Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Introdução: A identificação precoce da leucoplasia de prega vocal com risco de evoluir para malignidade é um assunto controverso e de difícil diagnóstico. Com a descoberta de marcadores biológicos capazes de identificar precocemente estas lesões, ter-se-iam melhores condições de realizar um tratamento mais efetivo precocemente. Objetivo: Analisar a imunoexpressão das proteínas Catepsina-B e Ecaderina nas leucoplasias de prega vocal e correlacioná-las com os dados clínicos, epidemiológicos e prognóstico da doença. Método: Foram avaliados, retrospectivamente, 32 pacientes portadores de leucoplasia de pregas vocais, tratados por cirurgia no período de 2000 a 2004. Os pacientes foram distribuídos de acordo com os resultados histológicos em dois grupos: Grupo A - Baixo Grau, n=16 e Grupo B - Alto Grau, n=16. As expressões quantitativas dos marcadores foram avaliadas, segundo a intensidade da sua coloração e distribuição tecidual, pelo programa de processamento de imagens-ImageLab®. O índice de expressão (IE) de cada marcador foi correlacionado com os hábitos de vida dos pacientes - uso de tabaco e bebida alcoólica -, sinais da síndrome faringolaríngea do refluxo e recidiva local da lesão. Resultados:Na análise estatística comparando o IE dos marcadores entre os grupos (A e B) separadamente, os pacientes com recidiva local do Grupo B - apresentaram maior IE para Catepsina-B. Na análise do IE dos marcadores entre todos os pacientes (A + B), o IE da Catepsina-B foi maior entre os fumantes e os que não apresentavam sinais sugestivos de refluxo,e o IE da E-caderina foi maior nos pacientes com recidiva local. Conclusão: Os pacientes com displasia moderada, severa e carcinoma in situ, com elevado IE de Catepsina-B e que tenham o hábito do tabagismo estão mais propensos à recidiva local, e aqueles com sinais sugestivos da síndrome faringolaríngea do refluxo apresentam índices de expressão mais baixo de Catepsina-B, independente da lesão histológica. O aumento no índice da expressão para Catepsina-B no grupo com lesões de alto grau aponta esta proteína como potencial marcador de recidiva para as lesões leucoplásicas da prega vocal. O índice de expressão da E-caderina encontra-se aumentado entre os pacientes com Leucoplasia de prega vocal que recidivaram após tratamento inicial. / Introduction: Early identification of vocal fold leukoplakia with risk for malignancy is a controversial subject and difficult in terms of diagnosis. Histological changes that may predispose to this irreversible malignant transformation remain as undefined lesions in the larynx. With the analysis of immunohistochemical parameters and the discovery of a biological marker able to identify these early lesions, a more effective early treatment can be provided, which can result in the preservation of phonatory organ. Objective: To analyze the immunohistochemical protein expression of cathepsin B-and ECadherin in leukoplakia of the vocal fold and correlate them with clinical data, epidemiology and prognosis of the disease. Method: We retrospectively evaluated 32 patients with leukoplakia of the vocal folds in the Institute of Larynx- city of Sao Paulo- diagnosed through laryngoscopy and treated with surgery during 2000 to 2004. Patients were divided into two groups according to histological results, Group A (Low Grade, n = 16) and Group B (High Grade, n = 16). Slides added by anti-cathepsin-B and anti-E-cadherin were obtained from paraffin blocks for subsequent reading of markers through Imagna- ImageLab processing. The quantitative expression of cathepsin B-and Ecadherin was evaluated according to the coloration intensity and tissue distribution. The expression index (EI) of each marker was correlated to patient´s lifestyle (use of tobacco and alcohol), signs of gastroesophageal reflux disease and local recurrence of the lesion in two separate groups and among all patients. Results: In the descriptive analysis, the vocal fold leukoplakia showed more intensity in men who had frequent habit of smoking and alcohol consumption. These patients had high levels suggestive of signs of gastroesophageal reflux disease and local recurrence of the lesion after initial treatment. Statistical analysis comparing the levels of expression (IE) of the markers between the groups (A and B), patients with local recurrence in Group B (High Grade) had higher IE for cathepsin-B. In the statistical analysis of IE markers among all patients without histological differentiation, the IE of cathepsin-B was higher among smokers and those with no signs suggestive of reflux. In the same analysis, E-cadherin was higher in all patients with local recurrence. Conclusion: Smoking patients who have moderate or severe dysplasia, carcinoma in situ and high levels of cathepsin-B were more susceptible to local recurrence of disease. Those with signs suggestive of gastroesophageal reflux disease had lower IE of cathepsin-B, independent of histologic differentiation. The increase in cathepsin-B expression, for high grade lesions group, indicates this protein as a possible marker of aggressiveness to leukoplastic vocal cord lesions. The rate of expression of Ecadherin is shown as a potential marker for recurrence of leukoplastic vocal fold lesions. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6066.pdf: 3990215 bytes, checksum: 05550a0cc5074637afaa52685749e202 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Brazil is a major exporter of oranges in the world, with the state of São Paulo, the largest citrus producer in the country. In the last years plants of the genus citrus have been strongly affected by various diseases and among them, the disease Huanglongbing (HLB) have occupied prominent role and importance due to the devastating damage caused to citrus production worldwide. Caused by Candidatus Liberibacter spp., a bacterium that colonizes and blocks the conductive vessels of elaborated sap (phloem) and transmitted by the vector, hemiptera, the psyllid Diaphorina citri. In this context, it is necessary to search for strategies to control the disease in citrus orchards. In order to identify a cysteine peptidase D. citri, in this work, the identification, recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase D. citri, the type (cathepsin B) called DiaciCATHB was performed. The identification of an ORF for cysteine peptidase was performed using the database of the transcriptome of D. citri. Recombinant expression was performed in Pichia pastoris yeast cells. For activation of the recombinant enzyme important factors were observed, acidic conditions and incubation in suitable temperature and time. Kinetic characterization of the enzyme was verified by hydrolysis of the synthetic substrate Z-Phe-Arg-MCA, resulting in a (km) of 15.7 mM. Inhibition of the enzymatic activity tests were conducted using the recombinant inhibitor of cysteine peptidases CaneCPI-4, resulting in the inhibition constant (Ki) of 0.05 nM. The analysis of gene expression DiaciCATHB demonstrated that gene expression occurs in all stages of insect development, there is however a significant difference in expression level. According to the developmental stages of the insect D. citri, the expression level gradually increases DiaciCATHB, being higher in nymph and adult stages. The present results do not prove that the location and function performed by the enzyme DiaciCATHB, but regardless, the cysteine peptidase in this study has the potential to become an important target for use in future studies on insect control. / O Brasil é um dos maiores exportadores de laranjas do mundo, sendo o estado de São Paulo o maior produtor de citros no país. Nos últimos anos as plantas do gênero citrus têm sido fortemente afetadas por diversas patologias e dentre estas, a doença Huanglongbing (HLB) têm ocupado papel de destaque e importância devido aos danos devastadores causados a citricultura mundial. Causada pela Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria que coloniza e obstrui os vasos condutores da seiva elaborada (floema) e transmitida pelo vetor, hemíptero, o psilídeo Diaphorina citri. Neste contexto, se faz necessário à busca por estratégias de controle para a doença nos pomares de citros. Com a finalidade de identificar uma cisteíno peptidase de D. citri, no presente trabalho, foi realizada a identificação, expressão recombinante e caracterização de uma cisteíno peptidase de D. citri, do tipo (catepsina B) denominada DiaciCATHB. A identificação de uma ORF para cisteíno peptidase de foi realizada através do banco de dados do transcriptoma de D. citri. A expressão recombinante foi realizada em células da levedura Pichia pastoris. Para a ativação da enzima recombinante fatores importantes foram observados, como condições ácidas e incubação em temperatura e tempo adequados. A caracterização cinética da enzima foi verificada pela hidrólise do substrato sintético Z-Phe-Arg-MCA, resultando em um (Km) de 15,7 μM. Testes de inibição da atividade enzimática foram realizados utilizando a o inibidor de cisteíno peptidases recombinante CaneCPI-4, resultando na constante de inibição (Ki) de 0,05 nM. A análise de expressão do gene DiaciCATHB demonstrou que a expressão do gene ocorre em todas as fases de desenvolvimento do inseto, havendo no entanto, uma diferença significativa no nível de expressão. De acordo com as fases de desenvolvimento do inseto D. citri, o nível de expressão de DiaciCATHB aumenta gradualmente, sendo maior nas fases de ninfa e adulto. Os resultados obtidos nesse trabalho não comprovam qual a localização e função exercida pela enzima DiaciCATHB, porém, independente disso, a cisteíno peptidase em estudo apresenta potencial para tornar-se um importante alvo para a utilização em futuros estudos no controle do inseto.