Centro Universitário de Patos de Minas / Caryocar brasiliense is a plant popularly known as pequi, native from the Brazilian cerrado , and is widely used in Brazilian cookery. Its fruit presents a high level - carotenes (which is a pro-vitamin A), retinol and vitamin C. These are efficient antioxidizing components, and they scavenging free radicals and prevent mutagenic action of physical and chemical agents. However, in high concentrations it may have mutagenic and recombinogenic effects. So to valuate the genotoxic effects of the pequi we prepared aqueous extracts of pequi (AEP) in concentrations of 1%, 5% and 10%. For this we used the wing spot test in Drosophila melanogaster (Somatic Mutation And Recombination Test SMART). The SMART was fulfilled through the following crossings: 1) standard cross (ST); flare3 virgin females (flr3/TM3, Bds) were crossed with mwh/mwh males; 2) HB High Bioactivation Cross which ORR (ORR, flr3/TM3, Bds) virgin females were crossed with mwh/mwh males. From these crossings, we obtained two kinds of descendents: marked heterozygote (MH - mwh +/+ flr3); balanced heterozygote (BH - mwh +/+TM3, Bds). 72-hour larvae from both crossings were treated with different concentrations of AEP (1%, 5% e 10%). Distilled water and doxorubicin (DXR) (0,125mg/mL) were respectively used as negative and positive controls. The present study aimed the valuating the genotoxic effects of AEP and its antigenotoxic effects against the genotoxic action of DXR (0,125mg/mL). The results obtained demonstrated that AEP induced a statistically significant increase in the frequency of mutant spots, when compared to negative control in all concentrations of HB crossi and only in the concentration of 10 % of ST crossi. In the analysis of HB descendents, we observed a recombinogenic effect of AEP, only when metabolized by P-450. When associated to DXR, there may be an overpotentiality of the genotoxic effect of this chemotherapy. This way, we may conclude that, in these experimental conditions and in the tested concentrations, the aqueous extract of pequi presented a mutagenic and recombinogenic potential. / A Caryocar brasiliense é uma planta, conhecida popularmente como pequi, nativa do cerrado brasileiro, amplamente utilizada na culinária brasileira. O fruto do pequizeiro apresenta alto teor de carotenos (que é uma pro-vitamina A) e retinol e vitamina C. Esses compostos são eficientes antioxidantes, seqüestrando radicais livres e prevenindo a ação mutagênica de agentes físicos e químicos. Contudo, em altas concentrações, podem ter efeitos recombinogênicos e mutagênicos. Para avaliar os efeitos genotóxicos do pequi foram preparados extratos aquosos do pequi (EAP) nas concentrações de 1%; 5% e 10%. Para tanto, utilizou-se o teste da mancha da asa em Drosophila melanogaster (Somatic Mutation And Recombination Test SMART). O SMART foi realizado por meio dos seguintes cruzamentos: 1) cruzamento Padrão (ST Standard Cross): fêmeas virgens flare3 (flr3/TM3, Bds) foram cruzadas com machos mwh/mwh; 2) cruzamento de alta bioativação (HB High Bioactivation Cross ), no qual fêmeas virgens ORR (ORR, flr3/TM3, Bds) foram cruzadas com machos mwh/mwh. Desses cruzamento foram obtidos dois tipos de descendentes: heterozigoto marcado (MH - mwh +/+ flr3); heterozigoto balanceado (BH - mwh +/+ TM3, Bds). Larvas de 72 horas, de ambos cruzamentos, foram tratadas com diferentes concentrações de EAP (1%, 5% e 10%). Como controles negativo e positivo foram utilizados, respectivamente, água destilada e doxorrubicina (DXR) (0,125mg/mL). O trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos genotóxicos do EAP e seus efeitos antigenotóxicos contra a ação genotóxica da DXR (0,125mg/mL). Os resultados obtidos demonstraram que o EAP induziu um aumento, estatisticamente significativo, na freqüência de manchas mutantes quando comparado com o controle negativo em todas as concentrações do cruzamento HB e somente na concentração de 10% do cruzamento ST. Na análise dos descentes BH observou-se efeito recombinogênico, do EAP, somente quanto metabolizado pelas P-450. Quando associado a DXR ocorre uma potencialização do efeito genotóxico desse quimioterápico. Portanto, pode-se concluir que, nestas condições experimentais e nas concentrações testadas, o extrato aquoso de pequi apresentou um potencial mutagênico e recombinogênico. / Mestre em Genética e Bioquímica

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 570177 bytes, checksum: d71e9d24e3e0eda58b4a211dd8553b04 (MD5) Previous issue date: 2008-12-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The effect of genetic drift on populations has been the subject of many studies due to a reduction in the effective population size. It may seem that the case has only effect on the genetic composition of populations. Meanwhile, a random sampling of gametes in small populations has significant consequences for the conservation of genetic diversity, as the loss of genetic diversity and fixation of alleles within the population. Genetic diversity is fundamental to the evolution. The natural selection operates between the variations within populations to adjust to the environment, providing variation among populations and, finally, variation among species. Thus, the higher the genetic variability exists in the population, the greater the chances of exploitation by breeders in their work. The maintenance of genetic variability in populations is the basis for the conservation of species and hence the description and study of the effect of genetic drift which appears on it, is reason for the search. Thus, the research aimed to analyze the effect of genetic drift on the genetic diversity of different populations. For that were generated and analyzed data from the simulation of populations. One of the key factors to evaluate the effect of genetic drift is the size of populations to be worked. To study and acquisition of genetic differentiation within and between populations under the effect of genetic drift, 4000 were simulated populations originated from molecular markers co- dominant. The samples were generated, 20, 50, 100 and 200 individuals with 100 sub-populations subjected to 10 generations of random mating with emphasis on 10 loci. The populations were evaluated with different indices of genetic diversity between and within: heterozygosity and inbreeding, Distance Shannon - Wiener (1978), Index of diversity of Nei (1973), Index of Fixing Wright (1951, 1978), heterozygosity for Weir (1996), Analysis of