Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cadmium (Cd) is one of the most toxic heavy metals by their ability to affect the vital organs like liver, kidney, brain and other. This metal can trigger a framework of oxidative stress by increase of reactive oxygen species and also affect cholinergic and purinergic neurotransmission. Quercetin (Querc), a flavonoid found in various foods has several functions in the body as a therapeutic antioxidant and neuroprotective action. The aim of this study was to evaluate the activity of ectoenzymes and acetylcholinesterase (AChE) activity in synaptosomes of the cerebral cortex of adult rats exposed to cadmium chloride at a dose of 2.5 mg/kg and treated with Querc at doses of 5, 25 and 50mg/kg, both solutions were orally administered in a volume of 1 mL/kg for 45 days. Results showed that the hydrolysis of ATP, ADP, AMP and ADA activity in the synaptosome cerebral cortex in the Cd/ethanol group increased compared to the saline/ethanol group (p<0.05). The treatment with all doses of Querc prevented the increase in the hydrolysis of ATP, ADP, and AMP as well as the ADA activity (p<0.05). In vitro assay with Querc 25 and 50 μM showed a decrease in the activities of these enzymes except of ADA (p<0.05). The AChE activity ex vivo was not significantly different in the Cd/ethanol group when compared to the saline/ethanol group. The treatment with Querc 25 and 50 mg/kg significantly decreased the AChE activity when compared to the Cd/ethanol group (p<0.05). In vitro assay showed a decrease in the AChE activity only with 100 and 200 μM of Querc (p<0.05). These results suggest that Querc prevented the alterations caused by Cd in purinergic and cholinergic system. Thus, the results reported here suggest that Querc is a promising compound that can be clinically investigated in order to be used in alternative therapies for the treatment of neurodegenerative diseases or brain diseases associated with poisoning by heavy metals. / O cádmio (Cd) é um dos metais pesados de maior toxicidade pela sua capacidade de afetar órgãos vitais como o fígado, os rins, o encéfalo entre outros. Este metal pode desencadear um quadro de estresse oxidativo pelo aumento de espécies reativas de oxigênio, e também afetar a neurotransmissão colinérgica e purinérgica. A quercetina (Querc), um flavonóide presente em vários alimentos exerce diversas funções terapêuticas no organismo como atividade antioxidante e ação neuroprotetora. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade de ectoenzimas e da acetilcolinesterase (AChE) em sinaptossomas do córtex cerebral de ratos adultos expostos ao cloreto de cádmio na dose de 2,5 mg/kg e tratados com Querc nas doses de 5, 25 e 50mg/kg, ambas por via oral e administradas no volume de 1 mL/kg por 45 dias. Os resultados demonstraram que a hidrólise de ATP, ADP, AMP e a atividade da ADA no sinaptossoma do córtex cerebral do grupo Cd/etanol aumentaram quando comparado com o grupo salina/etanol (p<0,05). O tratamento com todas as doses de Querc preveniu o aumento da hidrólise de ATP, ADP e AMP bem como a atividade da ADA (p<0,05). Ensaios in vitro com a Querc 25 e 50 μM demonstraram uma diminuição na atividade destas enzimas exceto na atividade da ADA (p<0,05). A atividade da AChE ex vivo não foi significativamente diferente no grupo Cd/etanol quando comparado com o grupo salina/etanol. O tratamento com Querc 25 e 50 mg/kg diminuiu significativamente a atividade da AChE quando comparado com o grupo Cd/etanol (p<0,05). Ensaios in vitro demonstraram uma diminuição na atividade da AChE somente com 100 e 200μM de Querc (p<0,05). Estes resultados sugerem que a Querc preveniu as alterações causadas pelo Cd no sistema purinérgico e colinérgico. Deste modo, os resultados descritos neste estudo sugerem que a Querc é um composto promissor que pode ser investigada clinicamente a fim de ser utilizado em terapias alternativas para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou doenças cerebrais associadas à intoxicação por metais pesados.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Chronic pain and depression often coexist, and several mechanisms are involved in the pathogenesis of this comorbidity, which confer it resistance to treatment. The serotonergic system is considered a central mechanism in the pain-depression dyad, which could also be generated from dysfunctions in the immune system or injuries to neuronal tissue, involving the process of neuroinflammation. The organoselenium compound m-trifluoromethyl-diphenyl diselenide (m-CF3-PhSe)2 shows antinociceptive and antidepressant-like effects in acute models in mice and behavioral evidence demonstrated that its antidepressant-like effect is related to the serotonergic system. The aim of this study was to further characterize the pharmacological effects of (m-CF3-PhSe)2 and investigate its effect on the comorbidity between pain and depression in mice, addressing the pathogenic mechanisms of this condition. The research project was approved by the ethics committee (CEUA) of the Federal University of Santa Maria (042/2012). First, it was demonstrated that the serotonergic system is involved in the antinociceptive effect of (m-CF3-PhSe)2 (1 50 mg/kg, p.o.) in the glutamate test, once antagonists of serotonergic receptors 5-HT1A (WAY100635) and 5-HT2A/2C (ritanserin) blocked its effect. In addition, (m-CF3-PhSe)2 (10 and 50 mg/kg, p.o.) inhibited the serotonin (5-HT) reuptake ex vivo in synaptosomes. It was also assessed the selenium distribution at different time points after the administration of (m-CF3-PhSe)2 (500 mg/kg, p.o.), which demonstrated a wide distribution in different tissues, including