Diversos tipos celulares nas mais variadas condições têm sido usados como doadores de núcleo para a TN. Ainda não está claro se o estado fisiológico destas células afeta o posterior desenvolvimento dos embriões. Neste trabalho, testou-se a hipóese que fibroblastos bovinos em processo de MCP podem ser reprogramados na transferência nuclear. Fibroblastos foram cultivados até atingirem 60% de confluência, sincronizados por restrição de soro durante 24h e em seguida a MCP foi analisada por citometria de fluxo com a ténica da Anexina V/Iodeto de propídeo. Células Anexina positivas (MCP) e Anexinanegativas (Vivas) foram separadas por citometria de fluxo e utilizadas para a TNS. Céulas não coradas e não separadas no citômetro serviram como controle (Controle). Os embriões reconstruídos foram avaliados quanto à fusão, clivagem (2º dia de cultivo), blastocisto (7º dia) e prenhez (D30, D60 e nascimento). O índice de MCP dos blastocistos obtidos foi determinado. Os resultados foram analisados pela ANOVA ou teste de X2 com nível de significância de 5%. Não houve efeito nas taxas de fusão (p>0,05). Embriões reconstruídos com células MCP tiveram menor taxa de clivagem e formação de blastocistos (72,7% e 18,8%, respectivamente) em comparação ao grupo reconstruído com células Vivas (83,4% e 34,7%, respectivamente; p<0,05), não diferindo dos embriões Controle (77,3% e 27,3%, respectivamente; p>0,05). O índice de MCP do grupo de embriões MCP foi similar aos índices dos embriões clonados a partir de células Vivas e Controle (p>0,05). Após a transferência para receptoras, os grupos MCP, Vivas e Controle não diferiram com relação à taxa de prenhez aos 30d (18,1%, 13,3% e 27,5%, respectivamente; p>0,05). Entretanto aos 60d, a perda gestacional no grupo MCP (25%) foi inferior a do grupo Vivas (100%) e Controle (62,5%). Somente um nascimento, do grupo MCP (4,5% dos embriões transferidos), foi obtido no experimento. Conclui-se que células em processo de MCP, podem ser reprogramadas quando utilizadas como doadoras de núcleo na técnica de transferência nuclear, podendo estabelecer gestações e nascimentos, entretanto houve um efeito prejudicial nas taxas de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto assim como houve aumento do índice de MCP nos embriões reconstruídos. / It is not clear if the physiological status of the cells can affect further embryonic development in NT. We hypothesized that adult bovine fibroblasts in PCD can be reprogrammed when used as nuclear donors for cloning. Fibroblasts were cultivated until 60% confluency, synchronized by serum starvation for 24 h and stained with Annexin V and Propidium iodide (PI) by flow citometry. Annexin positive cells (PCD cells) and Annexin negative cells (Live cells) were sorted and used for NT. Unsorted, unstained cells were used as control (Control cells). After reconstruction, fusion, cleavage (day 2 of culture), blastocyst (day 7) and pregnancy rates (day 30, 60 and birth) were recorded. Apoptotic index of the embryos was determined by TUNEL. Data were analyzed with ANOVA and Chi-square test with 5% of significance level. There was no effect on fusion rates (p>0.05). Embryos reconstructed with PCD cells had lower cleavage and blastocyst rates (72.7 and 18.8%, respectively) compared with embryos reconstructed with Live cells (83.4 and 34.7%, respectively; p<0.05). Apoptotic index in embryos produced from cells in PCD was similar compared to embryos produced from Live and Control cells (p>0.05). Pregnancy rates were similar between cloned groups on day 30 after embryo transfer (p>0.05). However it was observed a reduced pregnancy loss in PCD group on day 60 (25%) compared with Control (62.5%) and Live (100%) groups. Only one calf, from PCD cells (4.5% of the transferred embryos), has been obtained in this experiment. In conclusion, it was showed that cells in PCD process can be reprogrammed when used as nuclear donors after NT producing even live animals. However, a negative effect on embryonic development and an increase in the apoptotic index of these embryos was observed.

Peptídeos intracelulares são constantemente produzidos pelo sistema ubiquitina proteassomo e muitos são provavelmente funcionais. Aqui, um nonapeptídio derivado da ciclina-D2, específica da transição G1/S, chamado \"pep5\" mostrou um aumento específico durante a fase S do ciclo celular em células HeLa. O pep5 (50-100 &mu;M) induziu a morte celular em células HeLa e em várias outras células tumorais, mas isso só ocorreu quando o pep5 foi sintetizado acoplado ao peptídeo penetrador de células (pep5-cpp). In vivo, o pep5-cpp reduziu o volume do glioblastoma C6 de ratos Wistar em cerca de 50%. A acetilação reduziu a potência do pep5-cpp, enquanto substituições Leu-Ala aboliram totalmente a atividade deste peptídeo. Os resultados de caracterização inicial do mecanismo de morte celular indizida pelo pep5 incluem ativação de caspases 3/7 e 9, inibição da fosforilação Akt2 e inibição da atividade do proteassomo. Esses dados colaboram com a hipótese da função de peptídeos intracelulares na sinalização. / Intracellular peptides are constantly produced by the ubiquitinproteasome system and many are probably functional. Here, a nonapeptide of G1/S-specific cyclin-D2 named pep5 showed a specific increase during the S phase of HeLa cell cycle. Pep5 (50-100 &mu;M) induced cell death in HeLa and in several other tumor cells, only when it was fused to a cell penetrating peptide (pep5-cpp). In vivo, the pep5-cpp reduced the volume of the rat C6 glioblastoma by almost 50%. Acetylation reduced the potency of the pep5-cpp while Leu-Ala substitutions totally abolished the pep5 activity. Findings from the initial characterization of the cell death mechanism of pep5 include caspase 3/7 and 9 activation, inhibition of Akt2 phosphorylation and inhibition of proteasome activity. These data further support the intracellular function of peptides.