molecular variance (AMOVA) of Excoffier, et al., (1992). We conclude that the effect of genetic drift by changing the gene frequency depends on the size of the population. The lower the population, most obvious are the effects of random sampling, the statistics GST, FST and oST increase their value to the advancement of generations, a result of loss of genetic variation within and genetic divergence among populations. / O efeito da deriva genética sobre as populações de pequenos tamanhos tem sido objeto de diversos estudos, apresentando efeito sobre a composição genética das populações. A amostragem dos gametas ao acaso dentro de pequenas populações com perda de diversidade genética e fixação de alelos, tem conseqüências de grande significado para a conservação da diversidade genética e das espécies. A diversidade genética é fundamental para que ocorra a evolução. A seleção natural atua entre as variantes dentro das populações em relação à adaptação ao ambiente, proporcionando variação entre populações e, por fim, variação entre espécies. A manutenção da variabilidade genética em populações é a base da conservação de espécies e, portanto, a descrição e o estudo do efeito da deriva genética sobre as populações se tornam de grande importância. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito da deriva genética sobre a diversidade genética de diferentes populações simuladas de diferentes tamanhos. Para o estudo da diferenciação genética dentro e entre populações sujeitas ao efeito da deriva genética, foram simuladas 4000 populações originadas de marcas moleculares co-dominantes. As amostras geradas foram de 20, 50, 100 e 200 indivíduos com 100 subpopulações submetidas a 10 gerações de acasalamento ao acaso com base em 10 locos. As populações foram avaliadas por meio dos seguintes índices de diversidade genética entre e dentro: Endogamia e Heterozigosidade, Distância Shannon Wiener (1978), Índice de diversidade de Nei (1973), Índice de Fixação de Wright (1951, 1978), Heterozigosidade de Weir (1996), Análise de variância molecular (AMOVA) de Excoffier, et al., (1992). Conclui-se que o efeito da deriva genética alterando a freqüência gênica depende do tamanho da população. Quanto menor a população, maiores são os efeitos da amostragem, evidenciados pelas estatísticas GST, FST e oST, que aumentam seu valor com o avanço das gerações, indicando perda de variação genética dentro e aumento da divergência genética entre as populações.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3353732 bytes, checksum: c5790f6e05ae09dfbd6df05a41f56053 (MD5) Previous issue date: 2009-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The first part of this work involved the development and genetic mapping of a new battery of microsatellites for Eucalyptus derived from ESTs. Screening of 232 microsatellites derived from ESTs was carried out using a panel of 12 individuals corresponding to the parents used for population development in the Genolyptus project. Among the successfully amplified loci, 78% were polymorphic and showed complete inter-specific transferability. Thirty six loci were selected for mapping based on the amplicon size (< 400 pb), repeat motif and positive BLAST with interesting genes in public databases. With the objective of mapping, 36 loci were evaluated with regard to polymorphism and segregation in a reference segregating population derived from a cross between E. grandis x E. urophylla. The proportion of loci segregating in a fully informative configuration was about 40% lower than the one seen for microsatellites derived from genomic-enriched libraries. In spite of a relatively lower genetic information content, these loci are interesting for mapping, as they correspond to genes, allowing comparative mapping and potential co-location with QTL. Among the informative loci, 20 were successfully mapped in the particular reference mapping population. These mapped loci were characterized for polymorphism information content. Although EST derived microsatellites are generally less informative than those derived from non coding genomic regions they can be effectively used for individual identification, paternity analysis, evaluation of genetic diversity, certification of controlled crosses, genetic mapping and marker-assisted selection. In the second part of this work the coincidence in QTL detection was investigated by comparing the position and magnitude of effect of QTLs for wood and growth properties in three partially connected segregating populations of Eucalyptus spp. in two contrasting environments (Guanhães-MG and Guaíba-RS) over 3,000 km apart in a north-south latitude gradient. The families studied were: (E. camadulensis) x (E. urophilla x E. globulus), C1 x UGL, (E. dunnii x E. grandis) x (E. urophylla x E. globulus), DG x U2, and (E. dunnii x E. grandis) x (E. uropyilla), DG x UGL. Microsatellite markers flanking QTLs mapped in previous studies in these three families in Guaíba-RS were selected for the coincidence study. These markers were mapped using different sets of individuals from the same three families planted in Guanhães-MG. QTLs for eight quantitative traits related to wood and growth properties were studied. Two QTL (height and depth of pilodyn penetration, i.e. wood density) were detected in common for the two environments in the UGL parent (cross C1 x UGL); two (lignin content and pulp yield) in parents DG and U2 respectively (cross DG x U2) and four QTLs (two for diameter at breast height, one for height and one for volume), two of them colocalized with QTLs for biologically correlated traits (r > 0.8), in the parent UGL (cross DG x UGL). Furthermore, three QTLs (diameter at breast height, height and pilodyn penetration depth) located on linkage group 6 of the parent UGL were stable across the different genetic backgrounds and environments. Results indicate that QTLs of major effect for wood property traits are consistently detected in contrasting environments and/or different genetic backgrounds, suggesting that environmental variability and genetic background did not have a detectable impact on the action of the genes or genomic regions underlying these QTL, while other QTLs detected only in one of the environments are possibly under strong environmental interaction. These novel results are relevant, given that they provide target regions for marker assisted selection within families and starting point for association genetics studies. / No primeiro capítulo desta tese, foi desenvolvido e