IntroducciónEn la actualidad se buscan marcadores para identificar pacientes trasplantados que alcancen cierto grado de tolerancia. El más estudiado recientemente se engloba como células T reguladoras (Tregs), capaces de controlar la respuesta alogénica in vitro y con capacidad tolerogénica en modelos animales. En este trabajo se ha estudiado el comportamiento de Tregs en trasplantados renales y la implicación de procesos inflamatorios y fármacos inmunosupresores más comunes en estos pacientes. Material y MétodosSe midieron las Tregs sanguíneas en los pacientes trasplantados renales mediante citometría de flujo y su función in vitro en cultivos mixtos linfocitarios cada 6 meses post-trasplante hasta los 2 años. Resultados y conclusionesLos pacientes con enfermedad renal terminal presentan un número similar de Tregs que donantes sanos. A los 6 meses del trasplante se observa un descenso de Tregs, recuperándose posteriormente. Se observó una mayor frecuencia de Tregs en los pacientes tratados durante un año con inhibidores de mTOR que los tratados con inhibidores de calcineurina (CNI). Así mismo se observó cómo los niveles sanguíneos de los CNI tenían un efecto deletéreo sobre la función de las Tregs. / IntroductionKidney transplantation has become a therapeutic option choice in patients with chronic renal failure. With the advance of new immunosuppressive agents has been a lower incidence of acute rejection, but still persist long-term problems, largely associated with chronic treatment with immunosuppressive agents. Currently, are looking for markers to identify patients who reach a certain degree of tolerance in order to reduce immunosuppressive load avoiding side effects long term. The most studied biomarker in the last decade includeswith the name of regulatory T cells (Tregs), these cells are able to control allogeneic response in vitro and has tolerogenic capacity demonstrated in many transplant models. Prior to validate this biomarker of transplant tolerance, this work has studied the behavior of Treg cells in renal transplant recipients and their coexistence in the most common inflammatory processes in these patients. In addition, we assess the role of drugs immunosuppressants on these cells.ObjectivesMonitor the levels of Tregs in renal transplant patients and consider the involvement of different events inflammatory on the number of Tregs and to determine the involvement of different immunosuppressive treatments on the number and Tregs function.Material and MethodsThere were two parallel studies, one prospective, in which Treg cells were measured in kidney transplants patients by flow cytometry and theirfunction in vitro by mixed lymphocyte cultures. The samples were collected every 6 months post-transplant until 2 years. In another retrospective study enrolled 64 patients transplantation with a follow-up exceeding one year, dividedin terms of maintenance therapy with calcineurin inhibitors (CNI) or mTOR inhibitors.Results and conclusions At the time prior to transplantation, patients with ESRD have a similar number of Treg cells circulating than healthy donors, excluding retransplantated patients. At 6 months after transplantation there is a dramatic decrease in Treg cell numbers, when the immunosuppressive load is higher. Later the levels of Tregs were recovered. Within the immunosuppressive used in maintenance treatment, there was a higher frequency of Tregs in patients treated for one year with mTOR inhibitors when compared with patients received in the same period calcineurin inhibitors (CNI). Also it was observed that blood levels of the CNI had a deleterious effect on the function of Treg cells.

Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:26:40Z No. of bitstreams: 1 Carolina Valença Messias.pdf: 1326403 bytes, checksum: adde2666bf9c1e45634b4ea4926b6090 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:26:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carolina Valença Messias.pdf: 1326403 bytes, checksum: adde2666bf9c1e45634b4ea4926b6090 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) e o linfoma linfoblástico de células T (LL-T) são proliferações malignas de precursores de células T em diferentes estágios de maturação. LLA-T e LL-T são considerados atualmente duas formas de uma mesma doença, a leucemia/linfoma linfoblástico de células T (LLL-T), por compartilharem características morfológicas, imunofenotípicas e genéticas. Como os blastos de LLL-T apresentam características similares às de timócitos normais, moléculas envolvidas na migração destas células podem também estar envolvidas na migração ou homing dos linfoblastos no curso da doença. Neste sentido, foi demonstrado recentemente que o receptor 1 de esfingosina-1-fosfato (S1P1) é essencial para a saída de timócitos do timo. No presente estudo, decidimos avaliar a expressão e o papel do S1P1 na migração de quatro linhagens celulares de LLA-T (HPB-ALL, MOLT-4, CEM e JURKAT) em resposta ao seu ligante fisiológico, a esfingosina-1-fosfato (S1P). Observamos que a linhagem HPB-ALL apresentou baixa expressão de RNAm de S1P1, enquanto MOLT-4 e JURKAT apresentaram uma expressão mediana e CEM apresentou altos níveis de expressão de RNAm para este receptor. Em ensaios funcionais de migração celular observamos que a capacidade migratória das linhagens frente a S1P foi diretamente relacionada ao nível de expressão gênica do receptor. A S1P induziu a migração das linhagens analisadas em diferentes concentrações