Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T18:29:48Z No. of bitstreams: 1 TES_LEONARDO_PEDRAZZA_PARCIAL.pdf: 9312449 bytes, checksum: e82cef97eb17ae6eefdb30bc5fe133ed (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T18:29:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TES_LEONARDO_PEDRAZZA_PARCIAL.pdf: 9312449 bytes, checksum: e82cef97eb17ae6eefdb30bc5fe133ed (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-30T18:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_LEONARDO_PEDRAZZA_PARCIAL.pdf: 9312449 bytes, checksum: e82cef97eb17ae6eefdb30bc5fe133ed (MD5) Previous issue date: 2017-03-24 / Mesenchymal stem cells (MSC) were first identified by Friedenstein and Petrakova (1966), who isolated these progenitor cells from rat bone marrow and found that these cells are able to differentiate into connective tissue lineage including bone, adipose tissue, cartilage and muscle. MSCs have emerged in recent years as therapeutic tools based on four important features: differentiation potential, capacity to modulate immune responses, pro-angiogenic and repair promoting capacities, and low immunogenicity, the latter feature may allow allogeneic treatments. Based on their immunomodulatory properties and paracrine effects through trophic factors with anti-fibrotic, anti-apoptotic or pro-angiogenic properties, MSCs are considered a promising instrument for cell therapy, in particular for inflammatory diseases. MSCs regulate the function of a broad range of immune cells, and are activated by inflammatory mediators released from activated immune cells. The mechanisms involved in the immunoregulatory activity of MSCs are still under investigation. Therefore, MSCs become a potential treatment alternative for sepsis and for acute lung infection, which may lead to the interruption of the sequence in the pathogenesis and cause mortality reduction of both pathologies. The principal objective of this study was to evaluate the therapeutic and immunomodulatory effect of MSCs in the treatment of sepsis and acute lung injury and search for their possible mechanisms of action. Our results demonstrated for the first time that the reduction of inflammation in sepsis caused by treatment with MSCs is directly involved in the inhibition of the pathway of mitogen-activated proteins (MAPKs) and that MSCs were unable to modulate the expression of toll-like receptors. During acute lung injury (ALI), the immunomodulation caused by the treatment and the decrease of the oxidative stress that consequently led to a decrease in the formation of extracellular neutrophil network (NETs), leading to an increase in the survival of animals with LPA. The promising results obtained in these studies are encouraging and suggest that MSCs might be a therapeutic option to treat sepsis and acute lung infection in patients in the future. / As c?lulas-tronco mesenquimais (MSC) foram identificadas primeiramente por Friedenstein e Petrakova (1966), que isolaram estas c?lulas progenitoras a partir da medula ?ssea de rato e observaram serem capazes de se diferenciarem em linhagem de tecido conectivo, incluindo osso, tecido adiposo, cartilagem e m?sculo. As MSCs surgiram nos ?ltimos anos como ferramentas terap?uticas baseadas em quatro caracter?sticas importantes: potencial de diferencia??o, capacidade para modular a resposta imune, capacidades pr?-angiog?nicas promovendo regenera??o tecidual, e baixa imunogenicidade, sendo que esta ?ltima caracter?stica pode permitir tratamentos alog?nicos. Com base nas suas propriedades imunomoduladoras e efeitos par?crinos atrav?s de fatores tr?ficos com propriedades anti-fibr?ticas, anti-apopt?ticas ou pr?-angiog?nicas, as MSCs s?o consideradas um instrumento promissor para a terapia celular, em particular para doen?as inflamat?rias. As MSCs regulam as fun??es de uma ampla gama de c?lulas imunes, e s?o ativadas por mediadores inflamat?rios liberados de c?lulas imunes ativadas. Os mecanismos envolvidos na atividade imunorreguladora de MSCs est?o ainda sob investiga??o. Desta forma, as c?lulas-tronco mesequimais se tornam uma potencial alternativa de tratamento para a sepse e para infec??o pulmonar aguda, podendo levar a interrup??o do curso da patog?nese, e provocar a redu??o da mortalidade de ambas patologias. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito terap?utico e imunomodulador de c?lulas-tronco mesenquimais no tratamento da sepse e da les?o pulmonar aguda e buscar os seus poss?veis mecanismos de a??o. Nossos resultados demonstraram pela primeira vez, que a redu??o da inflama??o na sepse provocada pelo tratamento com c?lulas-tronco mesenquimais est? diretamente envolvido a inibi??o da via das prote?nas ativadas por mit?genos (MAPKs) e que as MSCs foram incapazes de modular a express?o de receptores do tipo toll. Durante a les?o pulmonar aguda (LPA) ficou evidente a imunomodula??o provocada pelo tratamento e a diminui??o do estresse oxidativo que consequentemente ocasionou a uma diminui??o da forma??o das redes extracelulares de neutr?filos (NETs), levando a um aumento na sobrevida dos animais com LPA. Os resultados promissores obtidos neste estudo s?o encorajadores e sugerem que as MSCs podem ser uma op??o terap?utica para tratar a sepse e a les?o pulmonar aguda em pacientes no futuro.