the brain. Taking into account that inflammation could be closely related to depression, the effect of (m-CF3-PhSe)2 on the depressive-like behavior induced by intracerebroventricular (i.c.v.) injection of tumor necrosis-α (TNF-α) in the forced swimming test (FST) and tail suspension test (TST) was also evaluated. The acute treatment with (m-CF3-PhSe)2 (from 0.1 mg/kg) at low doses prevented the increase in the immobility time of animals, which is an indicative of depressive-like behavior, in both tests, without altering the locomotor activity of mice. The doses that were not effective (0.01 mg/kg in the FST and 0.1 mg/kg in the TSC) in the acute treatment blocked the effect of TNF-α when chronically administered for 2 weeks to mice. In addition, (m-CF3-PhSe)2 demonstrated an anti-inflammatory effect in both acute and subchronic treatments, preventing the activation of p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) and the increase of nuclear factor-κB (NF-κB) levels induced by TNF-α in the hippocampus and pre-frontal cortex of mice. Lastly, it was demonstrated that (m-CF3-PhSe)2 (1 and 10 mg/kg, i.g.) elicited antinociceptive and antidepressant-like effects in a model of pain and depression comorbidity induced by partial sciatic nerve ligation (PSNL) in mice, which was related to anti-inflammatory effect. PSNL induced mechanical allodynia observed in the Von- frey hair test and increased the immobility time of animals in the FST and (m-CF3-PhSe)2 in both acute and subchronic treatments at low doses was effective in blocking these alterations. PSNL also induced an increase of pro-inflammatory cytokines in serum, cerebral cortex and hippocampus of mice. An increase of adrenocorticotropic hormone (ACTH) and corticosterone in the serum, activation of p38 MAPK, an increase in the NF-κB and cyclooxygenase-2 (COX-2) levels, a decrease of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and an increase of 5-HT reuptake and glutamate release in the cortex and hippocampus of mice were found in PSNL mice. In a general way, both acute (10 mg/kg, i.g.) and subchronic (0.1 mg/kg, i.g.) (m-CF3-PhSe)2 treatments were effective in preventing these alterations, although the best results were observed in the subchronic treatment. Considering that pain-depression dyad is a multi-pathogenic condition and inflammation could have a central role in this comorbidity, (m-CF3-PhSe)2 might be considered an interesting therapeutic alternative to treat chronic pain associated with depression. / A dor crônica e a depressão geralmente coexistem, e inúmeros mecanismos estão envolvidos na patogênese desta comorbidade, o que a torna resistente ao tratamento. O sistema serotoninérgico é considerado um mecanismo central na díade dor-depressão, que também pode ser originada a partir de disfunções do sistema imune ou danos no tecido neuronal, envolvendo o processo de neuroinflamação. O composto orgânico de selênio disseleneto de m-trifluormetil-fenila (m-CF3-PhSe)2 apresenta efeito antinociceptico e do tipo antidepressivo em modelos agudos em camundongos e evidências comportamentais demonstraram que o seu efeito antidepressivo está relacionado com o sistema serotoninérgico. O objetivo deste estudo foi caracterizar melhor os efeitos farmacológicos do (m-CF3-PhSe)2 e investigar o efeito do mesmo na comorbidade entre dor e depressão em camundongos, abordando os mecanismos patogênicos desta condição. O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Maria, sob o número 042/2012. Primeiramente foi demonstrado que o sistema serotoninérgico também está envolvido no efeito antinociceptivo do (m-CF3-PhSe)2 (1 50 mg/kg, p.o.) no teste da injeção de glutamato na pata de camundongos, uma vez que antagonistas dos receptores serotoninérgicos 5-HT1A (WAY100635) e 5HT2A/2C (ritanserina) bloquearam seu efeito. Além disso, o (m-CF3-PhSe)2 (10 e 50 mg/kg, p.o.) inibiu a recaptação de serotonina (5-HT) ex vivo em sinaptossomas. Também foi determinado a distribuição de selênio em diferentes tempos após a administração de (m-CF3-PhSe)2 (500 mg/kg, p.o.) em camundongos, o qual apresentou uma ampla distribuição em diferentes tecidos, incluindo o cérebro. Considerando que a inflamação pode estar intimamente relacionada com a depressão, avaliou-se também o efeito do (m-CF3-PhSe)2 (0.01 50 mg/kg, i.g.) no comportamento do tipo depressivo induzido pela administração intracerebroventricular (i.c.v.) da citocina pró-inflamatória fator de necrose tumoral-α (TNF-α) nos testes do nado forçado (TNF) e da suspensão da cauda (TSC). O tratamento agudo com (m-CF3-PhSe)2 em baixas doses (a partir de 0.1 mg/kg) preveniu o aumento do tempo imobilidade dos animais, o qual representa um comportamento do tipo depressivo, em ambos os testes, sem alterar a atividade locomotora dos camundongos. As doses que não foram efetivas (0.01 mg/kg no TNF e 0.1 mg/kg no TSC) no tratamento agudo bloquearam o efeito do TNF-α quando administradas subcronicamente por 2 semanas. Além disso, o (m-CF3-PhSe)2 apresentou efeito anti-inflamatório nos tratamentos agudo e subcrônico ao prevenir a ativação da proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38 MAPK) e o aumento dos níveis de fator nuclear-κB (NF-κB) induzidos pelo TNF-α no hipocampo e córtex pré-frontal de camundongos. Por fim, foi demonstrado que o (m-CF3-PhSe)2 (1 e 10 mg/kg, i.g.) apresentou efeito antinociceptivo e do tipo antidepressivo em um modelo de comorbidade entre dor e depressão induzido pela ligação parcial do nervo ciático (LPNC) em camundongos, associado a um efeito anti-inflamatório. A LPNC induziu alodínia mecânica observada no teste dos filamentos de Von-frey e aumento do tempo de imobilidade