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3861.pdf: 2836276 bytes, checksum: bc721126635c9ba884c4ab4a6d99384d (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The flavonoids are an important class of polyphenolic compounds present in relative abundance among the secondary metabolites of plants and are found in fruits, vegetables, nuts, seeds, flowers, tea, honey and propolis. They show several biological activities such as anti-inflammatory, antimicrobial, antioxidant, anticancer, antifungal, etc.. The present work aimed to synthetize and to evaluate the biological activity of a library of flavones and chalcones. The flavones and chalcones were prepared following classical organic synthesis and combinatorial chemistry. Among the flavones and chalcones prepared and tested against enzyme of T. cruzi gGAPDH, the best results were obtained with the flavone 56{1,6}, 85% of inhibition, and the chalcone 55{1,3}, 97% of inhibition, both at concentration of 100 M. In bioassay against human cathepsin V, a chalcone which showed the best inhibitory activity was chalcone 18 with 64% of inhibition and 9 flavones (40{1,1}, 40{2,1}, 40{3,1}, 56{1,1}, 56{1,5}, 56{2,1}, 56{3,1}, 56{3,2}, 56{4,1}) showed 100% of inhibition, both at concentration of 25 M. The flavones and chalcones prepared will contribute for the study of structure-activity relationship, which could let to the design and synthesis of more active flavones and chalcones. / Os flavonóides constituem uma importante classe de compostos polifenólicos presentes em relativa abundância entre os metabólitos secundários de plantas e são encontrados em frutas, vegetais, nozes, grãos, flores, chás, própolis e mel. Apresentam diversas atividades biológicas como, anti-inflamatória, antimicrobiana, anti-oxidante, anti-câncer, anti-fúngica, etc. O presente trabalho teve como objetivos síntetizar e avaliar a atividade biológica de uma coleção de flavonas e chalconas. A preparação das flavonas e chalconas foi realizada empregando-se metodologias de síntese orgânica clássica e também química combinatória. Dentre as flavonas e chalconas preparadas e testadas frente à enzima gGAPDH do T. cruzi, os melhores resultados foram obtidos com a flavona 56{1,6}, 85% de inibição, e a chalcona 55{1,3}, com 97% de inibição, ambas na concentração de 100 M. Nos testes realizados frente a catepsina humana V, a chalcona que apresentou maior atividade inibitória foi a chalcona 18 com 64% de inibição e 9 flavonas (40{1,1}, 40{2,1}, 40{3,1}, 56{1,1}, 56{1,5}, 56{2,1}, 56{3,1}, 56{3,2}, 56{4,1}) apresentaram 100% de inibição, ambas na concentração de 25 M. As flavonas e chalconas preparadas irão contribuir para o estudo de estrutura-atividade, visando o planejamento e síntese flavonas e chalconas mais ativas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6532.pdf: 4134216 bytes, checksum: 66fda1fc89e3d69ae6b01c3cbca83d4e (MD5) Previous issue date: 2015-02-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cathepsin D is an aspartyl endopeptidase involved in many pathological processes when overexpressed. In addition, it is responsible for degradation of hemoglobin ingested by parasites of schistosomiasis. For these reasons cathepsin D is considered an important target for chemotherapeutic intervention. The assays commonly performed to evaluate the inhibition of this enzyme monitor reaction products generated from the cleavage of fluorogenic peptide substrates or human hemoglobin in the presence of inhibitors that may exhibit autofluorescence/absorbance at the same wavelength used. Considering this problem, this paper presents the development and application of four methodologies for cathepsin D assays. In two methodologies the assays were performed in solution, and in one of them was used isolated bovine cathepsin D, and the other employed an extract of proteins taken from Schistosoma mansoni adult worms. A third assay was developed to evaluate inhibitors by means of a CatD-IMER bioreactor coupled to a multidimensional system in which it is possible to monitor the immobilized enzyme activity directly by quantifying the product formed. Finally, the last methodology was carried out by immobilizing the substrate human hemoglobin in the quartz crystal. The hydrolysis of hemoglobin by cathepsin D was evaluated by using a Quartz Crystal Microbalance technique, a method that monitor the enzyme activity by mass variations. For the enzymatic assays, twenty plant extracts were evaluated, which led to the isolation and identification of the alkaloid evolitrine, the compound 4-hydroxy-3- methoxycinnamaldehyde and the flavonoids orientin and isovitexina. It were also tested 31 pure compounds, among them, the substance (Z)-2-(pentadec-5- enyl)benzene-1,4-diol, which showed significant activity both against the isolated enzyme as the protein extract of S. mansoni. Finally, recombinant cathepsin D from S. mansoni was cloned and expressed using E. coli system, and in