até 100 nM, e inibiu a migração quando aplicada em altas concentrações (1000 nM). As respostas migratórias foram acompanhadas pela modulação do citoesqueleto de actina. Dependendo da concentração de S1P utilizada, observamos polimerização (menores concentrações) ou despolimerização (maiores concentrações) da actina. Além disso, o prétratamento das células com W146 (inibidor de S1P1) bloqueou a migração das linhagens frente à S1P em menores concentrações e induziu a migração frente à S1P em altas concentrações, sugerindo que a migração seja especificamente mediada por S1P1. Nossos resultados sugerem que as interações mediadas por S1P/S1P1 modulam a migração não apenas de precursores de células T normais, mas também de linfoblastos de LLL-T. Desta forma, a interação S1P/S1P1 pode ser considerada como alvo para possíveis estratégias terapêuticas frente a estas neoplasias. / T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and T-cell lymphoblastic lymphoma (TLBL) are malignant proliferations of T cell precursors at different stages of normal development. T-ALL and T-LBL are presently believed to represent two different forms of a single disease, the T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma (T-LLL), as they share morphological, immunophenotypic and genetic features. As T-LLL lymphoblasts present similar characteristics of normal T cell precursors, molecules involved on the migration of these cells might also be associated with migration and homing of T-ALL/LBL. In this context, the sphingosine-1-phosfate receptor 1 (S1P1), has been described as essential for mouse thymocyte migration and thymic egress. Herein, we evaluated the expression and role of S1P1 in four T-ALL cell lines (HPBALL, MOLT-4, CEM e JURKAT) in response to its physiological ligand, the sphingosine-1-phophate (S1P). We observed that HPB-ALL cells presented low expression levels of S1P1 mRNA, whereas MOLT-4 and JURKAT had medium levels and CEM showed high levels of S1P1 expression. In functional migration assays, we observed that the migratory response of the cells towards S1P was directly related with their expression levels of the receptor. S1P induced the migration of the cell lines analyzed in different concentrations up to 100 nM and inhibited cell migration at higher concentrations (1000 nM). Moreover, migratory responses were accompanied by the modulation of actin cytoskeleton. Depending on S1P concentrations, we observed actin polymerization (lower concentrations) or depolymerization (higher concentrations). Pre-treatment of the cells with W146 (a S1P1 inhibitor) blocked S1Pinduced migration at lower concentrations but induced migration towards S1P at high concentrations, suggesting that the migration is specifically mediated by S1P1. Our results suggest that interactions mediated by S1P/S1P1 can modulate cell migration of T-LLL blasts similarly to their normal T cell precursor counterparts. Accordingly, immune intervention upon this ligand/receptor interaction may be envisioned as a potential therapeutic strategy for these malignancies.

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-13T18:26:36Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71836.pdf: 6043659 bytes, checksum: baace5b9e2738bb17390dc3dd95f041d (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-08-24T13:34:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71836.pdf: 6043659 bytes, checksum: baace5b9e2738bb17390dc3dd95f041d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-24T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71836.pdf: 6043659 bytes, checksum: baace5b9e2738bb17390dc3dd95f041d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leucemia/linfoma linfoblástico de células T (LLL-T) é um processo patológico resultante de proliferações malignas de precursores de células T em diferentes estágios de desenvolvimento. Como os blastos de LLL-T apresentam características de precursores de células T normais, moléculas envolvidas na migração destas células podem estar envolvidas da migração e saída de blastos de LLL-T no curso da doença. Nesse sentido, foi descrito que o receptor 1 de esfingosina-1-fosfato (S1P1) é essencial para a saída de timócitos do timo. Nós observamos anteriormente que células de pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) e linfoma linfoblástico de células T (LL-T) expressam o receptor S1P1, assim como três linhagens celulares (MOLT-4, Jurkat e CEM) que representam esta doença. Baixas concentrações de S1P induzem a quimiotaxia destas células, mas não altas concentrações de S1P, e esta migração é dependente do S1P1 e de polimerização de actina. Entretanto nossos dados também indicam que outros receptores de S1P podem estar envolvidos nesse processo. No presente estudo, avaliamos a expressão e o papel dos receptores de S1P na migração de precursores de células T neoplásicas. Nós observamos que as linhagens celulares acima descritas expressam não só S1P1, mas outros receptores de S1P. MOLT-4 expressa preferencialmente S1P1, S1P3 e S1P5, Jurkat expressa S1P1 e S1P3, enquanto CEM expressa todos os receptores de S1P, com exceção de S1P2 Verificamos ainda que altas concentrações de S1P induzem a fugotaxia da célula CEM e que este processo é dependente do S1P1. Em contrapartida, nossos dados mostram que a migração celular induzida por baixas concentrações de S1P induz não só a quimiotaxia, mas também a quimiocinese desta célula. Além disso, observamos que o S1P3, único receptor expresso