dos animais no TNF e o (m-CF3-PhSe)2 tanto no tratamento agudo quanto no subcrônico em baixas doses foi efetivo em bloquear estas alterações. A LPNC causou também o aumento dos níveis de citocinas pro-inflamatórias no soro, no córtex cerebral e no hipocampo de camundongos, bem como do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e da corticosterona no soro, a ativação da p38 MAPK, o aumento dos níveis de NF-κB e da cicloxigenase-2 (COX-2), a diminuição dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e o aumento da recaptação de 5-HT e a liberação de glutamato, no córtex e no hipocampo. De maneira geral, tanto o tratamento agudo (10 mg/kg, i.g.) quanto o subcrônico (0.1 mg/kg) com (m-CF3-PhSe)2 foram eficazes em bloquear essas alterações, embora os melhores resultados foram observados no tratamento subcrônico. Tendo em vista que a díade dor-depressão é uma condição multipatogênica e a inflamação pode ter um papel central nessa comorbidade, o (m-CF3-PhSe)2 poderia ser considerado uma interessante alternativa terapêutica para tratar a dor crônica associada à depressão.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The interest in organoselenium biochemistry and pharmacology has increased in the last two decades due to a variety of organoselenium compounds that possess biological activity. Accordingly, bis selenide is known as a safe drug when administered acutely to mice at doses that have antiinflammatory and antinociceptive activities. Therefore, the search for the mechanisms by which this compound exerts its effects is extremely important for the therapeutic application. Based on the considerations above, the aims of the present study were to evaluate the antinociceptive properties, as well as the possible mechanisms involved in this process. The oral administration of bis selenide caused significant inhibition of the biting behavior induced by intrathecal (i.t.) injection of glutamate, kainate, (±)-1-aminocyclopentane-trans-1,3-dicarboxylic acid (trans-ACPD), capsaicin, substance P (SP), interleukin 1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) but completely failed to affect the nociception induced by α-amino-3-hydroxy-5-mehtyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and N-methyl-D-aspartate (NMDA). In addition, the oral administration (p.o.) of bis selenide caused a significant increase in hot plate (55 °C) response latency. The antinociceptive effect caused by bis selenide in the hot plate test was reversed by i.t. injection of several K+ channel blockers tetraethylammonium (TEA, non-selective voltage-dependent K+ channel inhibitor) and glibenclamide (ATP-sensitive K+ channel inhibitor) but was not significantly reversed by pretreatment of animals with apamin and charybdotoxin (large- and smallconductance Ca2+- activated K+ channel inhibitors, respectively). These results suggest the participation of glutamatergic, peptidergic and vanilloid systems and potassium channel in the antinociceptive action caused by bis selenide in mice. / Nos últimos anos, os compostos orgânicos de selênio têm sido alvos de interesse em síntese orgânica em virtude da descoberta de suas aplicações sintéticas e de suas propriedades farmacológicas. O seleneto vinílico bis substituído (SVBS) é um composto orgânico de selênio que apresenta baixa toxicidade quando administrado pela via subcutânea em camundongos, nas doses em que exerce ação antinociceptiva e antiinflamatória. Assim, a pesquisa dos mecanismos pelos quais esse composto exerce os efeitos farmacológicos é importante para a sua aplicação terapêutica. Desta forma, no presente trabalho investigou-se as propriedades antinociceptivas do SVBS, bem como os possíveis mecanismos envolvidos em tal processo. A administração oral do SVBS preveniu a nocicepção induzida pela injeção intratecal (i.t.) de glutamato, cainato, ácido (±)-1- aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico (trans-ACPD), capsaicina, substância P (SP), fator de necrose alfa (TNF-α) e interleucina 1β (IL-1β), mas não bloqueou significativamente a nocicepção causada pela injeção i.t. do ácido α- amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolopropionico (AMPA) e ácido N-metil-D-aspártico (NMDA). Além disso, a administração oral do SVBS foi capaz de prevenir a nocicepção térmica, no modelo da chapa quente a 55°C. A antinocicepção causada pela administração oral do SVBS no teste da chapa quente foi revertida pelo pré-tratamento com tetraetilamônio (TEA; bloqueador de diferentes tipos de canais de potássio, inclusive os dependentes de voltagem) e glibenclamida (bloqueador de canais de K+ dependente de ATP), mas não foi revertida pelo pré-tratamento dos animais com apamina (bloqueador de canais de potássio de baixa condutância ativados por cálcio) e caribidotoxina (bloqueador de canais de potássio de alta condutância ativados por cálcio). De acordo com o presente trabalho pode-se concluir que os mecanismos responsáveis pela ação antinociceptiva causada pelo SVBS em camundongos envolvem a participação dos sistemas glutamatérgicos, peptidérgicos e vanilóides e canais de potássio.