geneticamente mapeado um novo conjunto de microssatélites para Eucalyptus spp. derivados de EST (Expressed Sequence Tag). Foi feita uma triagem de 232 microssatélites derivados de EST utilizando-se um painel de 12 indivíduos correspondendo aos parentais das populações segregantes do projeto Genolyptus. Dentre os locos amplificados com sucesso, 78% foram polimórficos e apresentaram um nível elevado de transferibilidade interespecífica. Trinta e seis locos foram selecionados para mapeamento com base no tamanho dos segmentos amplificados (< 400 pb), motivos de repetição e BLAST positivo com genes de interesse em bancos públicos de dados. Com o objetivo de mapeamento, os 36 locos foram avaliados quanto ao polimorfismo e a segregação em uma população de referência envolvendo os parentais E. grandis x E. urophylla, verificando-se que a quantidade de locos totalmente informativos foi cerca de 40% menor quando comparados com microssatélites derivados de bibliotecas genômicas enriquecidas. Apesar da menor hipervariabilidade estes locos são interessantes para mapeamento, pois correspondem a regiões gênicas, possibilitando mapeamento comparativo e potencial colocalização de genes com QTLs. Dos locos em configuração informativa de segregação, 20 foram mapeados com sucesso. Estes locos mapeados foram caracterizados quanto ao seu conteúdo de informação para análise genética. Embora os microssatélites derivados de EST sejam menos polimórficos que os microssatélites derivados de sequências não codificantes, ainda assim eles podem ser utilizados com eficiência na discriminação de indivíduos, estudos de parentesco, avaliação de diversidade genética, mapeamento genético e seleção assistida por marcadores. O segundo capítulo teve como objetivo a verificação da coincidência de detecção de QTLs por meio da comparação da posição genômica e magnitude de efeito de QTLs para características silviculturais de crescimento e de qualidade da madeira em amostras de descendentes de três famílias segregantes de Eucalyptus spp. em dois locais experimentais contrastantes (Guanhães- MG e Guaíba- RS). As famílias estudadas foram: (E. camadulensis) x (E. urophilla x E. globulus), C1 x UGL, (E. dunii x E. grandis) x (E. urophilla x E. globulus), DG x U2, e (E. dunii x E. grandis) x (E. urophilla), DG x UGL. Primeiramente foram selecionados marcadores microssatélites flanqueantes e internos às regiões de QTL mapeados em experimentos anteriores para estas três famílias oriundas do ambiente de Guaíba-RS. Posteriormente mapeou-se estes marcadores utilizando-se diferentes indivíduos destas mesmas três famílias oriundos do ambiente de Guanhães-MG. Foram estudados QTLs para oito características quantitativas relacionadas com desempenho silvicultural e qualidade da madeira. Detectou-se dois QTLs (altura e profundidade de penetração do Pilodyn) em comum para os dois ambientes, no genitor UGL da família C1 x UGL; dois QTLs (teor de lignina e rendimento depurado) nos genitores DG e U2 respectivamente, do cruzamento DG x U2 e quatro QTLs (dois para diâmetro à altura do peito, um para altura e um para volume) no genitor UGL, do cruzamento DG x UGL, sendo que dois destes se colocalizaram com QTLs para características biologicamente correlacionadas (r > 0,8). Ainda, três QTLs (diâmetro à altura do peito, altura e profundidade de penetração do Pilodyn) localizados no grupo de ligação 6 do genitor UGL se mostraram estáveis entre os diferentes backgrounds genéticos e ambientes. Os resultados indicam que QTLs de maior efeito para características de qualidade da madeira são detectados em ambientes contrastantes e/ou entre diferentes backgrounds genéticos, sugerindo que a variabilidade ambiental e de background genético não teve impacto detectável sobre a expressão dos genes presentes nestes QTLs. Estes resultados inéditos para Eucalyptus são relevantes, pois fornecem regiões alvo interessantes para a seleção assistida dentro de famílias via seleção para QTLs ou ainda como ponto de partida para estudos de genética de associação.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 831305 bytes, checksum: 7de0dccf59e4128a858ec0de24b05804 (MD5) Previous issue date: 2009-08-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a crop of great nutritional, economical and social importance. Breeding programs use molecular markers as important auxiliary tools for various types of genetic studies. Different classes of molecular markers have been developed, and among them microsatellites highlight. Microsatellites are DNA simple sequence repeats (SSR) distributed in tandem along the genome, forming highly variable polymorphic sites, enabling their use as molecular markers. SSRs are codominant, multiallelic, and thus can be used in several types of studies, mainly for genetic mapping. Primers flanking microsatellite sequences are commonly developed from genomic libraries, enriched genomic libraries, sequences obtained from databases and, alternatively, from internal simple sequence repeats (ISSR-PCR). Common bean breeding molecular geneticists have developed SSR markers for mapping specific traits of interest. However, a saturated consensus genetic map for common bean has not been established so far that can be used as a reference for the development of specific maps. Therefore, the BIOAGRO/UFV common bean breeding program developed a population of recombinant inbred lines (RILs) which is suggested to be used to integrate, in one single map, all microsatellite markers that have been developed so far. However, to saturate the map, there must be a great number of markers available. The objective of the present study was to develop and validate primers that amplify microsatellites sequences obtained from enriched genomic libraries and from ISSR sequences. In the first case, two enrichedgenomic libraries for microsatellite sequences, that had been developed in a previous study, were used. In the present study, 207 clones were selected from these two genomic libraries. One hundred and ninety six of these clones (94.68%) were sequenced and 184 (88.89%) of them could be analyzed, 133 clones from library 1 and 51 from library 2. Forty eight redundant clones (26.09%) were detected. Clone analysis led to the identification of 66 (49.62%) microsatellite motifs in library 1 and 20 (39.22%) in library 2, and 56 primer pairs were designed. From the 56 primer pairs developed, 34 were characterized andtested in 20 Mesoamerican and Andean genotypes, including AND277 and Rudá. All the primer pairs were able to