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 447381.pdf: 1128253 bytes, checksum: d5ebf0da0d18404190c4e67763e48457 (MD5) Previous issue date: 2013-03-06 / Sepsis, a medical condition that affects 18 million people per year worldwide, is characterized by a generalized inflammatory state caused by infection. The widespread activation of coagulation pathways and inflammation progresses to multiple organ failure, the collapse of the circulatory system (septic shock) and death. Despite decades of research and numerous clinical trials, little progress has been made in developing new treatments and mortality rates are virtually the same in the last 20 to 30 years. As such, sepsis remains a difficult opponent for surgeons and their patients, so the search for new therapeutic alternatives becomes strictly essential. Recently stem cells have emerged as a promising therapy for a variety of diseases, including cardiovascular diseases, neurodegenerative disorders, peripheral vascular disease, renal disease, and several others. Its beneficial effects are due mainly to their ability to connect to injury and inflammation, to attenuate the inflammatory response, and accelerate tissue healing and neoangiogenesis due to noxious stimuli. Considering this therapeutic potential, this study aimed to evaluate whether these cells could lead to immune response back into balance, reducing the pathophysiology of sepsis and thereby increase the survival time in mice using an experimental model of sepsis. Our results demonstrated that treatment with mesenchymal stem cells was able to increase survival time of the animals that were tested. This effect is due to the ability of these cells to modulate the immune response providing a smaller reduction in tissue injury and apoptotic cells. These findings demonstrate that mesenchymal stem cells have therapeutic potential and can function as a possible future treatment for sepsis. / Sepse, uma condi??o m?dica que afeta 18 milh?es de pessoas por ano no mundo, ? caracterizada por um estado inflamat?rio generalizado causado por uma infec??o. A ativa??o generalizada de vias de coagula??o e inflama??o evolui para disfun??o de m?ltiplos ?rg?os, o colapso do sistema circulat?rio (choque s?ptico) e morte. Apesar de d?cadas de pesquisas e numerosas experimenta??es cl?nicas, pouco progresso tem sido observado no desenvolvimento de novos tratamentos e as taxas de mortalidade s?o praticamente as mesmas nos ?ltimos 20 a 30 anos. Como tal, a sepse continua sendo um dif?cil advers?rio para cirurgi?es e seus pacientes, logo, a busca por novas alternativas terap?uticas torna-se estritamente essencial. Recentemente as c?lulas-tronco t?m emergido como uma terapia promissora para uma variedade de patologias, incluindo doen?as cardiovasculares, neurodegenerativas, doen?a vascular perif?rica, doen?a renal, e v?rias outras. Seus efeitos ben?ficos est?o relacionados principalmente ?s suas capacidades de se conectarem a les?es e inflama??es, para atenuar a resposta inflamat?ria e acelerar a cicatriza??o de tecidos e de neoangiog?nese devido a est?mulos nocivos. Considerando esse potencial terap?utico, o presente estudo teve por objetivo avaliar se essas c?lulas poderiam conduzir a resposta imune de volta ao equil?brio, atenuando a fisiopatologia da sepse e dessa forma aumentando o tempo de sobrevida em camundongos, utilizando um modelo de sepse experimental. Os resultados demonstraram que o tratamento com as c?lulas-tronco mesenquimais foi capaz de aumentar o tempo de sobrevida dos animais em estudo. Esse efeito observado deve-se ? capacidade destas c?lulas de modularem a resposta imune, proporcionando uma menor les?o tecidual e a diminui??o de c?lulas apopt?ticas. Essas descobertas demonstram que as c?lulas-tronco mesenquimais t?m potencial terap?utico e podem funcionar futuramente como um poss?vel tratamento para a sepse.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 413419.pdf: 7548238 bytes, checksum: fb7df37e9d8df24acf3390709418323f (MD5) Previous issue date: 2009-03-31 / A engenharia tecidual tem se mostrado um campo promissor para a reabilita??o de pacientes com traumas ou deformidades faciais que necessitem de ?reas extensas de enxerto ?sseo. Seu princ?pio b?sico envolve a associa??o de um tipo apropriado de c?lula e de um arcabou?o biocompat?vel e bioabsorv?vel que mimetize funcional e estruturalmente determinado tipo de tecido. O Cimento de Fosfato de C?lcio (CFC) aparece como uma alternativa vi?vel de biomaterial a ser utilizado com esta finalidade em virtude de suas caracter?sticas como biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade. Assim, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar a capacidade de suportes tridimensionais macroporosos de CFC, confeccionados com mat?rias-primas brasileiras, de permitir a ades?o, prolifera??o e diferencia??o de c?lulas-tronco mesenquimais derivadas da medula ?ssea humana. Para isso, c?lulas obtidas da crista il?aca de um doador humano adulto foram rotineiramente processadas at? as condi??es experimentais e, a seguir, cultivadas sobre suportes de CFC, macroporosos, que tiveram como corpo gerador de poros, microesferas de parafina, com tamanho entre 100 e 250μm. Para indu??o das c?lulas em linhagem osteog?nica foi acrescentada Prote?na Morfog?nica ?ssea (BMP4) ao meio de