L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique. / Ex vivo hematopoietic stem cell expansion represents a most appealing option to improve bone marrow transplantation. Utilization of the unique hematopoietic stem cell (HSC) expansion abilities of the transcription factor HOXB4 for clinical applications is hampered by its short intracellular half-life. To overcome this difficulty, 3 different single amino-acid substitution mutants of HOXB4 with 3-4 fold increased half-life were generated and their biologic activity compared to that of wild type (wt) HOXB4 using in vitro and in vivo assays. We have shown that overexpression of mutated HOXB4 in HSC using an infection strategy did not impair their long term hematopoietic reconstitution potential in transplanted mice. We have found that cells overexpressing mutant HOXB4 had greater expansion in vitro in competitive and non-competitive designs than wt HOXB4. Moreover, in vivo peripheral blood and spleen repopulation had lymphoid and myeloid contributions closer to untransplanted animals with mutant than wt HOXB4. In addition, cells overexpressing mutant HOXB4 protein were detected much more rapidly and in greater proportion in peripheral blood than cells overexpressing the wt form. One of the mutated HOXB4 proteins (1426) did not promote the expansion of common myeloid progenitors in comparison to wt HOXB4. Finally, using intracellular protein modulation studies, we have shown that the effects of mutated and wt HOXB4 proteins in hematopoietic stem and progenitor cells were not completely due to a HOXB4 concentration effect.

Les cellules T mémoires (Tm) protègent l’organisme contre les réinfections de pathogènes qu’il a déjà combattu. Les Tm possèdent plusieurs propriétés en commun avec les cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment la capacité de se différencier, de s’auto-renouveler et de maintenir une population relativement constante au sein de l’organisme via des mécanismes homéostatiques. Il a été démontré que Hoxb4, un membre de la famille des facteurs de transcription Hox, était capable d’induire l’expansion des CSH in vivo et in vitro de façon rapide. Au vu de ces parallèles, nous avons posé l’hypothèse que la surexpression de Hoxb4 pourrait induire l’expansion de populations de Tm. Nous avons analysé les populations de Tm et lymphocytes T naïfs (Tn) dans les organes lymphoïdes de souris transgéniques surexprimant Hoxb4 et les avons comparées à des souris de type sauvage (wt). Alors que la fréquence des cellules T matures Hoxb4 diminuait avec l’âge, leur phénotype ainsi que leur viabilité demeuraient inchangés. Ensuite, nous avons procédé à des transplantations en compétition de Tm (CD4+CD44hi) Hoxb4 et wt chez des hôtes dépourvus de lymphocytes T (CD3-/-) dans le but d’évaluer leur contribution à la reconstitution du compartiment T après 2 mois. Au final, les Tm wt avait contribué un peu plus que les Tm Hoxb4 à la reconstitution (~60%). Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont montré que les Tm Hoxb4 possédaient une fonctionnalité normale, mais se distinguaient des Tm wt par la présence d’une faible population qui présentait un phénotype « mémoire central » (Tcm), conférant habituellement une longévité accrue. Les cellules des ganglions lymphatiques totaux des hôtes furent transplantées de façon sérielle chez trois générations de nouveaux hôtes. Le phénotype Tcm observés chez les Tm Hoxb4 était récapitulé chez les hôtes secondaires uniquement. Les ratios sont demeurés en faveur des Tm wt lors des deux transplantations suivantes, mais les Tm Hoxb4 ont commencé à montrer un avantage compétitif chez certains hôtes quaternaires. Une transplantation en compétition à court terme de Tm Hoxb4 et wt marqués avec un marqueur cytoplasmique ont démontré la présence chez les Tm Hoxb4 seulement d’une faible population CD62Lhi proliférant lentement. Ainsi, l’expansion préférentielle de Tcm CD4 par le biais d’une sélection ou d’une différenciation induite par la surexpression de Hoxb4 pourrait potentiellement leur permettre de maintenir un état de quiescence leur permettant de persister plus longtemps suite à des transplantations sérielles. / Memory T cells (Tm) protect the organism against reinfection from pathogens they’ve already encountered. Tm share characteristics