generate PCR products and six (17.65%) generated polymorphic DNA bands among the tested genotypes. In the ISSR enrichment methodology, 250 clones were seleted with sizes over 400 bp. From these 250 clones, 168 (67.2%) were sequenced and 103 (41.2%) could be analyzed. Thirty redundant clones (29.13%) were detected. Clone analyses led to the identification of 58 microsatellite motifs (56.31%) and 32 primer pairs were developed. Out of these, 10 were characterized and tested in the same genotypes used in the previous methodology. Out of the 10 primer pairs tested, six were identified as codominant markers and the other four as dominant. The codominant markers revealed no polymorphisms among the tested genotypes. Additionally, microsatellite containing sequences obtained from both methodologies were submitted to BLAST analysis against sequences deposited in public databases. Similarity was identified between the SSR sequences and transcribed and non-transcribed regions, from nuclear, mitochondrial and chloroplast genomes, and also with retrotransposon sequences. Both methodologies were effective for selecting, in common bean, sequences that contain microsatellites. The results obtained represent an initial effort to select molecular markers that will be mapped in the future RIL's consensus population, contributing for the construction of a satured genetic map for the species. In addition, these primers can be used in different types of genetic studies which are important for common bean breeding programs that use molecular markers. / O feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura de destacada importância nutricional, econômica e social. Programas de melhoramento genético do feijoeiro têm utilizado marcadores moleculares como importantes ferramentas auxiliares em diversos tipos de estudos genéticos. Diferentes classes de marcadores têm sido desenvolvidas, dentre as quais se destacam os microssatélites. Os microssatélites (SSR) são seqüências simples repetidas de DNA, que se repetem em tandem ao longo do genoma, formando sítios altamente polimórficos, o que possibilita o seu uso como marcas moleculares. Como marcadores, são codominantes, multialélicos, e aplicáveis em diversos tipos de estudos, principalmente no mapeamento genético. Primers que flanqueiam sequências SSR geralmente são desenhados a partir da construção de bibliotecas genômicas, bibliotecas genômicas enriquecidas, sequências depositadas em bancos de dados e, alternativamente, a partir de seqüências internas simples repetidas (ISSR). Geneticistas moleculares têm desenvolvido marcadores SSR com o intuito de mapear genes que codificam determinadas características de interesse. Entretanto, não existe um mapa consenso saturado para o feijão que sirva como referência para auxiliar na construção de mapas específicos. Nesta perspectiva, o Programa de Melhoramento Genético do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV desenvolveu uma população de RIL s que poderá ser usada para integrar, em um único mapa, todos os marcadores SSR já desenvolvidos. No entanto, para a saturação do mapa, há necessidade de um grande número de marcadores. O presente trabalho teve o objetivo de desenvolver e validar primers que amplifiquem regiões contendo microssatélites a partir da metodologia da construção de bibliotecas genômicas enriquecidas e a partir de ISSR. Na primeira metodologia, em trabalho anterior, foram construídas duas bibliotecas genômicas enriquecidas para seqüências SSR. No presente trabalho, a partir das bibliotecas genômicas desenvolvidas, foram selecionados 207 clones contendo insertos de tamanho desejado. Destes, foram seqüenciados 196 (94,68%), dos quais 184 (88,89%) puderam ser analisados, sendo 133 clones da biblioteca 1 e 51 da biblioteca 2. Foram detectados 48 (26,09%) clones redundantes. A análise dos clones permitiu identificar 66 (49,62%) motivos SSR na biblioteca 1 e 20 (39,22%) na biblioteca 2, a partir dos quais foram desenhados 56 pares de primers. Destes, 34 tiveram suas condições de amplificação otimizadas e padronizadas e foram testados quanto ao polismorfismo detectado entre 20 genótipos andinos e mesoamericanos, incluindo os genitores AND277 e Rudá. Todos os primers geraram produtos de amplificação e seis (17,65%) amplificaram produtos polimórficos entre os genótipos testados. Em relação à metodologia de enriquecimento por ISSR-PCR foram selecionados 250 clones contendo insertos com tamanho desejado, obtidos a partir da amplificação por ISSRPCR, clonagem dos fragmentos e transformação de células competentes. Dos 250 clones, 168 (67,2%) foram sequenciados e 103 (41,2%) puderam ser analisados. Foram detectados 30 clones redundantes (29,13%). A análise das sequências permitiu identificar 58 motivos microssatélites (56,31%) e foi possível o desenho de 32 pares de primers. Destes, 10 tiveram suas condições de amplificação padronizadas e foram analisados quanto ao polimorfismo detectado entre os mesmos 20 genótipos andinos e mesoamericanos utilizados na metodologia de bibliotecas genômicas enriquecidas. Dos 10 pares de primers testados, seis comportaram-se como marcadores codominantes e quatro como dominantes. Dos codominantes nenhum mostrou-se polimórfico dentre os genótipos testados. Adicionalmente, as sequências contendo motivos microssatélites, obtidas a partir das duas metodologias utilizadas, foram submetidas à busca por similaridade com sequências já caracterizadas em bancos públicos de sequências. Foi identificada similaridade com regiões transcritas e não traduzidas, e com regiões codificadoras de proteínas, a partir do genoma nuclear, mitocondrial e do cloroplasto, e também a partir de sequências advindas de retrotransposons. As duas metodologias utilizadas foram eficazes para a seleção, no feijoeiro, de seqüências contendo microssatélites. Estes resultados representam um primeiro esforço no sentido de selecionar marcadores moleculares que serão futuramente mapeados na população consenso de RILs, além de fornecer marcadores que poderão ser usados nos mais variados tipos de estudos genéticos, contribuindo de fundamental maneira para o aprimoramento dos programas de melhoramento do feijoeiro comum que utilizam marcadores moleculares.