cultura. Os per?odos de cultura estabelecidos foram de cinco, dez e 15 dias. Ap?s estes per?odos, o comportamento e a morfologia das c?lulas junto ao biomaterial foram avaliados por meio de Microscopia Eletr?nica de Varredura. Os n?veis de express?o dos genes BGLA e SSP1, que codificam as prote?nas osteocalcina (OC) e osteopontina (OP) respectivamente, bem como a atividade da Fosfatase Alcalina (ALP), outro marcador osteobl?stico importante, foram quantificados pela t?cnica de PCR em Tempo Real (QT-PCR) utilizando o fluor?foro SYBR Green?. O QT-PCR detectou a express?o dos genes BGLA e SSP1 e a atividade da fosfatase alcalina nos per?odos de 10 e 15 dias de cultura, o que nos permitiu constatar que houve prolifera??o celular e diferencia??o destas em c?lulas osteog?nicas. No per?odo de cinco dias, n?o foi observada a express?o de nenhum dos genes investigados. A partir destes resultados conclu?mos que o CFC, macroporoso, com tamanho de poros entre 100 e 250μm, criados por meio da utiliza??o de microesferas de parafina, permite a ades?o, prolifera??o e diferencia??o de c?lulas-tronco mesenquimais em c?lulas osteog?nicas, podendo ser utilizado como arcabou?o para engenharia de tecido ?sseo.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:29:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 417772.pdf: 8647052 bytes, checksum: ff0995a277ba9d1db6d58798d55822b1 (MD5) Previous issue date: 2009-08-13 / As c?lulas tronco mesenquimais origin?rias do estroma da medula ?ssea humana possuem grande capacidade de diferencia??o em diversos tecidos, inclusive osso. Culturas de c?lulas tronco mesenquimais in vitro podem sofrer osteoindu??o e produzir c?lulas dos diferentes est?gios da linhagem osteobl?stica. A busca de um arcabou?o adequado quanto a sua capacidade osteocondutora e osteoindutora vem sendo um dos grandes desafios da engenharia tecidual ?ssea. Neste estudo verificou-se o papel de um arcabou?o al?geno fresco congelado e do meio de cultura (DAG) sobre a osteog?nese de c?lulas tronco adultas. Os aspectos morfol?gicos das c?lulas osteog?nicas e do arcabou?o, al?m da express?o das prote?nas osteopontina, osteocalcina e fosfatase alcalina ?sseas foram analisadas em sete, quatorze e vinte e um dias de cultura, sem e com meio osteog?nico (DAG). Os resultados obtidos do s?timo dia at? o vig?simo primeiro dia da pesquisa demonstraram a presen?a de aumento na ades?o, migra??o, crescimento e diferencia??o celular ?ssea. O meio DAG foi um acelerador da osteog?nese, verificado principalmente, nas primeiras duas semanas. O arcabou?o de osso al?geno, in vitro, apresentou a capacidade de suportar a ostegen?se at? a mineraliza??o em todas as culturas. Assim, concluiu-se que as c?lulas derivadas da medula ?ssea humana podem: aderir, migrar, crescer, proliferar e se diferenciar sobre um arcabou?o de osso al?geno fresco congelado. O meio osteog?nico acelera a ades?o, migra??o, crescimento, prolifera??o e diferencia??o das c?lulas tronco adultas em osteoblastos principalmente nos primeiros quatorze dias de cultura. Os osteoblastos foram obtidos a partir de c?lulas de medula ?ssea humana sobre um arcabou?o de osso al?geno fresco congelado, mesmo sem adi??o de fatores osteoindutores. Finalmente, o arcabou?o de osso al?geno fresco congelado ? osteocondutor e osteoindutor quando associado com c?lulas tronco adultas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 425136.pdf: 6824100 bytes, checksum: a0f00fc5697ef7ef0055b9577b7dbbbe (MD5) Previous issue date: 2010-06-29 / O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) ? uma s?ndrome auto-imune ?rg?o-espec?fica caracterizada pela destrui??o seletiva de c?lulas β produtoras de insulina nas ilhotas pancre?ticas. A busca por alternativas terap?uticas para o DM1, voltadas ? preserva??o e/ou regenera??o da massa de c?lulas β e, consequentemente, ? reconstitui??o do padr?o fisiol?gico de secre??o de insulina, tem sido exaustivamente realizada. Dentre as estrat?gias de tratamento estudadas, destaca-se a terapia celular baseada na utiliza??o de c?lulas-tronco mesenquimais. Na busca por um produto que mimetize qualitativamente e quantitativamente as caracter?sticas das c?lulas β pancre?ticas, protocolos devem ser aperfei?oados e a capacidade de (trans)diferencia??o de novas fontes celulares tecido-espec?ficas devem ser exploradas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade de expans?o e diferencia??o in vitro de c?lulas-tronco mesenquimais murinas, isoladas do rim, p?ncreas e medula ?ssea, avaliando sua capacidade de diferencia??o em c?lulas produtoras de insulina. Evidenciou-se que estas popula??es celulares s?o capazes de se (trans) diferenciar em c?lulas com fen?tipo pancre?tico end?crino, quando cultivadas em meio rico em indutores, incluindo morfologia esf?rica, forma??o de clusters, secre??o de insulina (com a conseq?ente colora??o positiva para ditizona) e express?o in vitro do gene e da prote?na da insulina-1. Al?m disso, c?lulas produtoras de insulina (CPIs) derivadas de c?lulas-tronco mesenquimais pancre?ticas reverteram o estado hiperglic?mico quando transplantadas em c?psula renal de camundongos diab?ticos, indicando que s?o capazes de diferenciarem-se in vitro em CPIs funcionais e de manterem esta funcionalidade in vivo.