A luz solar apresenta ondas eletromagnéticas em ampla faixa espectral, incluindo as regiões do ultravioleta (UV-C, UV-B, UV-A), visível e infravermelho. Cada região interage com a pele de forma dependente da fotofísica e da fotoquímica dos seus respectivos compostos absorvedores. A luz UV-A causa a geração de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (EROs e ERNs) através da fotossensibilização de moléculas endógenas (co-enzimas de flavina, porfirinas, melaninas). Quando fotossensibilizadores produzem quantidades de EROs e ERNs maiores do que a capacidade celular de supressão destas espécies, caracteriza-se um quadro de desbalanço redox, que causa lesão em biomoléculas como os ácidos nucleicos, lipídeos e as proteínas. Essas lesões podem levar à morte celular ou a outras transformações fenotípicas e genotípicas e também estimulam a liberação de citocinas pró-inflamatórias. Com a finalidade de melhor compreender a dinâmica dos mecanismos de resposta celular após exposição ao UV-A e ao visível, nós caracterizamos inicialmente as propriedades fotofísicas da melanina e detectamos a produção de oxigênio singlete (1O2) pela fotossensibilização no visível e a supressão desta espécie excitada pela reação do oxigênio singlete com a dupla ligação reativa dos grupos indóis presentes na melanina. Estes processos também foram observados no cabelo e levaram-nos a propor um modelo que explica o efeito da luz visível na estrutura e cor dos cabelos. Demonstramos também que a feomelanina produz mais (30%) 1O2 do que a eumelanina, que sofre maior modificação na sua estrutura por fotodegradação. O efeito destes processos na pele foi estudado a nível celular. Demonstramos que células epiteliais com maior teor de melanina apresentaram maior geração de 1O2 que causa lesão no DNA e morte necro-apoptótica após irradiação com luz visível. A foto-oxidação da melanina pela luz visível nos motivou a estudar um pigmento que fosse foto-protetor não somente contra luz UV-B mas também contra luz visível. A pigmentação com Acetil-Tirosina se mostrou atóxica e protetora contra luz UV-B e visível ao contrário do pigmento com tirosina, que se mostrou protetor do UV-B mas tóxico no visível. Este efeito foi relacionado com a localização celular do polímero e não com a estrutura do mesmo. A luz UV-A, por sua vez, promove o acúmulo de lipofuscina dentro dos vacúolos autofágicos de queratinócitos da pele e que também ativa a fototoxicidade pela luz visível. A lipofuscina dentro dos vacúolos autofágicos é foto-oxidada pela luz visível, causando lesão no DNA e morte celular programada tipo II. Doses UV-A que desencadeiam a liberação de citocinas também foram caracterizados. / Sunlight presents electromagnetic radiation over a wide spectral range, including the regions of ultraviolet (UV-C, UV-B, UV-A), visible and infrared. Each region interacts with skin dependending on the photophysics and photochemistry of the respective absorbing compounds. UV-A light causes the generation of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) by photosensitization of endogenous molecules (flavin coenzymes, porphyrins, melanins). When photosensitizers produce amounts of ROS and RNS larger than the cell capacity to suppress these species, a set of redox imbalance, which damages biomolecules such as nucleic acids, lipids and proteins. This damage cause cell death and to other phenotypic and genotypic changes and also stimulates the release of proinflammatory cytokines. In order to better understand the dynamics of the mechanisms of cellular responses after exposure to UV-A and visible light, we initially characterized the photophysical properties of melanin and detected the production of singlet oxygen (1O2) by photosensitization in the visible, as well as the suppression of these excited species by reaction of singlet oxygen with the double bonds of the reactive groups presented in the melanin indols. These processes were also observed in hair and led us to propose a model that explains the effects of visible light on the structure and color of hair. We also demonstrated that pheomelanin produces more (30%) 1O2 than eumelanin, which undergoes a quick change on its structure by photodegradation. The effect of these processes in the skin was studied at the cellular level. We demonstrated that epithelial cells with larger melanin content have stronger generation of 1O2, which causes DNA damage and necro-apoptotic death after irradiation with visible light. The photo-oxidation of melanin by visible light has motivated us to study a pigment that was not only able to protect against UV-B but also against visible. Pigmentation with Acetyl-Tyrosine proved nontoxic and protective against UV-B and visible light instead of pigmentation with Tyrosine, which shielded against UV-B but showed toxicity in the visible. This effect was associated with the polymer, cell location and not with its structure. UV-A light, in turn, promotes the accumulation of lipofuscin, within autophagic vacuoles of keratinocytes also enabling phototoxicity in the visible light. The lipofuscin within the autophagic vacuoles is fotooxidized by visible light, causing DNA damage and programmed cell death type II. Linear dose of UV-A that trigger the release of cytokines were also characterized.

