A citocina IL-33 apresenta papel dual e está envolvida com a resolução ou progressão de inúmeras doenças, além disso, acredita-se que a via IL-33/ST2 esteja envolvida no equilíbrio entre a atividade de osteoclastos e osteoblastos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel do receptor ST2 no desenvolvimento e progressão de lesões periapicais experimentalmente induzidas em camundongos. Lesões periapicais foram induzidas em primeiros molares inferiores de camundongos WT e ST2 knockout (KO). Decorridos 7 e 14 dias, as amostras de mandíbula foram submetidas às análises: determinação da área de lesão periapical em cortes histológicos e do volume por microtomografia computadorizada (&mu;CT); contagem de osteoclastos submetidos ao ensaio de histoenzimologia (TRAP); expressão gênica de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos por q-PCR; quantificação de neutrófilos por ensaio de mieloperoxidases. Os linfonodos foram submetidos à análise da expressão dos fatores transcricionais T-bet, GATA-3, RORc e Foxp-3 por q-PCR. Análise estatística utilizada foi One-way ANOVA, seguido de pós-teste de Bonferroni. Aos 14 dias, observou-se maior extensão da lesão periapical em animais WT que em ST2KO (p<0,05). O tamanho da lesão nos animais ST2KO permaneceu igual em função do tempo. Foi observada maior quantidade de neutrófilos na lesão do grupo WT aos 7 dias, em comparação aos animais ST2KO (p<0,05). Na expressão de T-bet, GATA-3, RORc e Foxp-3 não foram observadas diferenças estatisticamente significantes. O número de osteoclastos contados nos animais ST2KO foi maior que o observado em WT aos 7dias e aos 14 dias (p<0,05). A expressão de Runx2 foi maior no grupo lesão dos animais ST2KO quando comparado a seu respectivo controle. Os outros marcadores relacionados com a formação óssea não apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Dentre os marcadores relacionados com a reabsorção óssea, a catepsina K e o MMP-9 apresentaram maior expressão aos 14 dias, na lesão dos animais WT quando comparada à expressão na lesão dos animais ST2KO (p<0,05). Com base nos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que na ausência do receptor ST2 as lesões periapicais são menos extensas e embora em maior quantidade, os osteoclastos são menos ativos. Nossos resultados sugerem um importante papel da via IL-33/ST2 na ativação dos osteoclastos e desenvolvimento da lesão periapical. / The IL -33 cytokine presents a dual role and is involved either in the resolution and progression of many diseases. Furthermore, it is believed that this pathway is involved between osteoclast and osteoblast activity balance. The aim of this study was to evaluate the role of ST2 receptor in the development and progression of experimentally induced periapical lesions in mice. Periapical lesions were induced in first molars of WT and ST2 knockout (KO) mice. After 7 and 14 days, jaw samples were subjected to various analysis: determination of periapical lesions area by histology and volume by computed microtomography (&mu;CT); osteoclasts number by TRAP histoenzymology; osteogenic and osteoclastogenic markers expression by q-PCR; neutrophil quantification by myeloperoxidase activity. The expression of transcription factors T-bet, GATA-3, RORC and Foxp-3 in lymph nodes were analysed by q-PCR. Statistical analysis was done by One-way ANOVA and Bonferroni post-test. It was observed a greater extent in periapical lesions of WT compared to ST2KO animals at 14 days (p<0.05). There is no progression in the lesion of ST2KO mice with the time. A larger number of neutrophils in WT group was observed, compared to ST2KO mice evaluated at 7 days (p<0.05). The expression of T-bet, GATA-3, RORc and Foxp-3 were not statistically significant different among the groups. The number of osteoclasts in lesions of ST2KO animals were greater than the observed in WT, at 7 and 14 days (p<0.05). Although, other osteogenic markers showed no statistically significant difference, Runx2 expression in ST2KO was higher in lesion side compared to control side at 14 days. The markers related to bone resorption, cathepsin K and MMP-9, were significantly abrogated in the lesion side of ST2KO mice, at 14 days (p<0.05). Based on the results, it can be concluded that although larger amounts of osteoclast were counted in ST2KO, the lesion was less extensive and osteoclasts less active. It all suggests that the IL-33/ST2 pathway play an important role in osteoclasts activation and periapical lesion development.