vitro studies of isolated natural product compounds showed excellent results regarding the limonoid cedrelona against somules and adult worms of S. mansoni. / A catepsina D é uma aspartil endopeptidase envolvida em muitos processos patológicos quando expressa de forma desregulada. Além disso, é responsável pela degradação da hemoglobina ingerida por parasitos causadores da esquistossomose. Por esses motivos a catepsina D é considerada um alvo importante na busca de inibidores. Os ensaios comumente realizados para avaliação da inibição dessa enzima monitoram produtos reacionais gerados a partir da clivagem de substratos peptídicos fluorogênicos ou a hemoglobina humana, na presença de inibidores, que podem apresentar autofluorescência/absorbância nos mesmos comprimentos de onda utilizados. Considerando esta problemática, este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de quatro metodologias para a realização de ensaios com a catepsina D. Em duas metodologias os ensaios são realizados em solução, sendo que, em uma delas utiliza-se a catepsina D bovina isolada, e na outra se emprega um extrato de proteínas retirado de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Um terceiro ensaio foi desenvolvido para estudo de inibidores por meio do biorreator CatD-IMER acoplado a um sistema multidimensional no qual é possível monitorar a atividade da enzima imobilizada diretamente por meio da quantificação do produto formado. Por fim, a última metodologia foi desenvolvida imobilizando-se o substrato hemoglobina humana em cristal de quartzo. Sua hidrólise pela catepsina D foi avaliada por meio do uso da técnica de Microbalança de Cristal de Quartzo, uma metodologia que monitora a atividade enzimática através de variações de massa. Nos ensaios enzimáticos foram avaliados 20 extratos de plantas, que levaram ao isolamento e identificação do alcaloide evolitrina, do composto 4-hidroxi-3-metoxicinamaldeído e dos flavonoides orientina e isovitexina. 31 compostos puros também foram ensaiados e, dentre estes, a substância (Z)-2-(pentadec-5-enil)benzeno-1,4-diol se destacou apresentando uma atividade expressiva tanto frente à enzima isolada quanto em relação ao extrato de proteínas de S. mansoni. Para finalizar, a catepsina D recombinante de S. mansoni foi clonada e expressa em sistema E. coli, e ensaios in vitro com compostos isolados de produtos naturais mostraram excelentes resultados em relação ao limonoide cedrelona frente à esquistossômulos e vermes adultos de S. mansoni.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-01Bitstream added on 2014-06-13T19:30:16Z : No. of bitstreams: 1 mazon_rc_me_arafcf.pdf: 520188 bytes, checksum: 4af452f70d4ec4f1806399a4a3c1661c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O mdm2 parece controlar o tráfego da proteína p53 do núcleo-citoplasma enquanto a proteína p27 é um inibidor de CDK que controla a fase G1 para S do ciclo celular. Em contraste, a catepsina B parece induzir um sinal de apoptose independente de caspase na presença do HPV. Entretanto, a influência da infecção pelo HPV na carcinogênese oral e o envolvimento na desregulação das proteínas do ciclo celular não são claras. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre a expressão de proteínas do ciclo celular, p27, mdm2 e catepsina B e câncer oral na presença do HPV. Cinqüenta e cinco biópsias orais representando lesões benignas (LB), lesões potencialmente malignas (LPM) e lesões malignas (LM). A detecção e tipagem do HPV (6/11,16,18, 31 e 33) foi realizada pela reação da polimerase em cadeia (PCR). A expressão quantitativa de p27, mdm2 e catepsina B foi analisada pela reação imunohistoquímica. Vinte e uma (38%) de 55 lesões orais foram positivas para HPV. O DNA do HPV 6/11 foi encontrado em 6 (33%), HPV 16 em 1(5%) e o HPV 18 em 14 (72%). Não foi encontrado HPV 31 e 33. De 55 biópsias, foi encontrada alta expressão de todas as proteínas: o p27 foi encontrado em 37 (67,2%) lesões, mdm2 em 17 (30,9%) e a catepsina B em 37 (67,2%). Entre lesões orais de HPV positivo, uma superexpressão de p27, mdm2 e catepsina B foi encontrada, respectivamente, em 6 (33%) de 18 lesões benignas, 4 (22%) de 18 lesões potencialmente malignas e 11 (57,9%) de 19 lesões malignas. Adicionalmente, o HPV16/18 (11/58%) foi detectado em lesões malignas com alta expressão de todas as proteínas. Nós concluímos que os tipos de HPVs de alto risco devem estar associados com carcinoma oral, bem como, com a superexpressão de p27, mdm2 e catepsina B. Estes resultados sugerem que os tipos de HPVs de alto risco podem desregular o controle do ciclo celular, contribuindo para a carcinogênese oral. / Mdm2 seems to control p53 nucleus-cytoplasm traffic while p27 is a CDK inhibitor which control G1 to S phase of the cell-cycle. In contrast, cathepsin B is reported in HPVinduced apoptotic signalling caspase-independent. However, the influence of HPV infection in oral carcinogenesis and