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:05:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoanaCMT_TESE.pdf: 5399741 bytes, checksum: 9af0d84203a9976314d4eb5bba7e4067 (MD5) Previous issue date: 2013-03-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Human mesenchymal stem cells (MSC) are powerful sources for cell therapy in regenerative medicine. The long time cultivation can result in replicative senescence or can be related to the emergence of chromosomal alterations responsible for the acquisition of tumorigenesis features in vitro. In this study, for the first time, the expression profile of MSC with a paracentric chromosomal inversion (MSC/inv) was compared to normal karyotype (MSC/n) in early and late passages. Furthermore, we compared the transcriptome of each MSC in early passages with late passages. MSC used in this study were obtained from the umbilical vein of three donors, two MSC/n and one MSC/inv. After their cryopreservation, they have been expanded in vitro until reached senescence. Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (Qiagen) and marked with the GeneChip ? 3 IVT Express Kit (Affymetrix Inc.). Subsequently, the fragmented aRNA was hybridized on the microarranjo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc.). The statistical analysis of differential gene expression was performed between groups MSC by the Partek Genomic Suite software, version 6.4 (Partek Inc.). Was considered statistically significant differences in expression to p-value Bonferroni correction ˂.01. Only signals with fold change ˃ 3.0 were included in the list of differentially expressed. Differences in gene expression data obtained from microarrays were confirmed by Real Time RT-PCR. For the interpretation of biological expression data were used: IPA (Ingenuity Systems) for analysis enrichment functions, the STRING 9.0 for construction of network interactions; Cytoscape 2.8 to the network visualization and analysis bottlenecks with the aid of the GraphPad Prism 5.0 software. BiNGO Cytoscape pluggin was used to access overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. The comparison between senescent and young at each group of MSC has shown that there is a difference in the expression parttern, being higher in the senescent MSC/inv group. The results also showed difference in expression profiles between the MSC/inv versus MSC/n, being greater when they are senescent. New networks were identified for genes related to the response of two of MSC over cultivation time. Were also identified genes that can coordinate functional categories over represented at networks, such as CXCL12, SFRP1, xvi EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. The biological interpretation of these data suggests that the population of MSC/inv has different constitutional characteristics, related to their potential for differentiation, proliferation and response to stimuli, responsible for a distinct process of replicative senescence in MSC/inv compared to MSC/n. The genes identified in this study are candidates for biomarkers of cellular senescence in MSC, but their functional relevance in this process should be evaluated in additional in vitro and/or in vivo assays / C?lulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH) s?o muito ?teis na terapia celular. O longo per?odo de cultivo pode resultar em senesc?ncia replicativa ou estar relacionado com o aparecimento de altera??es cromoss?micas respons?veis pela aquisi??o de um car?ter tumorig?nico in vitro . Neste estudo, foi comparado o transcriptoma de CTMH jovens e senescentes obtidas de diferentes doadores. Al?m disso, pela primeira vez, o perfil de express?o de CTMH com uma invers?o cromoss?mica parac?ntrica (CTMH/inv) foi comparado ao de CTMH que possuem cari?tipo normal (CTMH/n) em passagens jovens e senescentes de cultivo in vitro . As CTMH utilizadas neste estudo foram isoladas da veia do cord?o umbilical de tr?s dadores, dois CTMH/n e de um CTMH/inv. Ap?s a criopreserva??o, elas foram expandidas in vitro at? alcan?arem a senesc?ncia. O RNA total foi extra?do utilizando o RNeasy mini kit (Qiagen), marcado, purificado e fragmentado com o ? 3 GeneChip IVT expresso Kit (Affymetrix, Inc.). Subsequentemente, o RNA fragmentado foi hibridado no microarranjo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Inc.). A an?lise estat?stica da express?o diferencial foi realizada usando o Partek Suite Software Genomic, vers?o 6.4 (Partek, Inc.). Foram consideradas estatisticamente significativas as diferen?as na express?o com valor de P ˂0.01 corrigido com Bonferroni. Apenas os sinais com fold change ˃3.0 foram inclu?dos na lista de diferencialmente expressos. Diferen?as na express?o g?nica observadas no estudo dos microarranjos foram confirmadas por resultados de RT-PCR em tempo real. Para a interpreta??o biol?gica dos dados foram utilizados: IPA (Ingenuity Systems) para an?lise de enriquecimento de fun??es; STRING 9,0 para a constru??o de redes de intera??es; Cytoscape 2,8 para a visualiza??o das redes e an?lises de gargalos com o aux?lio do software GraphPad Prism 5.0. O pluggin BiNGO do Cytoscape foi utilizado para avaliar a representa??o de categorias funcionais no Gene Ontology nas redes biol?gicas. A compara??o entre senescentes e jovens em cada grupo de CTMH mostrou que h? uma diferen?a no perfil de