O biofilme bacteriano é o agente etiológico primário no desenvolvimento da resposta inflamatória observada na doença periodontal. Os receptores do tipo NOD (NLRs) são proteínas citosólicas que reconhecem componentes microbianos presentes no citoplasma liberados por bactérias invasoras. Sabendo que bactérias periodontopatogênicas têm a capacidade de invadir e colonizar diversas células do tecido periodontal, o presente projeto tem o objetivo de estudar a participação dos receptores do tipo NOD (NOD1 e NOD2) no reconhecimento das bactérias Porphyromonas gingivalis, na modulação da resposta imune e no processo de reabsorção óssea. Camundongos isogênicos machos da linhagem C57BL/6 (WT) e camundongos deficientes para o receptor NOD1 (NOD1-/-) e receptor NOD2 (NOD2-/-) foram infectados com Phorphyromonas gingivalis utilizando um modelo experimental de doença periodontal. O grau de reabsorção óssea foi avaliado por análise morfométrica macroscópica e histológica da maxila, além da quantificação do número de osteoclastos na crista óssea alveolar. O grau de inflamação local foi realizado por contagem do número total de bactérias orais, quantificação de neutrófilos no tecido gengival (MPO) e avaliação dos mediadores inflamatórios por ELISA. Foi também avaliada a expressão de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos no tecido gengival pela técnica de qPCR. Animais NOD1-/- e NOD2-/- apresentaram menor delta de reabsorção óssea quando comparados aos animais WT. Animais NOD2-/- infectados apresentaram debilitado controle bacteriano quando comparados aos animais WT infectados. Animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados apresentaram baixa expressão de Cxcl1 e MPO quando comparados aos animais WT infectados. Além disso, foi observado que animais NOD2-/- infectados apresentaram reduzida produção de TNF-&alpha; e elevada produção de IL-10 quando comparados aos animais WT infectados. Não foi detectado diferença estatística na expressão de fatores osteogênicos, Runx2 e osteocalcina, entre animais WT, NOD1-/- e NOD2-/- infectados. Embora não houve diferença no número de células TRAP positivas presentes na crista óssea alveolar entre os grupos no tempo avaliado, animais WT infectados apresentaram elevada expressão gênica de RANKL/OPG quando comparados aos animais NOD2-/- infectados. Além disso, a expressão de marcadores de atividades dos osteoclastos, catepsina k e matrix metaloproteinase-9, foi significantemente baixa nos animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados quando comparados aos animais WT infectados. Esses resultados permitem sugerir que independente das variáveis observadas, verificamos que a ausência dos dois receptores impede a rápida progressão da reabsorção óssea alveolar observada na periodontite, portanto os receptores NOD1 e NOD2 contribuem para progressão da reabsorção óssea no modelo experimental de periodontite. / The bacterial biofilm has been identified as an etiological agent in the pathogenesis of periodontal disease. The NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins that sense microbial by products released by invasive bacteria. Since periodontopathogenic bacteria are able to invade and colonize some periodontal tissue cells, the purpose of this study is to determine the role of NOD1 and NOD2 receptors in the recognition of invasive periodontopathogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis, modulating the immune response and bone resorption. Isogenic strain C57BL/6 males (WT), NOD1 (NOD1-/-) and NOD2 (NOD2-/-) knockout mice were infected with Porphyromonas gingivalis in an experimental model of periodontal disease. Alveolar bone resorption was evaluated by macroscopic and histological morphometric analysis, quantification of osteoclasts numbers in bone crest alveolar. Imune inflammatory response was evaluated by, bacterial load, neutrophils quantification and inflammatory mediators levels by ELISA. We also evaluated the osteogenic and osteoclastogenic markers expression in gingival tissue by Real time PCR techniques. NOD1-/- and NOD2-/- animals showed lower bone resorption when compared to WT animals. NOD2-/- infected animals expressed higher bacterial load compared to WT infected ones. NOD1-/- and NOD2-/- infected animals presented lower Cxcl1 and MPO levels compared to WT infected animals. In addition, NOD2-/- infected animals presented lower level of TNF-&alpha; and higher level of IL-10 when compared to WT infected animals. There was no significant difference in the osteogenic factors expression, Runx2 and osteocalcin, when compared NOD1-/- and NOD2-/- infected animals to WT infected ones. Although there was no difference in TRAP-positive cells number evaluated in the alveolar bone crest among the studied groups, WT infected animals showed elevated ratio RANKL/OPG when compared to NOD2-/- infected animals. Moreover, the expression of osteoclasts activity markers, cathepsin k and matrix metalloproteinase-9, was significantly lower in NOD1-/- and NOD2-/- infected animals compared to WT infected ones. These results suggest that NOD1 and NOD2 receptors contribute to progression of bone resorption in experimental model of periodontitis, since the lack of NOD like receptors impair the bone resorption.