Após a resposta imune, a expansão dos linfócitos T CD4 é seguida de uma fase de retração chamada Morte Celular induzida por Ativação (AICD), para que a homeostasia seja reestabelecida. Nosso grupo demonstrou que DCs estimuladas com LPS produzem PGE2 que inibe a expressão de FASL e bloqueia a AICD dos linfócitos T CD4. Nossa hipótese é que a apresentação de antígenos em contexto de infecção tenha um impacto na expressão de FASL e na sobrevivência das células T CD4, de maneira dependente de TLRPGE2. Para comprovar nossa hipótese nós estudamos a apresentação de OVA in vitro e in vivo. Observamos que a adição de LPS durante a apresentação de OVA aumenta a ativação e proliferação das células T CD4 específicas. O pré-tratamento dos camundongos com Indometacina, um inibidor da enzima COX, reduz a frequência das células específicas através do aumento na expressão de FASL e da apoptose, mas sem interferir com a proliferação. Nós sugerimos que a PGE2 produzida em resposta ao LPS regule a sobrevivência dos linfócitos T CD4 durante a persistência do estímulo antigênico. / After immune response, expansion of antigen-specific CD4 T cells is followed by a contraction phase due to Activation-Induced Cell Death (AICD) to reestablish homeostasis. Our group demonstrated that LPS stimulated-DCs produce PGE2 that protects CD4 T cells from AICD by preventing TCR/CD3-mediated FASL upregulation. Our hypothesis is that antigen presentation in the context of infection impacts on FASL expression and survival of CD4 T cells, dependently on TLR-mediated PGE2 release. To approach our hypothesis we studied OVA presentation in vitro and in vivo. We observed that the addition of LPS during OVA presentation increased specific CD4+ T cells activation and proliferation. Pretreatment of mice with indomethacin, an inhibitor of COX enzyme, reduces the frequency of specific T cells by increasing FASL expression and apoptosis, but did not interfere with proliferation. We suggest that PGE2 produced in response to LPS regulates the survival of CD4 T lymphocytes during persistent antigen stimulation.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para tratamento de câncer que usa um fotossensibilizador (FS) que na presença de luz e oxigênio molecular gera espécies altamente reativas de oxigênio (EROs) que levam as células tumorais à morte por apoptose ou necrose. Os FSs do tipo clorina apresentam problemas de agregação reduzindo sua eficácia fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi sintetizar, caracterizar e testar novas clorinas não agregáveis em meio fisiológico e determinar sua ação fotodinâmica em células tumorais (HEp-2 e HeLa) e não tumorais (Vero). As moléculas 10-a e 10-b foram obtidas com rendimentos de 68% e as moléculas 11-a e 11-b com 64% de rendimento. Foram caracterizadas por RMN 1H, 13C, UV-Vis e espectrometria de massas de alta resolução (HRMS). Os valores de rendimento quântico de oxigênio singleto (&Phi;0) das clorinas foram comparáveis a uma molécula comercial análoga usada em TFD, a verteporfina (Visudyne&reg;). As clorinas sintetizadas apresentaram valores de rendimento quântico de fluorescência (&Phi;f) maiores que o Visudyne&reg;, além de uma baixa fotodegradação. O coeficiente de absorção molar (&epsilon;) das clorinas 10a-b e 11a-b exibiram valores maiores em meio aquoso apresentando uma auto-agregação menor que o Visudyne&reg;. O coeficiente de partição (Log P) obtido para a verteporfina (1.61 ± 0.10) foi maior que das clorinas 10a-b e 11a-b (1,20 ± 0,04 e 1,40 ± 0,03) respectivamente, evidenciando uma maior lipofilicidade e dificuldade de solubilização em meio aquoso em relação às clorinas. Os valores de Concentração Inibitória Média (IC50) das clorinas 10-a e 10-b nas linhagens celulares HEp-2 e HeLa foram menores que os determinados para a verteporfina pelo método de MTT, estas clorinas foram três e duas vezes mais potentes do que Visudyne&reg; respectivamente. As análises por microscopia de fluorescência mostraram que as quatro clorinas sintetizadas levam à morte celular predominantemente por apoptose nas duas linhagens tumorais. A acumulação intracelular determinada por microscopia confocal mostrou que as clorinas 10a-b exibiram uma maior penetração em relação às clorinas 11a-b através da membrana citoplasmática nas células tumorais, assim como, nas não tumorais. Dessa forma, as clorinas sintetizadas mostraram-se mais fotoestáveis, mais fototóxicas e mais solúveis em meio fisiológico do que o Visudyne&reg;, vantagens consideráveis para o uso como fotossensibilizadores para TFD. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique for the treatment of cancer that uses a photosensitizer (PS) that in the presence of light and molecular oxygen generates highly reactive oxygen species (ROS) that lead tumor cells to death by apoptosis or necrosis. Chlorine-like PSs exhibit aggregation, reducing its photodynamic efficacy in PDT. Thus, the objective of this study was to synthesize, characterize and test new chlorins sterically-prevented for self-aggregation in physiological medium, as well as determining their photodynamic response in tumor cells (HEp-2 and HeLa) and non-tumor cells (Vero). The chlorins designated 10-a and 10-b (yield: 68%), 11-a and 11-b (yield: 64%) were characterized by 1H, 13C, UV-Vis, and high resolution mass spectrometry (HRMS). The singlet oxygen quantum yield (&Phi;0) values of the chlorins were comparable to an analogous commercial molecule used in PDT, verteporfin (Visudyne&reg;). The synthesized chlorins shown fluorescence quantum yield values (&oslash;f) higher than Visudyne&reg;, in addition to low photodegradation. The molar absorption coefficient (&epsilon;) of chlorins 10a-b and 11a-b exhibited higher values in aqueous medium showing less self-aggregation than Visudyne&reg;. The partition coefficient (Log P) obtained for verteporfin (1.61 ± 0.10) was higher than that of chlorins 10a-b and 11a-b (1.20 ± 0.04 and 1.40 ± 0.03), respectively, indicating a greater lipophilicity and difficulty of solubilization in aqueous medium comparing to chlorins. The half-maximal inhibitory concentration (IC50) values of 10-a and 10-b chlorins in HEp-2 and HeLa cell lines were lower than those determined for verteporfin by the MTT method. These chlorins were three and two times more potent than Visudyne&reg; respectively. Fluorescence microscopy analyzes displayed that the four synthesized chlorins lead to cell death predominantly by apoptosis in the two tumor cells. Intracellular accumulation determined by confocal microscopy showed that chlorinas 10a-b exhibited a greater penetration with respect to chlorins 11a-b through the cytoplasmic membrane in tumor cells, as well as in non-tumor cells. Thus, the chlorins synthesized in this study showed to be more phototoxic and more soluble in physiological medium than Visudyne&reg;, considerable advantages for the use as photosensitizers for PDT.