with hematopoietic stem cells (HSC), such as the capacity to differentiate, self-renew and maintain a relatively constant population via homeostatic mechanisms. Hoxb4, a member of the Hox genes family of transcription factors, has been shown to expand HSCs rapidly in vivo and in vitro. Thus, drawing from these parallels we hypothesise that Hoxb4 overexpression could lead to expansion of Tm populations. Tm and naïve T cell (Tn) populations were analysed in the lymphoid organs of young and aged transgenic mice overexpressing Hoxb4 in comparison with wild type (wt) mice. While the frequencies of mature Hoxb4 T cells in lymphoid organs seemed to decline with age, the phenotype or the cell viability remained unaffected. Next, CD4+CD44hi Hoxb4 Tm were transferred into T cell deficient (CD3-/-) hosts in competition with wt CD4+CD44hi Tm and evaluated for their contribution to T cell reconstitution after 2 months. Engraftment of wt Tm in secondary lymphoid organs was slightly higher than Hoxb4 Tm (~60%). Functional assays and phenotypic analysis showed that Hoxb4 Tm exhibited normal functionality, but in contrast to wt Tm, a fraction of Hoxb4 Tm exhibited a more central memory (Tcm) phenotype, indicative of a longer lifespan. Total lymph nodes from hosts were serially re-transplanted for three generations. The Tcm phenotype of the Hoxb4 Tm present in the primary hosts was recapitulated in the secondary but not in the tertiary hosts. The ratios remained in favor of the wt Tm after two subsequent expansion rounds, but Hoxb4 Tm showed a competitive advantage over wt Tm in some quaternary hosts. Cell tracking of a short term transplantation of Hoxb4 and wt Tm in competition exposed a small population of CD62Lhi cells displaying slow proliferation in the Hoxb4 Tm only. Thus preferential CD4+ Tcm expansion by selection or differentiation could potentially allow Hoxb4 Tm to persist longer following serial transplantations due to a more quiescent state.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent la génération de toutes les lignées sanguines. Leur différenciation en cellules T matures se déroule dans un microenvironnement spécialisé, le thymus, orchestrée par des interactions complexes entre cytokines, chimiokines et cellules stromales. Les mutations bloquant la différenciation des cellules T ont un impact sur l'architecture du thymus, soulignant l’importance des interactions entre cellules T en développement et cellules stromales thymiques.Les déficits immunitaires combinés sévères sont généralement traités, avec succès, par transplantation de CSH allogénique par voie intraveineuse. Cependant, des complications peuvent survenir notamment en cas de greffe non compatible. Pour pallier à cela, la thérapie génique a été développée mais son efficacité et son innocuité restent à améliorer. Dans ce but, notre groupe a développé une approche par correction génique des progéniteurs T directement in vivo, via un vecteur lentiviral. Bien qu’efficace, là encore, l’efficacité de traitement reste insuffisante voire extrêmement limitée chez les macaques.Lors de ma thèse, j'ai donc évalué le potentiel de différents sérotypes de vecteur viraux adéno-associés (AAV) pour la transduction des thymocytes. L'administration IT de plusieurs sérotypes de AAV2 engendre une transduction des thymocytes >10 fois plus élevée que celle des vecteurs lentiviraux. Le sérotype AAV2/8 induit la transduction des thymocytes la plus efficace et les cellules transduites représentent jusqu'à 1% des cellules T périphériques d’une souris immunocompétente. En utilisant des souris immunodéficientes ZAP-70-/- comme paradigme, j'ai découvert que l'injection IT de l’AAV2/8-ZAP-70 entraîne une transduction et différentiation lymphocytaire T rapide, associée à la génération d’une medulla thymique. En effet, des cellules épithéliales thymiques de la médulla (mTEC) exprimant le régulateur auto-immun AIRE sont détectées en <2 semaines. Bien que cette reconstitution soit transitoire, les mTECs AIRE+ diminuant 10 semaines post-injection, les cellules T périphériques corrigées persistent >40 semaines et présentent environ 1 copie du vecteur AAV/cellule. Ces cellules T effectrices peuvent sécréter des niveaux élevés de cytokines et un nombre important de cellules T régulatrices est également généré. Ainsi, une