A citocina IL-33 apresenta papel dual e está envolvida com a resolução ou progressão de inúmeras doenças, além disso, acredita-se que a via IL-33/ST2 esteja envolvida no equilíbrio entre a atividade de osteoclastos e osteoblastos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel do receptor ST2 no desenvolvimento e progressão de lesões periapicais experimentalmente induzidas em camundongos. Lesões periapicais foram induzidas em primeiros molares inferiores de camundongos WT e ST2 knockout (KO). Decorridos 7 e 14 dias, as amostras de mandíbula foram submetidas às análises: determinação da área de lesão periapical em cortes histológicos e do volume por microtomografia computadorizada (&mu;CT); contagem de osteoclastos submetidos ao ensaio de histoenzimologia (TRAP); expressão gênica de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos por q-PCR; quantificação de neutrófilos por ensaio de mieloperoxidases. Os linfonodos foram submetidos à análise da expressão dos fatores transcricionais T-bet, GATA-3, RORc e Foxp-3 por q-PCR. Análise estatística utilizada foi One-way ANOVA, seguido de pós-teste de Bonferroni. Aos 14 dias, observou-se maior extensão da lesão periapical em animais WT que em ST2KO (p<0,05). O tamanho da lesão nos animais ST2KO permaneceu igual em função do tempo. Foi observada maior quantidade de neutrófilos na lesão do grupo WT aos 7 dias, em comparação aos animais ST2KO (p<0,05). Na expressão de T-bet, GATA-3, RORc e Foxp-3 não foram observadas diferenças estatisticamente significantes. O número de osteoclastos contados nos animais ST2KO foi maior que o observado em WT aos 7dias e aos 14 dias (p<0,05). A expressão de Runx2 foi maior no grupo lesão dos animais ST2KO quando comparado a seu respectivo controle. Os outros marcadores relacionados com a formação óssea não apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Dentre os marcadores relacionados com a reabsorção óssea, a catepsina K e o MMP-9 apresentaram maior expressão aos 14 dias, na lesão dos animais WT quando comparada à expressão na lesão dos animais ST2KO (p<0,05). Com base nos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que na ausência do receptor ST2 as lesões periapicais são menos extensas e embora em maior quantidade, os osteoclastos são menos ativos. Nossos resultados sugerem um importante papel da via IL-33/ST2 na ativação dos osteoclastos e desenvolvimento da lesão periapical. / The IL -33 cytokine presents a dual role and is involved either in the resolution and progression of many diseases. Furthermore, it is believed that this pathway is involved between osteoclast and osteoblast activity balance. The aim of this study was to evaluate the role of ST2 receptor in the development and progression of experimentally induced periapical lesions in mice. Periapical lesions were induced in first molars of WT and ST2 knockout (KO) mice. After 7 and 14 days, jaw samples were subjected to various analysis: determination of periapical lesions area by histology and volume by computed microtomography (&mu;CT); osteoclasts number by TRAP histoenzymology; osteogenic and osteoclastogenic markers expression by q-PCR; neutrophil quantification by myeloperoxidase activity. The expression of transcription factors T-bet, GATA-3, RORC and Foxp-3 in lymph nodes were analysed by q-PCR. Statistical analysis was done by One-way ANOVA and Bonferroni post-test. It was observed a greater extent in periapical lesions of WT compared to ST2KO animals at 14 days (p<0.05). There is no progression in the lesion of ST2KO mice with the time. A larger number of neutrophils in WT group was observed, compared to ST2KO mice evaluated at 7 days (p<0.05). The expression of T-bet, GATA-3, RORc and Foxp-3 were not statistically significant different among the groups. The number of osteoclasts in lesions of ST2KO animals were greater than the observed in WT, at 7 and 14 days (p<0.05). Although, other osteogenic markers showed no statistically significant difference, Runx2 expression in ST2KO was higher in lesion side compared to control side at 14 days. The markers related to bone resorption, cathepsin K and MMP-9, were significantly abrogated in the lesion side of ST2KO mice, at 14 days (p<0.05). Based on the results, it can be concluded that although larger amounts of osteoclast were counted in ST2KO, the lesion was less extensive and osteoclasts less active. It all suggests that the IL-33/ST2 pathway play an important role in osteoclasts activation and periapical lesion development.

