o BoHV-1 circula em rebanhos bubalinos na região sul do Brasil, e apesar das reatividade cruzada, anticorpos anti-BoHV-5 e anti-BuHV-B6 também foram identificados na população estudada. Este é o primeiro estudo que utiliza testes moleculares para a detecção de infecções latentes por BoHV-1 na espécie bubalina no Brasil. / Infections caused by the bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) have been widely detected in Brazilian cattle, and they are responsible for major economic losses to the cattle industry. Among the diseases caused by this virus there are infectious rhinotracheitis (IBR), Infectious Pustular vulvovaginitis (IPV) and balanoposthitis Infectious Pustular (IBP). The economic impact of this disease is mainly due to reproductive failures, such as return to estrus and abortions. The bovine is a natural host of BoHV-1, however, serologic studies in several countries have suggested that buffaloes (Bubalus bubalis) may be susceptible to bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), and other genetically related alphaherpesvirus. Despite the cattle become infected naturally by BoHV-1, the distribution of this disease in the buffalo species has not been studied in Brazil, and the information is limited and only supported by serological surveys. Thus, the aim of this study was to detect the presence of viral DNA of BHV - 1 in trigeminal ganglia of 202 buffaloes collected in a slaughterhouse located in the city of Pelotas through a semi -nested PCR (SN - PCR) for detection of partial gene glycoprotein D of BoHV-1. In addition, 242 serum samples were obtained and tested by the serum neutralization (SN ) technique for the detection of neutralizing antibodies against different samples of herpesvirus: BHV -1 ( Los Angeles strain ) , BHV -5 (strain Riopel - RP ) and BuHV (strain B6 ). The BHV -1 DNA was detected in 30.1 % of the animals and the results of SN showed that 27.68 % of the animals had neutralizing antibodies against at least one of the tested viruses. This is the first study that uses molecular tests for the detection of latent BoHV - 1 in buffalo species in Brazil.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) is a major etiologic agent of meningo-encephalitis in cattle and establishes lifelong latent infection in trigeminal ganglia and also in other areas of the brain. Colonization of deep areas of the brain with latent viral DNA may have important implications on the pathogenesis of BHV-5 neurological infection upon reactivation. In this study, we investigated the distribution of BHV-5 DNA in the brain of experimentally infected rabbits a laboratory model for BHV-5 infection - prior and subsequently to virus reactivation, using a nested PCR for the glycoprotein B gene. Eighteen rabbits inoculated intranasally with a Brazilian BHV-5 isolate were divided in two groups: group A rabbits (n=8) were euthanized 60 days post-inoculation (pi) for tissue collection; group B (n=7) were submitted to dexamethasone administration at day 60pi for reactivation of latent infection and euthanized for tissue collection 60 days later. To compare, we used two groups of BHV-1-infected rabbits (C, n=3 and D, n=3), each group being submitted to one of the above treatments, respectively. In group A rabbits, viral DNA was consistently detected in trigeminal ganglia (8/8), frequently in cerebellum (6/8), anterior cortex, pons medulla (3/8) and only occasionally in thalamus (2/8), ventro-lateral, dorsal and posterior cortices, midbrain (1/8). In rabbits previously submitted to virus reactivation, viral DNA showed a broader distribution, being detected more frequently besides the TG (7/7) - in ventro-lateral (6/7) and posterior cortices (5/7), pons-medulla and thalamus (4/7) and midbrain (3/7). In contrast, rabbits inoculated with BHV-1 harbored latent viral DNA in a few tissues in addition to TG and did not show significant changes in distribution of viral DNA post-reactivation. These results demonstrate that latency by BHV-5 DNA and not BHV-1 DNA may be established in several areas of the brain of experimentally infected rabbits. Further, dexamethasone-induced virus reactivation is followed by a wider distribution of latent viral DNA, probably due to virus dissemination from the original sites. Thus, it is reasonable to speculate that reactivation of latent infection from deep areas of the brain may contribute to the recrudescence of neurological disease frequently observed upon reactivation of latent BHV-5 infection. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) é um importante agente etiológico de meningoencefalite em bovinos e estabelece infecção latente em seus hospedeiros, principalmente nos gânglios dos nervos sensoriais. No entanto, a colonização de áreas profundas do cérebro com DNA viral pode ter implicações importantes na patogenia da infecção pelo BHV-5 após a reativação da infecção latente. Neste estudo, foi investigada a distribuição do DNA do BHV-5 no cérebro de coelhos infectados experimentalmente, antes e após a reativação da infecção latente, utilizando um nested-PCR para uma seqüência do gene da glicoproteína B. Dezoito coelhos infectados pela via intranasal com um isolado brasileiro de BHV-5 foram divididos em dois grupos: coelhos do grupo A (n=8) foram submetidos a eutanásia 60 dias pós inoculação (pi) para a coleta de tecidos; animais do grupo B (n=7) foram submetidos a administração de dexametasona no dia 60 pi. Para comparação foram utilizados dois grupos de coelhos inoculados com o BHV-1 (C, n=3 e D, n=3), cada grupo sendo submetido a um dos tratamentos acima, respectivamente. Nos animais do grupo A, o DNA viral foi consistentemente detectado no gânglio trigêmeo (8/8), freqüentemente no cerebelo (6/8), com menor freqüência na ponte e córtex anterior (3/8) e ocasionalmente no tálamo (2/8) e córtices ventro-lateral, dorso-lateral e posterior, pedúnculo cerebral e tálamo (1/8). Nos animais previamente submetidos à reativação, a distribuição do DNA viral foi mais ampla, sendo detectado mais consistentemente, além do TG (7/7), nos córtices ventro-lateral (6/7), e posterior (5/7), ponte e tálamo (4/7) e menos freqüentemente no pedúnculo cerebral (3/7). Em contrapartida, os animais inoculados com o BHV-1 apresentaram o DNA viral latente em poucos tecidos além do TG, e não apresentaram alterações importantes na distribuição do DNA viral após a reativação. Esses resultados demonstraram que o DNA latente do BHV-5 - e não o do BHV-1 - pode estar presente em várias áreas do cérebro de coelhos infectados experimentalmente. A reativação induzida por dexametasona resulta na reativação viral e provavelmente na colonização de áreas adicionais no cérebro. Com base nesses resultados pode-se especular que a reativação do DNA viral latente nestas regiões pode contribuir para a recrudescência de doença neurológica observada após a reativação da infecção latente pelo BHV-5.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The bovine mammillits caused by bovine herpesvirus type 2 (BoHV-2) is an important disease of dairy cattle yet very little is known about its pathogenesis. This study aimed at reproducting and characterizing the clinical-pathological aspects of bovine herpesvirus mammillits in experimentally infected sheep. In the first experiment, ten lambs were inoculated in the nasal mucosa and the virological, clinical and serological aspects of acute infection were monitorated. Virus sheeding was detected in nasal secretions of 7 lambs between days 2 and 8 post inoculation (pi) and lasted from one to three days. A serous nasal discharge, changing to mucous and mucopurulent, was observed in all animals between days 2 and 5 pi. Seven lambs developed vesicles, pustules and erosions in the nasal mucosa between days 4 and 8 pi. All inoculated animals seroconverted to BoHV-2. Dexamethasone administration at day 40 pi was not followed by virus shedding, clinical recrudescence or seroconversion. In the second experiment, eight milking ewes were inoculated in the skin of the teats and udder, and monitorated thereafter regarding to viral replication, clinical signs and histological