Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Radek Machan Supervisor: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Title of diploma thesis: Determination of permeability and active transport of selected butyrylcholinesterase inhibitors in vitro European Medicine Agency (EMA) and Food and Drug Administration agency (FDA) emphasise drug membrane permeability and drug-drug interactions on ABC transporters expressed in physiological barriers should be investigated for compounds in preclinical studies or for those already clinically used but evidence free. In this work we aimed to assess the capability of several experimental butyrylcholinesterase inhibitors that had been designed to treat dementia to permeate blood-brain barrier and to elucidate role of ATP-binding (ABC) cassette transporters in this transport. For this purpose, we employed in vitro bidirectional transport study across monolayers formed by polarized and highly differentiated Caco-2 cells. The permeability values gained from measurements were similar to values of several commonly used drugs for treatment of CNS disorders (e.g. antidepressants, antiepileptics). In addition, the compounds showed values of efflux ratio (basolateral- to-apical/apical-to-basolateral) approximately one...

A permeabilidade através do epitélio intestinal tem se tornado um importante aspecto a ser determinado nas avaliações biofarmacotécnicas envolvendo fármacos e medicamentos. A técnica mais empregada para essa determinação in vitro é aquela que utiliza a cultura de células Caco-2. Entretanto, ainda são discutíveis as condições para a realização desses experimentos, uma vez que a padronização das mesmas é fator fundamental para a confiabilidade dos resultados. Nesta tese, foram avaliadas as condições para realização dos estudos de permeabilidade através de membranas de células Caco-2 para a rifampicina, principal fármaco utilizado no tratamento da tuberculose. Para tanto, foram investigados fatores tais como a citotoxicidade da rifampicina em diferentes concentrações, a influência da concentração do fármaco sobre a permeabilidade, do pH de realização dos experimentos e da presença de proteínas do muco intestinal, além da influência de proteínas plasmáticas. Foi também investigado o potencial indutor da rifampicina sobre a expressão da glicoproteína-P (Pgp) e seu impacto na permeabilidade da própria rifampicina. Os estudos foram desenvolvidos utilizando membranas de células Caco-2 provenientes da American Type Culture Collection (ATCC) cultivadas em placas Transwel®, a quantificação da fração permeada foi por cromatografia líquida de alta eficiência com métodos validados. A análise da indução da expressão da Pgp foi realizada por PCR-RT. Demonstrou-se que as concentrações da rifampicina (10,0; 25,0 e 50,0 µg/mL) não ocasionaram danos às células Caco-2 no estudo de citotoxicidade pela técnica que emprega o sal do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazoli)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). As concentrações de rifampicina (5,0; 10,0 e 25,0 µg/mL) não resultaram em valores estatisticamente diferentes de permeabilidade aparente (Papp) em células Caco-2 nas condições do estudo. A rifampicina apresentou valor de Papp significativamente maior em pH 6,8 dentre os valores de pH avaliados (5,8 ; 6,8; 7,4). A presença de muco simulado e de soro fetal bovino não resultou em valores de permeabilidade significativamente distintos do resultado obtido sem a sua adição ao experimento. A expressão da Pgp em células Caco-2 é induzida pela adição da rifampicina (10µg/mL), ocasionando diminuição da sua permeabilidade por mecanismo de efluxo. Pelos resultados de permeabilidade obtidos em todas as condições avaliadas, a rifampicina pode ser considerada um fármaco de alta permeabilidade de acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutica. / The permeability through the intestinal epithelium has become an important aspect to be determined in evaluations involving drugs and pharmaceutical products. The most common technique for this determination in vitro is one that uses the culture of Caco-2 cells. Nevertheless, the conditions for carrying out such experiments are still questionable, since the standardization of them is essential to the reliability of the results. In this thesis, we evaluate the conditions for the studies of permeability of rifampicin through membranes of Caco-2 cells, the main drug used in the treatment of tuberculosis. To this end, we examined factors such as cytotoxicity of rifampicin at different concentrations, the influence of drug concentration on the permeability, as well as the pH of the experiments, the presence of proteins of intestinal mucus, and the influence of plasma proteins. It was also investigated the potential of rifampicin on the expression of P-glycoprotein (Pgp) and its impact on the permeability of rifampicin itself. The studies were developed using membranes of Caco-2 cells from American Type Culture Collection (ATCC) grown on plates Transwel®, and the quantification of the fraction of drug permeated was obtained by high performance liquid chromatography with validated methods. The analysis of induction of expression of Pgp was performed by RT-PCR. It was demonstrated that the concentrations of rifampicin (10,0; 25,0 and 50,0 µg/mL) did not cause damage to Caco-2 cells in the study of the cytotoxicity technique that uses a bromide salt of 3 - (4,5-dimethyl-2 - thiazol) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT). The concentrations of rifampicin (5,0; 10,0 and 25,0 &#181g/mL) did not result in statistically different values of apparent permeability (Papp) in Caco-2 cells under the conditions of the study. Rifampicin showed a value of Papp significantly higher at pH 6.8 in comparison with other measured pH values (5,8 and 7,4). The presence of mucus simulated and fetal calf serum did not result in permeability values significantly different from the result obtained without its addition to the experiment. The expression of P-gp in Caco-2 cells is induced by the addition of rifampicin (10 µg/ml), decreasing its permeability by efflux mechanism. Taking into account the results of permeability obtained in all conditions, the rifampicin can be considered a high permeability drug according to the biopharmaceutical classification system.