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaianeCCF.pdf: 438800 bytes, checksum: c847da48b438b366ac3a9e69d018618a (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Flowering is a process marked by switch of shoot apical meristem to floral meristem, and it involves a complex regulation by endogenous and environmental factors. Analyses of key flowering genes have been carried out primarily in Arabidopsis thaliana and have provided a foundation for understanding the underlying molecular genetic mechanisms controlling different aspects of floral development. Several homologous have been found in other species, but for crops species such as tomatoes this process is not well known. The aim of this work was to use the genetic natural variation associated to the flowering process and use molecular tools such as subtractive libraries and real time PCR in order to identify and analyze the expression from genes that may be associated to flowering in these two species: L. esculentum cv Micro-Tom and L. pimpinellifolium. Our results showed there were identified many genes related to vegetative and possibly to the flowering process. There were also identified many sequences that were unknown. We ve chosen three genes to analyze the expression by real time PCR. The histone H2A gene gave an expression higher in L. pimpinellifolium, due to this the expression of this gene may be associated to flowering in this specie. It was also analyzed the expression of an unknown gene that might be a key factor of the transition to flowering, also in L. pimpinellifolium. For the elongation factor 1-&#945; expression, the expression results were not informative, so this gene may have a constitutive expression in vegetative and flowering state. The results observed allowed us to identify possible genes that may be related to the flowering process. For further results it will be necessary a better characterization of them. / A flora??o ? controlada por condi??es ambientais e fatores end?genos que se associam numa rede de mecanismos gen?ticos bastante complexos. An?lises de genes chaves da flora??o foram feitas primariamente em Arabidopsis thaliana tem fornecido grande conhecimento sobre mecanismos gen?ticos que controlam diferentes aspectos do desenvolvimento floral. Existem muitos hom?logos descritos em diversas outras esp?cies, inclusive em plantas de interesse agron?mico como o tomateiro. Nesta planta, as varia??es gen?ticas naturais relacionadas com a flora??o podem ter origem em diferentes genes expressos durante o desenvolvimento. Com isso, o objetivo deste trabalho foi de prospectar genes associados ao processo de flora??o utilizando a varia??o gen?tica natural existente entre L. esculentum cv Micro-tom e L. pimpinellifolium, aplicando-se a metodologia de biblioteca subtrativa e an?lise de express?o por qPCR em tempo real. Os resultados obtidos permitiram uma identifica??o de alguns genes que possam ser associados ? flora??o nestas esp?cies. Foram encontrados nas bibliotecas subtrativas genes relacionados tanto com o desenvolvimento vegetativo quanto genes ligados ao desenvolvimento reprodutivo, al?m de muitos genes n?o identificados em bancos de dados. Foram analisadas as express?es de tr?s genes por qPCR. As an?lises sugerem uma prov?vel associa??o do gene da histona H2A com a flora??o em L. pimpinellifolium, al?m de ter sido identificado tamb?m um gene desconhecido que pode ser outro fator chave na transi??o do meristema floral nessa esp?cie. Para os dados de express?o do gene fator de elonga??o 1-&#945;, outro gene resultante da subtra??o de uma biblioteca com mensagens vegetativas, n?o foi encontrada liga??o com a flora??o. Visando-se melhor caracterizar este evento fisiol?gico em tomateiro, devem-se realizar estas an?lises para os outros genes identificados.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Tese (Doutorado) / O sistema imune é um importante mecanismo de defesa contra agressões, bem como participa na manutenção do equilíbrio orgânico. As moléculas sinalizadoras do sistema imune além de participarem de sinais que visam eliminar os antígenos, se relacionam com danos teciduais. Desta forma se tornam importantes alvos de estudos. Com o advento de técnicas imunológicas, nano biotecnológicas e ainda a inserção das ciências ômicas tem avançado em passos largos na busca de respostas ao desenvolvimento e interações de doenças, assim como na inserção de novas terapias ou mesmo mecanismos de prevenção. Essa abordagem traz 5 capítulos, todos relacionam o estudo de moléculas sinalizadoras para indução, tratamento ou diagnóstico de doenças. O primeiro capítulo aborda de forma geral todos os temas que foram discutidos ao longo da tese. O segundo capítulo aborda a interação de um beta bloqueador adrenérgico não seletivo com proteínas sinalizadoras da resposta inflamatória na doença periodontal associadas à participação da indução de doenças cardiovasculares. Os resultados demonstram uma diminuição das proteínas associadas com desenvolvimento de doença cardiovasculares após tratamento com antagonista beta adrenérgico não seletivo em baixas concentrações. O terceiro relaciona descritores que possibilitam a indicação de principais proteínas sinalizadores na doença periodontal crônica no idoso. Neste relatamos a falta de associação e/ou abordagens que inclua esta importante população relacionada com diminuição da capacidade responsiva do sistema imune e aumento de índices de doença periodontal. Ainda assim, evidenciamos uma proteína que pode estar relacionada ao processo fisiopatogênico da doença periodontal, incluindo ao idoso, a IL-33; da qual é relacionada com a ativação de osteoclastos independente de RankL. Após certificar do aumento de moléculas sinalizadoras, e evidentemente com o aumento de metabólitos no local que ocorre o processo inflamatório, o estudo foi direcionado para predizer alvos para diagnóstico na doença periodontal crônica do idoso. Esta abordagem do 4º capítulo permitiu a predição de 2 metabólitos fortemente correlacionado na população idosa com doença periodontal crônica. Por fim no quinto capítulo predizemos possíveis sequências com alta associação em se relacionar com o eixo IL-33/ST2, eixo este relacionado com a fisiopatogênese de diversas doenças inflamatórias, mediadas pelo perfil Th2, incluindo a doença periodontal crônica. Nesta abordagem foi possível indicar sequências com alto potencial na monitoração da ativação e/ou repressão de ST2, tanto diretamente pela interação de um pequeno peptídeo no sítio de ligação ST2, como pela interação com a proteína ligante a IL-33. Contudo esta tese permitiu contribuir para uma melhor compressão dos mecanismos fisiopatológicos da doença periodontal crônica experimental, bem como na indicação de um possível marcador biológico ao diagnóstico e tratamento da doença.

