Equine spermadhesin HSP-7 is a 14 kDa protein isolated from stallion seminal plasma and present on the surface of spermatozoa. HSP-7 displays carbohydrate and zona-pellucida binding properties, but the physiological role in equine fertilization is not well defined. HSP-7 has 98% amino acid sequence homology with the well-studied boar spermadhesin, AWN. Currently, these two proteins are considered to have the same reproductive function. Immunofluorescence studies presented here show that the stallion and boar spermadhesins are localized to different segments on spermatozoa. The variation in molecular compartmentalization of spermadhesin molecules in different species suggests that these structurally related proteins could be involved in independent events of fertilization. While the variation in HSP-7 abundance was not statistically significant between fertile and subfertile stallions, capacitated spermatozoa displayed a marked increase in HSP-7 when compared to neat sperm (P < 0.05). These results indicate that rather than aiding in capacitation, HSP-7 is exposed with capacitation and may have a more significant role in the acrosome reaction and sperm-oocyte recognition than previously documented.

Twenty-three crossbred ewes were utilized during 1995, to investigate the possibility of xenogenous capacitation, using stallion spermatozoa. Ewes were grouped according to endocrine status as anestrus (n = 12) or estrus (n = 11) and were surgically inseminated with either fresh (FR), cooled/extended (FCE) or frozen/thawed (FZ) spermatozoal samples. The capacitation response of spermatozoa recovered from oviductal flushing 4 - 6 hours post-insemination, was assessed using a chlortetracycline (CTC) fluorescent probe. Data were recorded as percentages of spermatozoa exhibiting CTC staining patterns characteristic of capacitated (PCAP), unreacted (PUR) and acrosome reacted (PAR) sperm. Mean PCAP was not significantly different in estrous ewes despite an increasing trend. Mean PUR and PAR were also not different. Differences in capacitated, acrosome reacted and unreacted spermatozoa in inseminated and recovered samples (CAPDIF, ARDIF and URDIF, respectively) were analyzed. CAPDIF was significantly different between treatment groups (p < 0.01). CAPDIF was also significantly greater for the estrus versus anestrus group (p < 0.05). Total number of spermatozoa recovered (RTOTAL) was recorded. More spermatozoa were recovered from estrus ewes, however significance was not established. Mean number of spermatozoa recovered was 37.9 ± 35.9 per ewe. Treatment significantly affected RTOTAL in estrus animals (p = 0.01). FR samples had the highest recovery. Results suggest that xenogenous capacitation of stallion semen may occur in the reproductive tract of the ewe. Implications of these results are discussed in regards to their application of xenogenous gamete intrafallopian transfer (X-GIFT) as a treatment option for certain infertility problems in the mare. / Master of Science

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-08-22T19:40:23Z No. of bitstreams: 1 karinerochanery.pdf: 1556253 bytes, checksum: d3b2380b9e43afe724c8afd6f8a7d6b8 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: falta parte do resumo na parte inicial on 2018-08-28T12:41:07Z (GMT) / Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-08-28T12:44:13Z No. of bitstreams: 1 karinerochanery.pdf: 1556253 bytes, checksum: d3b2380b9e43afe724c8afd6f8a7d6b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-28T13:04:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 karinerochanery.pdf: 1556253 bytes, checksum: d3b2380b9e43afe724c8afd6f8a7d6b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-28T13:04:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karinerochanery.pdf: 1556253 bytes, checksum: d3b2380b9e43afe724c8afd6f8a7d6b8 (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / A presente dissertação é desenvolvida no âmbito do Mestrado Profissional em Gestão e Avaliação da Educação (PPGP) do Centro de Políticas Públicas e Avaliação da Educação da Universidade Federal de Juiz de Fora (CAEd/UFJF). O caso de gestão estudado discutiu o processo de capacitação dos Técnicos Administrativos em Educação (TAEs) da UFJF, ocupantes do cargo Assistente em Administração no campus avançado em Governador Valadares, tendo a seguinte questão norteadora: quais são os desafios dos servidores Assistentes em Administração do campus avançado da UFJF em Governador Valadares quanto a sua formação e capacitação para o serviço? O objetivo geral deste estudo foi a elaboração de um Plano de Ação Educacional (PAE), e para alcançá-lo, foi feito um estudo sobre as capacitações dos servidores que exercem funções administrativas no campus avançado da UFJF em Governador Valadares (UFJF-GV) e suas limitações. Como objetivos específicos, buscou-se: i) descrever a política de capacitação da UFJF e suas possíveis limitações; ii) analisar se as capacitações ofertadas são suficientes para o aperfeiçoamento dos servidores e; iii) propor um plano de intervenção que promova a melhoria dos cursos já ofertados pela UFJF e ações que propiciem aos servidores adquirirem mais conhecimentos e informações, de forma a se capacitarem continuamente. Assumimos