Métodos in vitro utilizando epitélio intestinal animal são importantes ferramentas para avaliar a permeabilidade de fármacos, propriedade que é um importante parâmetro de biodiosponibilidade. Considerando que o maior objetivo na indústria farmacêutica é desenvolver novos fármacos com boa biodisponibilidade oral, o projeto teve como objetivo padronizar o modelo de permeação com membrana de intestino de rã (Rana catesbeiana) em células de Franz, comparando seus resultados com ensaios de células Caco-2. Os fármacos modelo utilizados foram os antivirais zidovudina e aciclovir. A quantidade de fármaco permeado foi determinada por método de eletroforese capilar para o método com intestino de rã touro e por HPLC-UV para os ensaios com células Caco-2. O parâmetro de permeação foi o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) dos fármacos para ambos modelos experimentais. Para estabelecimento do protocolo experimental dos estudos de permeabilidade intestinal de rã, foi proposto um projeto fracionado 24-1 com 4 ensaios adicionais usando o software Minitab, e as variáveis foram: secção intestinal, pH da solução de Ringer e temperatura. A análise do planejamento experimental feita pela estimativa dos parâmetros da regressão obtidos através dos resultados do modelo fatorial possibilitou a determinação dos coeficientes da equação matemática que definiu a influência das variáveis sobre o coeficiente de permeabilidade aparente dos fármacos. Os efeitos das variáveis pH e temperatura interpretados conjuntamente apresentaram interferência leve, porém as variáveis fármaco e secção intestinal interpretados juntos tiveram interferência importante, mostrando maior permeação dos fármacos através da secção inicial do intestino da rã. Os resultados de Papp foram: para o metoprolol, pelo método das células Caco-2 foi de 28 x 10-6 cm/s, valor que está de acordo com demais dados de células Caco-2 na literatura e o valor obtido com células de Franz que mais se adequada a estes resultados e demais disponíveis provenientes de outras técnicas na literatura, foi de 28,1 x 10-6 cm/s, em uma das condições do planejamento estatístico utilizando segmento final da membrana epitelial da rã. No caso do aciclovir, o resultado de Papp de 0,48 x 10-6 cm/s também obtido em uma das condições envolvendo segmento intestinal final da rã foi exatamente igual a o valor 0,48 x 10 - 6 cm/s, encontrado com células Caco-2 no presente estudo e estão de acordo com outros valores disponíveis na literatura por Trapani e colaboradores, 2004 e também com células Caco-2. Para zidovudina o valor de Papp obtido em uma das condições utilizando segmento intestinal inicial da rã, de 13 x 10-6 cm/s, foi a que mais se assemelhou ao obtido pela técnica de células Caco-2, 13,6 x 10-6 cm/s, e também está de acordo com demais dados da literatura. / There are lots of different in vitro technics in the literature using animal intestinal epithelium to estimate permeability of drugs, property that is an important parameter of bioavailabity. Considering that the main objective of Pharmaceutical Companies is the development of new drugs with good oral bioavailabity, the aim of this work was to standardize the permeability of antivirals using in vitro/ex vivo method of intestinal epithelium of Rana catesbeiana in Franz cells and compare these results to those obtained from studies using Caco-2 cells. Zidovudine and Acyclovir were selected as model drugs. The amount of drug permeated will be determined by the method of capillary electrophoresis for assays using Rana Catesbeiana and HPLC-UV for studies with Caco-2 cells. The permeation parameter determined was the apparent permeability coefficient (Papp) of drugs for both experimental models. To establish the experimental protocol to studies of intestinal permeability of frog, it was proposed a fractional 24-1 design with 4 additional tests using Minitab software and the variables were: intestinal section, pH of Ringer solution and temperature. The analysis of the experimental design made by the estimate of the regression parameters obtained from the factorial model results allowed the determination of the coefficients of the mathematical equation that defines the influence of the variables on the apparent permeability coefficient of acyclovir and zidovudine. The effects of pH and temperature interpreted jointly presented a slight interference, but the variables drug and intes tinal section interpreted together had major interference, showing greater permeation of drugs through the initial section of the intestine of the frog . The results of Papp were: for metoprolol, with the method of Caco-2 cells was 28 x 10-6 cm/s, a value which is consistent with other data of Caco-2 cells provided in the literature and the condition obtained with Franz cells that are most suitable for these and other results obtained from other techniques available in the literature, was 28.1 x 10-6 cm/s, provided with the final intestinal segment using frog epithelial membrane. In the case of acyclovir, the result of Papp of 0.48 x 10-6 cm/s obtained in one condition with final frog intestinal segment was exactly equal to the value of 0.48 x 10-6 cm/s, found with Caco-2 cells in the present study and are in agreement with other values available in the literature for Trapani and colegues, 2004 and also with Caco-2 cells. The Papp value for zidovudine obtained with the initial gut segment of frog, 13 x 10-6 cm /s was which more resembled that obtained by the technique of Caco-2 cells, 13.6 x 10-6 cm/s and is also consistent with other literature data.

