Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Le domaine du génie tissulaire ouvre la voie à l'utilisation de nouvelles stratégies pour l'obtention de tissus de remplacement. Un soin particulier doit être porté lors de la production de ces substituts afin d'optimiser la quantité et la qualité des cellules prolifératrices présentes à l'intérieur de ces tissus. Nos analyses ont permis de déterminer que les caractéristiques du site de prélèvement cutané influençaient la quantité de cellules souches retrouvées in situ. De plus, nos expérimentations sur le modèle de peau reconstruite par auto-assemblage permet de préserver les cellules avec un cycle lent de division cellulaire, une caractéristique des cellules souches cutanées. Finalement, la cryopréservation, utilisée pour conserver les lignées de kératinocytes, n'influence pas la fonction des cellules souches épithéliales. Ces résultats suggèrent que les techniques utilisées pour la production de substituts cutanés sont optimales dans un contexte où la conservation des cellules souches est une nécessité.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les cellules épithéliales possèdent deux domaines membranaires distincts: le domaine apical, qui fait face à la lumière de l'organe, et le domaine basolatéral, qui interagit avec les cellules adjacentes et la matrice sous-jacente. Ces deux régions membranaires sont formées, entre autres, par la distribution particulière des protéines et des lipides membranaires. Les protéines membranaires sont transportées vers un domaine précis par l'intermédiaire de vésicules. Ce transport vésiculaire est contrôlé par des protéines spécialisées responsables d'étapes spécifiques de ce tri moléculaire. Parmi ces protéines spécialisées, les protéines "adaptrices" reconnaissent des structures ou des séquences d'acides aminés retrouvées sur les protéines membranaires. Ces signaux de transport servent d'adresses qui permettent à la machinerie cellulaire de reconnaître les protéines et de les transporter à destination. Les virus enveloppés utilisent ce processus de transport pour bourgeonner à des régions spécifiques de la cellule; notamment, à l'un ou à l'autre des domaines membranaires des cellules épithéliales. Il a précédemment été démontré que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) bourgeonne à la surface basolatérale des cellules épithéliales, et que le signal responsable de ce phénomène se trouve dans la partie cytoplasmique des glycoprotéines. Cependant, les structures ou acides aminés impliqués dans le signal n'étaient pas identifiés. Cette étude décrit le processus par lequel le signal de transport basolatéral des glycoprotéines du VIH a été identifié. Un système d'expression transitoire prenant avantage de cellules épithéliales MDCK directement cultivées sur membranes semi-perméables est utilisé. Une analyse de mutagénèse dirigée a démontré que la tyrosine amino-terminale de la région cytoplasmique est une composante essentielle du signal de transport. Cette étude suggère aussi qu'une structure locale en tours 13 contribue à la reconnaissance du signal. Enfin, les glycoprotéines mutantes ne démontrent aucune perte de fonction (infection, cinétiques de réplication virales), mais sont distribuées de façon non-polarisée à la surface cellulaire. Des observations préliminaires sur les glycoprotéines des virus de la leucémie T-lymphotropique humaine (HTLV) et de la leucémie mutine (MuL,V) suggéraient qu'elles possèdent des signaux de transport basolatéral. L'effet des glycoprotéines mutantes de ces deux virus sur le bourgeonnement polarisé du VIH a donc été étudié. Les signaux de transport de ces glycoprotéines ont été identifiés; ils se retrouvent dans la région cytoplasmique de ces glycoprotéines et une tyrosine est essentielle à chacun. La conservation d'un tel signal dans plusieurs rétrovirus suggère que le bourgeonnement polarisé est un phénomène important dans la biologie de ce groupe de virus. Enfin, étant donné que l'incorporation des glycoprotéines dans la particule virale est essentielle au bourgeonnement polarisé du VIH, les mécanismes gouvernant ce phénomène ont été étudiés. Il a été démontré que la délétion de la partie cytoplasmique des glycoprotéines du VIH permettait leur incorporation à l'intérieur de particules rétrovirales hétérologues. Ces observations sont ici reproduites en tenant compte de l'utilité de ces vecteurs en thérapie génique. Les vecteurs rétroviraux ayant incorporé les glycoprotéines tronquées transduisent spécifiquement un gène dans les cellules CD4+ d'une population mixte de lymphocytes. L'ensemble de ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'assemblage des rétrovirus et le transport intracellulaire de leurs protéines.