seule vague de thymopoïèse à partir de progéniteurs transduits par l’AAV-ZAP-70, permet une restauration, rapide et transitoire de l'architecture thymique mais, à long terme de cellules T périphériques fonctionnelles.Pour évaluer les diverses populations de TEC régissant le développement et la sélection des cellules T, j'ai collaboré avec les groupes de P Jay/J Abramson/I Amit pour établir une cartographie de novo du compartiment stromal thymique. Nos analyses ont mis en évidence quatre populations majeures de mTEC (I-IV) avec des fonctions distinctes. Notamment, les mTEC-IV constituent une population unique présentant des similarités moléculaires et morphologiques avec les cellules tuft intestinales. Comme nous avions précédemment identifié la sécrétion d'IL-25 par les cellules tufts comme un régulateur des interactions entre compartiment épithélial et hématopoïétique dans l'intestin, nous avons évalué ce potentiel dans le thymus. Ainsi, des souris déficientes en cellules tuft intestinales présentent également une déficience spécifique en mTEC-IV et une homéostasie perturbée de diverses populations exprimant l'IL-25R dans le thymus. Notre recherche a donc permis d'identifier une nouvelle population de TEC tuft avec un rôle critique dans la formation de la niche immunitaire du thymus.L’ensemble de mes résultats montrent le potentiel thérapeutique de stratégie intrathymique de thérapie génique pour des patients ayant besoin d’une reconstitution rapide en cellules T et fournissent de nouvelles perspectives sur les populations stromales thymique et leur rôle dans l’équilibre de la niche immunitaire. / Hematopoietic stem cells (HSC) ensure the generation of all blood lineages. Their differentiation to mature T lymphocytes occurs in the specialized microenvironment of the thymus, orchestrated by complex interactions between cytokines, chemokines, and stromal cells. Mutations resulting in a block in T cell differentiation impact on the architecture of the thymus, pointing to the critical crosstalk between developing T cells and thymic stromal components.Genetic severe combined immunodeficiencies (SCID) are generally treated by the intravenous transplantation of healthy allogeneic HSCs. Although this therapy is often successful, complications can occur, especially for patients receiving non-histocompatible HSC transplants. To circumvent these problems , significant efforts have gone into developing gene therapy strategies but adverse events indicate the necessity of exploring other avenues. Our group hypothesized that in situ gene correction of T lymphoid progenitors in the thymus itself may overcome some of the drawbacks of ex vivo gene therapy. While intrathymic (IT) lentiviral vector administration corrected immunodeficient thymocyte precursors in mice, thymus transduction was inefficient and efficacy in macaques was limited.During my PhD, I assessed the in vivo potential of adeno-associated vectors (AAV) to transduce thymocyte precursors. Intrathymic administration of several different scAAV2 serotypes resulted in a >10-fold higher transduction of thymocytes (3-5%) as compared to lentiviral vectors. scAAV2/8 promoted the highest level of gene transfer and strikingly, transduced cells represented up to 1% of peripheral T lymphocytes in immunocompetent mice. Using ZAP-70-/- immunodeficient mice as a paradigm, I found that IT injection of an AAV2/8-ZAP-70 vector resulted in a rapid transduction and T cell differentiation, correlating with a dramatic generation of the thymus medulla. Indeed, medullary thymic epithelial cells (mTEC) expressing the AIRE autoimmune regulator were detected within <2 weeks. While this reconstitution was transient––AIRE+ mTECs decreased by 10 weeks post gene transfer––gene-corrected peripheral T cells, harboring approximately 1 AAV genome/ cell, persisted for >40 weeks. Effector T cells had the potential to secrete high levels of cytokines and significant numbers of gene-corrected regulatory T cells were also generated. Thus, a single wave of thymopoiesis, from intrathymic AAV-ZAP-70-transduced progenitors, allows for a rapid but transient restoration of the thymic architecture and long-term peripheral T cell function.To better assess the diverse TEC populations that orchestrate T cell development and selection, I collaborated