como hipóteses que a capacitação ofertada pela UFJF não atende às demandas dos setores, e que os servidores não recebem capacitações específicas para as funções que exercem. Para tanto, utilizamos pesquisas bibliográficas e documentais como metodologia da pesquisa, e em primeiro momento, para o levantamento das evidências, foi realizada uma entrevista coletiva com os servidores lotados nas secretarias dos cursos do Instituto Ciências da Vida (ICV). No intuito de aprofundar na problemática descrita no primeiro capítulo, foi aplicado questionário a todos os servidores Assistentes em Administração, nível D, que atuam no campus avançado e realizada uma entrevista semiestruturada em Juiz de Fora ao setor responsável pela capacitação de servidores. Ao final da pesquisa foi constatado que a capacitação ofertada aos TAEs não atende às necessidades dos servidores e não é suficiente para o bom desenvolvimento das atividades, levando a vários problemas, como: atraso nos trâmites de processos, erros em documentos, insegurança nas ações, duplicidade de informações, falta de padronização, desperdício de recursos financeiros, perda de autonomia. / This Master Thesis is developed in the Professional Master in Management and Evaluation of Education (PPGP) of the Center for Public Policies and Education Evaluation of the Federal University of Juiz de Fora (CAEd/UFJF). The management case to be studied discussed the qualification process of the Technicians Administrative in Education (TAEs) of the UFJF, occupying the position Administrative Assistants in the Governador Valadares campus, having the following guiding question: what are the challenges of Governador Valadares campus Administrative Assistants of the regarding their training and training for the service? The general objective of this study was the elaboration of an Educational Action Plan (PAE), and in order to achieve it, a study was carried out on the qualifications of the servers that perform administrative functions in the UFJF campus in Governador Valadares (UFJF-GV) and its limitations. As specific objectives, it was sought: i) to describe the UFJF's training policy and its possible limitations; ii) analyze whether the offered capacities are sufficient for the improvement of the servers and; iii) to propose an intervention plan that promotes the improvement of the courses already offered by the UFJF and actions that allow the servers to acquire more knowledge and information, in order to be trained continuously. We assume as hypotheses that the training offered by the UFJF does not meet the demands of the sectors, and that the servers do not receive specific training for the functions they perform. To do so, we used bibliographical and documentary research as a research methodology, and in the first moment, to collect the evidence, a collective interview was held with the crowded servers in the departments of the Life Sciences Intitute (ICV). In order to deepen the problem described in the first chapter, a questionnaire was applied to all D-level Administrative Assistants, who work in UFJF-GV and conducted a semi-structured interview in Juiz de Fora to the sector responsible for server training. At the end of the research it was verified that the training offered to the TAEs does not meet the needs of the servers and is not enough for the good development of the activities, leading to several problems, such as: delay in processing of processes, errors in documents, duplication of information, lack of standardization, wastage of financial resources, loss of autonomy.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins. / Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins. / Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

La protéine TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) appartient à la famille des SLC26, une famille de transporteurs d’anions qui contribuent dans différents épithelia à l’homéostasie cellulaire. La protéine TAT1 s’exprime exclusivement dans les cellules germinales mâles, chez l’homme et chez la souris. Sur le spermatozoïde mature, la protéine TAT1 est localisée à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, au niveau de l’annulus, une structure en forme d’anneau composée de différents polymères de Septines (1, 4, 6, 7 et 12).Le modèle murin d’invalidation du gène Tat1 présente une infertilité mâle par asthénozoospermie totale (absence de mobilité des spermatozoïdes) et des défauts de capacitation associés à des anomalies structurales du flagelle (plicature du flagelle, disjonction entre la PI et la PP, atrophie de l’annulus). Ce modèle indique que la protéine TAT1 pourrait avoir un rôle structural dans le maintien de l’annulus et dans la mise en place du flagelle. Par ailleurs, la protéine TAT1 possédant une activité de transport d’anions, il est vraisemblable qu’elle puisse influer directement sur la régulation de la mobilité et de la capacitation puisqu’il est bien établi que les échanges ioniques sont essentiels au contrôle de ces deux processus.En effet, les ions chlorure, bicarbonate et calcium participent à l’activation de la voie de signalisation AMPc/PKA, au cours des processus de mobilité et de capacitation (i.e. processus de maturation ayant lieu dans le tractus