changes. Infectious virus was isolated from lesion swabs of one ewe on days 7 and 8 pi. Five animals developed lesions in inoculation sites between days 4 and 6 pi. The clinical-pathological aspects of the lesions were similar to those of natural infections and were characterizated by erythema, edema, papules, vesicles, exsudation and scabs. By histological examination, the lesions displayed cellular edema and linfoplasmocitic multifocal infiltrate surrounding blood vessels in the dermis. Moreover, eosinophilic intranuclear inclusion bodies were observed in inflamatory cells and syncitia. Virus particles resembling herpesvirus were observed by eletronic transmission microscopy. These results indicate that sheep are susceptible to BoHV-2 infection, and can develop clinical signs similar to those observed in cattle in natural outbreaks of herpes mammillitis. Thus, this animal species may be used as a model to study pathogenesis, vaccine development and antiviral drugs. / A mamilite causada pelo herpesvírus bovino tipo 2 (BoHV-2) é uma importante enfermidade de gado leiteiro, porém pouco se sabe sobre a sua patogenia. O presente trabalho teve como objetivos reproduzir e caracterizar em ovinos as manifestações clínico-patológicas associadas com a infecção natural de bovinos pelo BoHV-2. Em um primeiro experimento, dez cordeiros foram inoculados na mucosa nasal e a infecção aguda foi monitorada nos aspectos clínicos, virológicos e sorológicos. Excreção viral em secreções nasais foi detectada em 7/10 animais entre os dias 2 e 8 pós-inoculação (pi), com duração que variou entre um e três dias. Todos animais apresentaram secreção nasal serosa, passando a mucosa e mucopurulenta, entre os dias 2 e 5 pi, e sete deles apresentaram também hiperemia e o desenvolvimento de vesículas, pústulas e erosões na mucosa nasal entre os dias 4 e 8 pi. Todos os animais soroconverteram ao BoHV-2. A administração de dexametasona aos 40 dias pi não foi seguida de excreção viral, soroconversão ou recrudescência clínica. Em um segundo experimento, oito ovelhas lactantes foram inoculadas na pele das tetas e do úbere, seguida da caracterização virológica, clínica e histopatológica da infecção aguda. O vírus foi isolado a partir de suabes coletados das lesões de uma ovelha nos dias 7 e 8 pi. Cinco (5/8) animais desenvolveram lesões nos locais de inoculação entre os dias 4 e 6 pi. As lesões apresentaram características clínicopatológicas semelhantes às observadas em infecções naturais, e se caracterizaram por hiperemia, edema, pápula, vesículas, exsudação e formação de crostas. Histologicamente, as lesões se caracterizaram por edema intracelular, presença de um infiltrado linfoplasmocitário multifocal e predominantemente perivascular na derme, além de corpúsculos de inclusão eosinofílicos intranucleares em células inflamatórias e células sinciciais. Partículas víricas com morfologia típica de herpesvírus foram observadas sob microscopia eletrônica de transmissão. Esses resultados indicam que ovinos são susceptíveis à infecção pelo BoHV-2 e desenvolvem lesões características de mamilite herpética quando inoculados experimentalmente, podendo ser utilizados para estudos de patogenia, desenvolvimento de vacinas e pesquisas de drogas antivirais.

As biotécnicas da reprodução animal, amplamente difundidas no Brasil, tem possibilitado maior controle em relação à transmissão de agentes patogênicos, porém, a transmissão de doenças continua a ser uma preocupação justificável para a busca de melhores meios de controle. O objetivo do trabalho foi o de avaliar a diminuição da replicação viral (BoHV-1 Colorado) em embriões murinos após tratamentos com Produtos Naturais (PN). Trabalhamos com 3 grupos de PN, totalizando 18 tratamentos: Oléos Essenciais (OE) de Chamomilla recutita, Allium sativum, Zingiber officinale, Syzygium aromaticum, Illicium verum Hook f., Punica granatum e Melissa officinalis; Extratos Etanólicos (EE) das mesmas plantas anteriores com acréscimo de Pterodon emarginatus (casca e semente) e Extrato Aquoso (EA) de Própolis e Agaricus