with the groups of P. Jay/J. Abramson/I. Amit to combine single cell analysis and in-vivo fate-mapping to de novo characterize the entire stromal compartment of the thymus. Our analyses highlighted four major medullary TEC (mTEC I-IV) populations with distinct lineage regulator function and specifically, we found that mTEC-IV constitutes a highly divergent TEC subset that bears strong molecular and morphological characteristics to intestinal tuft cells. As we previously identified tuft cell secretion of IL-25 as a regulator of the crosstalk between the epithelial and hematopoietic compartments in the gut, we assessed the potential immune-modulatory function of mTEC-IV. Notably, mice deficient in intestinal tuft cells exhibited a specific depletion of mTEC-IV and a perturbed homeostasis of various IL25-R-expressing populations in the thymus. Taken together, our data identify a new tuft TEC population critical for shaping the thymus immune niche.In conclusion, the data generated during my PhD advance the therapeutic potential of intrathymic-based vector strategies for the treatment of patients requiring a rapid T cell reconstitution and provide new insights into thymic stromal subsets that are critical for shaping the thymus immune niche.

L’objectif prioritaire de ce travail était de provoquer un état de tolérance immunologique à des allogreffes cardiaques et cutanées chez des souris injectées avec des cellules souches hématopoïétiques (CSH) transduites avec le gène de l’interleukine 10. Un deuxième but était d’améliorer la survie des greffons cutanés en utilisant des cellules dendritiques immatures tolérogène. Le foie fœtal de souris contient en moyenne 2% de cellules souches capables de se différencier dans toutes les lignées hématolymphoïdes. De plus, leur relativement faible expression des antigènes du CMH fait d’elles un matériel biologique parfois susceptible de s’adapter à un environnement allogénique. L’IL-10 est une cytokine anti-inflamatoires. Produite par les lymphocytes Th2 principalement, elle inhibe la production de cytokines pro-inflamatoires telle l’IL-2. Elle empêche aussi la fonction de présentation des antigènes des CPA. Les cellules dendritiques (DC) dérivent de CSH, elles jouent un rôle central dans l’immunité et sont capables d’interagir avec les cellules du système immunitaire inné et adaptatif. Elles sont essentielles à la mise en place d’une réponse régulatrice ou tolérogène, ceci en fonction des informations fournies par le microenvironnement cellulaire. Les résultats montrent d’une part que les CSH fœtales, de souris C57 BL/6 transduites avec le gène de l’IL-10 et injectées plusieurs fois à des souris allogéniques (BALB/c), induisent une prolongation de survie du greffon cardiaque de même souche. Cette survie est de 86.25+13.8 jours versus 11.5+0.6 jours pour les groupes contrôles. Les DC tolérogènes (tol-DC) de souris DBA1 traitées avec le TNFα sont injectées à des souris allogéniques (BALB/c). Il en résulte une prolongation de survie du greffon cutané de même souche que les tol-DC : 15 jours vs 7.5 jours pour les contrôles. Seuls les animaux transplantés avec des tol-DC présentent un état de tolérance autorisant la prolongation de la survie de greffonsallogéniques / The main objective of this work was to induce a state of immunological tolerance to cardiac and skin allografts in mice injected with hematopoietic stem cells (HSCs) transduced with the gene for interleukin 10 (IL-10). A second goal was to improve the survival of skin grafts using immature dendritic cells well known for their tolerogenic function. Mouse fetal liver contains 2% of stem cells on average that can differentiate into all blood-lymphoid lineages. In addition, their relatively low antigen expression of major histocompatibility complex (MHC) makes them a biological material sometimes capable to adapt to an allogeneic environment. IL-10 is a cytokine with anti-inflammatory properties. Mainly produced by Th2 lymphocytes cells, IL-10 inhibits the production of pro-inflammatory cytokines such as IL-2. It prevents antigen presenting function of APCs. Dendritic cells (DC) derived from HSCs and play a central role in immunity. They are able to interact with cells of the innate and adaptive immune system. They are essential to the establishment of a