its involvement to this cell-cycle proteins dysfunction remain still unclear. The purpose of this study was to clarify the association between the expression of cell-cycle proteins, p27, mdm2 and cathepsin B and oral cancer HPV-related. Fifty-five oral biopsies presenting benign oral lesions (BL), potentially malignant lesions (PML) and malignant oral lesions (ML). HPV detection and typing (6/11, 16, 18, 31 and 33) was performed using polymerase chain reaction. p27, mdm2 and cathepsin B quantitative expression were performed by immunohistochemistry. Twenty one (38%) of the 55 oral lesions were positive for HPV, of which HPV6/11 DNA was found in 6 (33%), HPV 16 in 1(5%) e o HPV 18 in 14 (72%). No HPV positivity was found to HPV31 and 33. Of the 55 biopsies, a high expression of all proteins was found: to p27 in 37 (67,2%), mdm2 was observed in 17 (30,9%) slides, and cathepsin B in 37 (67,2%). Among HPV-positive oral lesions, an overexpression for mdm2, p27 and cathepsin B was found, respectively, in 6 (33%) out of 18 BL, 4 (22%) out of 18 PML and 11 (57,9%) out of 19 ML. In addition, HPV16/18 (11/58%) was detected in OSSC with high expression of all proteins. We conclude that high-risk HPV types might be associated with oral carcinoma, as well as, with the overexpression of mdm2, p27 and cathepsin B. These results suggest that high-risk HPV types might deregulate cell-cycle control, contribuiting to oral carcinogenesis.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-06-27T19:16:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) José Luiz de Figueiredo_TESE DE DOUTORADO_SA.pdf: 20285168 bytes, checksum: 2ae5d11950e2cb6dc18e886511b1c189 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T19:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) José Luiz de Figueiredo_TESE DE DOUTORADO_SA.pdf: 20285168 bytes, checksum: 2ae5d11950e2cb6dc18e886511b1c189 (MD5) Previous issue date: 2015-08-24 / Doença renal crônica acelera o desenvolvimento de ateroscleroses. A catepsina S é uma potente protease que quebra as fibras de elastina na parede das artérias e gera peptídeos bioativos de elastina, promovendo inflamação e calcificação vascular. Objetivo: Verificar os efeitos da inibição seletiva da catepsina S nas ateroscleroses de camundongos deficientes em apolipoproteína E (ApoE-/-) com doença renal crônica. Método: A doença renal crônica foi induzida por nefrectomia subtotal (5/6) em camundongos ApoE-/-, alimentados com uma dieta com alto teor de gorduras e colesterol. Os camundongos hipercolesterolêmicos, com doença renal crônica receberam essa dieta misturada com 6,6 ou 60 mg / kg do inibidor seletivo da catepsina S - RO5444101 ou a mesma dieta sem o inibidor seletivo da catepsina S (controle). Resultados: Camundongos com doença renal crônica tinham níveis plasmáticos significativamente mais elevados de osteopontina, osteocalcina e osteoprotegerina (204%, 148%, e 55%, respectivamente; p<0,05), que foram inibidos pelo RO5444101 (60%, 40%, e 36%, respectivamente; P<0,05). Imagens moleculares fluorescentes revelaram uma redução significativa na atividade da catepsina em camundongos tratados. O RO5444101 diminuiu também a atividade osteogênica. Avaliação histológica na placa aterosclerótica demonstrou que o RO5444101 reduziu a imunorreatividade da catepsina S (P<0,05), a degradação da elastina (P=0.01), o tamanho da placa (P=0.01), a acumulação de macrófagos (P<0,01), o fator de diferenciação do crescimento-15 (P=0.0001), a calcificação (atividade da fosfatase alcalina), P<0,01; e a osteocalcina, P<0,05). Além disso, o inibidor da catepsina S ou o siRNA significativamente diminuiu a expressão do fator de diferenciação do crescimento-15 e a proteína quimiotáctica de monócitos-1 numa linha de células de macrófagos de camundongos e macrófagos primários humanos. Conclusão: A inibição seletiva da catepsina S atenua a progressão de lesões ateroscleróticas em camundongos deficientes em apolipoproteína E com doença renal crônica. / Chronic kidney disease accelerates the development of atherosclerosis. Cathepsin S is a potent protease that cleaves elastin in the arteries wall and generates bioactive elastin peptides, promoting vascular inflammation and calcification. Objective: To verify the effects of selective inhibition of cathepsin S in atherosclerosis in apolipoprotein E deficient (ApoE-/-) mice with chronic kidney disease. Methods: chronic kidney disease was induced by a subtotal (5/6) nephrectomy in a high-fat high-cholesterol fed ApoE-/- mice. Hypercholesterolemic mice with CRD received a diet admixed with 6.6 or 60 mg/kg of the selective cathepsin S inhibitor RO5444101 or a diet without the selective inibidor of the catepsina S (control). Results: chronic kidney disease mice had significantly higher plasma levels of osteopontin, osteocalcin, and osteoprotegerin (204%, 148%, and 55%, respectively; P<0.05), which were inhibited by RO5444101 (60%, 40%, and 