blazei. Inicialmente encontramos concentrações não tóxicas em células MDBK (Madin Darby Bovine Kidney) relacionada a cada PN (ampla sintonia) para posteriormente verificarmos as concentrações não tóxicas para os zigotos/embriões murinos (sintonia fina). Após encontrarmos as concentrações não tóxicas, os zigotos foram divididos em quatro grupos: G1 (Controle), G2 (expostos aos vírus BoHV-1 Colorado à 108 TCID50/mL), G3 (expostos aos PN) e G4 (expostos aos vírus e PN). Os grupos foram mantidos a 37,5 ºC em meio TCM199 (100 μL) com 10% de soro fetal bovino em estufa a 5% de CO2 e 95% de umidade. Após 24h, analisamos a taxa de clivagem (Teste Exato de Fisher_p<0,05), a morfologia (por microscopia óptica), a n-PCR e a titulação dos embriões em co-cultura com células MDBK após mais 72h do tratamento com os PN (Teste de Mann Whitney_ p<0,05). Dentre as 18 análises, os embriões murinos tratados com EA de Própolis, EE de Punica granatum e de Pteron emarginatus (Casca) apresentaram resultados satisfatórios: sem alterações morfológicas, taxa de clivagem semelhante aos controles e apesar da constatação da partícula viral junto aos embriões pela n-PCR, houve diminuição da concentração viral após tratamentos com estes extratos, o que sugere interferência destes tratamentos no ciclo viral do BoHV-1 Colorado. / The biotech Animal reproduction widespread in Brazil, has allowed greater control over the transmission of pathogens, however, the disease transmission remains a justifiable concern for the pursuit of the best means of control. The aim of this study was to evaluate the reduction of viral replicarion (Colorado BoHV-1) in murine embryos after treatments with natural products (NP). We work with groups \'3 \'PN, totaling 18 treatments: essential oils (EO) of Chamomilla recutita, Allium sativum, Zingiber officinale, Syzygium aromaticum, Illicium verum Hook f., Melissa officinalis and Punica granatum; ethanol extracts (EE) of the same plants prior to adding Pterodon emarginatus (skin and seed) and Aqueous Extract (EA) Propolis and Agaricus blazei. Initially we find non-toxic concentrations in MDBK (Madin Darby Bovine Kidney) related to each PN (broad line) then we check for the non-toxic concentrations for zygotes / embryos murine (fine tuning). After finding the non-toxic concentrations, zygotes were divided into four groups: G1 (control), G2 (exposed to viruses BoHV-1 at 108 Colorado TCID50/mL), G3 (exposed to PN) and G4 (exposed to viruses and PN .) The groups were maintained at 37.5 °C in TCM199 (100 mL) with 10% fetal bovine serum in an incubator at 5% CO2 and 95% humidity. After 24h, we analyzed the cleavage rate (Exact Test Fisher_p <0.05), morphology (light microscopy), the n-PCR and titration of embryos in co-culture with MDBK cells after 72 h of treatment with more NPs (Mann Whitney_ p <0.05). Among the 18 analyzes, murine embryos treated with EA Propolis, EE Punica granatum and Pteron emarginatus (bark) showed satisfactory results: no morphological changes, cleavage rate similar to controls, and despite the finding of the viral particle with the embryos by n-PCR, decreased the viral concentration after treatment with these extracts, suggesting interference of these treatments in the viral cycle of BoHV-1 Colorado.

O objetivo geral desta pesquisa foi avaliar a transferência de imunidade passiva e a sua influência na resposta vacinal para as viroses envolvidas na Doença Respiratória Bovina (DRB). Os dados obtidos nesta pesquisa estão apresentados em dois capítulos. Capítulo 1 - Objetivou-se avaliar a dinâmica de anticorpos (Acs) específicos para as viroses respiratórias e subpopulações de linfócitos em bezerros do nascimento aos 240 dias (d) de vida. Para tanto, acompanhou-se a transferência de imunidade passiva de Acs específicos para as viroses respiratórias em 19 bezerros, destes cinco foram selecionados para acompanhamento da dinâmica de Acs neutralizantes e subpopulações de linfócitos dos 14 aos 240d. O colostro fornecido era proveniente de vacas doadoras vacinadas. A análise da qualidade individual do colostro