comumente por estas células, não está envolvido na quimiotaxia dos blastos de LLA-T. S1P ativa ainda as vias de sinalização de AKT e ERK, mas não de Rac1, e a ativação destas vias parece ser mediada pelo S1P1. No entanto, baixas e altas concentrações de S1P ativam estas vias de forma distinta. Altas concentrações de S1P parecem induzir uma ativação mais tardia de AKT e ERK, enquanto uma diminuição na atividade de Rac1 é observada. Nossos dados sugerem que S1P1 regula diferencialmente a migração dos blastos de LLA-T, dependendo da concentração de S1P no meio. Desta forma, a interação S1P/S1P1 deve ser considerada como possível estratégia terapêutica, visando a prevenção da disseminação dos blastos que pode ser resultante da quimiotaxia ou da fugotaxia / T-cell lymphoblastic leukemia and lymphoma (T-LLL) is a pathologic process resulting from malignant proliferations of T-cell precursors at different stages of development. As T-LLL lymphoblasts present similar characteristics of normal T-cell precursors, molecules involved on the migration of these cells might also be associated with migration and homing of T-LLL blasts. In this context, sphingosine-1- phosphate receptor 1 (S1P1) has been described as essential for thymocyte egress from the thymus. We previously observed that patient\2019s cells with T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and T-cell lymphoblastic lymphoma (T-LL) express S1P1, as well as three T-ALL cell lines (MOLT-4, Jurkat, and CEM). Low S1P concentrations induce chemotaxis of T-ALL cell lines, but high S1P concentrations do not. This migration mediated through S1P1 and actin polymerization events. However, our data suggests that other S1P receptors might be involved in this process. Herein, we evaluate the expression and role of S1P receptors in the migration of neoplastic T-cell precursors. We observed that this cell lines expressed not only S1P1, but also other S1P receptors. MOLT-4 preferentially expressed S1P1, S1P3 and S1P5 Jurkat mainly expressed S1P1 and S1P3 and CEM expressed all S1P receptors, except for S1P2. We also verified that high S1P concentrations induced CEM fugetaxis and this process is dependent on S1P1. In contrast, low S1P concentrations induced not only chemotaxis but also chemokinesis. Furthermore, S1P3, the only receptor expressed commonly by these cells lines, was not involved in chemotactic responses. Moreover, S1P activated AKT and ERK signaling pathways, but it was not able to activate Rac1, and activation of these signaling pathways seems to be S1P1-dependent. However, low and high S1P concentrations activated these signaling pathways in different ways. High S1P concentrations activated AKT and ERK later than low S1P concentrations and resulted in decreased Rac1 activity. Together, our results suggest that S1P1 regulates differentially T-ALL blast migration depending on S1P concentrations on the medium. Accordingly, immune intervention upon this ligand/receptor interaction may be envisioned as a potential therapeutic strategy for preventing the spread of blasts, which can result from chemotaxis or fugetaxis process

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-27T11:52:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Vanessa da Silva Brito.pdf: 1550973 bytes, checksum: a932addd006a46862584dd772338e50a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-27T11:52:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Vanessa da Silva Brito.pdf: 1550973 bytes, checksum: a932addd006a46862584dd772338e50a (MD5) / Introdução: O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus linfotrópico, descrito como agente causador da leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) e paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (HAM/TSP). Mesmo nos portadores aparentemente assintomáticos existem evidências de comprometimento funcional da resposta imune celular. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar as subpopulações linfocitárias e células T regulatórias em indivíduos infectados pelo HTLV-1 e comparar as populações de células T (CD4+, CD8+), por dois kits comerciais diferentes disponíveis. Material e Métodos: Este estudo foi aprovado pelo CEP-207/2009CPqGM/FIOCRUZ. Em amostras de sangue periférico de 55 indivíduos infectados com HTLV-1 (soropositivos) e 80 controles (não infectados / HTLV soronegativos), foram quantificados com os reagentes e kits Lymphogram (Cytognos-Espanha) e Tritest (BD-USA), linfócitos T (CD4+, CD8+, CD25+), células NK e linfócitos B, por reagentes de marcação simultânea, e avaliada a expressão de Foxp3 nas células T CD4+CD25+. Resultado: Com os dados analisados, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam valores mais elevados de células T CD4+ e CD8+, redução na frequência de células NK (p<0,05), sem diferença nas células B, quando comparados aos controles. Observa-se uma menor expressão da proteína Foxp3 em células T CD3+CD4+CD25+ de indivíduos infectados pelo HTLV quando comparados aos não infectados/soronegativos (p<0,05). Discussão: Com base nos resultados, pode-se concluir que o Lymphogram® é um método confiável, rápido e de baixo custo para o diagnóstico e monitoramento de linfopatias como a infecção pelo HTLV-1. Conclusão: As análises quantitativas mostraram que indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4+ e CD8+ maior, mantendo a proporcionalidade nas duas células, e valores menores de células NK, quando comparados aos controles não infectados.