Os transportadores de membrana do tipo ATP Binding Cassette (ABC) e solute carriers (SLC) regulam a homeostase intracelular de fármacos, modificando a biodisponibilidade e possivelmente a eficácia terapêutica. A variabilidade na resposta a hipolipemiantes, como as vastatinas, tem sido associada a vários fatores genéticos e ambientais. Com a finalidade de avaliarmos os mecanismos de regulação da expressão dos transportadores pela atorvastatina, a expressão de RNAm de transportadores ABC (ABCB1, ABCG2 e ABCC2) e SLC (SLCO1B1, SLCO2B1 e SLC22A1) foi avaliada por RT-PCRq em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 18 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 22 pacientes hipercolesterolêmicos (HC) tratados com atorvastatina (10mg/dia/4 semanas). A possível associação entre o polimorfismo ABCB1 C3435T e a expressão de RNAm também foi avaliada. Os estudos in vitro foram realizados com as células das linhagens HepG2 e Caco-2. Foram avaliados os efeitos da atorvastatina na ativação de fatores de transcrição (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1 e PXR) por ensaio de mobilidade eletroforética retardada em gel de poliacrilamida (EMSA) e na meia-vida do RNAm do gene ABCB1 por RT-PCRq, e a expressão e atividade funcional da proteína ABCB1 por Western blot, imunohistoquimica e citometria de fluxo. A proteina ABCB1 foi localizada por imunohistoquimica na membrana apical do canalículo biliar das celulas HepG2 e na membrana apical das Caco-2. O tratamento das células HepG2 com atorvastatina causou redução da expressão de RNAm do gene ABCB1 e aumento na expressão dos genes ABCG2 e ABCC2. Esses efeitos foram dose e tempo dependentes. O tratamento com atorvastatina das células Caco-2 não modificou a expressão dos transportadores de efluxo após 30 a 120 min. Nas células HepG2, as concentrações de 10 e 20 M de atorvastatina causaram diminuição da expressão de ABCB1 (0 &#181;M: 1,00 ± 0,06; 10 &#181;M: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 &#181;M: 0,69 ± 0,06, p< 0,05). A atividade da ABCB1, avaliada pelo efluxo de Rh123, mostrou-se estar reduzida em 41% nas células HepG2, após tratamento com atorvastatina 20 &#181;M. Embora a diminuição da expressão do ABCB1 não tenha sido decorrente de uma menor ativação transcricional, avaliada indiretamente por EMSA, estudos de mecanismos de regulação pós-transcricionais, revelaram que a atorvastatina diminui a estabilidade de RNAm do gene ABCB1. Esse resultado parece estar de acordo com o ocorrido nas CMSP, já que o tratamento com atorvastatina diminuiu a expressão de RNAm do gene ABCB1 nos indivíduos HC. Essa modulação, no entanto não está associada à presença do polimorfismo ABCB1 C3435T. Em relação aos transportadores de captação, a expressão do SLC22A1 nas células Caco-2 diminui após tratamento com atorvastatina por 30 min e não foi modificada nas células HepG2. Já o gene SLCO2B1 encontrou-se muito aumentado após 24 h de tratamento nas células HepG2. Estudos in vivo nas CMSP, mostrou que a expressão de mRNA basal dos transportadores nos HC foi 10 vezes maior que nos NL e diminuiu após tratamento com atorvastatina nos HC. Com os resultados obtidos podemos sugerir que diferenças no efeito da atorvastatina nos tipos celulares podem ser em decorrência da expressão tecido-específica de fatores de transcrição. No modelo de hepatócito, HepG2, a atorvastatina é um inibidor do transporte mediado pela ABCB1 e é capaz de diminuir a síntese e a função da ABCB1, via aumento da degradação de RNAm do gene ABCB1. Em conseqüência ocorre uma redução do efluxo pelo sistema biliar, causando aumento da concentração intracelular. Ainda, podemos concluir que em CMSP o colesterol pode ser o responsável pela modulação dos genes dos transportadores de membrana e que isso pode implicar em diferenças na eficácia da atorvastatina. / Specific membrane transporters have a significant impact on drug absorption and disposition. Most of them belong to two super-families, ABC (ATP-binding cassette) and SLC (solute-linked carrier). Statins are important therapeutic agents in the management of hypercholesterolemia, and considerable inter-individual variation exists in response to its therapy. The effects of atorvastatin expression of efflux (ABCG2 and ABCC2) and uptake (SLCO1B1, SLCO2B1 and SLC22A1) drug transporters were investigated by qPCR in Caco-2 and HepG2 cell lines and in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of eighteen normolipidemic (NL) and twenty two hypercholesterolemic (HC) individuals treated with atorvastatin (10mg/day/4 weeks). The possible involvement of ABCB1 C3435T polymorphism in ABCB1 mRNA expression was also evaluated. In vitro studies with the cell lines HepG2 and Caco-2 were also performed. The effect of atorvastatin on the activation of the promoter of ABCB1 by transcription factors (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1, and PXR) was evaluated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), and ABCB1 mRNA half-life were measured by PCRq. The expression and functional activity of ABCB1 were investigated by Western blot, imunohistochemistry and flow cytometry. Immunohystochemical analysis revealed that ABCB1 is located at the apical membrane of the bile canaliculi in HepG2, and in apical membrane of Caco-2 cells. Atorvastatin treatment of HepG2 cells caused a decreased in ABCB1 and an increase in ABCC2 and ABCG2 transcript levels. These effects were time and dose-dependent. Treatment of Caco-2 cells did not present any differences in efflux transporters mRNA levels. Treatment of HepG2 cells with 10 and 20 M atorvastatin caused a reduction on ABCB1 expression (0 &#181;M: 1,00 ± 0,06; 10 &#181;M: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 &#181;M: 0,69 ± 0,06, p< 0,05), and a 41% decrease in ABCB1-mediated efflux of Rhodamine123 (p < 0.01). Although reduced ABCB1 mRNA expression was not due to any repressor protein suppressing ABCB1 promoter activation, mRNA stability studies revealed that mRNA stability of ABCB1 was markedly decreased by atorvastatin treatment (2h versus 7h for control). In agrrement with these results, in PBMCs of HC individuals, atorvastatin treatment also reduced ABCB1 mRNA expression. However, the down-regulation was not associated with the presence of 3435T allele. For the uptake transporters, atorvastatin decreased SLC22A1 transcript levels after 30min-treatment and it was not regulated in HepG2. On the other hand, SLCO2B1 was up-regulated after 24h-treatment of HepG2 cells. In vivo studies with PBMCs revealed that during hypercholesterolemia all the drug transporters analyzed were increased almost 10-fold (p< 0.05), and after atorvastatin therapy the efflux and uptake transporters transcript levels were all down-regulated. These findings suggest that atorvastatin exhibits differential effects on mRNA expression of drug transporters depending on the cell type, which may be related to tissue-specific expression of transcription factors. Atorvastatin leads to decreased ABCB1 function and synthesis in HepG2 cells by increasing degradation of ABCB1 mRNA. Therefore, inhibition of ABCB1 may reduce atorvastatin elimination via bile, increasing its cellular concentrations. We also may suggest that in PBMCs cholesterol modulates mRNA expression of drug transporters, and this may contribute to the variability of response to atorvastatin.

Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC) que possuem a Ilha de Patogenicidade LEE são importantes patógenos humanos. A habilidade de adesão, invasão e perfil genético têm sido estudados, já que sorotipos que não possuem LEE tem sido isolados de pacientes com doença severa e intracelularmente. Das nove amostras relacionadas com doença, quatro (44.5%) apresentaram stx2+. Todas foram positivas para o gene lpfA e iha, e negativas para toxB. Três (33,3%) apresentaram saa e cinco hly. A maioria apresentou padrão de adesão difusa e invasão negativa em células HEp-2. Em CaCO-2 apresentaram aderência com variados graus de intensidade, e a maioria das amostras testadas apresentou invasão maior que 3,3%. Frente ao inibidor de polimerização de actina citocalasina D, houve significativa redução nos níveis de invasão, sugerindo que estas amostras utilizam um mecanismo da célula hospedeira para internalização, e que provavelmente, fatores de virulência como adesinas, favorecem a adesão das mesmas, compensando a ausência do LEE, e facilitando a instalação da infecção. / Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) that possess the pathogenic island LEE are important human pathogens. The adhesion ability, invasion and genetic profile have been studied, since serotypes that do not possess LEE have been isolated from humans with severe disease and found intracellular. Nine strains related with SHU, four (44,5%) were stx2+. All strains were positive for IpfA and iha genes and negative for toxB. Three (33,3%) showed saa and five hly. The most strains showed a diffusely adhesion pattern and negative invasion in HEp-2 cells. It presented various degrees of adhesion, and the most tested strains showed invasion high than 3,3% in CaCO-2. That was a significant reduction of invasion in the presence of actin polymerization inhibitor Citochalasin D, suggesting that these strains use a host cell mechanism to invade, and probably virulence factors, like adhesins, favors this adhesion and compensate LEE absence, promoting the installation of infection.

Listeria monocytogenes é uma bactéria transmitida principalmente via alimentos, podendo causar infecções graves em pessoas imunodeprimidas e durante a gestação, devido à sua capacidade de sobreviver intracelularmente. A formação de biofilmes por L. monocytogenes é um fator preocupante para as indústrias de alimentos, pois biofilmes comprometem a sanitização de superfícies, aumentando os riscos de contaminação. Além disso, alguns estudos indicam que a capacidade de formação de biofilme pode estar correlacionada com a capacidade de algumas bactérias causarem doença. O controle de L. monocytogenes representa um desafio, especialmente em alimentos refrigerados e prontos para o consumo, pois esta bactéria é de natureza psicrotrófica, ubíqua e adapta-se rapidamente a diferentes condições ambientais, por meio da modulação da expressão de seus genes. O efeito das condições ambientais na expressão de genes de virulência de L. monocytogenes não é totalmente compreendido. Neste trabalho, isolados de L. monocytogenes de diversas origens foram avaliados quanto à sua capacidade de formar biofilmes, de aderir/invadir em células eucarióticas e também de expressar o gene internalina (int A), que está relacionado com o potencial de virulência. A presença de bacteriocinas de bactérias láticas (BAL) e incubação a 5°C foram os principais fatores que influenciaram a formação de biofilmes por L. monocytogenes, em comparação com caldo BHI (controle). Em geral, a adesão/invasão de células Caco-2 foram significativamente menores em pH baixo (4,5), incubação a 5°C e na presença de 0,3% Oxgall (sais biliares). Entretanto, dois isolados de L. monocytogenes (INCQS 353 e Reg 26c) apresentaram aumento nas taxas de invasão quando cultivados na presença de NaCl a 5% (P<0,05). Um isolado de L. monocytogenes (H-2) obtido de hortaliças apresentou a maior capacidade de formação de biofilme e de invadir células Caco-2, sugerindo que há uma possível relação entre a formação de biofilme e de potencial de virulência. No ensaio para avaliação da expresão do gene inlA, todos os isolados foram regulados negativamente pela presença de bacteriocinas, Oxgall 0,3%, pH 4,5 e incubação a 5°C. No entanto, para um isolado de L. monocytogenes (HU 471), a expressão do gene int A foi oito vezes maior na presença de sacarose, indicando que os componentes de alimentos podem aumentar a virulência e o potencial de infecção de L. monocytogenes. / Listeria monocytogenes is a bacterium transmitted mainly by foods and can cause serious infections in immunocompromised individuals and in pregnant woman due to their ability to survive intracellularly. The biofilm formation by L. monocytogenes is a concern for the food industry because microorganism in biofilms may survive after treatment with sanitizers and increases the risk of food contamination. In addition, some studies indicate that the ability of biofilm formation can be correlated with virulence potential. The control of L. monocytogenes is a challenge, especially in chilled and ready to eat foods since it has psychrotrophic nature, it is ubiquitous and can adapt quickly to different environmental conditions by modulating the expression of its genes.The effect of environmental conditions on gene expression and virulence of Listeria monocytogenes is not fully understood. In this report, L. monocytogenes isolates from diverse sources were evaluated for their ability to form biofilms, for adhesion/invasion of eukaryotic cells and also for differential expression of internalin A gene (int A), which is related to virulence potential. The presence of bacteriocins of latic acid bacteria (BAL) and incubation at 5°C were the main factors that influenced biofilm formation by L. monocytogenes, in comparison with BHI broth (control). In general, adhesion and invasion of Caco-2 cells were significantly lower in low pH (4.5), incubation at 5°C and in presence of Oxgall 0.3% (bile salts). On the other hand, two L. monocytogenes isolates (INCQS 353 and Reg 26c) showed higher invasion rates when cultivated in the presence of NaCl 5% (P<0.05). One L. monocytogenes (H-2) isolated from minimally processed leafy vegetables showed the strongest ability to form biofilm and to invade Caco-2 cells, under selected conditions, suggesting there may be a relationship between biofilm formation and virulence potential. For the vast majority of isolates, expression of int A gene were down regulated by the presence of bacteriocins, Oxgall 0.3%, pH4.5 and incubation at 5°C. Nonetheless, for one L. monocytogenes isolate (HU 471) expression of int A gene was eight times higher in presence of sucrose, indicating that food components can increase the infectiveness of L. monocytogenes.