L'intestin est reconnu comme un organe métabolique clé impliqué dans le développement des complications de l'obésité et du diabète. En présence d'obésité, l'intestin grêle développe un état local de résistance à l'insuline, un métabolisme lipidique altéré et une inflammation ainsi qu'une perméabilité paracellulaire accrue. En raison de l'environnement complexe des cellules épithéliales intestinales, il n'est pas clair à ce jour si la dyshoméostasie intestinale peut être induite par des altérations endogènes liées à l'obésité de l'hôte. L'objectif de cette étude était d'évaluer l'impact individuel de l'hyperglycémie, la dyslipidémie et l'inflammation sur les fonctions épithéliales intestinales en utilisant des organoïdes de crypte intestinale. Les organoïdes, dérivés du duodénum de souris mâle C57BL/6, ont été incubés 24 h dans des conditions inflammatoires, dyslipidémiques avec un taux élevé d'acide gras libres et hyperglycémiques. L'expression génique ainsi que la sensibilité à l'insuline ont été mesuré par qPCR et analyse densitométrique, respectivement. Nous montrons que les organoïdes, et donc les cellules de l'épithélium intestinal, répondent bien à l'insuline car cette hormone induit une activation dose-réponse de la phosphorylation d'Akt, un effecteur clé de cette voie de signalisation. La signalisation de l'insuline a été réduite par le cocktail inflammatoire et par la dyslipidémie, alors que l'hyperglycémie réduit la sensibilité à l'insuline à des niveaux élevés de glucose. L'état inflammatoire affecte l'expression des gènes liés à la perméabilité paracellulaire intestinale, à la réponse immunitaire et inflammatoire, au métabolisme des lipides et des lipoprotéines et au transport des nutriments, alors que la dyslipidémie a eu peu d'effet sur ces gènes. Cette étude suggère que les changements endogènes de l'hôte liés à l'obésité représentent un mécanisme important dans le développement des altérations de l'intestin grêle lors du développement de l'obésité. Ces altérations auraient à leur tour un impact sur les complications systémiques, notamment en augmentant le taux de lipoprotéines et de glucose libéré en circulation.

La plupart des fonctions des epitheliums simples, tel que le transport vectoriel, l'absorption et la sécrétion, sont possibles grâce à la polarité épithéliale. La polarité épithéliale est caractérisée par la distribution asymétrique des composants cellulaires selon un axe apico-basal. L'altération de la polarité épithéliale est observée dans la plupart des cancers d'origine épithéliale. Lors de la polarisation épithéliale, la protéine CRB3 joue un rôle prépondérant. En effet, en absence de CRB3, les cellules épithéliales possèdent une polarité défectueuse et les jonctions cellulaires sont altérées, tel qu'observé lors de la tumorigénèse. De plus, l'augmentation de la prolifération, de même qu'une meilleure survie cellulaire sont également observés lors de la tumorigénèse. Selon notre hypothèse, la perte de la protéine de polarité CRB3, qui permet le maintien du domaine apical, serait capable de favoriser la prolifération et la survie cellulaire. Dans le but de vérifier notre hypothèse, nous avons d'abord généré des lignées cellulaires exprimant myc-CRB3 et un mutant de deletion de myc-CRB3, myc-CRB3[delta]ERLI, et nous avons testé par xénogreffes la tumorigénicité de ces celles-ci. Les résultats obtenus ont montrés la capacité de CRB3 à restreindre la croissance tumorale. Le taux de prolifération a été testé in vitro et a montré que CRB3 est capable de moduler à la baisse le taux de prolifération cellulaire. Pour mieux comprendre comment CRB3 est capable de moduler la prolifération, les