génital féminin et conférant au spermatozoïde un mouvement hyperactivé et la capacité à interagir avec l’ovocyte).Plusieurs travaux ont montré une interaction physique et fonctionnelle des membres de la famille SLC26 avec le canal chlorure/bicarbonate CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) dont les mutations sont responsables de la mucoviscidose. De manière intéressante des données récentes ont montré l’expression de CFTR dans le spermatozoïde et son rôle dans la régulation des flux de chlorure au cours de la capacitation. Au cours de ma thèse, nous avons testé la coopération entre les protéines TAT1 et CFTR ; nous avons pu montrer que la protéine TAT1 est capable d’interagir physiquement avec CFTR et de stimuler son activité de transport d’anions, suggérant qu’in vivo les deux protéines forment un complexe moléculaire impliqué dans la régulation des flux de chlorure et de bicarbonate dans le spermatozoïde.Tout comme TAT1, plusieurs membres de la famille SLC26 ont une expression tissulaire spécifique. Par ailleurs, les mutations génétiques de certains SLC26 sont associées à des pathologies humaines (surdité, diarrhée chlorurée congénitale et chondrodysplasie). De par le phénotype du modèle murin Tat1 et l’importance des SLC26 en pathologie humaine, TAT1 constitue un bon candidat dans la recherche des causes génétiques des asthénozoospermies humaines.Le laboratoire a mis en place au cours de ma thèse, un projet de recherche de mutations du gène TAT1 dans les asthénozoospermies humaines. Le séquençage des régions codantes du gène TAT1 dans une cohorte de 147 hommes infertiles par asthénozoospermie a ainsi permis d’identifier des variations de séquence inédites du gène chez 7 sujets. L’étude in vitro de certains variants indique pour trois d’entre eux une instabilité des formes mutantes associée à un défaut de stimulation du canal CFTR, in vitro. Par ailleurs, les spermatozoïdes de ces patients présentent d’importantes anomalies flagellaires dans la mise en place de la pièce intermédiaire, compatible avec un rôle de la protéine TAT1 et de ses partenaires (les septines) dans la genèse du flagelle / TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) belongs to the SLC26 family of anion transporters, which is implicated in cellular homeostasis of different epithelia. TAT1 is exclusively expressed in male germ cells, in human and mouse. On mature spermatozoa, TAT1 is located at the annulus, a ring-shaped structure composed of different septins polymers (1, 4, 6, 7 and 12), at the junction of the midpiece (MP) and principal piece (PP) of the flagellum.The knock-out mouse model of Tat1 gene shows a male infertility by complete asthenozoospermia (lack of sperm motility) and capacitation defects combined with flagellar structural abnormalities (flagella bending, MP and PP disjunction and atrophy of the annulus). This model suggests that the TAT1 protein could fulfill structural roles in the annulus and during flagellum biogenesis. Moreover TAT1 displayind an anion transport activity, it could also be implicated in the control of sperm motility and capacitation by regulating anions exchannges, which are well known to be essential for both processes.Indeed, chloride, bicarbonate and calcium ions are involved in the activation of the cAMP/PKA pathway, controlling sperm motility and capacitation processes (i.e. maturation events occuring in the female genital tract and providing the spermatozoa an hyperactivation movement and the ability to interact with oocyte).Several publications have reported a physical and functionnal interaction between SLC26 family members and the chloride/bicarbonate CFTR channel (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), which mutations are responsible of cystic fibrosis. Interestingly, recent data showed CFTR expression in spermatozoa and its role in the regulation of chloride fluxes during capacitation. During my thesis, we tested TAT1 and CFTR cooperation; we showed that TAT1 can interact physically with CFTR and stimulate its anion transport activity, suggesting that in vivo they form a molecular complex involved in the regulation of chloride and bicarbonate fluxes during sperm capacitation.Like TAT1, several SLC26 family members have a tissue specific expression. Furthermore genetic mutations in several SLC26 members result in human pathology such as deafness, congenital chloride diarrhea and chondrodysplasia. According to the phenotype of the KO Tat1 mouse model and the role of SLC26 members in human pathology, TAT1 constitutes a good candidate for the search of genetic causes of human asthenozoospermia.During my thesis, the laboratory has set up, a research project aiming at identifying mutations in the TAT1 gene that are responsible for human asthenozoospermia.Sequencing of the TAT1 gene coding regions in a cohort of 147 infertile men presenting with asthenozoospermia allowed us to identify several new sequence variations in in the TAT1 gene. In vitro study of these variants shows that 3 of them are associated with protein instability and abrogate CFTR stimulation. Besides, patients sperm show important flagellar abnormalities in the midpiece, consistent with a role of TAT1 and its partners (septins) in flagellum biogenesis.