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) é um dos principais responsáveis por infecções nosocomiais, sendo identificado também em infecções associadas à comunidade. Embora potentes fármacos anti-estafilocócicos estejam disponíveis, as infecções causadas por este patógeno continuam a apresentar significativa morbidade e mortalidade devido ao aparecimento de cepas com resistência a múltiplos fármacos, incluindo vancomicina e teicoplanina. Compostos 5-nitro-heterocíclicos com estrutura análoga à nifuroxazida, antimicrobiano utilizado em infecções gastrintestinais, têm apresentado satisfatória atividade in vitro frente a estas cepas multirresistentes, sendo importante e necessária a avaliação de sua biodisponibilidade oral como próximo estágio no desenvolvimento de um novo fármaco, visando à seleção eficiente e ao aprimoramento da estrutura molecular. Neste contexto, o presente estudo tem por objetivo empregar ensaios in vitro, utilizando células Caco-2, e métodos in silico, utilizando descritores moleculares VolSurf, a fim de analisar a permeabilidade de análogos à nifuroxazida com atividade antimicrobiana apresentando, principalmente, atividade potencial frente a cepas multirresistentes de S. aureus. Empregou-se o método de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) para a avaliação da citotoxicidade. Nos estudos de permeabilidade in vitro foram utilizadas membranas de células Caco-2 cultivadas em placas Transwel® por 21 dias. A quantificação das frações permeadas foi realizada por cromatografia a líquido de alta eficiência com detecção UV (CLAE-UV), com métodos validados de acordo com a Resolução 899/03. Os estudos in silico foram realizados por meio de análise exploratória, pelo método de consenso de análise de componentes principais (CPCA, Consensus Principal Component Analysis), e análise de regressão, por quadrados mínimos parciais (PLS, Partial Least Squares). As células Caco-2 apresentaram viabilidade adequada para a realização dos estudos de permeabilidade frente a todos os derivados da nifuroxazida, exceto o derivado MeTIO (5-nitro-2-tiofilideno 4-metilbenzidrazida). Os valores de permeabilidade aparente (Papp) obtidos para os análogos à nifuroxazida indicam que estes possuem alta permeabilidade. Os modelos obtidos por CPCA e PLS foram capazes de separar as moléculas em grupos de compostos de baixa, média e alta permeabilidade, sendo os análogos à nifuroxazida classificados como compostos de alta permeabilidade. Para os compostos em estudo, as propriedades determinantes da permeabilidade através de células Caco-2, de acordo com os modelos, seriam de natureza topológica e estérica, sendo possível a previsão externa qualitativa e quantitativa da permeabilidade através de células Caco-2. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the main pathogens responsible for nosocomial infections, also identified in community-associated infections. Although potent anti-staphylococcal drugs are available, infections caused by this bacteria continues to show significant morbidity and mortality due to the emergence of strains with resistance to multiple drugs, including vancomycin and teicoplanin. The 5-nitro-heterocyclic derivatives of nifuroxazide, which is an antimicrobial used to treat gastrointestinal infections, have shown satisfactory in vitro activity against multidrug-resistant strains of S. aureus. As a next step in the development of a new drug, it is important and necessary the evaluation of the oral bioavailability to achieve an efficient selection and refinement of the molecular structure. In this context, this study aims to develop in vitro assays through Caco-2 cells, and in silico approaches, using VolSurf molecular descriptors, in order to analyze the permeability of 5-nitro-heterocyclic compounds analogues to nifuroxazide with antimicrobial activity, especially showing promising activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus. The MTT (bromide 3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) method was employed to perform the cytotoxicity evaluation. Caco-2 cell monolayers cultivated for 21 days in Transwel® plates were used for the in vitro permeability assays. The quantification of the permeated fractions was done by High Performance Liquid Chromatography with UV detection (HPLC-UV), with validated methods according to the Resolution 899/03. In silico studies were performed through exploratory analysis by consensus principal component analysis (CPCA) and regression analysis by partial least squares (PLS). Caco-2 cells showed suitable cell viability for the permeability studies against all nifuroxazide analogues except the MeTIO (5-nitro-2-thiophilydene 4-methylbenzidrazide). The nifuroxazide derivatives apparent permeability values (Papp) obtained indicate these are high permeable compounds. The models obtained by CPCA and PLS were able to separate the molecules into groups of low, medium and high permeabilities, and the nifuroxazide analogues were classified as high permeable substances. The identified properties for the permeability through Caco-2 cells to the studied compounds were topologic and sterical, and it is possible to perform qualitative and quantitative external predictions with these models for the permeability through Caco-2 cells.