voie Wnt, MAPK-ERK1/2 et PI(3)K-AKT, toutes trois connues pour leur rôle dans la prolifération cellulaire, ont été étudiées. Dans un premier temps, l'implication de la voie Wnt a été vérifiée par essais luciférases dans un contexte de surexpression de la protéine CRB3. Les résultats ont montrés que CRB3 est incapable de réprimer la voie Wnt. Dans un deuxième temps, l'activité de la voie MAPK-ERK1/2 a été testée par le niveau de phosphorylation de ERK1/2. CRB3 n'a pas eu d'effet sur cette voie. Finalement, l'activité de la voie PI(3)K-AKT a été testée par le degré de phosphorylation de AKT. Les résultats obtenus à partir d'extraits de tumeurs montrent que l'expression de CRB3 atténue grandement le niveau de phosphorylation de AKT. De plus, l'expression de CRB3 a permis de diminuer le taux de prolifération cellulaire et de sensibiliser les cellules à l'apoptose, deux fonctions cellulaires contrôlées par la voie PI(3)K-AKT. La modulation de cette voie par CRB3 a été confirmée par les résultats obtenus dans des tests de prolifération en présence de LY294002, un inhibiteur de la PI(3)K. Cet inhibiteur a permis de ramener le taux de prolifération de CRB3[Delta]ERLI, la forme dominante négative de CRB3, au niveau de la prolifération des cellules n'exprimant pas myc-CRB3 ou myc-CRB3[delta]ERLI.Dans l'ensemble, les résultats obtenus montrent le rôle potentiel de CRB3 dans la régulation de la prolifération et de la survie cellulaires via la voie PI(3)K-AKT. Ceci amène une compréhension supplémentaire du rôle des régulateurs de la polarité épithéliale dans la suppression de cancers.

L’asthme est en progression et 5 à 10 % des asthmatiques sont réfractaires aux traitements. L’administration d’agonistes spécifiques du récepteur 1 de la sphingosine-1-phosphate (S1PR1) dans le poumon inhibe l’inflammation pulmonaire allergique dans un modèle murin d’asthme. Cependant, les mécanismes et les cellules cibles sont inconnus. Puisque les altérations des cellules épithéliales (CE) bronchiques contribuent à la pathogenèse de l’asthme, l’activation de S1PR1 a été évaluée dans l’atténuation des dysfonctions que présentent les CE bronchiques d’un modèle d’asthme de rats et humaines. La surexpression de S1PR1 par les CE bronchiques de rats asthmatiques et humaines semble bénéfique dans la réduction des dysfonctions épithéliales puisque l’activation spécifique par CYM-5442 augmente l’étanchéité paracellulaire et réduit la libération d’une chimiokine, CCL2 (MCP-1), dans un contexte inflammatoire. Donc, il semble que la protéine S1PR1 soit impliquée dans le maintien de l’homéostasie pulmonaire. Cette voie métabolique pourrait être approfondie afin de contrôler l’asthme réfractaire. / Asthma is in progression and 5 to 10 % of asthmatics are refractory to current interventions. In the lung, activation of sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) by specific agonists inhibits allergic airway inflammation in a murine model of asthma. However, cellular mechanisms and targeted cells are unknown. Since dysfunctions of bronchial epithelial cells (BEC) are central in asthma pathogenesis, activation of S1PR1 was evaluated in the reversal of BEC dysfunctions in a model of asthma and in human cells. Upregulation of S1PR1 in BEC of rats with experimental asthma and in human cells reversed epithelial cell dysfunctions. Indeed activation of S1PR1 by the specific agonist CYM-5442 decreases paracellular permeability and reduces the release of chemokine, under proinflammatory conditions. Therefore, S1PR1 seems to be involved in maintaining pulmonary homeostasis. This metabolic pathway could be of interest for controlling refractory asthma.

