O fator esteroidogênico 1 (SF-1) é um fator de transcrição envolvido no desenvolvimento, na produção de esteroides e na proliferação do córtex adrenal. POD-1/TCF21 parece estar envolvido na regulação de SF-1, inibindo sua expressão e suas funções nas células esteroidogênicas. No entanto, a expressão e a relação entre SF-1 e POD-1 em células normais adrenocorticais não está esclarecida. O objetivo desse trabalho foi determinar se Pod-1 regula a expressão de Sf-1 através da hiperexpressão de Pod-1 em culturas primárias de células adrenocorticais de rato. Foi analisada a expressão endógena de Sf-1 e Pod-1, através da reação de RT-PCR quantitativo, em células glomerulosas (G) e células fasciculadas/reticulares (F/R), bem como em células transfectadas com pCMVMycPod-1. Os resultados mostraram que Sf-1 está mais expresso nas células F/R do que nas células G e ambos os tipos celulares apresentaram baixa expressão endógena de Pod-1. As células F/R transfectadas apresentaram um aumento estatisticamente significante da expressão de Sf-1, mas não as células G. Esses resultados sugerem um mecanismo de ação de Pod-1 no controle da expressão de Sf-1 em células adrenocorticais normais distinto do descrito em células de tumores adrenais e células esteroidogênicas. / The steroidogenic factor 1 (SF-1) is a transcription factor involved in the development, steroids production and adrenal cortex proliferation. There are evidences that suggest that POD-1/TCF21 may be involved in the inhibition of SF-1 and modulating the SF-1 function in steroidogenic cells. However, the expression and the relation between SF-1 and POD-1 in normal adrenocortical cells are still unclear. The aim of this study was to determine whether Pod-1 regulates the expression of Sf-1 by overexpression of Pod-1 in primary cell cultures of rat adrenal cortex. We analyzed the expression of endogenous Sf-1 and Pod-1 by RT-PCR quantitative in glomerulosa (G) and fasciculata/reticularis (F/R) cells and also in cells transfected with plasmid CMVMycPod-1. The results showed that the SF-1 expression is higher in F/R cells than the G cells. Moreover, both cell types showed low endogenous expression of Pod-1. Analysis of Sf-1 expression in transfected cells showed a statistically significant increase in the Sf-1 expression in F/R cells but not in G cells. These results suggest a mechanism of action of Pod-1 in the regulation of Sf-1 in normal cells distinct of described in adrenocortical tumor cells and other steroidogenic cells.

Carcinoma adenóide cístico é uma neoplasia maligna de glândula salivar com alto grau de recorrência e metástase. Células tumorais que invadem tecidos subjacentes formam invadopódios, protrusões de membrana ricas em actina, cortactina e MT1-MMP capazes de degradar a matriz extracelular (MEC). Proteólise de moléculas da MEC, como a laminina, promove liberação de fragmentos e peptídeos bioativos. Nesse trabalho, estudamos o papel dos peptídeos AG73 e C16, da laminina-111, na atividade de invadopódios de células derivadas de carcinoma adenóide cístico (CAC2). Nossos resultados mostram que AG73 e C16 regulam atividade de invadopódio e aumentam a expressão de MT1-MMP em células CAC2. Silenciamento da integrina <font face=\"Symbol\">b1 e inibição da via ERK diminuem a atividade de invadopódio induzida por esses peptídeos. Já a inibição da via Rac diminui a atividade de invadopódios induzida apenas por AG73. Propomos que os peptídeos AG73 e C16 regulariam a atividade de invadopódios através da integrina <font face=\"Symbol\">b1 e da via ERK 1/2. Já a via Rac1 transduziria sinais gerados apenas pelo peptídeo AG73. / Adenoid cystic carcinoma is a frequently occurring malignant salivary gland neoplasm with high level of recurrence and metastasis. Tumor cells that invade surrounding tissues rely on invadopodia to degrade extracellular matrix (ECM). Invadopodia are actin and cortactin-rich membrane protrusions that localize MT1-MMP required for ECM degradation. Breakdown of ECM molecules, such as laminins, releases fragments and bioactive peptides. Here we addressed the role of laminin-111 peptides AG73 and C16 in invadopodia activity of cells derived from human adenoid cystic carcinoma (CAC2). Our results show that AG73 and C16 increase invadopodia activity and MT1-MMP expression in CAC2 cells. Silencing of <font face=\"Symbol\">b1 integrin and ERK pathway inhibition decrease AG73 and C16-induced invadopodia. Rac1 pathway inhibition decreases only AG73-induced invadopodia formation. We propose that AG73 and C16 increase invadopodia activity in CAC2 cells through <font face=\"Symbol\">b1 integrin. ERK1/2 pathway would transduce signals generated by both peptides, while Rac1 pathway is related to AG73 signaling.