A absorção intestinal de fármacos (HIA, na sigla em inglês para human intestinal absorption) é um dos processos farmacocinéticos mais críticos para a ação de medicamentos administrados por via oral. Modelos in vitro baseados em células que mimetizam os enterócitos do intestino humano (células Caco-2), ou aqueles que utilizam membranas articifiais são muito utilizados no estudo da permeabilidade celular de moléculas bioativas. No processo de planejamento de fármacos, estas técnicas são frequentemente empregadas em paralelo com estratégias computacionais na avaliação de propriedades físico-químicas e farmacocinéticas. Nessa tese de doutorado foram desenvolvidos modelos computacionais para a predição da permeabilidade celular de compostos bioativos em células Caco-2 e em membrana artificial paralela (PAMPA, na sigla em inglês para Parallel Artificial Membrane Permeability Assay). Os modelos foram gerados através do método baseado em fragmentos moleculares holograma QSAR (HQSAR). Os indicadores estatísticos obtidos indicam a boa capacidade de correlação dos modelos Caco-2 e PAMPA para os dados utilizados na modelagem e o alto poder de predição destes modelos para a permeabilidade de um conjunto teste de compostos. Adicionalmente, os modelos foram avaliados quanto a sua capacidade preditiva frente a dois conjuntos de validação, constituídos por novas moléculas que foram planejadas e testadas experimentalmente durante o desenvolvimento deste trabalho. Para estes conjuntos, os modelos demonstraram alta capacidade de predição da permebildade tanto em células Caco-2 quanto em ensaios PAMPA. O processo de validação experimental foi essencial para a confirmação da robustez dos modelos desenvolvidos, que serão incorporados à base de dados de propriedades farmacocinéticas PK/DB (http://www.pkdb.ifsc.usp.br/), contribuindo desta forma para o seu aprimoramento. Os métodos computacionais e experimentais utilizados neste projeto permitiram o desenvolvimento de ferramentas úteis para a avaliação da absorção de fármacos administrados por via oral e para o planejamento de moléculas bioativas com propriedades farmacocinéticas otimizadas. / Human intestinal absorption is a critical pharmacokinetics-related parameter for orally given drugs. In vitro models based on Caco-2 cells, which mimetize enterocytes, or those based on the parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) are broadly used in permeability studies of bioactive molecules. In drug discovery projects, these techniques are simultaneously used with computational methods to evaluate physico-chemical and pharmacokinetics properties. In this study, computational models to predict the cellular permeability of bioactive compounds in Caco-2 cells and in PAMPA assays were developed. The models were constructed by using the fragment-based method Hologram Quantitative Structure Activity Relationships (HQSAR). The obtained statistical indexes indicated the suitable correlation ability of the Caco-2 and PAMPA models for the employed data set, and the high predictive power for selected test set compounds. In addition, the HQSAR models were evaluated regarding their predictive ability against two validation sets, which are comprised by novel molecules that were designed and experimentally tested during this study. For these compounds, both the Caco-2 and PAMPA models demonstrated high predictive power. The process of experimental validation was an essential step for confirming the robustness of the developed models, which will be incorporated into the database of pharmacokinetic properties PK/DB (http://www.pkdb.ifsc.usp.br/), thus contributing to its improvement. The developed HQSAR models will be incorporated to the PK/DB pharmacokinetics database (http://www.pkdb.ifsc.usp.br/), thus contributing to its improvement. The molecular modeling and experimental methods employed in this study allowed for the development o robust tools for evaluating intestinal drug absorption and for the design of bioactive molecules with improved pharmacokinetics profiles.