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: &#946;-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), &#945;-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: &#946;-glucosidase (microvillar membrane marker), &#945;-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e &#945;-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and &#945;-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: &#946;-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), &#945;-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: &#946;-glucosidase (microvillar membrane marker), &#945;-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5217.pdf: 18042962 bytes, checksum: 6c55d259639b3b244326b14d21f608f1 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The sugarcane weevil, Sphenophorus levis, is an insect that feeds on the rhizome of sugarcane in its larval stage, boring channels that cause damage and death to the plant. Conventional methods of insect control have not been efficient. The aim of the present study was to generate knowledge on the biology of this insect on the molecular level using a transcriptomic approach to determine potential targets genes for the engineering of insect-resistant plants. After sequence processing and assembly using the dCAS program, 3804 sequences were grouped into 201 contigs and 1363 singlets, which were manually annotated. Several plant cell wall degrading enzymes were identified, including pectinases and cellulases. An invertasecontaining contig was identified for the first time in a coleopteran. Total probable digestive enzymes accounted for 19.3% and unknown genes accounted for 28.8% of the total number of expressed sequence tags. Considering the predominance of cathepsin L enzymes among the digestive enzymes found in the transcriptome (54.3%) and their importance to the breakdown of proteins in the insect digestive process, a cDNA clone encoding a cathepsin L enzyme, denominated Sl-CathL, was chosen for recombinant expression in Pichia pastoris cells, characterization and in vitro inhibition by the sugarcane cystatin CaneCPI-4 (Ki = 0.196 nM). Immunolocalization assays demonstrated the production of Sl-CathL in the midgut epithelium and secretion into the gut lumen from vesicles containing the enzyme. S. levis demonstrated sensitivity in triggering RNA interference machinery induced by dsRNA injections in the body cavity and gene-specific knockdown was confirmed by qRT-PCR. Larvae injected with V-ATPase E dsRNA died within three weeks after injection and serpin 1-silenced larvae either exhibited delayed development, arresting in the pupal stage, or died as pharate adults. In conclusion, transcriptome analyses, together with the inhibition of the main digestive enzyme by Cane-CPI-4 and gene silencing using RNAi, are promising procedures for the development of transgenic sugarcane plants to enhance resistance to Sphenophorus levis. / O bicudo da cana-de-açúcar, Sphenophorus levis, é um inseto que na fase larval se alimenta do rizoma da cana-de-açúcar cavando galerias que causam danos e levam à morte das plantas. Os métodos convencionais de controle disponíveis não tem sido eficientes contra esse inseto. O objetivo desse estudo foi gerar conhecimento sobre a biologia desse inseto em nível molecular utilizando uma abordagem transcriptômica para a identificação de possíveis genes alvo, visando futuros estudos para desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao ataque deste inseto. Após o processamento e montagem das sequências utilizando o programa dCAS, 3804 sequências foram agrupadas em 201 contigs e 1363 singlets, os quais foram manualmente anotados. Foram identificados diversos genes de degradação de parede celular, incluindo pectinases e celulases. Pela primeira vez um contig contendo uma sequência que codifica uma invertase foi identificado em um coleóptero. As prováveis enzimas digestivas totalizam 19,3% e os genes desconhecidos representam 28,8% do total de sequências expressas. Considerando a predominância de catepsinas L dentre as enzimas digestivas identificadas no transcriptoma (54,3%) e a sua importância para a hidrólise de proteínas nos processos digestivos, um clone de cDNA codificando uma catepsina L, denominado Sl-CathL, foi escolhido para a expressão recombinante em células