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It is estimated that less than 1% of the individuals infected with M. leprae develop the disease. Several authors suggest that the genetic pattern and variations in the mechanisms of the patient's immune response influence the susceptibility or resistance to disease. The most recent studies have established the role of Th1, Th2 and Treg cell responses in immunopathogenesis of leprosy. However, several mechanisms of the immune response that act in clinical evolution still lack clarification, such as the role of Th17 cells, and the innate immune response. The objective of this study was to evaluate the role of the immune response in the clinical presentation of leprosy and the use of M. leprae recombinant antigens as a perspective for the development of prognostic and immunoprophylaxis tools. To investigate the involvement of immune response in the pathogenesis of leprosy, we analyzed the cytokine profile in lesions, in serum, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with M. leprae antigens in leprosy patients and household contactants (HHC). CD4+IL-17+ T cells expressing IL-17A, IFN-γ and IL-10 were evaluated by confocal microscopy in lesions from patients with tuberculoid (TT, n = 09) and lepromatous leprosy (LL, n = 08). Inflammatory cytokines were measured in serum samples from 23 paucibacillary (PB) patients, 28 multibacillary (MB) and 23 HHC, using the Luminex technique. The phenotype of lymphocytes producing IL-17A and IFN-γ was determined by flow cytometry. In addition, PBMC from leprosy patients and HHC were stimulated with crude M. leprae (MLCS) and M. tuberculosis (PPD) and a recombinant antigen of M. leprae (ML2028), and the cytokine profile and the CD4+ and CD8+ multifunctional T cells (producing IFN-γ, IL-2 or TNF-α) of effector and central memory were analyzed. We observed that TT lesions expressed more CD4+IL-17A+ cells than LL. Higher levels of IFN-γ were detected in PB patients, but also in MB patients who presented leprosy reactions (LR) at the time of evaluation (MB LR+). Significantly, higher concentrations of IL-17A and IL-1β were observed in serum from PB than in from MB patients. Ex vivo cell analysis by flow cytometry revealed higher frequency of Th17 cells in TT than LL patients, and it is not high in LL patients with LR. These results indicate that the Th17 cells are associated with an effective inflammatory response that occurs in PB presentation of leprosy but were not associated with the inflammatory response in LR. Th1 response was also associated with PB presentation. However, high levels of IFN-γ were also associated with LR. Multiparameter analyzes by flow cytometry revealed a higher frequency of multifunctional T cells specific for M. leprae antigens in HHC than in leprosy patients, and it might explain the absence of disease in these individuals. These data indicate that these antigens are capable of inducing a more effective immune response and multifunctional T cell memory against M. leprae infection, and open perspectives for the future development of immunoprophylaxis with M. leprae antigens. Additionally, this study suport the attempt to induce a Th1 and Th17 response in individuals at risk of acquiring the disease, even considering this could induce only a partial protection, because it would protect against the most severe MB forms of leprosy, and reduce the disease transmission. This Thesis includes one paper accepted for publication, about the role of Th1 and Th17 cells in subjects with different clinical forms of leprosy, and another paper submitted about the immune response to M. leprae crude and recombinant antigens. / A Hanseníase é uma doença infecciosa crônica e de evolução lenta causada pelo Mycobacterium leprae. A literatura sugere que menos de 1% dos indivíduos infectados pelo bacilo evolui com a doença. O padrão genético dos indivíduos e diferenças nos mecanismos da resposta imune do paciente influenciam na susceptibilidade ou resistência à infecção e apresentação clínica da doença. Os estudos mais recentes estabeleceram o papel das respostas de células Th1, Th2 e Treg na imunopatogênese da hanseníase. No entanto, diversos mecanismos das células Th17 e o papel da resposta imune inata na doença ainda não estão bem estabelecidos. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar o papel da resposta imune na apresentação clínica da hanseníase e o uso de antígenos brutos e recombinante de M. leprae como perspectiva para o desenvolvimento de ferramentas de prognóstico e imunoprofilaxia. Para investigar o envolvimento das células da resposta imune na patogênese da hanseníase, analisamos o perfil de citocinas em lesões, nos soros, e em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com antígenos de M. leprae em pacientes com hanseníase e controles contactantes sadios (CCS). As células T CD4+IL-17+ e que expressam IL-17A, IFN- e IL-10 foram avaliadas por microscopia confocal em biópsias de lesões de pacientes com hanseníase tuberculóide (HT, n = 9) e virchowiana (HV, n = 8). As citocinas inflamatórias foram dosadas em amostras de soro de 23 paucibacilares (PB), 28 multibacilares (MB) e em 23 CCS, pela técnica de Luminex. O fenótipo de linfócitos produtores de IL-17A e IFN-γ foi determinado por citometria de fluxo. Além disso, PBMC de pacientes com hanseníase e de CCS foram estimuladas com os antígenos brutos de M. leprae (MLCS), M. tuberculosis (PPD) e recombinante de M. leprae, (ML2028), e o perfil de citocinas e o fenótipo das células T CD4+ e CD8+ multifuncionais (produtoras de IFN-γ, IL-2 ou TNF-α) de memória efetora e central foram analisados. Observamos que as lesões de HT expressaram mais células CD4+IL-17A+ do que as de HV. Níveis mais elevados de IFN-γ sérico foram detectados em pacientes com as formas HT e em MB que apresentavam reações hansênicas (MB RH+). Concentrações mais elevadas de IL-17A e IL-1β foram observadas nos soros de pacientes PB do que em MB. As análises das células ex vivo por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células Th17 nos pacientes com hanseníase tuberculóide (HT) em comparação com aqueles com hanseníase virchowiana (HV). Estes resultados indicam que a resposta Th17 está associada a uma resposta inflamatória efetiva que se apresenta nas formas PB, mas não estão associadas à resposta inflamatória durante as reações hansênicas. A resposta Th1 também está associada às formas PB, entretanto altos níveis de IFN-γ foram associados também aos episódios de reação hansênica. As análises multiparamétricas por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células T multifuncionais antígeno-específicas em CCS, do que em pacientes com hanseníase. Nossos dados indicam que controles contactantes, quando estimulados com antígenos brutos e com o ML2028 recombinante, produziram mais células T multifuncionais e isto sugere que estas células proporcionam uma resposta imunológica mais eficaz contra a infecção por M. leprae, podendo explicar a ausência de doença nesses indivíduos. Estes dados sugerem que esses antígenos são capazes de induzir uma resposta protetora e indutora de células T multifuncionais de memória e abrem perspectivas para o desenvolvimento futuro de imunoprofilaxia com estes antígenos de M. leprae. Além disso, o estudo dá suporte à busca de induzir uma resposta Th1 e Th17 em indivíduos em risco de adquirir a doença, mesmo que haja uma proteção parcial, pois neste caso haveria uma proteção contra formas mais graves MB, e reduziria também a transmissão da doença. Esta tese é composta por um artigo aceito para publicação sobre a resposta de células Th17 e Th1 nas formas clínicas da hanseníase e outro submetido sobre a resposta a antígenos recombinantes de M. leprae na indução de células T multifuncionais.