Brazil is the country with the greatest biodiversity on the planet and a major producer of food. Tropical fruits, especially natives from Brazil, may contain considerable amounts of carotenoids that have antioxidant, anti-inflammatory, provitamin A and anticancer actions, such as &beta;-carotene and lycopene. The food structure design concept aims to manipulate the food matrix for specific purposes, e.g. the preservation and manipulation of carotenoid bioaccessibility. The aim of this thesis was to explore tropical fruits, native and exotic from Brazil in the development of delivery systems for carotenoids. A screening step was carried out with 11 fruits, among which 2 were selected, the pitanga (Eugenia uniflora) and buriti (Mauritia flexuosa) fruits that were used for the production of microemulsions. At the screening were evaluated the proximate composition, fiber contents, carotenoid profiles and bioacessibilities. The nutritional value demonstrated that these fruits have high potential as raw-materials for healthy products due to their high fiber, minerals and carotenoid contents in addition to low energy value. Analysis by HPLC-DAD allowed the identification of 14 carotenoids in the 11 fruits studied for the screening. Results demonstrated the superiority of the bioaccessibility of xanthophylls (ranging 10 % - 52 %) in relation to carotenes, and the low bioaccessibility of lycopene from pitanga (1.1 %) and average bioaccessibility of &beta;-carotene from buriti (26 %). Pitanga and buriti had their carotenoid profiles analyzed and monitored throughout an in vitro simulation of the digestion coupled with caco-2 cell cultures. Although xanthophylls are more bioaccessible, the intestinal ephitelium absorb preferentially the provitamin A carotenoids, such &beta;-carotene and &beta;-criptoxanthin. In order to produce these microemulsions, high-speed homogenization (HSH) and ultrasound (US) were studied in combination with the use of surfactants (Whey Protein Isolate and Tween 80), and addition of corn oil as carotenoid carrier. The experiments have shown that the interaction of US and HSH is capable to break cell walls and release carotenoids with higher efficiency. Optical and fluorescence microscopy, as well as carotenoid analysis demonstrated that it was possible to manipulate the food matrix structure releasing the carotenoids from the plant cells and encapsulating them inside the oil droplets, what increased their retention after processing. The microemulsion were affected by time of processing and by surfactant related to their rheology, final structure, stability of emulsion and carotenoid stability to processing. Finally, a dynamic gastrointestinal system was used to compare the behavior of carotenoids from whole fruit pulps and selected microemulsions (2% Tween 80, 5% corn oil, processed by HSH-US 4 min -4 min). The results demonstrated that it was possible to increase the stability to digestion and bioaccessibility of total carotenoids, lycopene and &beta;-carotene from the microemulsions. / O Brasil é o país detentor da maior biodiversidade do planeta e um grande produtor de alimentos. Frutas tropicais, em especial as nativas brasileiras, podem conter quantidades consideráveis de carotenoides que possuem ação antioxidante, anti-inflamatória, provitamina A e anticâncer, como &beta;-caroteno e licopeno. O desenho estrutural dos alimentos (food structure design), visa manipular a matriz alimentar com fins específicos, por exemplo, a preservação e manipulação da bioacessibilidade de carotenoides. Na presente tese buscou-se explorar frutas brasileiras não-convencionais no desenvolvimento de sistemas de entrega de carotenoides. Foi realizada uma etapa de triagem com 11 frutas, dentre as quais, 2 foram selecionadas, a pitanga (Eugenia uniflora) e o buriti (Mauritia flexuosa), e utilizadas na produção de microemulsões. Nesta triagem foram avaliadas a composição centesimal, o teor de fibras, o perfil de carotenoides e a bioacessibilidade destes carotenoides. O valor nutricional das frutas demonstrou seu potencial para utilização em produtos saudáveis, devido a seus teores eleveados de fibras, minerais e carotenoides além do baixo teor calórico. A análise por HPLC-DAD permitiu identificar até 14 carotenoides nas amostras das 11 frutas estudadas na triagem. O estudo da bioacessibilidade dos carotenoides das 11 frutas demonstrou principalmente a superioridade da bioacessibilidade de xantofilas (variando de 10 a 52 %) em relação aos carotenos, e portanto a baixa bioacessibilidade de licopeno da pitanga (1,1%) e média bioacessibilidade de &beta;-caroteno do buriti (26%). Pitanga e buriti tiveram o perfil de carotenoides detalhadamente acompanhados através da simulação in vitro da digestão associada à absorção intestinal por culturas de células Caco-2. Neste estudo, observou-se que embora as xantofillas sejam mais bioacessíveis, o tecido epitelial do intestino absorve preferencialmente carotenoides provitaminicos A, como o &beta;-caroteno e a &beta;-criptoxantina. Para produzir as microemulsões foram estudados processamentos (homogeneização de alta-velocidade - HSH e ultrassom - US) em combinação com uso de surfactantes (Whey Protein Isolate e Tween 80) e adição de óleo de milho como carreador dos carotenoides. Os experimentos mostraram que a interação entre US e HSH é capaz de romper as paredes celulares e liberarem os carotenoides com maior eficiência. Ficou demonstrado através de microscopia ótica e de fluorescência, tanto quanto pela análise de carotenoides, que foi possível manipular estruturalmente a matriz alimentar liberando os carotenoides de dentro das células vegetais e encapsulando-os dentro das gotículas de óleo, além de aumentar sua retenção após o processamento. As microemulsões obtidas sofreram efeito do tempo de processamento e do surfactante em relação à reologia, estrutura final da matriz, estabilidade ao armazenamento e estabilidade dos carotenoides ao processo. Por fim, foi utilizado um sistema dinâmico de simulação da digestão gastrointestinal para comparar o comportamento dos carotenoides oriundos das polpas integrais das frutas e das microemulsões selecionadas (Tween 80 a 2%, óleo de milho a 5% e processado por HSH-US 4 min-4 min). Os resultados demonstraram que foi possível aumentar a estabilidade à digestão e a bioacessibilidade dos carotenoides totais, do licopeno e do &beta;-caroteno.