Gliomas são tumores do sistema nervoso central e o glioblastoma multiforme (GBM) é sua forma mais comum e de pior prognóstico. A proliferação desordenada, migração estão entre os processos biológicos que conferem ao GBM um comportamento altamente agressivo. O objetivo deste estudo foi analisar in vitro o papel de PGE2 na proliferação, migração e apoptose da linhagem de glioma humano T98G através de tratamento com ácido gama-linolênico (GLA), Ibuprofeno (IBU) e adição de prostaglandina E1 (PGE1) e prostaglandina E2 (PGE2) exógeno. Nossos resultados demonstraram através uma diminuição nas taxas de proliferação e de migração e uma indução de apoptose nas células T98G tratadas com GLA ou IBU. Por outro lado, a adição exógeno de PGE1 ou PGE2 resultou num aumentou da proliferação e da migração e numa inibição da apoptose. Esses resultados demonstram a influência de PGE2 na linhagem T98G. / Gliomas are tumors of the central nervous system and glioblastoma multiforme (GBM) is the most common form with the worst prognosis. Uncontrolled cell proliferation, migration are among the biological processes that give GBM a highly aggressive behavior. The aim of this study was to analyze in vitro the role of PGE2 the proliferation, migration and apoptosis of the T98G human glioma cell line through treatment with gamma-linolenic acid (GLA), ibuprofen (IBU) and the addition of exogenous prostaglandin E1 (PGE1) and prostaglandin E2 (PGE2). Our results demonstrated through various tests a decrease in the rates of proliferation and migration and an induction of apoptosis in T98G cells treated with GLA or IBU. On the other hand, the addition of exogenous PGE1 or PGE2 resulted in increased proliferation and migration and inhibition of apoptosis. These results demonstrate the influence of PGE2 in the T98G cell line.

No presente trabalho, desenvolvemos uma estratégia vacinal baseada em vacinas de DNA que codificam proteínas do HPV-16, o tipo viral de maior relevância epidemiológica, fusionadas à glicoproteína D (gD) do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). A vacina que contêm o gene da E7 de HPV-16 fusionada à gD de HSV-1 (pgDE7), administrada em regime vacinal de quatro doses, foi capaz de gerar significativa ativação de células T CD8+ E7-específicas e apresentar 40% de efeito protetor anti-tumoral terapêutico em camundongos desafiados com células transformadas que expressam as proteínas E6 e E7 do HPV-16 (células TC-1). A partir das evidências geradas, desenvolvemos um novo vetor vacinal que codifica as proteínas E7, E6 e E5 do HPV-16 (pgD-E7E6E5). Em ensaios em modelo murino, apenas uma dose da vacina foi capaz de gerar ativação de células T CD8+ específicas e 70% dos camundongos previamente desafiados com células TC-1 e inoculados com 3 doses da vacina mantiveram-se livres de tumores. Como tentativa de potencializar o efeito protetor terapêutico encontrado, adotamos duas medidas: a co-administração de plasmídeos que codificam citocinas e a otimização de códons da sequência gênica que codifica a proteína quimérica. A combinação das vacinas pgDE7 ou pgD-E7E6E5 com plasmídeos que carregam os genes das citocinas IL-2, IL-12 ou GM-CSF foi capaz de aumentar a proteção terapêutica para 100% em regime vacinal de dose única. A adequação da sequência antigênica ao sistema de expressão humano, aumentou em cerca de 5 vezes o potencial terapêutico do vetor vacinal pgDE7. Em conjunto, os dados apresentados nesta tese demonstram a evolução do desenvolvimento de uma estratégia vacinal contra tumores induzidos por HPV-16 e encorajam seu potencial para uso em futuros ensaios clínicos. / The development of immunotherapeutic strategies against human papillomavirus (HPV) is a priority for the control of HPV-induced lesions and cervical cancer. In this study, we developed DNA vaccines encoding HPV-16 proteins fused to glycoprotein D (gD) of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) as an approach to control HPV-16 induced tumors. The vaccine encoding HPV-16 E7 fused to HSV-1 gD (pgDE7), when administered in a four doses vaccine regimen, was able to generate significant activation of E7-specific CD8+ T cells and showed 40% of therapeutic anti-tumor effect in mice previously challenged with tumor cells expressing HPV-16 E6 and E7 proteins (TC-1 cells). Following these evidences, we developed a new vaccine vector encoding HPV-16 E7, E6, E5 proteins fused to HSV-1 gD (pgD-E7E6E5). Only one vaccine dose generated antigen-specific CD8+ T cell responses and three doses conferred 70% protection to mice previously challenged with TC-1 cells. As an attempt to enhance the observed therapeutic anti-tumor effects, we tested two approaches: co-administration of cytokine-expressing plasmids and codon optimization of the gene encoding the chimeric protein. The combination of the vaccines pgDE7 or pgD-E7E6E5 with plasmids encoding the cytokines IL-2, IL-12 or GM-CSF increased the therapeutic protection to 100% of the vaccinated animals following a single dose. The gene sequence adaptation increased by a factor of 5 the therapeutic potential of the pgDE7 vaccine. In summary, the data presented in this thesis demonstrated the development of a vaccine strategy against HPV-16 induced tumors and reinforces its potential use in future clinical trials.