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Polyamines (putrescine, spermidine and spermine) are aliphatic amines produced by the action of ornithine descarboxylase (ODC), a rate-limiting and protein kinease C (PKC)-regulated step in polyamine synthesis. Since the levels of polyamines were found to be high in synovial fluid of arthritic patients, the aim of the present study was to identify the role of peripherally produced polyamines in the model of inflammatory pain induced by adjuvant arthritis. The subcutaneous injection of complete Freund s adjuvant (CFA, 50 μL/paw) caused the development of mechanical allodynia and edema. Moreover, it increased ODC expression and activity as well as PKC activation. The previous administration of the selective ODC inhibitor DFMO (10 μmol/paw) was capable of preventing the development of allodynia and edema as well as the increase in ODC activity produced by CFA injection. Furthermore, the previous administration of the PKC inhibitor GF109203X (1 nmol/paw) reduced allodynia and the increase of ODC activity in animals injected with CFA. Accordingly with the synthesis inhibition, we have observed that subcutaneous injection of putrescine (10 μmol/paw), spermidine (3-10 μmol/paw) or spermine (0.3-3 μmol/paw) into the rat paw also caused mechanical allodynia and edema. The present results suggest that endogenously synthesized polyamines are involved in the development of nociception and edema caused by the adjuvant. Moreover, the polyamine production in inflammatory site seems to be related with the increase in ODC activity stimulated by PKC activation. Thus, the control of polyamine synthesis and action could be an interesting target to control inflammatory pain. / Poliaminas (putrescina, espermidina e espermina) são aminas alifáticas produzidas pela ação da ornitina descarboxilase (ODC), enzima limitante e proteína quinase C (PKC), passo regulatório da síntese de poliaminas. Desde que níveis elevados de poliaminas foram encontrados no fluído sinovial em pacientes com artrite, o objetivo do presente estudo foi investigar a produção de poliaminas perifericamente em modelo de dor inflamatória induzido por CFA. A injeção subcutânea do adjuvante completo de Freund (CFA, 50 μL/pata) causou o desenvolvimento de alodínia mecânica e edema, bem como um aumento na expressão e atividade da ODC e na ativação da PKC. A administração prévia do inibidor seletivo da ODC, o DMFO (10 μmol/pata), foi capaz de prevenir o desenvolvimento da alodínia e edema, bem como o aumento da atividade produzida pela injeção de CFA. Além disso, a pré-administração do inibidor da PKC o GF109203 (1 nmol/pata), reduziu a alodínia e o aumento da atividade da ODC em animais injetados com CFA. De acordo com a inibição da síntese, também observamos que a injeção subcutânea de putrescina (10 μmol/pata), espermidina (3-10 μmol/pata) ou espermina (0,3-3 μmol/pata) na pata de ratos desenvolveu alodínia mecânica e edema. O presente estudo sugere que as poliaminas sintetizadas endogenamente estão envolvidas no desenvolvimento da nocicepção e edema causado pelo CFA. Além disso, as poliaminas produzidas nos sítios de inflamação estão relacionadas com o aumento na atividade da ODC estimulada pela ativação da PKC. Assim, o controle da síntese das poliaminas e função poderia ser um interessante alvo para o controle da dor inflamatória.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Lead (Pb) is a toxic metal without biological function, which can cause various undesirable changes in organism. Developing animals are more sensitive to external aggressions, and exposure to Pb may cause pronounced and even irreversible damage. Studies show detoxifyng action by zinc chloride (ZnCl2) and N-acetylcysteine (NAC), suggesting same protective effect against intoxication with Pb. Therefore, we investigated the toxic effect of lead acetate (AcPb) on biochemical and behavioral parameters, in developing animals, and the possible protective effect of ZnCl2 and NAC. For this young Wistar rats received subcutaneously: saline, ZnCl2 (27 mg/kg), NAC (5 mg/kg) or more NAC ZnCl2 from the 3rd to 7 th; and AcPb (7 mg/kg) or saline from the 8th to 12th day of age. The animals were subjected to behavioral tasks: negative geotactismo, the tail immersion test beaker and open field to assess neurological damage and motors. They were sacrificed at 33 days and the biological samples were stored for further analysis. We assessed the body weight, the activity of porphobilinogen synthase (PBG synthase) in blood, acetylcholinesterase (AChE) in brain and cerebellum, hemoglobin (Hb) in whole blood, serum urea and creatinine, and blood, cerebrum and cerebellum levels. Pups exposed to AcPb presented a decrease of blood PBG-synthase activity, without changes in Hb content. ZnCl2 pre-exposure partially prevented the PBG-synthase inhibition. Pb caused a decrease in the activity of brain AChE, while the treatment with ZnCl2, NAC and ZnCl2 more NAC prevented this change. In addition, animals exposed to AcPb presented Pb accumulation in blood and brain; all preventive treatments decreased Pb levels. In summary, the results show that there was an accumulation of Pb and inhibition of the activity of two enzymes, which are important biomarkers of toxicity. As preventive treatments, the protector effect of ZnCl2 may related to its capacity of to induce the biosyntese of metal ligant proteins. As to NAC, it is probable that its protective effect is related to chelating effects. / O chumbo (Pb) é um metal tóxico, sem função biológica, o qual pode provocar várias alterações indesejadas no organismo. Animais em desenvolvimento apresentam maior sensibilidade à agressões externas, e a exposição ao Pb poderá provocar danos pronunciados e até mesmo irreversíveis. Alguns trabalhos sugerem que o cloreto zinco (ZnCl2) e a N-acetilcisteína (NAC) possuem ação detoxificante, podendo então, ter um efeito protetor frente a uma intoxicação com Pb. Sendo assim, buscamos investigar o efeito tóxico do acetato de chumbo (AcPb) em parâmetros bioquímicos e comportamentais, quando administrado em animais em desenvolvimento, e a possível ação protetora do ZnCl2 e da NAC sobre esta toxicidade. Para isso ratos Wistar jovens receberam subcutaneamente: salina, ZnCl2 (27 mg/kg), NAC (5 mg/kg) ou ZnCl2 mais NAC do 3o ao 7o; e AcPb (7 mg/kg) ou salina do 8o ao 12o dia de idade. Os animais foram submetidos às tarefas comportamentais: geotactismo negativo, imersão da cauda, teste do becker e campo aberto para avaliação de danos neurológicos e motores. Foram sacrificados aos 33 dias e as amostras biológicas foram guardadas para análises posteriores. Avaliou-se: o peso corporal; a atividade das enzimas porfibilinogênio-sintase (PBG-sintase) em sangue, acetilcolinesterase (AChE) em cérebro e cerebelo; níveis de hemoglobina (Hb) em sangue total, de ureia e creatinina em soro; níveis de metalotioneíanas (MT) em sangue, fígado e cérebro; dosagem de metais em sangue, cérebro e cerebelo. Filhotes expostos ao AcPb apresentaram diminuição da atividade da PBG-sintase de sangue, sem alterações no conteúdo de Hb. O ZnCl2 preveniu parcialmente a inibição PBG-sintase. O AcPb causou diminuição na atividade da AChE de cérebro, enquanto os tratamentos com ZnCl2, NAC e ZnCl2 mais NAC preveniram essa alteração. Além disso, os animais expostos ao AcPb apresentaram acúmulo de Pb em sangue e cérebro; todos os tratamentos preventivos diminuiram os níveis de Pb. Em resumo, os resultados mostram que houve um acúmulo de Pb nos tecidos onde houve inibição das enzimas, que são importantes biomarcadores de toxicidade; acredita-se que a inibição ocorra através da ligação do metal aos grupamentos tiois das enzimas. Quanto aos tratamentos preventivos, o efeito protetor do zinco pode estar ligado a indução de proteínas ligantes de metais. Ainda, sugere-se que a proteção exercida pela NAC está ligada a sua capacidade quelante.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2085482 bytes, checksum: 22303ee6597c676fbc153930781c403e (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / Geminivirus are plant virus packed as geminate semi- icosahedral particles and single-stranded circular DNA genomes. They can be either mono or bipartite and in the bipartite geminivirus, the genomic components are designated DNA-A and DNA-B. DNA-A encodes the proteins needed for replication, transactivation and encapsidation of the viral genome. DNA-B encodes two movement proteins, Movement Protein, MP, and Nuclear Shuttle Protein, NSP, both required for the establishment of a systemic infection. NSP transports the viral DNA between the nucleus and cytoplasm and acts cooperatively with MP to move the viral DNA cell-to-cell across the wall. The geminivirus are highly dependent on the host factors for proliferation and spread. NSP interacts with a plasma membrane receptor kinase, designated NIK (NSP- interacting kinase), from tomato, soybean and Arabidopsis. It has been demonstrated previously that inactivation of NIK gene enhances the susceptibility of the mutant to geminivirus infection. To elucidate the possible role of NIK in the protection mechanism to geminivirus infection, we investigated here the effects of NIK overexpression in the tomato response to geminivirus infection. The NIK gene from Arabidopsis thaliana was used to transform tomato. The primary transformants were confirmed by PCR, selected by RT-PCR according to the transgene expression, in vitro replicated and used for developmental analysis in vitro and in green house. NIK overexpression affected the overall developmental performance of transgenic lines which display delayed and stunted growth, with lower stem, less developed root and shoot systems and a leaf curly phenotype. These transgenic line phenotypes overexpression NIK were similar to that displayed by inhibition of Brassinosteroid synthesis or signaling. Infectivity assays in tomato with ToYSV-[MG-Bi2] revealed that overexpression of NIK caused attenuation of symptom, as the transgenic lines developed less severe symptoms in comparison with the untransformed lines. These results are consistent with a protective role of NIK against viral infection and suggest that the NIK-mediated signaling communicates to some level with the brassinosteroid signaling. / Geminivírus são vírus de plantas com partículas semi- icosaédricas geminadas e genoma de DNA circular de fita simples, podendo ser mono ou bissegmentados, sendo, no último caso, os dois componentes genômicos, denominados DNA-A e DNA-B. No DNA-A, encontram-se os genes que codificam as proteínas necessárias para a replicação viral e encapsidação. O DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein, MP e Nuclear Shuttle Protein, NSP, ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e atua cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. Os geminivírus são altamente dependentes de fatores do hospedeiro para sua proliferação. A proteína NSP interage com uma quinase receptora da membrana plasmática, designada NIK (NSP-Interacting Kinase) de tomate, soja e Arabidopsis. Foi demonstrado, em estudos anteriores, que a inativação do gene NIK aumenta a suscetibilidade dos mutantes à infecção viral. Visando elucidar o possível papel de NIK no mecanismo de proteção à infecção por geminivírus, este estudo propôs uma avaliação dos efeitos da superexpressão de NIK na resposta de tomate à infecção por geminivírus. Assim sendo, o gene NIK de Arabidopsis thaliana foi utilizado para transformar tomateiro. Os transformantes primários foram confirmados por PCR, selecionados por RT- PCR, de acordo com a expressão do transgene, repicados in vitro e utilizados em experimentos de análise de desenvolvimento in vitro e em casa-de-vegetação. Análises fenotípicas demonstraram que a superexpressão da proteína promoveu retardo de crescimento dos transformantes, os quais apresentaram baixa estatura, menor comprimento caulinar, menor desenvolvimento de sistema radicular e aéreo, folhas enrugadas/encarquilhadas. O fenótipo observado nas linhagens transgênicas superexpressando NIK é muito similar àquele resultante da inibição da via de biossíntese ou sinalização de brassinosteróides. Os ensaios de infectividade em tomateiro com o vírus ToYSV-[MG-Bi2] revelaram que a superexpresão de NIK causou atenuação dos sintomas uma vez que os transformantes apresentaram menor severidade de sintomas em relação ás linhagens não transformadas. Estes resultados são consistentes com o papel protetor de NIK contra a infecção viral e sugere que a sinalização mediada por NIK comunica-se, em algum nível, com a via de sinalização de brassinosteróides.