express?o, sendo maior nas senescentes do grupo CTMH/inv. Os resultados tamb?m mostraram que h? diferen?a nos perfis de express?o entre as CTMH/inv e CTMH/n, sendo maior a diferen?a quando as c?lulas est?o senescentes. Novas xiv redes foram identificadas para genes relacionados com a resposta ao longo do tempo de cultivo nos dois grupos de CTMH. Foram identificados genes que podem coordenar fun??es importantes mais enriquecidas nas redes, como por exemplo, CXCL12, SFRP1, EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. A interpreta??o biol?gica destes dados sugere que a popula??o de c?lulas CTMH/inv tem diferentes caracter?sticas constitucionais, relacionadas com o seu potencial de prolifera??o, diferencia??o e resposta a est?mulos, respons?veis por um processo de senesc?ncia replicativa em CTMH/inv distinto das CTMH/n. Os genes identificados neste estudo s?o candidatos a marcadores da senesc?ncia celular em CTMH, mas a sua relev?ncia funcional neste processo deve ser testada em experi?ncias adicionais in vitro e/ou in vivo

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:05:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeborahAC_TESE.pdf: 2567069 bytes, checksum: 17be3c292d241e19b0a9d1323613899f (MD5) Previous issue date: 2012-04-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Human multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs), also known as mesenchymal stem cells, have become an important and attractive therapeutic tool since they are easily isolated and cultured, have in vitro expansion potential, substantial plasticity and secrete bioactive molecules that exert trophic effects. The human umbilical cord as a cell source for cell therapy will help to avoid several ethical, political, religious and technical issues. One of the main issues with SC lines from different sources, mainly those of embryonic origin, is the possibility of chromosomal alterations and genomic instability during in vitro expansion. Cells isolated from one umbilical cord exhibited a rare balanced paracentric inversion, likely a cytogenetic constitutional alteration, karyotype: 46,XY,inv(3)(p13p25~26). Important genes related to cancer predisposition and others involved in DNA repair are located in 3p25~26. Titanium is an excellent biomaterial for bone-implant integration; however, the use can result in the generation of particulate debris that can accumulate in the tissues adjacent to the prosthesis, in the local bone marrow, in the lymph nodes, liver and spleen. Subsequently may elicit important biological responses that aren?t well studied. In this work, we have studied the genetic stability of MSC isolated from the umbilical cord vein during in vitro expansion, after the cryopreservation, and under different concentrations and time of exposition to titanium microparticles. Cells were isolated, in vitro expanded, demonstrated capacity for osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation and were evaluated using flow cytometry, so they met the minimum requirements for characterization as MSCs. The cells were expanded under different concentrations and time of exposition to titanium microparticles. The genetic stability of MSCs was assessed by cytogenetic analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH) and analysis of micronucleus and other nuclear alterations (CBMN). The cells were able to internalize the titanium microparticles, but MSCs preserve their morphology, differentiation capacity and surface marker expression profiles. Furthermore, there was an increase in the genomic instability after long time of in vitro expansion, and this instability was greater when cells were exposed to high doses of titanium microparticles that induced oxidative stress. It is necessary always assess the risks/ benefits of using titanium in tissue therapy involving MSCs, considering the biosafety of the use of bone regeneration using titanium and MSCs. Even without using titanium, it is important that the therapeutic use of such cells is based on analyzes that ensure quality, security and cellular stability, with the standardization of quality control programs appropriate. In conclusion, it is suggested that cytogenetic analysis, FISH analysis and the micronucleus and other nuclear alterations are carried out in CTMH before implanting in a patient / C?lulas mesenquimais estromais multipotentes, tamb?m conhecidas como c?lulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH), s?o c?lulas multipotentes utilizadas em v?rias pesquisas de terapia celular, pois apresentam a capacidade de se diferenciar em m?ltiplas e diferentes linhagens, t?m grande capacidade de autorrenova??o e de expans?o in vitro, excelentes propriedades imunossupressoras e s?o capazes de secretar mol?culas bioativas que exercem efeitos tr?ficos. O cord?o umbilical ? uma fonte de CTMH cuja extra??o n?o necessita de um procedimento invasivo, al?m de n?o envolver controv?rsias ?ticas, pol?ticas e religiosas. Um dos problemas que envolvem linhagens de CTMH de diferentes fontes ? a possibilidade de ocorr?ncia de altera??es cromoss?micas e instabilidade gen?tica, que podem aparecer durante a expans?o in vitro. Al?m disso, as CTMH de um dos cord?es apresentaram uma altera??o cromoss?mica constitucional: invers?o parac?ntrica no bra?o curto do