36%, respectively; P<0.05). Near-infrared fluorescence molecular imaging revealed a significant reduction in cathepsin activity in treated mice. RO5444101 decreased osteogenic activity. Histologic assessment in atherosclerotic plaque demonstrated that RO5444101 reduced immunoreactive cathepsin S (P<0.05), elastin degradation (P<0.01), plaque size (P<0.01), macrophage accumulation (P<0.01), growth differentiation factor-15 (P<0.0001), and calcification, alkaline phosphatase activity, (P<0.01); osteocalcin, (P<0.05). Furthermore, cathepsin S inhibitor or siRNA significantly decreased expression of growth differentiation factor-15 and monocyte chemotactic protein-1 in a murine macrophage cell line and human primary macrophages. Conclusion: The selective inhibition of cathepsin S attenuates the progression of atherosclerotic lesions in apolipoprotein E deficient mice with chronic kidney disease

Orientador: Marcio Ajudarte Lopes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:31:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flores_IsadoraLuana_D.pdf: 2280685 bytes, checksum: 4c70e1fe2979897700a7a4161710b445 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: OBJETIVO: A leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP) é uma variante rara e ainda pouco compreendida de leucoplasia oral com um comportamento de progressão persistente para malignidade apresentando uma taxa de malignização entre 40-100%. Além disso, a detecção precoce da LVP às vezes é um desafio para os clínicos, porém desempenha um papel crucial para estabelecer um contínuo e rigoroso acompanhamento. Aspectos moleculares subjacentes são relevantes e nenhum estudo anterior investigou a saliva de pacientes com LVP. O aumento do interesse no estudo do proteoma salivar ocorre porque as proteínas são consideradas as moléculas mais importantes do fluido salivar com potencial para atuar como biomarcador para o diagnóstico de várias doenças sistêmicas e locais. Com base nestes aspectos, o presente estudo teve como objetivo traçar o perfil do proteoma salivar de pacientes com LVP, a fim de identificar potenciais biomarcadores para a melhor compreensão desta entidade visando o possível uso clínico. MATERIAIS E MÉTODOS: A saliva total não estimulada foi coletada de 30 voluntários (15 pacientes com LVP e 15 controles). Uma abordagem proteômica baseada na associação de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa foi realizada para análise de 20 µg de proteínas das amostras. Os testes de qui-quadrado, análise de variância e regressão logística foram utilizados na análise estatística. RESULTADOS: Um total de duzentas e oitenta e três proteínas foram identificadas. Entre estas, 31 proteínas apresentaram diferença estatisticamente significativa em relação à abundância, sendo 25 proteínas com maior abundância no grupo controle e 6 proteínas com maior abundância no grupo LVP. A combinação das proteínas angiotensinogênio e dipeptidil peptidase 1 criaram um modelo de diferenciação de grupo com um índice de concordância de 94,2% revelando ambas as proteínas como potenciais biomarcadores para o diagnóstico de LPV. CONCLUSÕES: Apesar deste estudo ser o primeiro a avaliar o proteoma salivar em pacientes com LVP, os resultados mostraram que a triagem da saliva pode ser um teste útil no diagnóstico de indivíduos com risco para o desenvolvimento de LPV / Abstract: OBJECTIVE: Proliferative verrucous leukoplakia (PVL) is a rare variant and still poorly understood of oral leukoplakia with a behavior of persistent progression to malignancy showing a rate of malignancy between 40-100%. Moreover, the early detection of PVL is sometimes challenging for clinicians, but plays a crucial role to establish a continuous and rigorous follow-up. Underlying molecular aspects are relevants and no previous study investigated the saliva of PVL patients. The increased interest in the salivary proteome study is because proteins are considered the most important molecules in the salivary fluid with potential to act as biomarker for diagnosis of various systemic and local diseases. Based on these aspects, the present study aimed to draw the salivary proteome profile of patients with PVL in order to identify potential biomarkers to better understanding of this entity targeting the possible clinical use. MATERIALS AND METHODS: Unstimulated whole-mouth saliva was collected of 30 voluntaries (15 PVL patients and 15 controls). Proteomic approach based to liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry was performed to 20 µg of proteins of the samples. Chi-Square, analysis of variance and logistic regression test were used in the statistical analysis. RESULTS: A total of two hundred eighty-three proteins were identified. Among of them, 31 proteins showed statistical significance difference in relation to abundance, being 25 proteins with higher abundance in control group and 6 proteins with higher abundance in PVL group. The combination of angiotensinogen and dipeptidyl peptidase 1 created a model for group differentiation with a concordance index of 94.2% revealing both proteins as potential biomarkers for diagnosis of PVL. CONCLUSIONS: Although this study is the first to evaluate the salivary proteome in PVL patients, the results showed that saliva screening may be helpful test to diagnosis of individuals with risk to PVL development / Doutorado / Patologia / Doutora em Estomatopatologia