A hanseníase é uma doença crônica causada por Mycobacterium leprae e apresenta diversas formas clínicas. O entendimento da interação parasita-hospedeiro na hanseníase evidenciou que ocorre a persistência assintomática do patógeno, caracterizando um estado de latência. Os fatores mais importantes relacionados com a permanência do patógeno são: a patogenicidade do agente infeccioso e o perfil da resposta imune, no qual os eventos de migração celular, produção de citocinas, as células efetoras e reguladoras são extremamente relevantes. As células T reguladoras (Treg) desempenham papel central na regulação da resposta imune em infecções crônicas o que favorece a persistência do patógeno. A importância de células T reguladores na hanseníase ainda é pouco conhecida. Neste trabalho investigou-se a presença de células T reguladoras em lesões e sangue periférico de indivíduos com hanseníase. Inicialmente avaliou-se a proliferação e a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes com hanseníase. Os resultados evidenciaram que não há diferenças quanto à proliferação de células T e produção de IFN-&#947; e TNF-&#945; por células desses pacientes, mas a produção de IL-4 e IL-5 foi detectada apenas entre os pacientes com hanseníase virchoviana. Em relação à presença de células T reguladoras, os resultados evidenciaram aumento no número de linfócitos T CD4+CD25+FoxP3+ no sangue periférico de pacientes com hanseníase virchoviana. As células T reguladoras dos pacientes com hanseníase apresentaram elevada expressão de moléculas co-inibitórias PD-1, CTLA-4, GITR e ICOS. De modo relevante, as células T CD4+CD25+ isolados de pacientes com hanseníase virchoviana apresentaram maior atividade supressora quando comparado às células isoladas de pacientes com hanseníase tuberculóide. As células T CD4+CD25+ de pacientes com hanseníase virchoviana inibiram a proliferação de PBMC alogênico e a produção de IFN-&#947; e TNF-&#945;. Os resultados demonstraram também que nas amostras de lesão de pele de pacientes com hanseníase virchoviana há acúmulo de células CD25+ produtoras de IL-10 e TGF-&#946;, enquanto que estas células não foram detectadas nas lesões de pacientes com hanseníase tuberculóide. Dessa forma, os resultados descritos indicam que pacientes com hanseníase virchoviana apresentam aumento no número de células T reguladoras circulantes e no infiltrado inflamatório, e estas células apresentaram maior atividade supressora. O acúmulo de células T reguladoras no sítio da infecção pode ser correlacionado com o controle da resposta imune e conseqüente persistência de M. leprae. / Leprosy is caused by Mycobacterium leprae and its clinical features depend on the host immune background. The understanding of parasite-host interactions in leprosy have highlighted asymptomatic persistence of the pathogen, which indicates that this infection becomes latent. The most important factors related to the permanence of pathogens are: the pathogenicity of the infectious agents; the profile of the immune response developed by the host whose events of cellular migration, cytokines production, and the effector and regulatory cells are extremely relevant. The regulatory T cells (Treg) seem to play a central role in the regulation of the immune response in chronic infections, which favors the persistence of the pathogen. Herein, we analyzed the relation between tuberculoid and lepromatous leprosy with the presence and function of T regulatory cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and skin lesions from these patients. First, the proliferation and cytokine production of PBMC isolated from leprosy patients were analyzed. We did not observe any difference in the proliferation ability or IFN-&#947; and TNF-&#945; release; however, the production of IL-4 and IL-5 was detected only in patients with lepromatous leprosy. Furthermore, T CD4+CD25+FoxP3+ cells were detected in the PBMC of patients with leprosy and these cells from lepromatous patients showed high expression of co-inhibitory molecules such as PD-1, GITR, CTLA-4 and ICOS. T CD4+CD25+cells isolated from patients with lepromatous leprosy were significantly more suppressive than the cells obtained from tuberculoid patients. In addition, TCD4+CD25+ cells isolated from patients with lepromatous leprosy inhibited allogeneic PBMC proliferation and their production of IFN-&#947; and TNF-&#945;. The results also demonstrated that IL- 10 and TGF-ß were co-expressed with CD25+ cells at the inflammatory infiltrate of skin lesions from lepromatous patients, but similar results were not detected among tuberculoid patients. Thus, these results indicate that lepromatous leprosy patients have an enhanced presence of Treg cells with a suppressive ability in the blood and in the inflammatory infiltrate. The accumulation of Treg cells at the infection sites might be associated to the control of immune response and consequently to Mycobacterium leprae presistence.