A transição materno-embrionária é um fenômeno complexo caracterizado pela iniciação da transcrição no embrião e a substituição do mRNA materno pelo mRNA embrionário. O mRNA e as proteínas estocadas no oócito são utilizados nas primeiras clivagens e, posteriormente, o embrião deve iniciar a transcrição dos genes necessários ao seu desenvolvimento, que ocorre no estádio de oito células em embriões bovinos. Nesta etapa, podem ser observados embriões competentes a continuar o desenvolvimento, enquanto embriões incompetentes sofrem bloqueio. Pelo fato do bloqueio ocorrer na fase de ativação do genoma embrionário, formulou-se a hipótese de que o bloqueio estaria associado a genes transcritos neste momento, contrariamente à hipótese mais aceita de bloqueio passivo. O objetivo deste trabalho foi de identificar, categorizar e avaliar transcritos diferencialmente expressos entre embriões bovinos de desenvolvimento rápido e lento, além de elucidar possíveis vias de sinalização de morte ou sobrevivência celular. Para isso, foi feita uma hibridação em membrana de macro arranjo contendo genes humanos relacionados a ciclo celular, hibridada com aRNA marcado radioativamente oriundo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com sua velocidade de desenvolvimento, seguido por RT-PCR e análise de vias de sinalização para validação da hibridação. A média de similaridade entre estes genes humanos e bovinos de 89,3%. Pelas membranas de macro arranjos foram identificados 120 genes com modulação diferencial entre embriões lentos e rápidos, sendo 100 genes com regulação superior nos embriões lentos. Entre os genes com modulação positiva nos embriões rápidos, 40% foram primariamente identificados como ligantes a proteínas e 25% têm atividade catalítica, com resultados similares no grupo de genes com modulação positiva nos embriões lentos. Por um lado, as diferenças de transcrição entre embriões de desenvolvimento rápido e lento não foram confirmadas pelo RTPCR. Mas os genes diferencialmente modulados estão associados e constitutivamente presentes em algumas vias de sinalização para morte celular. Os resultados sugerem que a ativação do genoma embrionário é necessária para a sinalização de vias de sobrevivência ou morte celular programada. Assim, o bloqueio do desenvolvimento não é um processo passivo, mas sim um processo ativo de transcrição de genes, ativando tanto a cascata de sobrevivência quanto a cascata de morte em embriões com baixo potencial de desenvolvimento. / Maternal-zygotic transition is a complex phenomenon characterized by the initiation of transcription in the embryo and the transition of maternal mRNA with embryonic mRNA. It is believed that the mRNAs and proteins synthethized by the oocyte during its growth and final maturation allow the zygote to develop during the early stages of embryo development up to the 8 cell-stage, the moment when the bovine embryo acquires transcriptional competence. Competent embryos are able to develop until blastocyst, while incompetent embryos block. Since the blockage occurs during embryo genome activation, we developed the hypothesis that gene transcription in incompetent embryos is associated with the blockage, instead of passive blockage. The aim of this work was to identify, categorize and analyze gene expression differences between fast cleavage and slow cleavage embryos, and discover possible signaling pathways to cell death or cell survival. We used a macroarray membrane spotted with human genes related to cell cycle and hybridizated with a radioactive labeled aRNA from fast or slow in vitro produced embryos. Real-time PCR and signaling pathways analysis were designed for further validation of the array. The mean similarity between human and bovine genes was 89,3%. According to the array membranes, it was possible to identify 120 genes differentially expressed between slow and fast cleavage embryos. Hence, the majority of the genes were more expressed in slow embryos (100 genes versus 20 genes in fast group). Among genes more expressed at fast embryos, 40% were identified as protein binding and 25% have catalytic activity, with similar results in slow embryos. In one hand, differences between fast and slow embryos transcripts were not confirmed by real-time PCR analysis. But on the other hand, the differentially expressed genes are somehow related to and constitutively present in some recognized death pathways. Together, these results presented herein suggest that embryonic genome activation is necessary for survival or cell death signaling. Moreover, developmental block is not a passive pathway, but rather a very active transcriptional pathway, leading to activation of cell survival genes prior to genes related to death in slow-developing embryos.