Dengue fever is caused by an arbovirus of the Flaviridae family, transmitted from person to another through an intermediate fly vector, Aedes aegypti. It is a tropical and subtropical infectious disease characterized by fever and strong pain in joints, which could also lead to bleeding in its hemorrhagic form. In this investigation, Phage Display technology was used to identify recombinant peptides with affinity to polyclonal antibodies (IgY) raised in immunized chickens with total proteins of the DENV-3 culture. Animal sera was purified in a HiTrap column and concentrated through dialysis. The IgY s were immunoreactive against DENV cultures, but were not type specific. Phage clones were selected from a random peptide library (PhD-7) in four cycles of biopanning against IgY. Selected phages were amplified in deepwell microtiter plates and submitted to ELISA tests. Immunoreactive clones against IgY were sequenced, translated and analysed through bioinformatics. Fourteen distinct clones were selected and aligned against viral proteome sequences and among themselves. Three consensus sequences among phage clones were detected: VLRN, APP and LPP. The peptide search in BLASTp showed similarity to the following viral proteins: polyprotein, envelop, and the nonstructural proteins NS1, NS2a, NS3 and NS5. All of them have matched with DENV-1, -2, -3, and/or -4 sequences, corroborating with the lack of type specificity of the raised IgY. Considering the VLRN motif, the analyses of antigenicity indexes of similar peptides demonstrated that its antigenicity is highly influenced by neighboring residues. Three-dimensional analysis of the DENV-2 capsid protein, with the alignment of the VLRN motif, have identified two target sequences, NRVSTVQQL and EIGRMLNILNRR, that are present in the polyprotein of all four viral types, which may contain the two possible domains VxRN and LRN, respectively. Six selected phages have presented known protein domains, and five of them presented specific phosphorylation and glycosylation sites, similar to known eukaryotic viruses; however, they may not be physiologically active sites in the dengue virus. Finally, the peptides were used to detect human IgG and IgM. ELISA tests were performed in two patients with isolated infections of DENV-1 or DENV-3. The reactivity of the 14 clones was superior to total antigens obtained from cultures, but they were not type specific. / RESUMO - GERAL A dengue é uma doença infecciosa febril aguda, transmitida de uma pessoa doente a uma pessoa sadia pela picada da fêmea contaminada de um mosquito Aedes aegypti. A doença é causada por um arbovírus, membro da família Flaviviridae e do gênero flavivirus. Existem quatro tipos de vírus da dengue: Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 e Dengue 4, e há um grande espectro de manifestações clínicas da doença, sendo as duas principais, a dengue clássica e a dengue hemorrágica. O diagnóstico geralmente é baseado em sintomas, e laboratorialmente é tardio, no entanto vários testes específicos para cada sorotipo. A tecnologia do Phage Display (exposição de biomoléculas em fagos) tem sido amplamente utilizada no mapeamento de epítopos de diversos antígenos, constituintes de vários agentes causadores de doenças. Com o objetivo de selecionar peptídeos recombinantes expressos no capsídeo de bacteriófagos produziu-se soro policlonal em galinhas previamente sensibilizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. Após 4 ciclos de seleção de uma biblioteca de fagos com peptídeos recombinantes lineares de 7 resíduos contra a IgY policlonal, 14 fagos imunorreativos foram selecionados e suas seqüências de ácidos nucléicos foram posteriormente analisadas por bioinformática. Foi possível identificar domínios protéicos comuns entre os peptídeos, sendo que o principal domínio mapeado foi VLRN. Testes subseqüentes se fazem necessários para a melhor caracterização destes peptídeos, incluindo possíveis aplicações diagnósticas e vacinais dos peptídeos selecionados. RESUMO - CAPÍTULO I A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviridae, transmitido de uma pessoa à outra através de um hospedeiro intermediário, o mosquito Aedes aegypti. É uma doença infecciosa tropical e subtropical caracterizada por febre e dor intensa nas articulações, além de sangramentos intensos quando na sua forma hemorrágica. Neste trabalho utilizou-se da tecnologia de exposição de peptídeos randômicos em fagos, phage display, no intuito de identificar peptídeos recombinantes com afinidade a anticorpos policlonais (IgY) gerados em galinhas imunizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. As IgYs dos animais foram purificadas em coluna HiTrap e concentradas por diálise. As IgYs foram imunorreativas contra todas as culturas de DENV, mas não foram tipo específico. Os clones foram selecionados de uma biblioteca de fagos randômicos (PhD-7) por quatro ciclos de seleção contra as IgYs. Os fagos selecionados foram amplificados em placas deepwell e submetidos a testes ELISA. Clones imunorreativos contra IgY foram seqüenciados, traduzidos e analisados por bioinformática. Quatorze clones distintos foram selecionados e alinhados contra a seqüência de dados do proteoma viral e entre todos eles. Três seqüências consenso entre os clones foram detectadas: VLRN, APP e LPP. A procura por prováveis seqüências protéicas do vírus da dengue no BLAST mostrou similaridade a diversos sítios protéicos virais: poliproteína, envelope e as proteínas não-estruturais NS1, NS2a, NS3 e NS5. Todas elas se alinharam com as seqüências dos tipos DENV-1, -2, -3, e/ou -4, corroborando com a falta de especificidade das IgYs. Considerando o motivo VLRN, as análises dos índices de antigenicidade dos peptídeos similares demonstraram que estes índices são altamente influenciados pelos resíduos vizinhos. Análise 3-D da proteína do capsídeo viral do tipo DENV-2, com superposição do motivo VLRN, identificou duas seqüências alvos, NRVSTVQQL e EIGRMLNILNRR, que estavam presentes na poliproteína dos quatro tipos virais, os quais podem conter dois prováveis domínios, VxRN e LRN, respectivamente. Domínios de fosforilação e glicosilação, encontrados em vírus eucarióticos, foram similares às seqüências presentes em cinco fagos recombinantes selecionados, o que não implica que estes motivos sejam fisiologicamente ativos no vírus da dengue. Finalmente, os peptídeos foram usados para detectar IgG e IgM humana. Testes ELISA foram realizados em dois pacientes com infecções isoladas de DENV-1 ou DENV-3. A reatividade dos 14 clones foi superior àquela observada para antígenos totais obtidos das culturas, embora não tenha sido específica. / Mestre em Genética e Bioquímica