de Pichia pastoris, caracterização e inibição in vitro utilizando a cistatina da cana-de-açúcar CaneCPI-4 (Ki = 0,196 nM). Os ensaios de imunolocalização evidenciaram a produção da Sl-CathL no epitélio do intestino médio e a secreção de vesículas, contendo a enzima, no lúmen do intestino. Larvas do inseto S. levis também apresentaram sensibilidade para disparar a maquinaria de RNA de interferência induzida por injeções de dsRNA na cavidade corpórea e o silenciamento gênico específico foi confirmado por qRT-PCR. As larvas que receberam injeções com dsRNA da V-ATPase E morreram dentro de três semanas, enquanto as larvas que tiveram a serpina 1 silenciada exibiram atraso no desenvolvimento, aprisionamento na fase pupal, ou morreram como adultos farados. Desse modo, concluímos neste trabalho iniciado a partir da análise do transcriptoma, que a inibição da principal enzima digestiva pela Cane-CPI-4 e o silenciamento gênico via RNAi são alternativas promissoras para o estabelecimento de plantas resistentes ao inseto e podem ser aplicadas no desenvolvimento de plantas de cana-de-açúcar transgênicas com o objetivo de aumentar sua resistência ao Sphenophorus levis.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3716.pdf: 15456968 bytes, checksum: 4a39e68e7b10a9e50bb83087365cf289 (MD5) Previous issue date: 2011-09-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / Ten herbs used in traditional medicine supported by literature for its effectiveness to osteoarticular diseases were selected to conduct a screening of inhibition activity against the cathepsin K, an important enzyme responsible for cleavage of collagen, the main constituent of extracellular matrix of cartilage and bone. Out of the ten herbs selected (ginger, saffron, camellia, cat s claw, mentrasto , moringa , babaçu , devil s claw, urtica e pequi ), one, gengibre (Z. officinale), should be highlighted by a high inhibitory activity of its extracts and fractions against cathepsin K and due to its ancient use as a therapeutic agent. From the dichloromethane fraction obtained of the crude extract of the rhizome of Z. officinale were isolated and identified 18 compounds (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8-shogaol, 10-shogaol, 6- paradol, 6-gingerdiol, methyl 6-gingerol, methyl 6-shogaol, diacetoxy-6-gingerdiol, methyl diacetoxy-6-gingerdiol, zingerone, gingerenone A, galanolactone, 3-acetoxy- 5-hydroxy-1,7-bis(4 -hydroxy-3 -methoxyphenyl)-heptane and hexahydrocurcumin). From the hexane fraction and essential oil were identified two monoterpenes and four sesquiterpenes. The most active compounds against cathepsin K were gingerols and shogaols with longer alkyl chain. Optimization of the separation of major compounds (6, 8 and 10-gingerol) and an overload study of C18 column was performed using HPLC, obtained as result dozens to hundreds of milligrams of each gingerol with high purity. Structural modifications of 6-gingerol were carried out and of the seven derivatives obtained 4 presented significant increase in inhibition of cathepsin K. Of all the compounds, three, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, were selected for later tests: determinating of the mode the inhibition against cathepsin K, inhibition against cathepsin K and inhibition of nitric oxide (NO) production, in cellular culture. The inhibitions determined were: partially noncompetitive, partially uncompetitive and complete uncompetitive for the SSi6, 10-gingerol and 6-shogaol, respectively. Excellent inhibition activity against the cathepsin K, in cellular culture, can be observed for SSi6 and 6-shogaol. In the inhibition assay of NO production, the 6- shogaol was the only compound that appeared as effective. / Dez plantas utilizadas pela medicina tradicional com indicativos na literatura de suas eficácias frente a doenças osteoarticulares foram selecionadas para a realização de uma triagem de atividade inibitória frente à catepsina K, uma importante enzima responsável pela clivagem do colágeno, principal constituinte da matriz extracelular da cartilagem e ossos. Das dez plantas selecionadas (gengibre, açafrão, camélia, unha-de-gato, mentrasto, moringa, babaçu, garra-do-diabo, urtigão e pequi), uma, gengibre (Zingiber officinale), merece destaque pela alta inibição de seu extrato e frações frente