Trypanosamas de diversas espécies podem infectar mamíferos de interesse econômico em todo o mundo. Trypanosoma vivax, T. evansi, T. equiperdum, T. congolense, T. b. brucei e T. simiae geram importantes doenças em ungulados na África, Ásia e Américas Central e do Sul; enquanto T. theileri e espécies relacionadas são pouco patogênicas. Compreender a epidemiologia e as interações parasita-vector-hospedeiro requer estudos de estrutura populacional, filogeográficos e de diversidade e relações filogenéticas entre isolados. Sequências de microssatelites e dos genes SSUrRNA, gGAPDH, CatL, ITS, SL, 5S, Cytb e ESAG6 mostraram ampla diversidade biológica e diferenciaram genótipos com associação geográfica e restrição de hospedeiros em T. theileri e espécies relacionadas. T. evansi mostrou importante heterogeneidade de sequências no gene ESAG6, enquanto populações de T. vivax muito divergentes foram observadas em regiões preservadas e com transmissão cíclica quando comparadas com a microheterogeneidade biológica de áreas de transmissão mecânica. / Trypanosames can infect diverse species of mammals of economic interest worldwide. Trypanosoma vivax, T. evansi, T. equiperdum, T. congolense, T. brucei brucei and T. simiae cause important diseases in ungulates in Africa, Asia and Central and South America, while T. theileri and related species are of low pathogenicity. Understanding the epidemiology and host-parasite-vector interactions requires studies of population structure, phylogeography and diversity and phylogenetic relationships among isolates. Microsatellite loci and sequences from genes SSUrRNA, gGAPDH, CatL, ITS, SL, 5S, Cytb and ESAG6 revealed high biological diversity and allowed differentiation of genotypes with geographic structure and host-restriction event in T. theileri and related species. T. evansi showed significant heterogeneity in ESAG6 sequences, while populations of T. vivax widely divergent were observed in pristine regions and cyclical transmission compared to the microheterogeneity showed by isolates from mechanical transmission areas.

Apesar de Culex quinquefasciatus ser um eficiente vetor de doenças tais como a filariose linfática, febre do Nilo Ocidental e outras várias neuroviroses, poucas pesquisas sobre sua fisiologia têm sido conduzidas. Como em todos os animais ovíparos, o desenvolvimento embrionário dos mosquitos depende da degradação dos nutrientes armazenados no ovo, sendo a catepsina B uma protease que tem sido identificada e caracterizada em vários insetos como envolvida nesta função. Neste trabalho identificamos, por espectrometria de massas, duas catepsinas B de Culex quinquefasciatus, parcialmente purificadas por autoproteólise de extrato total de ovos. Segundo a anotação de suas sequências no banco de dados específico para vetores, o VectorBase, elas são enzimas parálogas e suas sequências apresentam 77% de homologia. Denominadas neste trabalho como CatB1 e CatB2, ambas são expressas simultaneamente no corpo gorduroso de todas as fêmeas vitelogênicas de nossa colônia e sua atividade pode ser detectada nos ovários vitelogênicos, sugerindo sua origem materna. A transcrição de ambas as enzimas se inicia após o repasto sanguíneo (ARS), alcançando o pico de expressão às 36 h ARS, de forma bastante semelhante à da vitelogenina. / Despite Culex quinquefasciatus be an efficient vector of diseases such as lymphatic filariasis, West Nile fever and other various neurotrophic viruses, little research on its physiology have been conducted. As in all oviparous animals, embryonic development of mosquitoes depends on the degradation of the nutrients stored in the egg. Cathepsin B is a protease that has been identified and characterized in a number of insects as involved in this function. In this work we have identified, by mass spectrometry, two cathepsins B of Culex quinquefasciatus, partially purified by self-proteolysis of total egg extract. According to the annotation of their sequences in the specific vector database, the VectorBase, they are paralogue enzymes and their sequences have 77% homology. Named in this work as CatB1 and CatB2, both are expressed simultaneously in the fat body of all vitellogenic females of our colony and its activity can be detected in vitellogenic ovaries, suggesting a maternal origin. The transcription of both enzymes starts post blood meal (PBM), reaching their peak of expression at 36 h PBM, quite similar to vitellogenin.