revelou índice Brix ≥21%, observando-se forte correlação desses valores com proteína total (r= 0,942 e P= 0,001). Após 48 horas da ingestão do colostro, pôde-se observar soroconversão dos 19 animais (100%) para os agentes virais envolvidos na DBR. As medianas (Log2) encontradas foram de 12,3, 9,0, 5,0 e 8,5 para BVDV, BoHV-1, BRSV e BPIV-3. Dos 14 aos 240d os 5 bezerros avaliados, demonstraram declínio gradual dos títulos de Acs (Log2) para BVDV (12,8-3,3), BoHV-1 (10,0-3,3) e BPIV-3 (10,0-2,0), embora o BVDV não tenha apresentado soronegatividade até os 240d. Manifestações clínicas de broncopneumonia foram observadas em 4/5 (80%) bezerros dos 80 aos 135 d. BRSV (11,3-2,0) apresentou perfil diferenciado na dinâmica de anticorpos em relação às demais viroses. Não foram detectadas diferenças estatísticas entre os momentos para as viroses apesar das variações detectadas (P>0,05). A meia-vida e tempo para soronegatividade foram de 36,2±6,1 e 367,01±68,7d para BVDV, 50,7±18,0 e 239,67±66,88d para BoHV-1 e, 46,8±21,1 e 303,36±60,15d para BPIV- 3. BRSV não respeitou modelo de regressão para cálculos de meia-vida e soronegatividade. Valores absolutos e relativos das populações de linfócitos não revelaram diferenças estatísticas entre os momentos (P>0,05). Contudo, a dinâmica das subpopulações de linfócitos revelou aumento de células B CD21+ até 150d; aumento nos valores relativos das subpopulações CD4+, CD8+ e CD3+CD4-CD8- principalmente aos 74-90d. Assim, pôde-se determinar uma janela de susceptibilidade a partir dos 74d especialmente ao BRSV e BoHV-1, momento que precede o aumento dos títulos de Acs após exposição natural. Capítulo 2 Objetivou-se avaliar a influência dos Acs maternos na resposta imune para DRB induzida pela vacinação. Foram selecionados 23 bezerros recém-nascidos, distribuídos aleatoriamente entre 4 grupos experimentais: G1 vacinado aos 14d e booster aos 44d; G2 aos 90d e aos 120d; G3 aos 180d e aos 210d. Além disso manteve-se um grupo controle não vacinado CG1, CG2 e CG3. Os bezerros foram vacinados com a mesma vacina comercial empregada para vacinação das doadoras de colostro. Observou-se: (1) a vacina com BVDV inativado não promoveu aumento dos títulos de Acs para nenhum dos grupos avaliados; (2) G1 não demonstrou soroconversão para nenhuma das viroses, enquanto controle CG1 exibiu decréscimo dos títulos para BVDV, BoHV-1 e BPIV-3; (3) o BRSV apresentou baixa soroconversão no G2, enquanto o controle demonstrou altos títulos dos 44-120d; (4) não foi possível distinguir entre quais tempos ocorreram diferenças entre títulos (P>0,0167); (5) linfócitos B (CD21+) aumentaram do T0-T2 para G1, diminuíram para G2, e aumentaram no G3; (6) linfócitos T CD3+ diminuíram ao longo do tempo para todos os grupos, exceto CG3; (7) apesar de oscilações, linfócitos T CD4+, CD8+ e WC1+ se mantiveram praticamente constantes até 240d, exibindo maiores proporções nos grupos vacinados; (8) a expressão do marcador CD25+foi mantida pelo grupo G1 até o T2, mas apresentou aumento no G2 e G3; (9) manifestações de broncopneumonias foram identificadas nos bezerros do grupo controle (4/5 - 80%) e podem ter exercido influência nas diferenças encontradas para as células entre os grupos. Em geral, a vacinação dos bezerros aos 90 (G2) e 180d (G3) manteve ou estimulou a produção de Acs para o BoHV-1, BRSV e BPIV-3, e a ativação das células T expressas pelo marcador CD25+ pode ter sido responsável pela proteção dos bezerros frente à DRB. Assim, com base nos resultados, concluiu-se que a intensidade da imunidade dos bezerros induzida pela vacinação aumentou de acordo com o desenvolvimento etário e diminuição dos títulos de Acs maternos. A conclusão geral desta dissertação aponta para a necessidade precoce de imunização dos bezerros, especialmente pela susceptibilidade observada para BRSV e BPIV-3 aos 74-90d de vida. Entretanto, esta pesquisa não encontrou resposta humoral induzida pela vacinação no grupo de bezerros vacinados aos 14 e 44 dias, apesar dos indícios de resposta imune celular. Assim, estudos futuros devem ser elaborados