Problemas reprodutivos ocorrem no hipo e no hipertireoidismo, mas pouco se conhece a respeito das bases moleculares destas alterações. Avaliou-se o efeito da administração de triiodotironina na atividade do gonadotrofo em ratos Wistar tireoidectomizados. O hipotireoidismo ocasionou elevação no TSH e do LH sérico, aumento do conteúdo do mRNA e redução do conteúdo protéico do LH e do FSH, redução da cauda poli (A), redução da testosterona e do FSH séricos, redução da expressão do receptor de LH, aumento da expressão do receptor de andrógenos testiculares e epididimais. O tratamento com T3 acarretou a diminuição do mRNA e aumento do conteúdo protéico de LH, aumento do FSH sérico, diminuição do conteúdo do mRNA e aumento do conteúdo protéico do FSH, aumento da expressão do receptor de LH, redução da expressão de receptores de andrógenos testiculares e epididimais. Esses resultados sugerem que o T3 age na modulação da função do gonadotrofo e na modulação da expressão dos receptores em tecidos-alvo. / Reproductive disorders occur in hypo and hyperthyroidism, but little is known about the molecular basis of these alterations. The effect of administration of triiodothyronine (T3) on the activity of gonadotropes in thyroidectomyzed male Wistar rats was evaluated. Hypothyroidism caused increased on TSH and LH serum concentrations, increased of mRNA content and decreased in protein content of LH and FSH, reduction in the length of poli(A) tail of LH, reduction in testosterone and FSH serum concentrations, reduction in the expression of LH receptor, increased in the expression of androgen receptors in the testis and epididymis. T3 treatment caused reduction on mRNA and increased on mRNA of LH and FSH, increased serum FSH, increased the expression of LH receptor, and reduction of the expression of androgen receptors in the testis and epididymis. These results suggest that T3 modulates the function of gonadotrope and the expression of the receptors in target-tissues.

No processo de metástase os movimentos de migração e invasão tem um papel essencial e em ambos a função dos microfilamentos é de grande importância. Neste contexto, o presente trabalho buscoui analisar os efeitos da droga jaspamídeo e após a determinação das concentrações de IC50 para as linhagens HT144 e NGM foram estudados os efeitos da droga. Os tratamentos mostraram que o fármaco atua desorganizando o citoesqueleto de modo dependente de sua concentração. Os ensaios de ferida mostraram diminuição da taxa de fechamento da área livre após os tratamentos e os ensaios de migração com placas de transwell mostraram que os grupos tratados sofrem aumento desse parâmetro. Nos ensaios de invasão com câmara de Boyden o tratamento mostrou-se efetivo apenas para a célula NGM quando tratadas com 75 nM de jaspamídeo e 30 <font face=\"Symbol\">mM de Y-27632. Quanto à migração, a linhagem NGM não completava este processo quando tratada com as concentrações do IC50 e do IC50/2 acrescido de Y-27632 e a linhagem HT144 apresenta aumento deste parâmetro quando tratado com jaspamídeo e 200 <font face=\"Symbol\">mM de NSC23766. / Many signaling ways are involved in metastasis and the cellular migration and invasion are important in this context. The role of microfilaments is essential in mesenchymal and amoeboid migration. In this context, the present work aimed to analyze the effects of the drug jaspamide and. after the determination of the IC50 concentrations for the HT144 and NGM cell lines, the effects of the treatment with jaspamide were studied. The wound assays indicated a decrease in the free area after the treatments, and the migration assays with transwell showed that, after the inoculation with the drug, the cells increased the process of migration. In the invasion assays with Boydens chamber, the treatment with jaspamide was effective only in NGM cells, when they are treated with 75 nM of the drug plus 30 <font face=\"Symbol\">mM of Y-27632. Regarding the migration process, the NGM cell line did not show movement when treated with the IC50 concentration and the IC50/2 concentration plus Y-27632, and the HT144 cell line increases this parameter when treated with jaspamide and 200 <font face=\"Symbol\">mM of NSC23766.