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_otavio_martins_cruz.pdf: 364672 bytes, checksum: 4c494367518aef716a4090f1f8e5da0e (MD5) Previous issue date: 2012-10-25 / The spontaneous abortion (SA) is characterized as a loss of fetal product before 20 weeks of gestation and its etiology has not completely understood. Numerous studies have shown that polymorphisms in the gene of the enzyme metilenotetrahydrofolate reductase (MTHFR) are involved in susceptibility to AE. Then, the present study was conducted to evaluate the polymorphisms 677C>T and 1298A>C MTHFR gene and their associations in susceptibility to spontaneous abortion in a sample of women in the South of Brazil in a casecontrol approach. Ninety-eight women with SA (cases) and two hundred and twenty-seven healthy women with no history of miscarriage (controls) were studied. Genotyping of MTHFR677C>T and MTHFR1298A>C polymorphisms were analyzed by allele discrimination with TaqMan® pre-designed probes in Real Time PCR. The results showed that there was not difference in the distribution of allelic and genotypes frequencies of MTHFR677C>T and MTHFR1298A>C SNPs between cases and control group. It was observed an increase in the risk of SA in relation to genotype THFR1298CC when compared to genotype MTHFR1298AA (RR: 1,13 95%CI: 1,04; 1,23; p=0.02). Moreover, the classification of the type of abortion is different between genotypes of MTHFR1298A>C polymorphism (p = 0.03). In the control group, non-electron carriers of 677T allele have a higher number of pregnancies than women 677T (p = 0.04). The results presented in our work suggests that the CC genotype of polymorphism MTHF1298A > C is associated with increased risk of SA. However, the polymorphism MTHFR677C>T is not involved in the occurrence of miscarriage in studied population. / O aborto espontâneo (AE) é caracterizado como a perda do produto fetal antes de 20 semanas de gestação e sua etiologia não é completamnete esclarecida. Inúmeros estudos têm demonstrado que polimorfismos no gene da enzima metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) estão envolvidos na susceptibilidade ao AE. Dessa forma, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os polimorfismos 677C>T e 1298A>C do gene da MTHFR e suas associações na susceptibilidade ao aborto espontâneo em uma amostra de mulheres do Sul do Brasil em uma abordagem de caso-controle. Noventa e oito mulheres com AE (casos) e duzentas e vinte sete mulheres saudáveis e sem histórico de aborto espontâneo (controles) foram estudadas. A genotipagem dos polimorfismos MTHFR677C>T e MTHFR1298A>C foi analisada através da técnica de discriminação alélica com uso de sondas pré-desenhadas TaqMan® por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que não houve diferença na distribuição das frequências dos alelos e dos genótipos dos SNPs MTHFR677C>T e MTHFR1298A>C entre os casos e o grupo controle. Foi observado um aumento do risco de AE em relação ao genótipo MTHFR1298CC quando comparado ao genótipo MTHFR1298AA (RR: 1,13 95%IC: 1,04; 1,23; p=0.02). Além disso, a classificação do tipo de aborto é diferente entre os genótipos do polimorfismo MTHFR1298A>C (p = 0,03). No grupo controle, mulheres não-carreadoras do alelo 677T apresentam um maior número de gestações do que mulheres 677T (p = 0,04). Os resultados apresentados neste trabalho sugerem que o genótipo CC do polimorfismo MTHF1298A>C é associado ao aumento do risco do AE, entretanto, em nossa população, o polimorfismo MTHFR677C>T não está envolvido na ocorrência do aborto espontâneo.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-15T11:27:01Z No. of bitstreams: 1 talithacaiafaferreiraalvesbotelho.pdf: 1130454 bytes, checksum: c1b10245c9b48a2632cac3cd710bbb13 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:22:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 talithacaiafaferreiraalvesbotelho.pdf: 1130454 bytes, checksum: c1b10245c9b48a2632cac3cd710bbb13 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:22:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 talithacaiafaferreiraalvesbotelho.pdf: 1130454 bytes, checksum: c1b10245c9b48a2632cac3cd710bbb13 (MD5) Previous issue date: 2014-05-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A crescente busca por novos compostos antimicrobianos, devido a altas taxas de resistência aos mesmos, tem sido objeto de estudo de vários pesquisadores no desenvolvimento de ferramentas para descobrimento e desenho de novos antimicrobianos. No presente trabalho utilizamos três estirpes de Brucella abortus: RB51, S19 e S2308. As bactérias são cocobacilos, gram-negativas, intracelulares facultativas e, agente etiológico da brucelose em bovinos, bubalinos, humanos, ovinos e outros animais. O difícil tratamento da doença através da combinação de diferentes antibióticos está associado às altas taxas de resistência aos antibióticos utilizados contra a Brucella abortus, tornando-a uma bactéria de difícil controle e ao mesmo tempo um campo extenso de estudo para novos agentes antimicrobianos. Os peptídeos sintéticos são uma alternativa promissora como agentes antimicrobianos. No presente trabalho foram usados os peptídeos (Lalb1; Lalb1.2; Lalb1.3; Lrot3.5; Lrot3.6; Lrot3.7 e Lrot3.8) que possuem características baseadas em peptídeo naturais produzidos pelas plantas Lippia alba(Lalb) e Lippia rotundifolia (Lrot), e que foram modificados utilizando-se ferramentas computacionais de modelagem. Todos os peptídeos apresentaram atividade antimicrobiana em alguma das concentrações testadas (8, 16, 32, 64 e 128 μg/mL). Os peptídeos Lrot3.5 e Lrot3.6 além de apresentarem atividade antimicrobiana contra as três estirpes estudas na concentração 32μg/mL e demonstraram não diminuir a viabilidade celular de macrófagos em testes com redução de tetrazolio (MTT). Estes são, portanto, peptídeos promissores para estudos adicionais. / The search for new antimicrobial compounds leads many researchers to the development of tool for antimicrobial prospection and design due to the increasing of antibiotic resistance by bacteria. In the present study, three strains of Brucella abortus were used: RB51, S19 and S2308. The bacteria are coccobacilli, gramnegative, facultative intracellular and etiological agents of brucellosis in cattle, buffaloes, humans, sheep, and other animals. The treatment is very difficult and a combination of different antibiotics associated to high antibiotic resistance rates for commonly used drugs against Brucella abortus increases the difficult of microorganism control. Thus, an avenue of opportunities for an extensive research field for antimicrobial agents’ studies is opened. Synthetic peptides are a promising alternative for the development of new antimicrobial agents. In this study, the following synthetic peptides were used: Lalb1.2; Lalb1.3; Lrot3.5; Lrot3.6; Lalb1; Lrot3.7 and Lrot3.8 against Brucella strains. These peptides were developed based on natural characteristics of antimicrobial peptides produced by plants using Lippia alba (Lalb) and Lippia rotundifolia (Lrot) leaf transcritptome for antimicrobial prospection. All peptides showed antimicrobial activity for all of the evaluated concentrations (8, 16,32, 64 and 128 mg/mL). TheLrot3.5 and Lrot3.6 peptides showed antimicrobial activity against all of the three studied strains at the concentration 32μg/mL. These peptides at this concentration do not decrease cell viability of macrophages in tetrazolium reduction (MTT) tests and are prospective peptides for additional studies.