cromossomo 3, cari?tipo: 46,XY,inv(3)(p13p25~26). Em 3p25-26, est?o localizados v?rios genes de grande import?ncia biol?gica, como genes envolvidos com o reparo de DNA e outros respons?veis pelo desenvolvimento de tumores. O tit?nio ? um dos materiais mais utilizado para fabrica??o de implantes ortop?dicos e dent?rios, e ? considerado um excelente biomaterial, entretanto, as part?culas derivadas de pr?teses acumulam-se nos tecidos periprost?ticos e na medula ?ssea local, disseminam-se para linfonodos, f?gado e ba?o. As implica??es biol?gicas em longo prazo da dissemina??o sist?mica de part?culas de metais e seus efeitos cito e genot?xicos n?o est?o bem caracterizados. Neste trabalho investigamos a estabilidade gen?tica de CTMH isoladas da veia do cord?o umbilical durante a expans?o in vitro, ap?s a criopreserva??o, e em diferentes condi??es de cultivo, na presen?a e na aus?ncia de tit?nio, antes e ap?s o aparecimento de c?lulas senescentes no cultivo. As c?lulas foram isoladas, expandidas, diferenciadas em osteoblastos, adip?citos e condroblastos e analisadas com citometria de fluxo para comprovar que s?o c?lulas-tronco mesenquimais. As CTMH foram tratadas com diferentes doses/ tempo de exposi??o ? micropart?culas de tit?nio. A avalia??o da estabilidade gen?tica das CTMH foi realizada atrav?s da an?lise do cari?tipo, de hibrida??o in situ por fluoresc?ncia (FISH) e da an?lise do micron?cleo e outras altera??es nucleares (CBMN). Ficou estabelecido que as CTMH foram capazes de internalizar as micropart?culas de tit?nio, mas as c?lulas mant?m sua capacidade de prolifera??o, diferencia??o e preservam os mesmos marcadores de membrana. Al?m disso, demonstrou-se que existe um aumento na instabilidade gen?tica com o decorrer do tempo de expans?o in vitro, e esta instabilidade foi maior na presen?a de grande concentra??o de micropart?culas de tit?nio que induzem estresse oxidativo. ? necess?rio sempre avaliar os riscos/ benef?cios da utiliza??o do tit?nio na terapia tecidual envolvendo CTMH, considerando a biosseguran?a da utiliza??o da regenera??o ?ssea guiada que utiliza CTMH e tit?nio. Mesmo n?o se utilizando o tit?nio, ? importante que o uso terap?utico de tais c?lulas seja baseado em an?lises que garantam a qualidade, seguran?a e estabilidade celular, com a padroniza??o de programas de controle de qualidade adequados. Como conclus?o, sugere-se que a an?lise citogen?tica, FISH e a an?lise do micron?cleo e outras altera??es nucleares sejam realizadas nas CTMH antes de implantar num paciente, sejam elas cultivadas por longo tempo ou n?o

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-29T15:00:54Z No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_GONCALVES_BOECKEL_PARCIAL.pdf: 676511 bytes, checksum: cb9dde990f100982c7eac5a144973b47 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-29T15:01:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_GONCALVES_BOECKEL_PARCIAL.pdf: 676511 bytes, checksum: cb9dde990f100982c7eac5a144973b47 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T15:01:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_GONCALVES_BOECKEL_PARCIAL.pdf: 676511 bytes, checksum: cb9dde990f100982c7eac5a144973b47 (MD5) Previous issue date: 2016-12-19 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The present research aims to characterize the mesenchymal stem cells of adipose origin (MSCAs) and to evaluate its use on the scaffold of hyaluronic acid (HA) as a cellular compound for bone tissue engineering. Firstly, cell characterization was performed through the collection of epididymal adipose tissue, isolation, culture and in vitro expansion. Through the morphological analysis of MSCAs culture it was possible to confirm elongated fusiform characteristic, centralized nucleus, extensions and adhesion to the plastic bottle. Expansion analysis also demonstrated a high cell proliferative index during the 26 days of in vitro culture. The Flow Cytometry test allowed the identification of the main surface markers that characterize the mesenchymal stem cells (CD29 and CD90) and negative for hematopoietic markers (CD31 and CD45). Moreover, MSCAs when induced to adipogenic and osteogenic media showed plasticity, since they were able to differentiate into adipocytes and osteoblasts respectively. The cell viability test was also performed in vitro, through the M.T.T (mitochondrial activity) of MSCAs on the HA scaffold. Concentrations of 100%, 75%, 50%, 25% and 15% were evaluated on the HA scaffold at times of 24, 48 and 72 hours. The results have shown cellular viability above 60% in almost all times and concentrations. Then, 50 critical bone defects were performed in the femoral region with 2 mm in diameter (one defect per femur) in 25 Lewis rats. The grafting treatments were divided as follows: I-negative control / only the defect (C); II-HA Scaffold; III- MSCAs; IV- MSCAs + HA and V- MSCAs previously osteoinduced + HA. After 23 days the rats were euthanized and had 5 femurs used for the microtomographic (?-CT) and histomorphometric analysis and 5 femurs used for the RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) analysis. The results for the ?