considerando estratégias para amplificar a resposta imune precoce dos bezerros para os agentes virais envolvidos na DRB / The main purpose of this research was to evaluate the transfer of passive immunity and its influence on vaccine response to the viruses involved in bovine respiratory disease (BRD). The data obtained in this study are presented in two chapters. Chapter 1 - The objective was to evaluate the dynamics of specific antibodies to the respiratory viruses and lymphocyte subpopulations in the calves from birth to 240 days (d) of life. Thus, the transfer of passive immunity of specific antibodies to the respiratory viruses were assessed in 19 calves; from these, five were selected for monitoring the dynamic of neutralizing Abs and lymphocytes subpopulations from 14 to 240d. The colostrum was provided from donor vaccinated cows. The analysis of individual quality of the colostrum revealed Brix ≥21%, observing strong correlation of these values with total protein (r = 0.942 and P = 0.001). After 48 hours of colostrum intake, was observed seroconversion of the 19 animals (100%) for the viral agents involved in the DBR. The median (Log2) ratio found was 12.3, 9.0, 5.0 and 8.5 for BVDV, BoHV-1, BRSV and BPIV-3. The 5 calves followed from 14 to 240d showed gradual decline in antibody titers (Log2) to BVDV (12.8 to 3.3), BoHV-1 (10.0 to 3.3) and BPIV-3 (10, 0-2.0), although could not be detected seronegative calves for BVDV up to eight months of age. Clinical manifestations of bronchopneumonia were observed in 4/5 (80%) calves from 80 to 135 days of life. BRSV (11.3 to 2.0) showed a distinct profile in the dynamics of antibodies compared to other viruses. There were no statistical differences between times for viruses despite variations detected (P> 0.05). The half-life and time to become seronegative were 36.2±6.1 and 367.01±68.7d for BVDV, 50.7±18.0 and 239.67± 66.88d for BoHV-1 and, 46.8±21.1 and 303.36±60.15d for BPIV-3. BRSV did not respect regression model to perform half-life and seronegative calculations. Absolute and relative values of lymphocyte populations revealed no statistical differences between times (P> 0.05). However, the dynamics of lymphocyte subpopulations showed increase in B cells CD21+ up to 150d; increase in the relative values of CD4+, CD8+ and CD3+CD4-CD8- subpopulations, mainly to 74-90d. Thus, it was possible to determine a window of susceptibility since 74d especially for BRSV and BoHV-1, moment that precede the increase in antibody titers after natural exposure. Chapter 2 - The objective was to evaluate the influence of maternal antibodies in the immune response to respiratory viruses induced by vaccination. Was selected 23 newborn calves that were randomly distributed in four groups: G1 - vaccinated at 14d and booster at 44d; G2 - vaccinated at 90d and booster at 120d; G3 - vaccinated at 180d and booster at 210d. Furthermore were kept a non-vaccinated control group - CG1, CG2 and CG3. Calves were vaccinated with the same commercial vaccine in the colostrum donors. From these, could be observed: (1) the vaccine with inactivated BVDV did not promote increase of antibodies titers in any of the assessed groups; (2) G1 did not demonstrated seroconversion for any of the viruses while CG1 control exhibited decrease in the titers for BVDV, BoHV-1 and BPIV-3; (3) BRSV had low seroconversion in G2, while the control showed high titers from 44 to 120d; (4) where the differences between times occurred could not be distinguished (P <0.0167); (5) B cells (CD21+) increased from T0 to T2 for G1, decreased for G2, and increased for G3; (6) T lymphocytes CD3+ decreased over time for all groups except for CG3; (7) despite variations, T lymphocytes CD4+, CD8+ and WC1+ remained almost constant until 240d, displaying greater proportions in the vaccinated groups; (8) the expression of the CD25+ marker was maintained in the vaccinated group G1 up to T2, whereas vaccination promoted an increase of this expression in G2 and G3; (9) clinical manifestations of bronchopneumonia were identified in the