Potentially harmful elements (PHE) are found naturally in soils, usually in low concentrations. However, due to the intensity of the anthropic activities, the concentrations of these elements may increase and have negative effects on the environment and human health. Methods for risk assessment may predict or indicate the level of exposure to contamination of an area. In addition to the total or pseudo-total concentration of PHE, generally extracted with acidic solutions, it is possible to determine the reactive, bioavailable and bioaccessible levels of these elements in order to evaluate the degree of soil contamination. Urban soil samples located in residential areas were collected in Piracicaba, State of São Paulo (SP) and in Santo Amaro, State of Bahia, including soils collected near a primary lead smelter area (COBRAC/Plumbum), where researchers detected elevated levels of PHE. Soils samples in an old lead metallurgy plant (Usina do Calabouço / IPT), which today belongs to the Centro Integrado de Ensino Multidisciplinar (CIEM/ Companhia de Pesquisa de Recursos Minerais (CPRM) - Geological Survey of Brazil) in Apiaí, located in the Upper Ribeira Valley (SP) were also collected. In vitro methods have been used in several countries to assess the bioaccessibility of PHE in humans. In this study, procedures based on ingestion and inhalation of soils using the Unified BARGE Method (UBM) and Artificial Lysosomal Fluid (ALF) methods were used to obtain the bioaccessible concentration in the gastrointestinal and pulmonary tract, respectively. As the bioaccessible fraction does not estimate the concentration absorbed and transported into the bloodstream, the in vitro method using Caco-2 cells, which are derived from human colon adenocarcinoma, was used to assess the amount of PHE that intestinal cells can absorb. The mineralogical data was obtained, and the sequential extraction of As, Cd, Cu, Mn, Pb and Zn was carried out to evaluate their interaction with lung fluid and gastric/gastrointestinal fluids. As expected, mine tailing samples had the highest pseudo-total concentrations of PHE in comparison to soil and sediment samples, both in the bulk soil (2 mm) and in the 250 &mu;m and 10 &mu;m sizes. Both respiratory and oral bioaccessibility of PHE varied widely among matrices, indicating that they were influenced by matrices´ chemistry, physical and mineralogical characteristics. The respiratory bioaccessible fraction, calculated as a percentage of the PHE pseudo-total concentrations, ranged from 13 - 109% for As; 14 - 98% for Cd; 21 - 89% for Cu; 46 - 140% for Pb, 35 - 88% for Mn and; 21 - 154% for Zn. Gastric bioaccessibility was greater than gastrointestinal bioaccessibility, ranging from 0-33% and 0-26% for As; 0-69% and 0-40% for Cd; 18-75% and 12-89% for Cu; 24-83% and 7-50% for Pb; 43-105% and 27-97% for Mn; 14-88% and 6-46% for Zn. Pseudo-total concentration provided a good estimate of respiratory and oral bioaccessibility, but the in-vitro methods provided more accurate results. Caco-2 cell line (in vitro test) was a good model for evaluating the effect of PHE exposure, but further studies on the transport and bioavailability of PHE in intestinal cells are needed. / Elementos potencialmente nocivos (EPN), dentre eles os metais pesados, são encontrados naturalmente nos solos, geralmente em baixas concentrações. Porém, devido à intensidade das atividades antrópicas, as concentrações destes elementos podem aumentar e ocasionar efeitos negativos ao meio ambiente e à saúde humana. Métodos para a avaliação de risco podem prever ou indicar o nível da exposição de uma área à contaminação. Além do teor total ou pseudototal de EPN, geralmente extraídos com soluções ácidas, pode-se determinar os teores nas frações reativa, biodisponível, bioacessível destes elementos para avaliação do grau de contaminação do solo. Por sua vez, métodos in vitro têm sido utilizados em vários países para avaliar a bioacessibilidade de PHE em seres humanos. Neste trabalho foram utilizadas amostras de solo urbano coletadas em Piracicaba e solos coletados em áreas de uma antiga usina de metalurgia de chumbo (Usina do Calabouço/IPT) na cidade de Apiaí, ambas localizadas no Estado de São Paulo; e na cidade de Santo Amaro, Bahia, onde foram coletadas amostras de solos urbanos localizados em áreas residenciais, principalmente próximas a uma antiga área de refino de chumbo, onde foram detectados níveis elevados de EPN. Foram avaliados procedimentos baseados na ingestão e na inalação de solos coletados por meio dos métodos Unified BARGE Method (UBM) e do Artificial Lysosomal Fluid (ALF) para obtenção do teor bioacessível nos fluidos gastrointestinais e nos fluidos pulmonares, respectivamente. Como a fração bioacessível não estima a concentração absorvida e transportada para a corrente sanguínea, o método in vitro, utilizando células Caco-2, que são extraídas de adenocarcinoma do cólon humano, foi usado para avaliar a quantidade de EPN que as células intestinais podem absorver. As características mineralógicas das amostras e a extração sequencial de As, Cd, Cu, Mn, Pb e Zn foram obtidas para avaliar a interação com fluido pulmonar e do o suco gástrico e gastrointestinal. Como esperado, as amostras de rejeito de mineração apresentaram as maiores concentrações pseudototais de EPN em comparação com as amostras de solo e sedimento, tanto nas amostras < 2mm, como nas amostras de tamanho < 250 &mu;m e < 10 &mu;m. A bioacessibilidade respiratória e oral dos EPN variou amplamente entre as matrizes, indicando que foram influenciadas por características químicas, físicas e mineralógicas das matrizes. A fração bioacessível respiratória, calculada como porcentagem das concentrações de EPN pseudototal, variou de 13 a 109% para As; 14 - 98% para Cd; 21 - 89% para Cu; 46 - 140% para Pb, 35 - 88% para Mn e; 21 - 154% para Zn. A bioacessibilidade gástrica foi maior que a bioacessibilidade gastrointestinal, variando de 0 a 33% e 0 a 26% para As; 0-69% e 0-40% para Cd; 18-75% e 12-89% para Cu; 24-83% e 7-50% para Pb; 43-105% e 27-97% para o Mn; 14-88% e 6-46% para Zn. A concentração pseudototal forneceu uma boa estimativa para bioacessibilidade respiratória e oral, mas os métodos in vitro fornecem resultados mais precisos. A linhagem celular Caco-2 foi um bom modelo para avaliar o efeito da exposição ao PHE, mas são necessários mais estudos sobre o transporte e biodisponibilidade de PHE em células intestinais.