Mon projet de recherche vise à évaluer l'effet à long terme de l'exposition à la fumée de cigarette (FC) sur la croissance des cellules épithéliales gingivales et l'expression de plusieurs kératines (K). Les cellules exposées à la FC montrent une activité métabolique et une prolifération cellulaire élevées par rapport aux cellules non exposées. Cependant, une exposition prolongée à la FC réduit le rapport Bax/Bcl-2 ce qui suggère une résistance des cellules exposées à la mort cellulaire. Nos analyses montrent aussi que l'exposition à la FC diminue le niveau d'ARNm des kératines K5, K1, K10, K16. Cependant les K14 et K6 montrent une augmentation après une certaine période d'exposition. Fait intéressant, l'analyse de la production de protéines dont les K5, K1 et K16 montre une expression stable de ces protéines après l'exposition à la FC. En revanche, les K14 et K6 sont significativement augmentées, tandis que la K10 a diminué. Ces observations peuvent expliquer l’hyperplasie observée au niveau des tissus gingivaux des fumeurs, et la fréquence des maladies parodontales. / This research project is aimed to evaluate the effect of long-term exposure to cigarette smoke (CS) on the gingival epithelial cells growth and the expression of different keratins (K). The CS-exposed cells are showing high metabolic activity and cell proliferation as compared to non-exposed cells, suggesting an increase in the cells growth. Importantly, the prolonged exposure to CS was found to decrease Bax/Bcl-2 ratio that indicates the death resistance. Moreover, the gene expression analysis showed that the exposure to CS decreases the mRNA level of K5, K1, K10, and K16; excepting K14 and K6 were showing an increase after a certain exposure period. Interestingly, protein production analysis of K5, K1, and K16 are showing a stable expression after the exposure to CS. In contrast, K14 and K6 are significantly increased, while K10 decreased after CS exposure. These observations suggest an abnormal growth of the gingiva that may lead to the periodontal diseases.

Élément essentiel du système dioptrique de l'œil, la cornée joue aussi un rôle important de protection du globe oculaire. Toutefois, sa localisation la prédispose à plusieurs blessures de diverses origines. 11 peut alors en résulter une lésion importante nécessitant son remplacement. Le but ultime du programme de recherche est donc de reconstruire, selon la méthode d'auto-assemblage, une cornée humaine afin de l'utiliser comme modèle expérimental et éventuellement comme greffon pour des patients. Cependant, plusieurs aspects importants devaient faire l'objet d'études approfondies avant l'utilisation clinique afin d'évaluer le potentiel de réussite à long terme des greffes sur les patients. Le premier objectif spécifique de cette thèse consistait à étudier la grande hétérogénéité dans les capacités prolifératives des cellules épithéliales de cornées humaines (CECH) obtenues de différents donneurs. Cette étude démontre que ces variations sont liées à des altérations dans les niveaux d'expression des facteurs de transcription appartenant à la famille Sp. De plus, ces fluctuations semblent liées à la progression des CECH vers leur différenciation terminale. Finalement, une stratification adéquate des cellules épithéliales sur les équivalents cornéens coïncide avec un retard dans le pic d'expression des protéines Spl et Sp3. Nous disposons ainsi d'un moyen permettant d'identifier rapidement les populations cellulaires les plus appropriées pour la production des tissus reconstruits. Le deuxième objectif spécifique était de s'assurer que l'épithélium de nos cornées reconstruites puisse réépithélialiser des plaies éventuelles après la greffe. Pour ce faire, un modèle de guérison de plaies cornéennes in vitro a été développé à partir des cornées reconstruites. En plus de s'être assuré de la régénération des substituts cornéens à la suite d'une blessure, ce modèle a également permis de montrer que durant la réépithélialisation, la migration des cellules épithéliales suit un patron qui est semblable à celui rapporté lors de la guérison de blessures cornéennes humaines in vivo. Ce modèle présente aussi des aspects histologiques semblables au tissu d'origine ainsi que l'expression des constituants de la matrice extracellulaire et des sous-unités d'intégrines. Il permet