As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígeno do sistema imune. No entanto, trabalhos têm demonstrado seu envolvimento na manutenção da tolerância imunológica. As células T CD4+CD25+Foxp3+ possuem a capacidade de suprimir respostas imunes. Neste estudo avaliamos as alterações ocorridas na população de células T CD4+CD25+Foxp3+ após co-cultura de células de linfonodo com DCs. Nossos resultados demonstram que após a co-cultura há um aumento da população de células CD4+CD25+Foxp3+ de maneira independente do estado de ativação das DCs ou da presença de antígenos exógenos. No entanto, o aumento observado é maior quando DCs imaturas são incubadas com antígenos exógenos. Notamos ainda que há presença de TGF-ß em todas as condições experimentais em que observamos aumento da população de células CD4+CD25+Foxp3+. Nossos dados sugerem ainda que este aumento se deve à proliferação das células T CD4+CD25+Foxp3+. / Dendritic cells (DCs) are the most important antigen-presenting cells of the immune system. However, DCs have also been implicated in maintaining immunologic tolerance. CD4+CD25+Foxp3+ T lymphocytes are known as cells with regulatory properties. In this study we evaluated the changes in the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population after co-culture of lymph-node cells with DCs. Our results show an increase in the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population after co-culture and occurs regardless of the activation state of DCs and the presence of exogenous antigens; however it is greater when immature DCs are previously pulsed with exogenous antigen. We also noticed that TGF-? is present in all cultures conditions in which the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population increases. Our data also suggests that the increase of the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population may be due to the proliferation of these cells.

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It is estimated that less than 1% of the individuals infected with M. leprae develop the disease. Several authors suggest that the genetic pattern and variations in the mechanisms of the patient's immune response influence the susceptibility or resistance to disease. The most recent studies have established the role of Th1, Th2 and Treg cell responses in immunopathogenesis of leprosy. However, several mechanisms of the immune response that act in clinical evolution still lack clarification, such as the role of Th17 cells, and the innate immune response. The objective of this study was to evaluate the role of the immune response in the clinical presentation of leprosy and the use of M. leprae recombinant antigens as a perspective for the development of prognostic and immunoprophylaxis tools. To investigate the involvement of immune response in the pathogenesis of leprosy, we analyzed the cytokine profile in lesions, in serum, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with M. leprae antigens in leprosy patients and household contactants (HHC). CD4+IL-17+ T cells expressing IL-17A, IFN-γ and IL-10 were evaluated by confocal microscopy in lesions from patients with tuberculoid (TT, n = 09) and lepromatous leprosy (LL, n = 08). Inflammatory cytokines were measured in serum samples from 23 paucibacillary (PB) patients, 28 multibacillary (MB) and 23 HHC, using the Luminex technique. The phenotype of lymphocytes producing IL-17A and IFN-γ was determined by flow cytometry. In addition, PBMC from leprosy patients and HHC were stimulated with crude M. leprae (MLCS) and M. tuberculosis (PPD) and a recombinant antigen of M. leprae (ML2028), and the cytokine profile and the CD4+ and CD8+ multifunctional T cells (producing IFN-γ, IL-2 or TNF-α) of effector and central memory were analyzed. We observed that TT lesions expressed more CD4+IL-17A+ cells than LL. Higher levels of IFN-γ were detected in PB patients, but also in MB patients who presented leprosy reactions (LR) at the time of evaluation (MB LR+). Significantly, higher concentrations of IL-17A and IL-1β were observed in serum from PB than in from MB patients. Ex vivo cell analysis by flow cytometry revealed higher frequency of Th17 cells in TT than LL patients, and it is not high in LL patients with LR. These results indicate that the Th17 cells are associated with an effective inflammatory response that occurs in PB presentation of leprosy but were not associated with the inflammatory response in LR. Th1 response was also associated with PB presentation. However, high levels of IFN-γ were also associated with LR. Multiparameter analyzes by flow cytometry revealed a higher frequency of multifunctional T cells specific for M. leprae antigens in HHC than in leprosy patients, and it might explain the absence of disease in these individuals. These data indicate that these antigens are capable of inducing a more effective immune response and multifunctional T cell memory against M. leprae infection, and open perspectives for the future development of immunoprophylaxis with M. leprae antigens. Additionally, this study suport the attempt to induce a Th1 and Th17 response in individuals at risk of acquiring the disease, even considering this could induce only a partial protection, because it would protect against the most severe MB forms of leprosy, and reduce the disease transmission. This Thesis includes one paper accepted for publication, about the role of Th1 and Th17 cells in subjects with different clinical forms of leprosy, and another paper submitted about the immune response to M. leprae crude and recombinant antigens. / A Hanseníase é uma doença infecciosa crônica e de evolução lenta causada pelo Mycobacterium leprae. A literatura sugere que menos de 1% dos indivíduos infectados pelo bacilo evolui com a doença. O padrão genético dos indivíduos e diferenças nos mecanismos da resposta imune do paciente influenciam na susceptibilidade ou resistência à infecção e apresentação clínica da doença. Os estudos mais recentes estabeleceram o papel das respostas de células Th1, Th2 e Treg na imunopatogênese da hanseníase. No entanto, diversos mecanismos das células Th17 e o papel da resposta imune inata na doença ainda não estão bem estabelecidos. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar o papel da resposta imune na apresentação clínica da hanseníase e o uso de antígenos brutos e recombinante de M. leprae como perspectiva para o desenvolvimento de ferramentas de prognóstico e imunoprofilaxia. Para investigar o envolvimento das células da resposta imune na patogênese da hanseníase, analisamos o perfil de citocinas em lesões, nos soros, e em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com antígenos de M. leprae em pacientes com hanseníase e controles contactantes sadios (CCS). As células T CD4+IL-17+ e que expressam IL-17A, IFN- e IL-10 foram avaliadas por microscopia confocal em biópsias de lesões de pacientes com hanseníase tuberculóide (HT, n = 9) e virchowiana (HV, n = 8). As citocinas inflamatórias foram dosadas em amostras de soro de 23 paucibacilares (PB), 28 multibacilares (MB) e em 23 CCS, pela técnica de Luminex. O fenótipo de linfócitos produtores de IL-17A e IFN-γ foi determinado por citometria de fluxo. Além disso, PBMC de pacientes com hanseníase e de CCS foram estimuladas com os antígenos brutos de M. leprae (MLCS), M. tuberculosis (PPD) e recombinante de M. leprae, (ML2028), e o perfil de citocinas e o fenótipo das células T CD4+ e CD8+ multifuncionais (produtoras de IFN-γ, IL-2 ou TNF-α) de memória efetora e central foram analisados. Observamos que as lesões de HT expressaram mais células CD4+IL-17A+ do que as de HV. Níveis mais elevados de IFN-γ sérico foram detectados em pacientes com as formas HT e em MB que apresentavam reações hansênicas (MB RH+). Concentrações mais elevadas de IL-17A e IL-1β foram observadas nos soros de pacientes PB do que em MB. As análises das células ex vivo por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células Th17 nos pacientes com hanseníase tuberculóide (HT) em comparação com aqueles com hanseníase virchowiana (HV). Estes resultados indicam que a resposta Th17 está associada a uma resposta inflamatória efetiva que se apresenta nas formas PB, mas não estão associadas à resposta inflamatória durante as reações hansênicas. A resposta Th1 também está associada às formas PB, entretanto altos níveis de IFN-γ foram associados também aos episódios de reação hansênica. As análises multiparamétricas por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células T multifuncionais antígeno-específicas em CCS, do que em pacientes com hanseníase. Nossos dados indicam que controles contactantes, quando estimulados com antígenos brutos e com o ML2028 recombinante, produziram mais células T multifuncionais e isto sugere que estas células proporcionam uma resposta imunológica mais eficaz contra a infecção por M. leprae, podendo explicar a ausência de doença nesses indivíduos. Estes dados sugerem que esses antígenos são capazes de induzir uma resposta protetora e indutora de células T multifuncionais de memória e abrem perspectivas para o desenvolvimento futuro de imunoprofilaxia com estes antígenos de M. leprae. Além disso, o estudo dá suporte à busca de induzir uma resposta Th1 e Th17 em indivíduos em risco de adquirir a doença, mesmo que haja uma proteção parcial, pois neste caso haveria uma proteção contra formas mais graves MB, e reduziria também a transmissão da doença. Esta tese é composta por um artigo aceito para publicação sobre a resposta de células Th17 e Th1 nas formas clínicas da hanseníase e outro submetido sobre a resposta a antígenos recombinantes de M. leprae na indução de células T multifuncionais.

A indução de tolerância ao aloenxerto, no contexto do transplante clínico, é um dos maiores desafios da imunologia. Existem pacientes transplantados que mesmo após a retirada de imunossupressores mantêm a função estável do aloenxerto. Este estado é chamado de tolerância operacional. Nosso objetivo foi analisar se os indivíduos em tolerância operacional tem um perfil imunológico molecular diferencial em relação aos outros grupos clínicos, visando identificar potenciais mecanismos envolvidos na manutenção desse estado de não agressão ao órgão transplantado. Analisamos 10 doadores renais saudáveis (Sau) e 32 indivíduos transplantados renais, sendo 4 tolerantes operacionais (TO), 11 com rejeição crônica (RC), 12 com função renal estável e imunossupressão convencional (Est) e 5 com função renal estável e baixa imunossupressão (BI). Analisamos a expressão gênica, em células mononucleares do sangue, de um painel de moléculas predominantemente imunorreguladoras ou próinflamatórias (REGULA/INFLAMA), por PCR em tempo real, em duas amostras, com intervalos de 4-6 meses. Quantificamos as células T CD4+CD25+Foxp3+, por citometria de fluxo, e estudamos a ativação de duas vias de sinalização, IL-6/STAT3 e IL-4/STAT6, por PhosFlow, nos diferentes grupos de estudo. Nós observamos algumas diferenças significativas entre os indivíduos TO e os outros grupos de estudo, (p<0,05). A expressão dos genes de TGF- e TGF-R foi maior no grupo de indivíduos TO em comparação aos grupos Est e BI, analisando-se 2 tempos distintos. A expressão de GATA-3 foi maior no grupo TO comparado a todos os outros grupos de estudo. A expressão gênica de Foxp3 foi maior no grupo TO comparado aos grupos RC e BI, apenas quando analisamos as 2 amostras. Neste painel REGULA/INFLAMA, o grupo TO teve um predomínio de modificações do tipo REGULA, em ambos os tempos estudados, e maior estabilidade na expressão gênica entre as 2 amostras. Em relação as células T CD4+CD25+Foxp3+, os grupos RC e Est tiveram menores números absolutos e porcentagens em comparação aos outros grupos. O grupo TO teve uma