control group (4/5 calves - 80%) and may have influenceon the differences found for the cells between the groups. In general, vaccination of calves at 90 (G2) and 180d (G3) maintained or stimulated the production of Abs to BoHV-1, BRSV and BPIV-3, and the activation of T cells expressed by the CD25+ marker may have been responsible for the protection of calves from BRD. Thus, based on the results, it was concluded that the intensity of the immunity induced by vaccination of calves increased according to the age of development and decay of maternal antibody titers. The general conclusion of this research, points to the need for early immunization of calves, especially by the susceptibility observed for BRSV and BPIV-3 from 74-90d of life. However, this research didnot found humoral response induced by vaccination in the group of calves vaccinated at 14 and 44 days, despite the evidence of cellular immune response. Thus, future studies should be designed considering strategies to amplify the early immune response of calves to the viral agents involved in the BRD

Rabbits have been used as animal models to study the pathogenesis of neurological infection by bovine herpesvirus type 5 (BHV-5), an important agent of meningoencephalitis in cattle. The olfactory system has been implicated as the main pathway for the virus to reach the brain after replication in the nasal mucosa. To investigate the role of the olfactory route in the pathogenesis of neurological infection, a technique of transfrontal craniotomy for ablation of the main olfactory bulbs (MOBs), using the eyes as the anatomic reference was developed and evaluated. Using this technique, twenty three 30 days-old rabbits were submitted to surgical ablation of the MOBs and subsequently inoculated with BHV-5. After skin, subcutaneous tissue and periosteum incisions, the craniotomy was performed in a point equidistant to the medial corner of the eyes, with a 3 mm drill coupled to a low intensity elyptic drilling machine. The removal of the MOB s tissue was performed by using a number 6 uretral probe coupled to a surgical vaccum pump. The anatomic references used were appropriate in allowing an adequate and easy access to the MOBs. Necropsy performed in three animals after the surgery demonstrated that the surgical procedure was efficient in completely removing the MOB tissue. This was also demonstrated by the interruption of the access of the virus to the brain after intranasal inoculation: only one animal (1/11) in the bulbectomized group developed neurological infection and disease, against 100% (10/10) of the control group. The transfrontal craniotomy using the eyes as the anatomical reference allowed for an adequate access for localization and removal of the MOBs in rabbits. This techique may be used in studies of viral pathogenesis requiring the complete interruption of the olfactory connection to the brain. / Coelhos têm sido utilizados como modelo para o estudo da neuropatogenia da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5), um importante agente de doença neurológica em bovinos. O sistema olfatório tem sido apontado como a principal via de acesso do vírus ao cérebro após replicação na cavidade nasal. Para investigar a importância da via olfatória na patogenia da infecção neurológica pelo BHV-5, foi elaborada e avaliada técnica operatória de craniotomia transfrontal para remoção dos bulbos olfatórios (BOs), definindo-se as órbitas como referência anatômica. Foram utilizados 45 coelhos com 30 a 40 dias de idade, sendo 23 submetidos à ablação cirúrgica dos BOs e posteriormente inoculados pela via intranasal (IN) ou no saco conjuntival (IC) com o BHV-5. Após incisões de pele, tecido subcutâneo e periósteo, a craniotomia foi realizada em um ponto eqüidistante entre os cantos mediais dos olhos, com uma broca sulcada de 3mm acoplada a uma perfuratriz elétrica de baixa rotação. A remoção dos BOs foi realizada com uma sonda uretral nº6 acoplada a um aspirador. O estudo macroscópico de três animais após a cirurgia comprovou que o procedimento foi eficiente na remoção total dos BOs. Isso também foi comprovado pela interrupção do acesso do vírus ao córtex cerebral: apenas um animal (1/11 ou 9,1%) no grupo submetido à ablação dos BOs com inoculação IN desenvolveu enfermidade neurológica, contra 100% (10/10) dos coelhos controle. Conclui-se que a técnica de craniotomia transfrontal utilizando a órbita como referência anatômica permite o acesso adequado para localização e remoção dos BOs e pode ser utilizada em estudos de patogenia de infecções por vírus neurotrópicos que exijam a interrupção completa da via olfatória.