également de quantifier le taux de réépithélialisation, qui est significativement accéléré en présence de la fibrine ou de l'EGF. Enfin, pour ce qui est du troisième objectif spécifique, il était important d'évaluer si l'origine des cellules utilisées lors de la fabrication des cornées in vitro influençait l'épaisseur de l'épithélium obtenu, caractéristique essentielle à une bonne acuité visuelle. Les observations recueillies nous ont permis de démontrer que l'origine des cellules du mésenchyme et des cellules épithéliales influence grandement, en plus de l'aspect macroscopique, l'histologie des tissus reconstruits et que ces changements dans la différenciation et la stratification des cellules épithéliales sont contrôlés par des facteurs solubles. Une différence significative dans l'expression d'IL-6 a été détectée entre les fibroblastes cornéens et dermiques. Les résultats montrent également que la cornée reconstruite est en mesure d'absorber les rayons ultraviolets de façon similaire à la cornée in situ. Tous ces travaux ouvrent la voie à de nombreuses autres recherches et laissent entrevoir une application clinique des cornées reconstruites à moyen terme. / The cornea is an essential part of the dioptric System of the eye. Furthermore, it also has a significant role in the protection of the eyeball. However, its location predisposes it to several wounds of various origins. In such cases, serious injuries may ensue requiring the replacement of the cornea. The main objective of the research program is base on the reconstruction, with the self-assembly method, of a human cornea in order to perform experimental studies and eventually graft it on patients. However, several aspects of this subject had to be carefully examined before any clinical use, in order to evaluate the success of long-term corneal graft on patients. The first specific objective of this thesis was to study the heterogeneousness in the proliferative capacities of the human corneal epithelial cells (HCECs), obtained from various donors, was initially studied. This work shows that these variations were related to changes in the levels of expression of transcription factors belonging to the Sp family. In fact, these factors were highly expressed during one passage and then totally disappeared as cells terminally differentiated. Proper stratification of HCECs on reconstructed tissue substitutes could be obtained only with cells that also had a delayed peak of Spl/Sp3 expression when cultured in vitro. We thus have a mean to identify quickly the cell lines most adapted for the production of reconstructed tissues. The second specific objective was to make sure that the epithelium of the reconstructed corneas could reepithelialize following a wound, after grafting. For this purpose, an in vitro corneal wound healing model was developed from the reconstructed corneas. We show that corneal substitutes regenerate after wounding. During reepithelialization, epithelial cell migration followed a consistent wave-like pattern similar to that reported for human corneal wound healing in vivo. This model showed an histological appearance similar to the native tissue as well as expression of basement membrane components and the integrin subunits known to be main actors during the wound healing process. It also allowed us to quantify the reepithelialization rate, which was significantly accelerated in the presence of fibrin or EGF. Finally, for the third specific objective, we determined whether the origin of the cells used during the production of in vitro corneas had any effect on the thickness of the epithelium obtained, an essential characteristic of a good vision. The results indicated that the origin of fibroblasts and epithelial cells influences largely the macroscopic aspect as well as the histology of reconstructed tissues, and that these changes in the differentiation and stratification of epithelial cells are controlled by soluble factors. A significant difference in the expression of IL-6 was detected between corneal and skin fibroblasts. Our results also unravel that the reconstructed cornea has similar UV-absorption characteristics to that of the normal human cornea. Our research will lead to other experimental studies on human cornea. Moreover, clinical application of reconstructed corneas are anticipated in the future.