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 478603 bytes, checksum: 2f73d62b9c5b69dd70468c095488ebaf (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / NIK (NSP-Interacting Kinase) is a receptor-like kinase involved in defense against geminiviruses, which was first identified as a virulence target of the begomovirus transport protein NSP (Nuclear Shuttle Protein). We have previously identified that NIK activation mediates an indirect phosphorylation of the ribosomal protein L10 causing the translocation of the cytosolic protein to the nucleus, where it interacts with LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) to regulate genes involved in the translation machinery resulting in a global translation suppression. Constitutive activation of NIK, through ectopic expression of the mutant T474D in Arabidopsis, has been previously shown to induce the plant immune system. In this investigation, we examined further whether activation of the signaling module NIK-RPL10-LIMYB would transduce a typical defense signal that promotes the induction of the plant immune system. However, the current results suggest that the NIK-mediated antiviral signaling does not induces the basal immune system. Firstly, the global variation of gene expression by ectopic expression of the constitutively activated mutant receptor T474D or LIMYB does not cause a gene enrichment in the up-regulated list of typical defense categories, such as response to pathogens, response to virus and virus-induced gene silencing. Secondly and very importantly, quantitative RT-PCR of a representative sample of defense genes confirmed that they are not up-regulated by expression of T474D or LIMYB. In contrary, expression of LIMYB in the transgenic lines caused a down-regulation of the defense genes examined. We have also examined new host targets that interact with NSP. Initially, we used a 12000 Arabidopsis protein expression-based microarray to isolate a t-SNARE-like protein with the capacity to bind NSP in vitro. This interaction NSP-At4g30240 protein was further confirmed by two- hybrid assay in yeast and by bimolecular fluorescence complementation assay in planta. Our results indicate that At4g30240 interacts with NSP in vivo to mediate or facilitate the viral protein transport among cell compartments. / NIK (NSP-Interacting Kinase) é um receptor cinase envolvido na resposta de defesa contra geminivírus, e foi primeiramente identificado como alvo de virulência da proteína de transporte NSP (Nuclear Shuttle Protein) de begomovírus. Previamente, foi identificado que a ativação de NIK medeia a fosforilação indireta da proteína ribossomal L10, promovendo a translocação da proteína citosólica para o núcleo, onde interage com a proteína LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein), para regular genes envolvidos na maquinaria de tradução da célula, resultando em supressão da tradução global. Foi também demonstrado que a ativação constitutiva de NIK1, através da expressão ectópica do mutante T474D, induz o sistema imune de plantas em Arabidopsis. Nesta investigação, foi analisado em maiores detalhes se a ativação do módulo de sinalização NIK-RPL10-LIMYB também transmitiria um sinal típico de defesa, resultando na indução do sistema imune de plantas. Entretanto, os resultados encontrados sugerem que a via de sinalização antiviral mediada por NIK não transmite o sinal de defesa típico que culmina na ativação de genes relacionados ao sistema imune de plantas. Em primeiro lugar, por meio de estudos de variação global de expressão gênica, induzida por expressão ecotópica do mutante constitutivo T474D ou LIMYB, foi constatado que não houve enriquecimento gênico significativo na lista dos genes regulados positivamente nas categorias de defesa, como resposta de defesa a patógenos, resposta de defesa a vírus e silenciamento gênico induzido por vírus. Além disso, RT- PCR quantitativo de uma amostra representativa dos genes de defesa confirmou que estes genes de defesa não foram regulados positivamente pela expressão de T474D ou LIMYB. Ao contrário, a expressão de LIMYB nas linhagens transgênicas promoveu a regulação negativa dos referidos genes de defesa. Nesta investigação, também se avaliou novos alvos do hospederio que interagem com NSP. Inicialmente, foi isolada, por meio de microarranjos de expressão de 12.000 proteínas de Arabidopsis, uma proteína com características de uma t-SNARE, codificada pelo locus At4g30240 com a capacidade de interagir com NSP in vitro. Esta interação NSP- proteína At4g30240 foi confirmada em ensaios de duplo hibrido em leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular in planta. Os resultados indicam que At4g30240 interage com NSP in vivo, e pode mediar ou mesmo facilitar o transporte dessa proteína viral entre compartimentos celulares.