Physiologiquement, l’ADN, séquestré dans les noyaux, n’est pas détecté par les récepteurs de danger du système immunitaire. En revanche, au cours d’inflammations chroniques, une rupture de la tolérance vis-à-vis de l’ADN du soi, consécutivement à sa libération dans le milieu extracellulaire par les cellules mortes, a été démontrée. L’accès de l’ADN extracellulaire aux récepteurs intracellulaires est médié par des molécules cargo capables de s’associer à l’ADN extracellulaire et d’induire sont internalisation.L’IL-26, qui est un membre de la famille de l’IL-10, a été décrite comme une cytokine pro-inflammatoire, dont les mécanismes moléculaires restent mal connus. Nous avons démontré que l’IL-26 se lie à l’ADN, permet son internalisation dans le cytosol des cellules myéloïdes et la sécrétion de cytokines pro inflammatoires via la voie STING et la voie des inflammasomes. La modélisation informatique de l’IL-26, basée sur la structure de l’IL-10,met en évidence des caractéristiques structurales similaires aux molécules cargo : un domaine de liaison à l’ADN, deux hélices amphipathiques et un motif d’ancrage à la membrane. De plus, des complexes circulants d’IL-26-ADN sont retrouvés dans les sérums de patients en poussée aigues de vascularite à ANCA,une pathologie inflammatoire chronique. L’IL-26 est détectée dans les lésions de glomérulonéphrite aigue nécrosante à croissants, ainsi qu’au niveau des cellules musculaires lisses artérielles de ces patients. Ces dernières sécrètent de l’IL-26 en présence de cytokinespro-inflammatoires. En conclusion, l’IL-26 établit d’une boucle d’autoamplification entre une mort cellulaire intense et l’inflammation. / In physiological conditions, self-DNA released by dying cells is not detected by intracellular DNA sensors. Inchronic inflammatory disorders, unabated inflammation has been associated with a break in innate immune tolerance to self-DNA. However, to gain access to intracellular DNA sensors, extracellular DNA has to complex with DNA-binding molecules. IL-26 is a member of the IL-10 cytokine family, overexpressed in numerous chronic inflammatory diseases, which biological activity remains unclear. We demonstrate here that IL-26 binds to DNA and shuttles it in the cytosol of human myeloid cells. As a consequence, IL-26 allows extracellular DNA to trigger proinflammatory cytokine secretion by monocytes, in a STING- and inflammasome-dependent manner. Supporting these biological properties, IL-10-based modelling predicts two DNA-binding domains, two amphipathic helices, and an in-plane membrane anchor in IL-26, structural features of cationic amphipathic cell penetrating peptides. In line with these properties, patients with active autoantibody-associated vasculitis, a chronic relapsing autoimmune inflammatory disease associated with extensive cell death, exhibit high levels of both circulating IL-26 and IL-26-DNA complexes. Moreover, in patients with crescentic glomerulonephritis, IL-26 is expressed by renal arterial smooth muscle cells and deposits in necrotizing lesions. Accordingly, human primary smooth cells secrete IL-26 in response to proinflammatory cytokines. In conclusion, IL-26 expressed in lesions confers proinflammatory properties to DNA released by dying cells, setting up a positive amplification loop between extensive cell death and unabated inflammation.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para tratamento de câncer que usa um fotossensibilizador (FS) que na presença de luz e oxigênio molecular gera espécies altamente reativas de oxigênio (EROs) que levam as células tumorais à morte por apoptose ou necrose. Os FSs do tipo clorina apresentam problemas de agregação reduzindo sua eficácia fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi sintetizar, caracterizar e testar novas clorinas não agregáveis em meio fisiológico e determinar sua ação fotodinâmica em células tumorais (HEp-2 e HeLa) e não tumorais (Vero). As moléculas 10-a e 10-b foram obtidas com rendimentos de 68% e as moléculas 11-a e 11-b com 64% de rendimento. Foram caracterizadas por RMN 1H, 13C, UV-Vis e espectrometria de massas de alta resolução (HRMS). Os valores de rendimento quântico de oxigênio singleto (&Phi;0) das clorinas foram comparáveis a uma molécula comercial análoga usada em TFD, a verteporfina (Visudyne&reg;). As clorinas sintetizadas apresentaram valores de rendimento quântico de fluorescência (&Phi;f) maiores que o Visudyne&reg;, além de uma baixa fotodegradação. O coeficiente de absorção molar (&epsilon;) das clorinas 10a-b e 11a-b exibiram valores maiores em meio aquoso apresentando uma auto-agregação menor que o Visudyne&reg;. O coeficiente de partição (Log P) obtido para a verteporfina (1.61 ± 0.10) foi maior que das clorinas 10a-b e 11a-b (1,20 ± 0,04 e 1,40 ± 0,03) respectivamente, evidenciando uma maior lipofilicidade e dificuldade de solubilização em meio aquoso em relação às clorinas. Os valores de Concentração Inibitória Média (IC50) das clorinas 10-a e 10-b nas linhagens celulares HEp-2 e HeLa foram menores que os determinados para a verteporfina pelo método de MTT, estas clorinas foram três e duas vezes mais potentes do que Visudyne&reg; respectivamente. As análises por microscopia de fluorescência mostraram que as quatro clorinas sintetizadas levam à morte celular predominantemente por apoptose nas duas linhagens tumorais. A acumulação intracelular determinada por microscopia confocal mostrou que as clorinas 10a-b exibiram uma maior penetração em relação às clorinas 11a-b através da membrana citoplasmática nas células tumorais, assim como, nas não tumorais. Dessa forma, as clorinas sintetizadas mostraram-se mais fotoestáveis, mais fototóxicas e mais solúveis em meio fisiológico do que o Visudyne&reg;, vantagens consideráveis para o uso como fotossensibilizadores para TFD. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique for the treatment of cancer that uses a photosensitizer (PS) that in the presence of light and molecular oxygen generates highly reactive oxygen species (ROS) that lead tumor cells to death by apoptosis or necrosis. Chlorine-like PSs exhibit aggregation, reducing its photodynamic efficacy in PDT. Thus, the objective of this study was to synthesize, characterize and test new chlorins sterically-prevented for self-aggregation in physiological medium, as well as determining their photodynamic response in tumor cells (HEp-2 and HeLa) and non-tumor cells (Vero). The chlorins designated 10-a and 10-b (yield: 68%), 11-a and 11-b (yield: 64%) were characterized by 1H, 13C, UV-Vis, and high resolution mass spectrometry (HRMS). The singlet oxygen quantum yield (&Phi;0) values of the chlorins were comparable to an analogous commercial molecule used in PDT, verteporfin (Visudyne&reg;). The synthesized chlorins shown fluorescence quantum yield values (&oslash;f) higher than Visudyne&reg;, in addition to low photodegradation. The molar absorption coefficient (&epsilon;) of chlorins 10a-b and 11a-b exhibited higher values in aqueous medium showing less self-aggregation than Visudyne&reg;. The partition coefficient (Log P) obtained for verteporfin (1.61 ± 0.10) was higher than that of chlorins 10a-b and 11a-b (1.20 ± 0.04 and 1.40 ± 0.03), respectively, indicating a greater lipophilicity and difficulty of solubilization in aqueous medium comparing to chlorins. The half-maximal inhibitory concentration (IC50) values of 10-a and 10-b chlorins in HEp-2 and HeLa cell lines were lower than those determined for verteporfin by the MTT method. These chlorins were three and two times more potent than Visudyne&reg; respectively. Fluorescence microscopy analyzes displayed that the four synthesized chlorins lead to cell death predominantly by apoptosis in the two tumor cells. Intracellular accumulation determined by confocal microscopy showed that chlorinas 10a-b exhibited a greater penetration with respect to chlorins 11a-b through the cytoplasmic membrane in tumor cells, as well as in non-tumor cells. Thus, the chlorins synthesized in this study showed to be more phototoxic and more soluble in physiological medium than Visudyne&reg;, considerable advantages for the use as photosensitizers for PDT.

As fosfolipases são bastante estudadas e podem ser encontradas de forma abundante nas peçonhas. Algumas fosfolipases que sofrem modificação no resíduo 49 com a substituição do aminoácido Asp por Lys, o que provoca perda do seu sítio catalítico, são classificadas como miotoxinas. A miotoxina BthTX-I foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu, possui 121 resíduos de aminoácidos, pI 8,2 e massa molecular de 13kDa. O objetivo do presente projeto foi avaliar a ação da BthTX-I, quanto à sua ação citotóxica, indutora de morte celular, interferência na cinética celular e expressão de genes responsáveis pela morte celular em quatro linhagens tumorais, HL-60 (leucemia promielocítica), HepG-2 (hepatocarcinoma humano), PC-12 (feocromacitoma murino) e B16F10 (melanoma murino). Também foi analisada a indução de citocinas inflamatórias IL-8 e TNF-? em linhagens humanas HL-60 e HepG2. A citotoxicidade, avaliada pela metodologia do MTT, apresentou valores citotóxicos em torno de 62, 53, 53 e 63%, respectivamente para HepG2, HL-60, PC12 e B16F10. A toxina mostrou ação moduladora do ciclo celular na fase S em células HepG2; na fase G2/M em células HL-60. Nas linhagens B16F10 e PC-12 a toxina provocou atraso na fase G0/G1 e redução de células na fase S e G2/M. O perfil eletroforético em gel de agarose a 1,5% mostrou fragmentação do conteúdo do DNA, indicando possível apoptose, que foi confirmada pelo ensaio de morte celular por citometria de fluxo. O ensaio revelou que a linhagem B16F10 tem maior índice apoptótico (~40%), seguido da HepG2 (~35%), PC-12 (~25%) e HL-60 (~4%). A indução de citocinas pela metodologia de ELISA apresentou valores elevados de IL-8 para linhagem HL-60 (~400 pg/mL) e HepG2 (~400 pg/mL), sugerindo uma possível quimiotaxia/migração de células de defesa. TNF- ? também apresentou alteração em seus níveis representando cerca de 150 pg/mL na linhagem HepG2. A expressão dos genes Bax, Bcl-2 e p53 demonstrou que o gene p53 se altera somente na linhagem HepG2, todavia a expressão dos genes Bax e Bcl-2 mostrou ser diferente para cada linhagem. Em células B16F10 a toxina aumentou os níveis de Bax e diminuiu os níveis de Bcl-2 enquanto que, as células PC-12 exibiram aumento nos níveis de ambos. Em HepG2 houve redução da expressão do gene antiapoptótico Bcl-2 e valor inalterado de Bax, ao passo que a linhagem