regulatory or tolerogenic response, this based on the information provided by the cellular microenvironment. Results firstly show that fetal HSC of C57 BL/6 mice transduced with IL-10 gene and injected several times to allogeneic mice (BALB/c) sublethally irradiated induce a prolongation of heart transplant survival of the same strain. This survival is of 86.25+13.8 days in comparison with 11.5+0.6 days for control groups. Tolerogenic dendritic cells (tol-DC) of DBA1 mice treated with TNFα are injected into allogeneic mice (BALB/c) sublethally irradiated. This results in a prolongation of skin graft survival of same strain as tol-DC: 15 days compared to 7.5 days for the control groups. Only tol-DC transplanted animals have a tolerance state allowing prolonged survival of allogeneic skin grafts

L'objectif de notre projet de recherche est l'exploration de la faisabilité de l'allogreffe des tissus composites (ATC) chez les nouveau-nés ayant des anomalies congénitales sévères de la main ou du visage. Dans la partie bibliographique, nous avons étudié les mécanismes de tolérance néonatale chez la souris, ainsi que la transplantation in utero des cellules souches hématopoïétiques avec des modèles animaux et humains. Ensuite, les propriétés du système immunitaire du nouveau-né humain ont été décrites avec étude des différents protocoles de conditionnement non-myéloablatifs utilisés pour induire une tolérance aux greffes d'organes solides, afin de trouver le type de conditionnement utilisable chez les nouveaux nés pour l'induction de tolérance. La greffe du thymus et de la moelle osseuse vascularisée avec l'ATC ont été également étudiés. Enfin, une revue exhaustive des différentes études d'ATC concernant l'induction de tolérance chez les humains et les larges animaux a été faite. Un premier modèle préclinique expérimental d'ATC a été élaboré chez le porcelet nouveau-né. Des études ultérieures ont par suite étudié les agents immunosuppresseurs ainsi que le régime de conditionnement avec l'administration de cyclosporine A., des thymo-globulines de lapin anti-porc et du mycophénolate mofétil. Un protocole d'induction de tolérance pour l'ATC chez les porcelets nouveau-nés a été rédigé et l'expérimentation sera réalisée courant 2014-2015. Si la tolérance d'ATC spécifique du donneur pourra être induite avec notre protocole, nous allons par la suite élaborer un protocole d'induction de tolérance et un programme d'allogreffe de main applicable chez les nouveau-nés humains / This present research is devoted to the exploration of performing vascularized composite allografts as a treatment for severe congenital hand or face anomalies in neonates or very young infants. The bibliographic studies at first revised the discovery and mechanisms of neonatal tolerance in mice, as well as in utero hematopoietic stem cells transplantation in large-animal models and human fetuses. Then the properties of human neonatal immune system were described; and the non-myeloablative or non-toxic conditioning regimens for solid organ transplant tolerance induction were also studied, in order to give the clue to a applicable conditioning regimen for tolerance induction in neonates. The potent thymus and vascularized bone marrow transplantation in neonatal VCA were considered as advantages. Finally, the researches concerning tolerance induction for VCA in large animal models and in human patients were reviewed. ln experimental studies, the preclinical VCA was firstly established in neonatal swines. Subsequent experiments thus studied the immunosuppressive agents, as well as conditioning regimen, including the administration of cyclosporine A, rabbit anti-pig thymocyte globulin and mycophenolate mofetil for VCA in pig neonates. The findings in these experiments were then concluded. Based on these finding, a general tolerance induction protocol for VCA in neonatal swines was designed and experiment will be performed in year 2014-2015. lf donor-specific tolerance for VCA could be induced with present protocol, we will subsequently elaborate an applicable tolerance induction protocol and hand allotransplantation program in human newborn infants