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 835531 bytes, checksum: 813caac126d354619ba3de602cddedc4 (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The Feline coronavirus (FCoV) is an enveloped virus RNA single-stranded, which belongs to the family Coronaviridae and the order Nidovirales. This virus is an important pathogen of wild and domestic cats and can cause a mild or inapparent enteric infection and also a rare and fatal disease called feline infectious peritonitis (FIP). The precise cause of FIP is still unknown but some hypotheses are suggested. The most accepted hypothesis is the theory of internal mutation that suggests a less virulent biotype of FCoV (FECV), would lead to other more pathogenic biotype (FIPV), capable of infecting monocytes and macrophages leading to FIP. However, despite being the most mentioned, there are still uncertainties in the relationship of the FCoV genome with the disease phenotype. This work presents a review from different FCoV studies attempt to elucidate existing theories on the pathogenesis of FCoV infection and tested through phylogenetic and phylogeographic approaches, the 7b gene of the first Brazilians FCoV sequences of asymptomatic and symptomatic cats in order to study the correlation between genetic diversity of this gene and differentiation of the two biotypes (FECV and FIPV). The 7b gene was shown to be highly conserved among the isolates and there was no differentiation between FIPV and FECV biotypes in phylogeographical and phylogenetic analysis, calling into question the theory of mutation. / O Feline coronavirus (FCoV) é um vírus envelopado de RNA fita simples, pertencente a família Coronaviridae e a ordem Nidovirales. Esse vírus é um importante patógeno de felinos domésticos e selvagens e pode causar uma inaparente ou leve infecção entérica e também causar uma doença imunomediada e fatal denominada peritonite infecciosa felina (PIF). A causa precisa da PIF ainda é desconhecida, mas algumas hipóteses são sugeridas. A hipótese mais aceita é a teoria da mutação interna que sugere que um biotipo menos virulento do FCoV (FECV), daria origem a outro biotipo mais patogênico (FIPV), capaz de infectar monócitos e macrófagos levando a PIF. Entretanto, apesar de ser a mais citada, ainda existem incertezas da relação do genoma do FCoV com o fenótipo da doença. Este trabalho, apresenta uma revisão com as diferentes pesquisas que tentam elucidar as teorias existentes sobre a patogênese da infecção pelo FCoV e testa, por meio de abordagens filogenética e filogeográfica, o gene 7b das primeiras sequências brasileiras de FCoV de gatos assintomáticos e sintomáticos, a fim de estudar, a correlação entre a diversidade genética desse gene e a diferenciação dos dois biotipos (FIPV e FECV). O gene 7b se mostrou altamente conservado entre os isolados virais e não houve diferenciação, na análise filogenética e filogeográfica, dos biotipos FIPV e FECV, pondo em questionamento a teoria da mutação.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The present study aims shows that Scientific Literacy involves more than the domain of scientific theories and concepts, it shows that it is necessary to incorporate understanding about the Nature of Science, thus promoting the development of scientific skills in the classroom. The History of Science is an important component when trying to understand the Nature of Science. This study was carried out in a rural elementary school with 12-to-15-year-old students. It was developed through a collaborative activity which aimed at rewriting the classic Micrographia book written by Robert Hooke in 1665. It was tested if this activity improve the possibility to teach aspects about the History and Nature of Science by developing scientific competences. In order to rewrite the book, students were first introduced to the historical context in which Robert Hooke lived, demonstrating cultural and scientific aspects related to that historical period. In the next step, students explored their home and school environments using a microscope made by themselves, built with PET bottles and lenses obtained from CD / DVD players to unravel an invisible world in which they had not previously known. After these steps, students had to draw and describe the structures observed using the microscopes, where they collaboratively rewrote the classic book, creating a replica. The learning evidences were evaluated through a quantitative tool called the Historical Word Association Test (HWAT), which aims to evaluate the general view of students about the historical period and the sociocultural circumstances involved. The students who participated in the didactic activity showed improvement in the identification and retention of ideas associated to the history of the discovery of the microscopic world, comparing to students who did conventional activities. / O presente estudo busca mostrar que a Alfabetização Científica envolve mais do que o domínio das teorias científicas e conceitos, mostra que é preciso incorporar a compreensão sobre a Natureza da Ciência, assim promovendo o desenvolvimento de competências científicas em sala de aula. A História da Ciência é um componente importante para compreender a Natureza da Ciência. Este estudo realizou-se em uma escola rural de ensino fundamental, com estudantes entre 12 a 15 anos de idade, foi desenvolvido por meio de uma atividade colaborativa visando reescrever o livro clássico Micrographia, escrito por Robert Hooke, em 1665, testamos a hipótese de que com esta atividade é possível ensinar aspectos sobre a História e a Natureza da Ciência desenvolvendo competências científicas. Para reescrever o livro, primeiramente os alunos foram apresentados ao contexto histórico em que viveu Robert Hooke, demonstrando aspectos culturais e científicos relacionados ao período