HL-60 apresentou resultado contrário ao de células HepG2, com aumento na expressão de Bax e valores inalterados de Bcl-2. Assim a toxina mostra diferente ação na expressão dos genes responsáveis pela apoptose em diferentes linhagens celulares, mostrando que a BthTX-I influencia a expressão desses genes, ou promove apenas a alteração de dessses, levando assim à apoptose celular das linhagens tratadas com a miotoxina. Diante dos dados obtidos ficou evidenciado o potencial antitumoral da BThTX-I levando a busca de outros mecanismos de atuação da toxina, abrindo perspectivas de sua aplicação biotecnológica para a produção de novo fármaco antitumoral e tornando-se uma terapia alternativa a essa enfermidade. / Phospholipases are widely studied and can be found in abundance in several animal venoms. Some phospholipases, classified as myotoxins, present a modification at residue 49, with replacement of the amino acid Asp by Lys, causing loss of their catalytic site. BthTX-I was isolated from the venom of Bothrops jararacussu and is a myotoxin with 121 amino acid residues, pI 8.2 and a molecular mass of 13kDa. The aim of this study was to evaluate BthTX-I regarding its cytotoxic action, induction of cell death, interference with cell kinetics and expression of genes responsible for cell death in four tumor cell lines: HL-60 (promyelocytic leukemia), HepG2 (human hepatocellular carcinoma), PC-12 (murine pheochromocytoma) and B16F10 (murine melanoma). The induction of inflammatory cytokines (IL-8 and TNF-?) in the human cell lines HepG2 and HL-60 was also analyzed. Cytotoxicity, as assessed by the MTT methodology, showed values around 62, 53, 53 and 63% for HepG2, HL-60, PC12 and B16F10, respectively. The toxin showed modulating action of the cell cycle in the S phase in HepG2 cells, in the G2/M phase in HL-60 cells and delay in the G0/G1 phase. The toxin also caused a delay in the G0/G1 phase and reduced the number of cells in the S and G2/M phases in B16F10 and PC-12 cell lines. The electrophoretic profile on 1,5% agarose gel showed fragmentation of DNA content, possibly indicating apoptosis, which was confirmed by flow cytometry cell death assays. This assay revealed that B16F10 cells presented a higher apoptotic rate (~40%), followed by HepG2 (~35%), PC-12 (~25%) and HL-60 (~4%) cells. Induction of cytokines analyzed by ELISA showed high levels of IL-8 in HL-60 (~400 pg/mL) and HepG2 (~400 pg/mL) cells, suggesting a possible chemotaxis and migration of immune cells. The levels of TNF-? also showed changes, representing about 150 pg/mL in HepG2 cells and 14 pg/mL in HL-60 cells. Gene expression of Bax, Bcl-2 and p53 showed that the p53 gene did not change only in HepG2 cells, with the gene expression of Bax and Bcl-2 being different for each cell line. The toxin increased the levels of Bax and decreased the levels of Bcl-2 in B16F10 cells, while PC-12 cells showed increased levels of both genes. Regarding HepG2 cells, a decrease in the expression of the antiapoptotic gene Bcl-2 was observed, with unchanged values for Bax, while opposite results were observed for HL-60 cells, with increased expression of Bax and unchanged values of Bcl-2. Thus, the toxin showed different actions on the expression of genes responsible for apoptosis in different cell lines, showing that BthTX-I influences the expression of both genes, promoting changes in one or another apoptotic gene, thus leading the tumor cell lines treated with this myotoxin to apoptosis. The obtained data evidenced the antitumor potential of BthTX-I, leading to the search for other mechanisms of action of this toxin and opening prospects for its biotechnological applications for the production of new anti-cancer drugs.

by Chan Po-cheung. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 1994. / Includes bibliographical references (leaves 218-244). / Acknowledgement --- p.i / Abbreviations --- p.ii / Abstract --- p.iv / Table of content --- p.ix / Chapter Chapter 1. --- Biochemistry of Tumor Necrosis Factor --- p.1 / Chapter I. --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- The discovery of tumor necrosis factor (TNF) --- p.1 / Chapter 1.2 --- TNF as an antitumor agent --- p.3 / Chapter 1.3 --- Production of TNF --- p.4 / Chapter 1.4 --- Structure of TNF --- p.5 / Chapter 1.5 --- TNF receptor --- p.6 / Chapter 1.6 --- Biological activities of TNF --- p.10 / Chapter 1.7 --- Anti-tumor activity of TNF --- p.14 / Chapter 1.7.1 --- In vitro studies --- p.14 / Chapter 1.7.1.1 --- Synergistic effect of other cytokines --- p.14 / Chapter 1.7.1.2 --- DNA damages --- p.15 / Chapter 1.7.1.3 --- Free radical generation --- p.15 / Chapter 1.7.1.4 --- Utilization of ATP --- p.16 / Chapter 1.7.1.5 --- Phospholipase A2 activation --- p.17 / Chapter 1.7.2 --- In vivo studies --- p.17 / Chapter 1.8 --- Clinical trials --- p.18 / Chapter Chapter 2. --- Materials and Methods --- p.20 / Chapter 2.1 --- Materials --- p.20 / Chapter 2.2 --- Solutions commonly used --- p.21 / Chapter 2.3 --- Methods and procedure --- p.23 / Chapter 2.3.1 --- Culture of L-929 cells --- p.23 / Chapter 2.3.2 --- Trypan Blue exclusion test --- p.23 / Chapter 2.3.3 --- Determination of viability of L-929 cells upon rhTNF treatment --- p.24 / Chapter 2.3.4 --- Determination of