A maioria dos tumores sólidos apresentam características aneuplóides. Porém a relação entre aneuploidia e transformação maligna, ainda não está definida. Nos últimos anos diversas proteínas têm sido descritas como reguladoras de eventos durante a divisão celular, principalmente as relacionadas com a formação do fuso bipolar e segregação equacional dos cromossomos. Neste estudo propomo-nos a analisar os efeitos da interferência em dois pontos críticos da mitose, a segregação cromossômica e a citocinese, em relação à aneuploidia e à instabilidade genética tumoral. Nossos dados mostraram que o tratamento sequencial de Monastrol e Blebistatina determinou o surgimento de fusos mitóticos anormais, amplificação centrossômica, localização ectópica de Aurora A e aumento de micronúcleos. Esta interferência pode levar a um quadro de instabilidade genética e, consequentemente a progressão tumoral, abrindo novas possibilidades para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação do ponto de checagem mitótico e resistência a quimioterápicos. / Most solid tumors have aneuploid feature. Therefore the relationship between aneuploidy and malignant transformation is not yet understood. In the last years it has been described many proteins involved in regulation of mitosis, mainly those related to bipolar spindle and chromosome segregation. In this work we propose to study the effects of the interference on two mitotic critical points, the chromosome segregation and cytokinesis, in relation to aneuploidy and genetic tumor instability. Our data showed that sequential treatment with Monastrol and Blebbistatin led to abnormal mitotic spindle, centrosome amplification, Aurora A ectopic and micronucleus increased. This interference can lead to genetic instability and may be involved in a tumor progression, opening news possibilities to study the molecular mechanisms involved in regulation the checkpoint mitotic and resistance to chemotherapy found in genetically unstable cells.

O câncer cervical é o terceiro tipo de câncer mais comum entre as mulheres, sendo a infecção por HPV16 o principal fator de risco para sua etiopatogênese. Neste trabalho avaliamos o potencial profilático e terapêutico da vacina proteica E6E7, constituída de epítopos imunogênicos de E6 e E7 do HPV16, com ou sem Ubiquitina (Ub) fusionada (E6E7Ub e UbE6E7), contra tumor de células TC-1. A vacina E6E7 conferiu total proteção contra a formação de tumores em animais C57BL/6 selvagens, CD4 nocautes e TLR4 deficientes previamente imunizados e posteriormente desafiados com células TC-1. Entretanto, em animais imunizados após desafio, a fusão da Ub no antígeno E6E7 foi crucial para a vacina promover a regressão do tumor em 60% dos animais. Além da fusão da Ub na extremidade N-terminal do antígeno (UbE6E7) aumentar a poliubiquitinação in vitro, essa estratégia de fusão promoveu uma melhor resposta imunoterapêutica contra o tumor que E6E7 e E6E7Ub, sendo promissora para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra câncer cervical e também contra outros tipos de câncer. / Cervical cancer is the third most common cancer women worldwide and HPV16 infection is a major risk factor for its ethiopathogenesis. In this study we evaluated in mice the prophylactic and therapeutic potential of the E6E7 proteic vaccine, consisting of immunogenic HPV16 E6 and E7 epitopes, with or without Ubiquitin-fused (E6E7Ub and UbE6E7), against TC-1 tumor cells. The E6E7 vaccine conferred complete protection against tumor growth in previously immunized wild-type, CD4 knockout and TLR4 deficient mice challenged with TC-1 cells. However, immunization of previously challenged animals with TC-1 cells, Ubiquitin-fused antigens promoted tumor regression in 60% of mice against 0% in non-Ubiquitinfused antigens. Besides, the fusion of Ubiquitin at the N-terminus of the antigen (UbE6E7) seems to enhance polyubiquitination in vitro, this Ubiquitin fusion strategy promoted an effective immunotherapeutic response against the tumor, being promising for the development of therapeutic cervical cancer vaccines and also other types of tumor.