-CT tests in the volume of osseous tissue parameter (VOT) and the percentage of osseous tissue (POT) did not present statistical differences among all groups. However, on the osseous contact surface (SCO) and osseous surface density (DSO) parameters, we had groups IV, III and V with higher indexes and differing statistically from the negative control groups I and group II. In histomorphometry we also had groups IV, V and III with greater area of regenerated bone tissue and differing with significance from groups I and II. The results were analyzed statistically by Analysis of Variance one way (ANOVA) and the level of significance was 5% (p <0.05). Regarding RT-PCR, a statistically significant difference was observed only when we evaluated osteonectin (ON) in which group II and V were more expressive in relation to groups III and IV. Regarding osteopontin (OP) and Type I collagen (Col1A), no differences were identified among the treated groups. The results were analyzed using Kruskal-Wallis non-parametric test and the significance level set was 5% (p <0.05). / A presente pesquisa tem por objetivo caracterizar as c?lulas-tronco mesenquimais de origem adiposa (CTMAs) e avaliar seu uso sobre a matriz de ?cido hialur?nico (AH) como composto celular para engenharia tecidual ?ssea. Primeiramente, foi realizada a caracteriza??o celular atrav?s da coleta do tecido adiposo epididimal, isolamento, cultivo e expans?o in vitro. Atrav?s da an?lise morfol?gica da cultura das CTMAs foi poss?vel confirmar caracter?stica fusiforme alongada, n?cleo centralizado, prolongamentos e ades?o ? garrafa pl?stica. A an?lise de expans?o tamb?m comprovou um alto ?ndice proliferativo celular, durante os 26 dias de cultura in vitro. J? o teste de citometria de fluxo permitiu a identifica??o dos principais marcadores de superf?cie que caracterizam as c?lulas-tronco mesenquimais (CD29 e CD90) e sendo negativo para marcadores hematopoi?ticos (CD31 e CD45). As CTMAS tamb?m quando induzidas aos meios adipog?nico e osteog?nico mostraram plasticidade, j? que foram capazes de diferenciarem-se em adip?citos e osteoblastos, respectivamente. Ainda in vitro, foi realizado o teste de viabilidade celular atrav?s do MTT (atividade mitocondrial), ap?s o contato das CTMAs sobre a matriz de AH. As concentra??es de 100%, 75%, 50%, 25% e 15% foram avaliadas sobre a matriz de AH nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Os resultados comprovaram uma viabilidade celular acima de 60% em quase todos os tempos e concentra??es. Em seguida, foram realizados 50 defeitos ?sseos cr?ticos (DOC) na regi?o femoral com 2 mm de di?metro (um defeito por f?mur) em 25 ratos Lewis. Os tratamentos de enxertia realizados foram divididos da seguinte forma: I-controle negativo / apenas o defeito (C); II- matriz AH; III-CTMAs; IV-CTMAs + AH e V- CTMAs osteoinduzida + AH. Ap?s 23 dias os ratos sofreram eutan?sia e tiveram 5 f?mures utilizados para as an?lises microtomogr?ficas (?-CT) e histomorfom?trica e 5 f?mures utilizados para a an?lise por RT-PCR (Rea??o em cadeia da Polimerase em tempo Real). Os resultados para os testes por ?-CT no par?metro volume de tecido ?sseo (VTO) e porcentagem de tecido ?sseo (PTO) n?o apresentaram diferen?as estat?sticas entre todos os grupos. J?, nos par?metros superf?cie de contato (SCO) e densidade de superf?cie ?ssea (DSO) tivemos o grupo IV, III e V com maiores ?ndices e diferindo estatisticamente dos grupos controle negativo I e do grupo II. Na histomorfometria tamb?m tivemos os grupos IV, V e III com maiores ?reas de tecido ?sseo regenerado e diferindo com signific?ncia dos grupos I e II. Os resultados foram analisados estatisticamente pela An?lise de Vari?ncia de uma via (ANOVA) o n?vel de signific?ncia estabelecido foi de 5% (p < 0,05). Em rela??o ao RT-PCR, observou-se diferen?a estatisticamente significante apenas quando foi avaliada osteonectina (ON), sendo que o grupo II e V apresentaram maior express?o em rela??o aos grupos III e IV. Em rela??o ? osteopontina (OP) e ao col?geno Tipo I (Col1A) n?o foram identificadas diferen?as entres os grupos tratados. Os resultados foram analisados atrav?s do teste n?o param?trico de Kruskal-Wallis e o n?vel de signific?ncia estabelecido foi de 5% (p < 0,05).

Submitted by Natalie Mendes (nataliermendes@gmail.com) on 2015-07-24T01:11:42Z No. of bitstreams: 1 marcus_vinicius_pinheiro_mendonca_tese.pdf: 8890182 bytes, checksum: 8c3486b869dff02251529c805a28b23c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-24T01:11:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marcus_vinicius_pinheiro_mendonca_tese.pdf: 8890182 bytes, checksum: 8c3486b869dff02251529c805a28b23c (MD5) Previous issue date: 2014-10-10 / Despite the advancement in the care of patients with spinal cord injury, currently there is no specific treatment for neurological lesion. Therapy with mesenchymal stem cells from bone marrow (BMMC) has shown to be a safe and promising technique in various medical fields. The objective of this study is to evaluate the safety of autologous BMMC transplantation for the treatment of chronic spinal cord injury of traumatic origin.Fourteen paraplegic patients (classified as A in ASIA scale) with at least 6-month thoracic or thoracolumbar spinal cord injurywere selected. They underwent aspiration of bone marrow tissue from the iliac crest with further expansion and in vitro characterization; by means of microsurgical procedure, the BMMC suspension was introduced