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:55:48Z : No. of bitstreams: 1 affonso_ib_me_jabo.pdf: 804054 bytes, checksum: 44c5a047b2c4507ea787e45752bb674c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV) é um dos patógenos pertencentes ao complexo respiratório bovino. Apesar de não provocar enfermidade severa na maioria dos casos, há evidências de que este vírus possa facilitar o estabelecimento de outros patógenos. Assim, o presente estudo buscou estabelecer a possibilidade de relação entre o BRSV e o Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV-1), em três propriedades leiteiras, localizadas em três municípios do noroeste do Estado de São Paulo. Além disso, visou também monitorar ao longo do tempo os títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros desde o nascimento. Com base em dados previamente estabelecidos, essas propriedades foram categorizadas como tendo alta, média e baixa prevalência de BoHV-1, respectivamente, propriedade A, no município de Viradouro, (78,6%); propriedade B, no município de Altinópolis, (40%); e, propriedade C, no município de Jaboticabal, (1,6%). Com relação à prevalência de BRSV, a propriedade B apresentou maior prevalência sorológica (82,4%), possivelmente por possuir fatores de risco facilitadores para o desenvolvimento da infecção, enquanto que as propriedades A e C mostraram prevalências estatisticamente equivalentes (45,6% e 59,1%, respectivamente), sem qualquer correlação entre as prevalências de BRSV e BoHV-1. A curva dos títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros nas propriedades A e B monitorados ao longo de um ano foi semelhante, pois ambas apresentaram redução dos títulos a partir do sexto até o oitavo mês de idade dos animais, com seguida retomada de títulos cada vez mais elevados, fato característico de infecção natural. A propriedade C apresentou uma dinâmica semelhante, porém, a maior parte dos bezerros manteve-se positiva durante todo o período, com títulos que decresceram e voltaram a aumentar. / The Bovine Respiratory Syncytial Vírus (BRSV) is one of the Bovine Respiratory Complex pathogens. The disease caused by this virus is often mild, but there are evidences that this pathogen may ease the establishment of other pathogens. Data on the epidemiology of BRSV are still scarce. Based on that, this study aimed to determine the prevalence and evaluate antibody titers in calves from three farms. Moreover, the relationship between BRSV and the Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) was investigated, based on epidemiological data previously determined in these farms. The three farms were categorized as A, in Viradouro municipality, with high prevalence of BHV-1 (78.6%); B, in Altinópolis municipaltity, with intermediate prevalence for this agent (40%); and C, in Jaboticabal municipality, with low prevalence of BHV-1 (1.6%). Farm B showed higher BRSV prevalence (82.4%), maybe due to larger herd and colder climate than farms A and C, which showed equivalent prevalences for BRSV (45.6% and 59.1%, respectively). The curve of antibody titers against BRSV in calves from farms A and B over one year were similar, as both showed lower titers by 6 to 8 months of age, rising up again due to antigenic induction. Farm C showed equivalent dynamics, but calves remained positive all over the year. In disagree to literature data, this experiment did not showed correlation between BRSV and BHV-1 prevalences, maybe due to lack of circulation of the latter.