O diferencial da cultura de células em 3-dimensões é permitir que as células explorem as 3-dimensões do espaço, aumentando assim as interações com o ambiente e entre as células. Em estudos relacionados à biologia do câncer de mama, vem ganhando espaço a utilização de esferóides para estudos que visam à compreensão da morfogênese do espaço luminal. Neste trabalho foi mostrado que as células MCF-7 reorganizam-se em estruturas tubulares e acinares. Em ambas as situações, a formação do lúmen veio acompanhada pelo estabelecimento de uma camada de células polarizadas, arranjo este muito semelhante ao encontrado em glândulas mamárias. Os resultados apresentados apontam para a existência de uma população de células na linhagem MCF-7 que não estão totalmente comprometidas ao fenótipo tumoral. Mantidos diferenciados, os esferóides de células MCF-7 apontam como um novo modelo para estudos relacionados à formação do lúmen, permitindo assim explorar o papel de diferentes vias como as relacionadas a apoptose, autofagia, diferenciação e sobrevivência celular. / As a particularity, a 3D cell culture permits cells to explore the three dimensions of the space thereby increasing cell-cell interactions, as well as interaction with the environment. In studies related to breast cancer biology, spheroids are becoming widely used in the aim to comprehend luminal space morphogenesis. We showed that MCF-7 cells reorganize themselves in tubular and acinar structures. In both situations, lumen formation was accompanied by the establishment of a layer of polarized cells, an arrangement that is very similar to that of breast glands. The presented results suggest the existence of an MCF cell line population not completely committed to the tumor phenotype. When maintained as differentiated, MCF-7 cell spheroids can be a new model for studies regarding lumen formation, thereby exploring the role of diiferent pathways, such as those related to cell apoptosis, autophagy, differentiation and survival.

O Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais maligno tumor cerebral e apresenta uma alta capacidade proliferativa, invasiva e angiogênica. Neste estudo foi avaliada a distribuição espacial de moléculas envolvidas nesses processos num modelo de GBM de rato in vivo (C6). Por imunohistoquímicas observou-se que o tumor foi capaz de expressar diferentes elementos de matriz extracelular (colágenos I, III e IV, fibronectina, tenascinas C e R, vitronectina e proteoglicanos), moléculas de adesão (RHAMM, CD44 e integrinas) e a enzima proteolítica MMP-2. Esses elementos parecem se organizar num padrão pericelular nas células invasivas das bordas do tumor e nas células C6 migrando pelos vasos. A expressão de moléculas de adesão mostrou que o RHAMM pode ter um papel mais importante que o CD44 no reconhecimento do ácido hialurônico. A expressão de flt-1 e flk-1 pelas células tumorais sugere um papel desses receptores do VEGF não apenas na proliferação endotelial, mas também na proliferação tumoral. Todas as moléculas aqui analisadas são potenciais alvos terapêuticos futuros. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most malignant brain tumour and presents high proliferative, invasive and angiogenic capacities. In the present study the spatial distribution of molecules involved with these processes was analyzed in a rat GBM (C6) in vivo. Immunohistochemical analysis showed that tumours expressed extracellular matrix elements (collagens I, III and IV, fibronectin, tenascin C and R, vitronectin and proteoglycans), adhesion molecules (RHAMM, CD44 and integrins) and the proteolytic enzyme MMP-2. At the tumour borders and around the cells migrating along blood vessels these molecules seemed to organize in a pericellular pattern. The adhesion molecules analysis showed that RHAMM could have a pivotal role in hyaluronic acid recognition. Flt-1 and flk-1 expression by tumour cells suggests a role for these VEGF receptors not only in endotheliocyte metabolism, but also in tumour proliferation. All of the studied molecules are potential targets for anti-cancer therapies.