at the level of the spinal cord injury. A 6-month clinical follow-up was performed after surgery, including functional and imaging tests. There was a change in ASIA scale in 7 patients, increased bladder capacity in 5 patients and appearance of the SSEP waveform in one patient. Throughout the observation period, no major complications were observed. The present protocol proved to be safe and, due to significant improvements in neurological symptoms in many patients, also a potentially promising therapeutic method for patients with spinal cord injury. / A despeito do avan?o na assist?ncia do paciente com trauma raquimedular, atualmente n?o h? tratamento espec?fico para a les?o neurol?gica. A terapia com c?lulas-tronco mesenquimais da medula ?ssea (CMMO) tem-se mostrado uma t?cnica segura e promissora em diversas ?reas m?dicas. O objetivo deste estudo ? avaliar a seguran?a do transplante aut?logo de CMMO para o tratamento de les?o medular cr?nica de origem traum?tica. Foram selecionados 14 pacientes parapl?gicos (classificados como A na escala ASIA) com les?o medular tor?cica ou t?raco-lombar h? mais de 6 meses. Eles foram inicialmente submetidos ? aspira??o de tecido da medula ?ssea da crista il?aca, com posterior expans?o e caracteriza??o in vitro de CMMO e, por meio de procedimento microcir?rgico, introduziu-se a suspens?o de CMMO na medula espinhal no n?vel da les?o. Os pacientes foram acompanhados clinicamente, com realiza??o de exames funcionais e de imagem por um per?odo de 6 meses ap?s o procedimento cir?rgico. Houve mudan?a na escala ASIA em 7 pacientes, aumento da capacidade vesical em 5 pacientes e aparecimento de onda ao SSEP em 1 paciente. Durante todo o tempo de observa??o, n?o foram identificadas complica??es potencialmente graves. O presente protocolo se mostrou seguro e, ainda, devido a melhoras significativas no quadro neurol?gico em boa parte dos pacientes, um m?todo terap?utico potencialmente promissor para pacientes com trauma raquimedular.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:34:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 407116.pdf: 4086224 bytes, checksum: 0d63db77cbcec70fa4573faaf2637eea (MD5) Previous issue date: 2008-09-29 / A aplica??o de diferentes c?lulas-tronco na regenera??o de tecidos lesionados ou na engenharia de tecidos tem recebido grande aten??o. Devido ?s dificuldades pr?ticas de obten??o de c?lulas-tronco embrion?rias e considerando os aspectos ?ticos e legais, in?meros pesquisadores t?m realizado seus estudos com c?lulas-tronco adultas, principalmente aquelas derivadas do estroma da medula ?ssea. No entanto, estudos recentes comprovam que essa popula??o celular tamb?m pode ser isolada do tecido adiposo (PLA) obtida atrav?s de lipoaspira??o. Esse tipo de c?lula tem a caracter?stica de se diferenciar numa variedade de tecidos mesod?rmicos, dentre eles o tecido ?sseo. O processo de osteoindu??o ? influenciado por v?rios fatores e consiste na indu??o de c?lulas-tronco mesenquimais indiferenciadas a formarem c?lulas osteoprogenitoras. Os fatores osteoindutores utilizados mais freq?entemente s?o a rhBMP-4 ou DAG (Dexametasona/?cido asc?rbico/b-glicerolfosfato). Este estudo teve como objetivo avaliar a ades?o, prolifera??o e diferencia??o de c?lulas-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo quando cultivadas em meio indutor espec?fico, contendo rhBMP-4 ou DAG. C?lulas-tronco adultas foram obtidas do tecido adiposo de tr?s pacientes pela t?cnica de lipossuc??o, realizada pelo Servi?o de Cirurgia Pl?stica do Hospital S?o Lucas da PUCRS. Ap?s tratamento com colagenase para dissocia??o do tecido, as c?lulas foram quantificadas, caracterizadas com rela??o aos marcadores de membrana celular e cultivadas em meio contendo rhBMP-4, DAG ou convencional (controle). As culturas foram avaliadas no 7?, 14? e 21? dia ap?s indu??o em meio espec?fico. A express?o da fosfatase alcalina, osteopontina e osteocalcina foram avaliadas pela t?cnica de RT-PCR nas culturas de c?lulas derivadas do tecido adiposo de dois pacientes. A express?o das prote?nas osteopontina e osteocalcina foi determinada pela t?cnica do PCR em tempo real em uma cultura de c?lulas derivada de um paciente. Igualmente, nesta mesma cultura foram realizada colora??es para fosfatase alcalina e von Kossa para demonstrar a diferencia??o das c?lulas-tronco mesenquimais (MSC) em c?lulas osteobl?sticas pela detec??o da transforma??o osteobl?stica e mineraliza??o da matriz. O n?mero m?dio de c?lulas tronco adultas derivadas de tecido adiposo foi de 1,2 x 107/mL. A m?dia da freq??ncia de express?o dos marcadores CD34 e CD117 foram semelhantes, 0,73% e 0,72%, respectivamente, embora tenha ocorrido uma grande varia??o entre as amostras. Para os marcadores CD45 e CD105 a m?dia das freq??ncias foram de 1,17% e 1,57%, respectivamente. A freq??ncia do CD105 foi mais elevada nas tr?s amostras. Este estudo mostrou que as c?lulas-tronco adultas derivadas de tecido adiposo cultivadas, ou n?o em meio osteog?nico aderem e proliferam em cultura, sofrem osteoindu??o e expressam prote?nas marcadoras da linhagem osteog?nica como a fosfatase alcalina, osteocalcina e osteopontina. C?lulas-tronco adultas derivadas de tecido adiposo s?o capazes de realizar a deposi??o de matriz mineralizada somente quando cultivadas em meio contendo DAG.