cellular cAMP level --- p.25 / Chapter 2.3.5 --- Determination of inositol phosphate turnover --- p.26 / Chapter 2.3.6 --- Use of fluorescence probe in the study of rhTNF mediated killing --- p.28 / Chapter 2.3.6.1 --- Determination of changes in internal pH of L-929 cells --- p.29 / Chapter 2.3.6.2 --- Determination of intracellular calcium level in L-929 cells --- p.30 / Chapter 2.3.6.3 --- Determination of membrane potential by fluorescence probes --- p.32 / Chapter 2.3.6.4 --- "Translocation of nucleolar protein, nucleophosmin (B23)in L-929 cells" --- p.32 / Chapter 2.3.6.5 --- Determination of calcium mobilization in L-929 cells by confocal microscopy --- p.34 / Chapter 2.3.6.6 --- Determination of protein kinase C and phospho-tyrosine kinase in L-929 cells --- p.34 / Chapter 2.3.7 --- Uptake of 45Ca2+ in L-929 cells --- p.35 / Chapter 2.3.8 --- Measurement of membrane potential by Patch-clamp assay --- p.36 / Chapter 2.3.9 --- Determination of tyrosine kinase activation by Western blotting --- p.36 / Chapter 2.3.10 --- Statistical analysis --- p.38 / Chapter Chanter 3. --- Effect of rhTNF treatment on nucleophosmin in L-929 cells --- p.39 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.39 / Chapter 3.2 --- Results --- p.43 / Chapter 3.2.1 --- Effect of TNF (in the presence or absence of actinomycin D) on the nucleophosmin translocation in L-929 cells --- p.43 / Chapter 3.2.2 --- Effect of actinomycin D on the TNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.51 / Chapter 3.3 --- Discussion --- p.57 / Chapter Chapter 4. --- Changes in membrane potential and intracellular pH in rhTNF-mediated cytotoxicity in L-929 cells --- p.59 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.59 / Chapter 4.2 --- Results --- p.61 / Chapter 4.2.1 --- Effect of rhTNF on the membrane potential of L-929 cells determined by fluorescence method --- p.61 / Chapter 4.2.2 --- Effect of rhTNF on the membrane potential of L-929 cells determined by patch clamp technique --- p.64 / Chapter 4.2.3 --- "Effect of K+, Na+ and pH on the rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells" --- p.67 / Chapter 4.3 --- Discussion --- p.90 / Chapter Chapter 5. --- Effect of intracellular cAMP and cAMP-dependent protein kinase (PKA) on the rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.92 / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.92 / Chapter 5.1.1 --- "GTP-binding protein (G protein), cAMP and protein kinase A" --- p.92 / Chapter 2.1.2 --- Role of cAMP as second messenger --- p.96 / Chapter 5.1.3 --- Bacterial toxin used for study of G-protein --- p.98 / Chapter 5.1.4 --- Effect of cAMP on rhTNF cytotoxicity --- p.99 / Chapter 5.1.5 --- Effect of cAMP-dependent protein kinase (PICA) on rhTNF cytotoxicity --- p.101 / Chapter 5.2 --- Results --- p.102 / Chapter 5.2.1 --- Cyclic-AMP (cAMP) level in rhTNF-treated L-929 cells --- p.102 / Chapter 5.2.2 --- Effect of intracellular cAMP level on rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.104 / Chapter 5.2.3 --- Effect of agonist and inhibitor of cAMP dependent protein kinase (protein kinase A) on rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.107 / Chapter 5.2.4 --- Effect of protein kinase A inhibitors on rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.111 / Chapter 5.3 --- Discussion --- p.118 / Chapter Chapter 6. --- "Role of intracellular free calcium, ions and calcium dependent response in rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells" --- p.121 / Chapter 6.1 --- Introduction --- p.121 / Chapter 6.1.1 --- Inositol triphosphate and intracellular free calcium --- p.121 / Chapter 6.1.2 --- Diacylglycerol --- p.131 / Chapter 6.1.3 --- Protein kinase C (PKC) --- p.131 / Chapter 6.1.4 --- Intracellular free calcium ions and protein kinase C --- p.134 / Chapter 6.1.5 --- Effect of intracellular free calcium ions and protein kinase C on TNF-mediated cytotoxicity --- p.135 / Chapter 6.1.6 --- Tyrosine kinase induced release of IP3 --- p.136 / Chapter 6.1.7 --- Calcium channels --- p.136 / Chapter 6.2 --- Result --- p.139 / Chapter 6.2.1 --- Effect of rhTNF on intracellular free [Ca2+] of L-929 cells --- p.141 / Chapter 6.2.2 --- Effect of calcium ion channel blockers on rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.148 / Chapter 6.2.3 --- Effect of protein kinase C (PKC) on rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.158 / Chapter 6.2.4 --- Immunofluorescence staining of PKC in rhTNF-treated L-929 cells --- p.162 / Chapter 6.2.5 --- Effect of calmodulin and calmodulin sensitive calcium ATPase on rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.165 / Chapter 6.2.6 --- Role of inositol triphosphate in rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.167 / Chapter 6.2.7 --- Role of tyrosine kinase activity in the rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.185 / Chapter 6.3 --- Discussion --- p.191 / Chapter Chapter 7. --- Effect of antioxidants on rhTNF-mediated cytotoxicity on L-929 cells --- p.195 / Chapter 7.1 --- Introduction: Oxygen free radicals as mediators of rhTNF-induced tumor cell necrosis --- p.195 / Chapter 7.2 --- Results --- p.199 / Chapter 7.3 --- Discussion --- p.203 / Chapter Chapter 8. --- General Discussion --- p.205 / Bibliography --- p.217