histórico. Na próxima etapa, os alunos exploraram o ambiente escolar e domiciliar utilizando um microscópio feito por eles mesmos, construído com garrafas PET e lentes obtidas em leitores de CD/DVD para desvendar um mundo invisível que até então não conheciam. Após estas etapas, os alunos tiveram que desenhar e descrever as estruturas observadas nos microscópios, de forma colaborativa reescreveram o livro clássico criando uma réplica. As evidências de aprendizagem foram avaliadas por meio de uma ferramenta quantitativa, denominada Teste de Associação de Palavra Histórica (TAPH), que visa avaliar a visão geral de estudantes sobre o período histórico e as circunstâncias socioculturais envolvidas. Os alunos que participaram da atividade didática mostraram melhoria na identificação e retenção de ideias associadas à história da descoberta do mundo microscópico, comparando com estudantes que fizeram atividades convencionais.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RoberioMN.pdf: 839058 bytes, checksum: 1087756ecda3734e7aef07c3e72cb26c (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / ?-D-glucosidase (EC 3.2.1.21) is one of the most interesting glycosidases, especially for hydrolysis cellobiose releasing glucose, is last step degradation of cellulose. This function makes the ?-D-glucosidase is of great interest as a versatile industrial biocatalyst, being critical to various bio-treatment / biorefinery processes, such as bioethanol production. Hen in the report, a ?-D-glucosidase was extracts from protein extracted of the invertebrate marine Artemia franciscana was purified and characterized with a combination of precipitation with ammonium sulfate (0 - 30%, 30 to 50%, 50 to 80%), the fraction saturated in the range of 30 to 50% (called F-II) was applied in a molecular exclusion chromatography, in Sephacryl S-200, the fractions corresponding to the first peak of activity of ?-D-glucosidase were gathered and applied in a chromatography of ion exchange in Mono Q; the third peak this protein obtained chromatography, which coincides with the peak of activity of ?-D-glucosidase was held and applied in a gel filtration chromatography Superose 12 where the first peak protein, which has activity of ?-D-glucosidase was rechromatography on Superose 12. This enzyme is probably multimerica, consisting of three subunit molecular mass of 52.7 kDa (determined by SDS-PAGE) with native molecular mass of 157 kDa (determined by gel filtration chromatography on Superose 12 under the system FPLC). The enzyme was purified 44.09 times with a recovery of 1.01%. Using up p-nitrophenyl-?-D-glucopiranoside as substrate obtained a Km apparent of 0.229 mM and a Vmax of 1.109 mM.60min-1.mL-1mM. The optimum pH and optimum temperature of catalysis of the synthetic substrate were 5.0 and 45 ?C, respectively. The activity of the ?-D-glucosidase was strongly, inhibited by silver nitrate and N- etylmaleimide, this inhibition indicates the involvement of radical sulfidrila the hydrolysis of synthetic substrate. The ?-D-glucosidase of Artemia franciscana presented degradativa action on celobiose, lactose and on the synthetic substrate ?-nitrophenyl-?-D-glucopiranoside indicating potential use of this enzyme in the industry mainly for the production of bioethanol (production of alcohol from the participating cellulose), and production hydrolysate milk (devoid of milk lactose) / ?-D-glicosidase (EC 3.2.1.21) ? uma das mais interessantes glicosidases, especialmente por hidrolisar celobiose liberando glicose, ?ltimo passo de degrada??o de celulose. Esta fun??o faz com que a ?-D-glicosidase seja de grande interesse como um vers?til biocatalizador industrial, sendo critica para v?rios processos de bio-tratamento / biorrefinaria, como produ??o de bioetanol. Neste trabalho, uma ?-D-glicosidase extra?da de extratos prot?icos do invertebrado marinho Artemia franciscana foi purificada e caracterizada com uma combina??o de precipita??o com sulfato de am?nio (30; 50; 80%), a fra??o saturada na faixa de 50% (chamada F-II) foi aplicada em uma cromatografia de exclus?o molecular em Sephacryl S-200, as fra??es correspondentes ao primeiro pico de atividade da ?-D-glicosidase foram reunidas e aplicadas numa cromatografia de troca i?nica em Mono Q; o terceiro pico prot?ico obtido nessa cromatografia, o qual coincide com o pico de atividade da ?-D-glicosidase, foi reunido e aplicado numa cromatografia gel filtra??o Superose 12 onde o primeiro pico prot?ico, o qual possui atividade da ?-D-glicosidase, foi recromatografado em Superose 12. Esta enzima provavelmente ? multimerica, constitu?da por tr?s subunidades, de massa molecular de 52,7 kDa (determinado por SDS-PAGE) e com massa molecular nativa de 157 kDa (determinado por cromatografia gel filtra??o em Superose 12 sob o sistema FPLC). A enzima foi purificada 44,09 vezes com uma recupera??o de 1,01%. Utilizando-se ?-nitrofenil-?-D-glicopiranos?deo como substrato obtivemos uma Km aparente de 0,229 mM (12,7 ?M de produto/cm/hora) e Vm?x de 1,109 mM.60min-1.mL-1. O pH ?timo e a temperatura ?tima de cat?lise do substrato sint?tico foram 5,0 e 45?C, respectivamente. A atividade ?-D-glicosid?sica foi fortemente inibida por nitrato de prata e N-etilmaleimida, esta inibi??o indica o envolvimento de radicais sulfidrila na hidr?lise do substrato sint?tico. A ?-D-glicosidase de Artemia franciscana apresentou a??o degradativa sobre celobiose, lactose e sobre o substrato sint?tico ?-nitrofenil-?-D-glicopiranos?deo, indicando potencial uso desta enzima na ind?stria principalmente para produ??o de bioetanol (produ??o de ?lcool a parti de celulose) e produ??o de leite hidrolisado (leite destitu?do de lactose)