Cette thèse étudie le mouvement d'apprentissage en famille (école â la maison ) comme un cas limite de participation des parents à l'éducation et, plus particulièrement, à la gouvernance de l'éducation. Les théories de la gouvernance réflexive et de la pragmatique contextuelle de Lenoble et Maesschalck suggèrent de considérer les groupes de parents-éducateurs comme des unités d'expérimentation pédagogique et sociale porteuses d'un potentiel de réflexivité pour l'institution éducative. Dans cette optique, un apprentissage de l'action collective puis politique par ces groupes favoriserait leur participation à une gouvernante réflexive de leur pratique et du système éducatif. Cependant, le développement de la capacité de participation d'un acteur collectif émergent est insuffisamment connu: les objets de cet apprentissage social, ses sous-processus spécifiques et leurs conditions d'application et de réussite.Cette recherche vise à 1- mieux comprendre le processus d'apprentissage de l'action collective à la base de la capacitation d'un nouvel acteur collectif à participer à la gouvernance réflexive d'un domaine; ainsi qu'à 2- contribuer au développement de l'interaction entre les parents-éducateurs et les instances scolaires au Québec. Une recherche-formation de vingt mois avec trois groupes régionaux d'apprentissage en famille du Québec a été menée à l'aide d'un programme d'«autoformation accompagnée» visant la production de propositions de gouvernance de leur pratique. La démarche de recherche consistait en une étude de cas multiple au moyen d'une observation participante, d'une analyse documentaire puis d'une analyse des parcours d'apprentissage des groupes. L'analyse a permis de tracer un portrait-type du processus de capacitation de l'acteur collectif. Les conditions déterminantes pour la réussite de ce processus sont: un projet d'«autoformation accompagnée» d'une durée suffisante, la confiance et l'ouverture du collectif à une extériorité. De plus, cette thèse fournit des pistes de réflexion et d'action à l'intention des différents acteurs concernés par la gouvernance de l'apprentissage en famille au Québec.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The process of sperm capacitation and acrosome reaction (AR) are highly dynamic processes essential for the fertilization, including cytoskeleton proteins in the sperm head. The study of the distribution of actin, spectrin and α-tubulin in the head of representative mammalian sperm indicates that before and after the AR there were changes in the distribution of the cytoskeleton structures in the sperm head of all representatives, mainly in the apical part of the acrosome, but also in the equatorial and postacrosome part of the sperm head. The particularly well-studied actin cytoskeleton plays an important role during the capacitation and before and after the AR. Environmental estrogens can interfere with the function of endogenous hormones in very low concentrations. They can interact with specific receptors affecting several signalling pathways leading to sperm capacitation and AR. The effect of 17β-estradiol, estrone, estriol and synthetic 17α-ethynylestradiol was evaluated by the ratio of tyrosine phosphorylation and the state of the acrosome during in vitro capacitation in the sperm head. This study has provided the evidence that estrogens significantly stimulate capacitation progress in a concentration-dependent manner. Estrogens decrease number of sperm after the induced AR too. The raising...