à catepsina K e por seu uso milenar como agente terapêutico. Da fração de diclorometano obtida do extrato bruto dos rizomas de Z. officinale isolou-se e identificou-se 18 substâncias (4-gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 6-shogaol, 8- shogaol, 10-shogaol, 6-paradol, 6-gingerdiol, metil-6-gingerol, metil-6-shogaol, diacetato de 6-gingerdioila, diacetato de metil-6-gingerdioila, zingerona, gingerenona A, galanolactona, 3-acetato de 5-hidroxi-1,7-bis(4 -hidroxi-3 -metoxifenil)-heptila e hexaidrocurcumina). Da fração de n-hexano e do óleo essencial, foram identificados 2 monoterpenos e 4 sesquiterpenos. As substâncias mais ativas frente à catepsina K foram os gingerois e shogaois de maior cadeia alquílica. Otimização da separação das substâncias majoritárias (6, 8 e 10-gingerol) e um estudo de sobrecarga de uma coluna C18 por CLAE, foram realizados, obtendo-se como resultado o isolamento de dezenas a centenas de miligramas de cada gingerol com considerável grau de pureza. Modificações estruturais do 6-gingerol foram realizadas e, das sete substâncias obtidas, 4 tiveram um aumento considerável do poder inibitório. Das substâncias obtidas, três, SSi6, 10-gingerol, 6-shogaol, foram selecionadas para ensaios posteriores: determinação do tipo de inibição frente à catepsina K, inibição da catepsina K e inibição da produção de óxido nítrico (NO), em meio celular. As inibições determinadas foram não-competitiva parcial, acompetitiva parcial e acompetitiva completa, para o SSi6, 10-gingerol e 6-shogaol, respectivamente. Excelentes atividades de inibição frente à catepsina K, em meio celular, puderam ser observadas para o SSi6 e 6-shogaol. No ensaio de inibição da produção de NO, o 6- shogaol foi a única substância que se apresentou como efetivo.

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e &#945;-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and &#945;-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

Apesar de Culex quinquefasciatus ser um eficiente vetor de doenças tais como a filariose linfática, febre do Nilo Ocidental e outras várias neuroviroses, poucas pesquisas sobre sua fisiologia têm sido conduzidas. Como em todos os animais ovíparos, o desenvolvimento embrionário dos mosquitos depende da degradação dos nutrientes armazenados no ovo, sendo a catepsina B uma protease que tem sido identificada e caracterizada em vários insetos como envolvida nesta função. Neste trabalho identificamos, por espectrometria de massas, duas catepsinas B de Culex quinquefasciatus, parcialmente purificadas por autoproteólise de extrato total de ovos. Segundo a anotação de suas sequências no banco de dados específico para vetores, o VectorBase, elas são enzimas parálogas e suas sequências apresentam 77% de homologia. Denominadas neste trabalho como CatB1 e CatB2, ambas são expressas simultaneamente no corpo gorduroso de todas as fêmeas vitelogênicas de nossa colônia e sua atividade pode ser detectada nos ovários vitelogênicos, sugerindo sua origem materna. A transcrição de ambas as enzimas se inicia após o repasto sanguíneo (ARS), alcançando o pico de expressão às 36 h ARS, de forma bastante semelhante à da vitelogenina. / Despite Culex quinquefasciatus be an efficient vector of diseases such as lymphatic filariasis, West Nile fever and other various neurotrophic viruses, little research on its physiology have been conducted. As in all oviparous animals, embryonic development of mosquitoes depends on the degradation of the nutrients stored in the egg. Cathepsin B is a protease that has been identified and characterized in a number of insects as involved in this function. In this work we have identified, by mass spectrometry, two cathepsins B of Culex quinquefasciatus, partially purified by self-proteolysis of total egg extract. According to the annotation of their sequences in the specific vector database, the VectorBase, they are paralogue enzymes and their sequences have 77% homology. Named in this work as CatB1 and CatB2, both are expressed simultaneously in the fat body of all vitellogenic females of our colony and its activity can be detected in vitellogenic ovaries, suggesting a maternal origin. The transcription of both enzymes starts post blood meal (PBM), reaching their peak of expression at 36 h PBM, quite similar to vitellogenin.