quantidade dessas células semelhantes aos grupos Sau e BI. No estudo das vias de sinalização observamos que a fosforilação de STAT6, na região de monócitos, foi menor em indivíduos TO quando comparada a todos os outros grupos estudados. O painel de moléculas REGULA/INFLAMA, utilizado neste estudo, permitiu determinar um perfil imunológico molecular com características predominantemente imunorreguladoras no grupo TO. O perfil de fosforilação da via de sinalização IL-4/STAT6 nos indivíduos TO, na região de monócitos, nos permite interpretar que essas vias sejam mobilizadas de forma diferente, podendo participar deste estado de não agressão ao enxerto. A redução de células T CD4+CD25+Foxp3+ nos indivíduos com imunossupressão convencional (grupos RC e Est) nos permite interpretar que a imunossupressão afeta essa população celular, potencialmente imunorreguladora. O maior número de células T CD4+CD25+Foxp3+, nos indivíduos TO e BI nos permite sugerir que essas células tenham um papel importante no estado de tolerância operacional. Também o fator de transcrição GATA-3 parece desempenhar um importante papel na indução/manutenção do estado de TO, sugerindo que um desvio Th2 seja relevante para a manutenção deste estado. Os nossos resultados nos permitem interpretar que o estado de tolerância operacional tem uma repercussão sistêmica e que essas moléculas parecem ser relevantes e talvez dominantes neste estado de homeostase no contexto do transplante renal humano. / standard immunosuppression, lead us to suggest that these cells may be affected by immunosuppression. Moreover, the higher numbers of CD4+CD25+Foxp3+ T cells observed in TO and BI individuals suggest that these cells may have an important role in the induction/maintenance of these two homeostatic states of minimal, or of no aggression to the graft. Furthermore, the higher mRNA expression of GATA-3, in the TO group, suggests that a Th2 deviation may also be relevant to the maintenance of operational tolerance. Our results allowed us to interpret that the state of operational tolerance has systemic repercussion, and that the molecules studied in our work may be relevant to the process of homeostasis in the context of human kidney transplantation.

As células T Natural Killer (NKT) são linfócitos que expressam o rearranjo V24V11 com TCR invariante e reconhecem glicolipídeos como o alfagalactosilceramida (-GalCer) apresentado no contexto da molécula MHC-não clássica chamada CD1d. As NKT são divididas em subgrupos distintos: os fenótipos CD4+ e CD4- em camundongos e humanos, e CD8+ e CD4-CD8- em humanos. Após estímulo, as NKT secretam citocinas Th1 e Th2. A frequência das NKT representa menos de 1% da população de linfócitos T no sangue periférico humano. O objetivo deste trabalho é primeiro, identificar a frequência, o fenótipo e a função da população de células NKT nos grupos de indivíduos saudáveis de procedências distintas. Segundo, avaliar a influência da idade, gênero e país de moradia na frequência das NKT, incluindo suas subpopulações, no sangue periférico; Terceiro, verificar se há variabilidade ou não na apresentação da molécula CD1d. Quarto, verificar se há alteração na função das NKT utilizando o estímulo -GalCer e por fim, verificar o perfil das NKT quanto ao seu estado de ativação e migração celular quando submetidas a expansão. As amostras são provenientes de São Paulo, Brasil; São Francisco, Estado Unidos da América e Estocolmo, Suécia. Os parâmetros imunológicos foram analisados por citometria de fluxo. Demonstramos que o grupo de São Paulo, não apresentou maiores valores de linfócitos T CD3+, no entanto, apresentou valores significantes de células NKT V24+/V11+. Não estabelecemos a expressão dos marcadores de ativação e migração nas NKT. Estabelecemos, no grupo de São Paulo, a capacidade funcional das NKT que expressaram IFN- e TNF- assim como de expansão, sob estímulo de -GalCer. Os resultados sugerem que vários fatores podem alterar a quantidade das células NKT na periferia. Mais estudos devem ser endereçados para esclarecer melhor estes fatos / Natural Killer T cells (NKT cells) are lymphocytes that express the invariant TCR rearrangement V24V11 and recognize glycolipid as alpha-galactosylceramide (-GalCer) presented in conjunction with a non-MHC pathway molecule named CD1d. The NKT cells are divided into distinct subsets: the CD4+ and CD4- phenotype in mice and humans and the CD8+ and CD4-CD8- phenotype in humans. After stimulation, the NKT secrete Th1 and Th2 cytokines. The frequencies of NKT cells represent <1% of the population of T lymphocytes in human peripheral blood. The objective of this study is to 1) identify the frequency, phenotype and function of NKT cell population in groups of healthy individuals from different racial/ethnic origins, 2) evaluate the influence of age, gender and country of residence on the frequency of NKT cells/subpopulations, 3) investigate the variability of presentation of the CD1d molecule, 4) investigate the functional variability of NKT cells using -GalCer stimulation, and 5) study the activation and migration profile of NKT cells after expansion. Immunologic parameters of clinical samples from Sao Paulo, Brazil; San Francisco, California and Stockholm, Sweden were analyzed by flow cytometry. We demonstrate that the São Paulo group does not have an elevated number of CD3+ T lymphocytes, but does have significantly more NKT V24+/V11+ cells. We have not yet determined expression of NKT markers for activation and migration. Thus, we have shown that among sample obtained in São Paulo, there is increased functional capacity of IFN- and TNF--expressing NKT cells along with NKT cells expansion under stimulation with the -GalCer. These results suggest that there are several factors that can modulate NKT cell number and function in the peripheral blood and additional studies are needed to further clarify these findings