Made available in DSpace on 2015-09-25T12:20:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Wanessa Porto Tito Gambarra.pdf: 3492589 bytes, checksum: 3c41a91fa9b3b301b8f6bbcd99c71cf5 (MD5) Previous issue date: 2010-11-19 / The frequent use of temephos has resulted in development of insecticide resistance in Aedes aegypti, compromising control and favoring the transmission of diseases transmitted by him. This study aimed to obtain information on temephos resistance of A. aegypti collected in the municipalities of Paraíba, aiming to support health workers to develop strategies to monitor and control the populations of this vector. The twenty-four populations were collected in the towns of Alagoa Grande, Alagoa Nova, Campina Grande, Esperança, LagoaSeca e Serra Redonda, where eggs were collected using ovitraps from neighborhoods with high levels of vector infestation - area A neighborhoods and equidistant at 500 m, 1,000 m and 1,500 m away from the area, constituted the areas B, C and D, respectively. The eggs were taken to the laboratory for mosquito breeding, identification and determination of the index for Oviposition Trap (IAO). Geographical coordinates of each collection point were obtained, mounted an array of geographical distance with the number of blocks, the total number of residences and/or establishments positive or not. The laboratory bioassays were conducted from temephos, which was determined with the diagnostic dose. The homogenate protein L4 larvae was subjected to electrophoresis on 7.5% polyacrylamide gels. In this study we found that the IAO was high, above 20%. The highest incidence of vector was found for the Catolé district, area C of the City of Esperança with IAO 90%. All populations underwent diagnostic dose of 0.352 mg de i.a./L, where we had 0% mortality. Most LC90 was found in the city of Alagoa Nova, about thirty-eight times the value of LC90 to the susceptible population (Rockefeller - default). All populations showed RR bigger than 20, therefore is considered highly resistant. The esterase activity was visualized using the substrates &#945; and &#946;-naphthyl acetate, allowed the visualization of six regions of &#945; and &#946;-esterase, called EST- 1 EST- 6. The populations characterized as resistant showed two to six regions of esterase activity, whereas the susceptible population was viewed only one region of activity. / O uso frequente do temefós tem levado ao desenvolvimento de resistência a inseticida em Aedes aegypti, comprometendo o controle e favorecendo a transmissão das doenças por ele veiculadas. Assim, este trabalho teve como objetivo obter informações sobre a resistência ao temefós de populações de A. aegypti coletadas em municípios da Paraíba, visando subsidiar os agentes sanitários a desenvolverem estratégias de monitoramento e controle das populações deste vetor. As vinte e quatro populações estudadas foram coletadas nos municípios de Alagoa Grande, Alagoa Nova, Campina Grande, Esperança, Lagoa Seca e Serra Redonda, onde foram realizadas coletas de ovos utilizando-se ovitrampas, a partir de bairros com altos índices de infestação do vetor área A- e em bairros equidistantes a 500 m, 1.000 m e 1.500 m de distância da área A, constituindo as áreas B, C e D, respectivamente. Os ovos coletados foram levados ao laboratório para criação do mosquito, identificação e determinação do Índice de Infestação para Armadilha de Oviposição (IAO). Coordenadas geográficas de cada ponto de coleta foram obtidas, montada uma matriz de distância geográficas com o número dos quarteirões, o total de residências e/ou estabelecimentos positivos ou não. Os bioensaios de laboratório foram realizados com o temefós, do qual se determinou a dose diagnóstica. O homogenato protéico de larvas L4 foi submetido à eletroforese em géis de poliacrilamida 7,5%. Nesse estudo foi observado que o IAO foi elevado, acima de 20%. A maior incidência do vetor foi constatada para o bairro Catolé, área C do município de Esperança com IAO de 90%. Todas as populações foram submetidas à dose diagnóstica de 0,352 mg de i.a./L, onde obtivemos 0% de mortalidade. A maior CL90 foi verificada no município de Alagoa Nova, aproximadamente trinta e oito vezes o valor da CL90 para a população susceptível (Rockefeller padrão). Todas as populações estudadas apresentaram RR maior que 20, sendo, portanto, consideradas altamente resistentes. A atividade esterásica foi visualizada através dos substratos &#945; e &#946;-naftil acetato, possibilitando a visualização de seis regiões de &#945; e &#946;-esterase, denominadas EST-1 a EST-6. As populações caracterizadas como resistentes mostraram de duas a seis regiões de atividade esterásica, enquanto que a população suscetível foi visualizada apenas uma região de atividade.