Chez les ruminants, la prostaglandine lutéolytique F₂α (PGF₂α) est produite dans l'endomètre par les cellules endometriales épithéliales en réponse à l'oxytocine (OT). Par ailleurs, la prostaglandine potentiellement lutéoprotective et pro-nidation PGE₂ est stimulée dans les cellules stromales de l'endomètre en réponse au signal d'origine embryonnaire interféron-t (IFNt). Afin de pousser plus loin les études in vitro amorcées avec des cultures primaires, nous avons établi des lignées stables de cellules endométriales de l'endomètre bovin. Les cellules épithéliales (bEEL) et stromales caronculaires (CSC) ont servi à l'étude de la signalisation et de la régulation transcriptionnelle responsable de la production des prostaglandines (PGs). Des études phénotypiques et fonctionnelles ont révélé qu'autant les cellules bEEL que les CSC ont retenu les caractéristiques distinctives des cultures primaires. Les cellules bEEL s'avèrent "un modèle antilutéolique in vitro" typique car l'IFNt y inhibe la production de PGF₂α. induite par l'OT en 3-6 h. De plus, l'effet inhibiteur de l'IFNt n'est pas médié par la diminution du récepteur à l'oxytocine ou l'expression de la cycloxygénase-2 (COX2) tel que stipulé chez le mouton. Les résultats suggèrent plutôt que l'IFNt peut interférer dans l'axe de signalisation de la production de PGF₂α induite par l'OT. De ce fait, nous avons étudié le mécanisme de transduction du signal de PGF₂α induit par l'OT dans les cellules bEEL. Le relâchement de PGF₂α induit par l'OT est dépendant de l'activation de Ras par la régulation extracellulaire du signal du module kinase V% (ERK 1/2). La transactivation d'EGFR, ainsi que l'activation de c-Src et PI3K sont requis pour l'activation de RAS. En résumé, les résultats suggèrent que la sous-unité activé Gαiβy serait impliquée dans la production de PGF₂α induite par l'OT. À l'instar de ce qui a été observé in vivo, l'IFNt à concentration élevée stimule préférentiellement la production de PGE₂ dans les cellules CSC alors qu'il induit COX2 de manière concentration-dépendante dans les deux types de cellules bEEL et CSC. Il est donc tentant de spéculer que la reconnaissance maternelle de la grossesse chez les ruminants est un phénomène physiologique transitoire d'inflammation régulé par l'effet paracrine de l'IFNt induisant le PGE₂ stromal.

Les spermatozoïdes subissent la maturation lors de leur passage dans l'épididyme sous l'influence de plusieurs facteurs et protéines encore méconnus. Le présent projet concerne l'étude des protéines induites par la présence des spermatozoïdes. Pour y arriver, des cellules épithéliales épididymaires immortalisées de souris ont été misent en co-culture pour étudier l'expression des protéines induites. Par ce procédé, une protéine a été identifiée comme étant sécrétée par les cellules épithéliales. La protéine en question est la fibuline-2 qui est exprimée entre autres, dans les membranes basales et au cours du développement embryonnaire. De plus, le transcriptome des cellules en culture a été étudié par macro-array ce qui a permis l'identification de plusieurs ARNm induits par les spermatozoïdes dont le CD49c qui est exprimé dans des conditions similaires à la fibuline2. En résumé, nos résultats semblent indiquer que la présence de spermatozoïdes pourrait effectivement influencer l'expression de gènes ainsi que la synthèse et la sécrétion de protéines par les cellules épididymaires. / When passing through the epididymis, the spermatozoon becomes mature by acquiring forward motility and fertilizing capacity. This maturation process is under influence of several unknown factors and proteins. Experiments were done to study the modification of transcriptom and proteome modulate by spermatozoa. Cell culture was done with epithelial epididymal cell lines which origined from transgenic mice in coculture with mouse spermatozoa. Experiment allows us to find a protein expressed only in co-incubation conditions named fibulin-2 which is found in basement membrane and during embryonic development. Also, study of transcriptom of PC-1 in presence of spermatozoa by Macro-array determines several mRNA induced by spermatozoa such as CD49c. This protein is expressed in same condition that fibulin-2. Together, these results strongly suggest that spermatozoa can modulate gene expression and de novo protein synthesis and secretion of epididymal cell. This novel finding provides new concept and working hypothesis to clarify how testicular factors, such as spermatozoa itself, initiate the activation and differentiation of epididymal epithelium during the sperm maturation process.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.