O biofilme bacteriano é o agente etiológico primário no desenvolvimento da resposta inflamatória observada na doença periodontal. Os receptores do tipo NOD (NLRs) são proteínas citosólicas que reconhecem componentes microbianos presentes no citoplasma liberados por bactérias invasoras. Sabendo que bactérias periodontopatogênicas têm a capacidade de invadir e colonizar diversas células do tecido periodontal, o presente projeto tem o objetivo de estudar a participação dos receptores do tipo NOD (NOD1 e NOD2) no reconhecimento das bactérias Porphyromonas gingivalis, na modulação da resposta imune e no processo de reabsorção óssea. Camundongos isogênicos machos da linhagem C57BL/6 (WT) e camundongos deficientes para o receptor NOD1 (NOD1-/-) e receptor NOD2 (NOD2-/-) foram infectados com Phorphyromonas gingivalis utilizando um modelo experimental de doença periodontal. O grau de reabsorção óssea foi avaliado por análise morfométrica macroscópica e histológica da maxila, além da quantificação do número de osteoclastos na crista óssea alveolar. O grau de inflamação local foi realizado por contagem do número total de bactérias orais, quantificação de neutrófilos no tecido gengival (MPO) e avaliação dos mediadores inflamatórios por ELISA. Foi também avaliada a expressão de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos no tecido gengival pela técnica de qPCR. Animais NOD1-/- e NOD2-/- apresentaram menor delta de reabsorção óssea quando comparados aos animais WT. Animais NOD2-/- infectados apresentaram debilitado controle bacteriano quando comparados aos animais WT infectados. Animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados apresentaram baixa expressão de Cxcl1 e MPO quando comparados aos animais WT infectados. Além disso, foi observado que animais NOD2-/- infectados apresentaram reduzida produção de TNF-&alpha; e elevada produção de IL-10 quando comparados aos animais WT infectados. Não foi detectado diferença estatística na expressão de fatores osteogênicos, Runx2 e osteocalcina, entre animais WT, NOD1-/- e NOD2-/- infectados. Embora não houve diferença no número de células TRAP positivas presentes na crista óssea alveolar entre os grupos no tempo avaliado, animais WT infectados apresentaram elevada expressão gênica de RANKL/OPG quando comparados aos animais NOD2-/- infectados. Além disso, a expressão de marcadores de atividades dos osteoclastos, catepsina k e matrix metaloproteinase-9, foi significantemente baixa nos animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados quando comparados aos animais WT infectados. Esses resultados permitem sugerir que independente das variáveis observadas, verificamos que a ausência dos dois receptores impede a rápida progressão da reabsorção óssea alveolar observada na periodontite, portanto os receptores NOD1 e NOD2 contribuem para progressão da reabsorção óssea no modelo experimental de periodontite. / The bacterial biofilm has been identified as an etiological agent in the pathogenesis of periodontal disease. The NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins that sense microbial by products released by invasive bacteria. Since periodontopathogenic bacteria are able to invade and colonize some periodontal tissue cells, the purpose of this study is to determine the role of NOD1 and NOD2 receptors in the recognition of invasive periodontopathogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis, modulating the immune response and bone resorption. Isogenic strain C57BL/6 males (WT), NOD1 (NOD1-/-) and NOD2 (NOD2-/-) knockout mice were infected with Porphyromonas gingivalis in an experimental model of periodontal disease. Alveolar bone resorption was evaluated by macroscopic and histological morphometric analysis, quantification of osteoclasts numbers in bone crest alveolar. Imune inflammatory response was evaluated by, bacterial load, neutrophils quantification and inflammatory mediators levels by ELISA. We also evaluated the osteogenic and osteoclastogenic markers expression in gingival tissue by Real time PCR techniques. NOD1-/- and NOD2-/- animals showed lower bone resorption when compared to WT animals. NOD2-/- infected animals expressed higher bacterial load compared to WT infected ones. NOD1-/- and NOD2-/- infected animals presented lower Cxcl1 and MPO levels compared to WT infected animals. In addition, NOD2-/- infected animals presented lower level of TNF-&alpha; and higher level of IL-10 when compared to WT infected animals. There was no significant difference in the osteogenic factors expression, Runx2 and osteocalcin, when compared NOD1-/- and NOD2-/- infected animals to WT infected ones. Although there was no difference in TRAP-positive cells number evaluated in the alveolar bone crest among the studied groups, WT infected animals showed elevated ratio RANKL/OPG when compared to NOD2-/- infected animals. Moreover, the expression of osteoclasts activity markers, cathepsin k and matrix metalloproteinase-9, was significantly lower in NOD1-/- and NOD2-/- infected animals compared to WT infected ones. These results suggest that NOD1 and NOD2 receptors contribute to progression of bone resorption in experimental model of periodontitis, since the lack of NOD like receptors impair the bone resorption.