Les CSH sont responsables de la production de toutes les cellules sanguines et possèdent une double capacité d'auto-renouvellement et de différenciation en progéniteurs incluant les progéniteurs lymphoïdes B. Étant donné l’importance des CSH, leur physiologie est étroitement contrôlée par une pléthore de signaux qui équilibrent quiescence, prolifération, auto-renouvellement et différenciation. La diminution de la fonction des CSH au cours du vieillissement dépend de plusieurs facteurs intrinsèques et extrinsèques, y compris l’accumulation des ROS au cours du vieillissement. Lorsque les taux de ROS intracellulaires deviennent excessifs, ils provoquent une sénescence ou une apoptose, entraînant un épuisement prématuré des CSH et un dysfonctionnement hématopoïétique. La régulation et les effets des ROS sont donc liés au destin des CSH. Notre laboratoire a dévoilé l'activité antioxydante de la protéine TP53INP1. En effet, les souris KO développent un stress oxydatif chronique. Le gène codant pour TP53INP1 est exprimé au niveau basal dans tous les types de cellules de la MO et est fortement surexprimé lorsque la moelle osseuse lors du vieillissement. L'analyse des compartiments cellulaires de la MO a montré que l'absence de TP53INP1 a un impact important sur la différenciation des cellules B, qui est étonnamment maintenue dans la moelle osseuse des souris KO âgées, et réduite chez les souris WT âgées. Ces cellules B produisent IgM et IgG et sont fonctionnelles. Le traitement antioxydant inverse le phénotype observé. Enfin, nous démontrons que la maintenance des lymphocytes B chez les souris KO âgées est dépendant de la voie de signalisation IL-7Rα / pSTAT5. / HSCs are responsible for the production of all blood cells and possess the dual ability to self-renew and differentiate into progenitor including precursors of B cells which complete their differentiation in the spleen. Given their importance, their physiology is tightly controlled by a plethora of signals that balance quiescence, proliferation, self-renewal and differentiation. The decreased repopulation and differentiation capacity of HSC during aging is believed to depend on several intrinsic and extrinsic factors, including aging-associated accumulation of ROS. At physiological level, ROS can regulate various cellular functions, including HSCs and lineage precursors proliferation, differentiation and mobilization. However, when intracellular ROS levels become excessive, they cause senescence or apoptosis, resulting in a premature exhaustion of HSCs and hematopoietic dysfunction. In this condition many signaling molecules are activated. Our laboratory has previously unveiled TP53INP1; indeed, TP53INP1- KO mice develop a chronic oxidative stress. The gene encoding TP53INP1 is expressed at basal level in all BM cell types, and strongly over-expressed when the BM upon aging. Analysis of BM cell compartments showed that the absence of TP53INP1 strongly impacts on B cell differentiation, which is surprisingly maintained in old KO BM while reduced in old WT. As shown by immunization assays, these B cells produce IgM and IgG showing that they are functional. Antioxidant treatment that scavenges ROS reverses the phenotype observed in old KO BM. Finally, we demonstrate that the B cell maintenance observed in KO old BM is due to an enhanced IL-7Rα/ pSTAT5 signaling pathways.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le corps humain est composé de plus de 100 000 protéines qui interagissent entre elles afin d’assurer son bon fonctionnement. Néanmoins, il peut arriver que certaines de ces protéines subissent une mutation changeant l’équilibre de fonctions du corps telles que la réplication cellulaire. Ces mutations affectant la réplication cellulaire peuvent mener à des cancers, une maladie qui touche de plus en plus de gens à travers le monde. Afin de développer des médicaments efficaces contre cette maladie, il est nécessaire de bien comprendre les mécanismes biologiques impliqués pour établir une approche thérapeutique. Cette compréhension repose notamment sur l’utilisation d’outils moléculaires, de petites molécules possédant des fonctions chimiques versatiles pouvant donner des informations critiques dans le développement de médicaments. Ce présent mémoire se consacre sur le développement d’outils moléculaires à travers deux projets ayant des objectifs distincts. Le premier projet avait comme principal objectif d’approfondir les connaissances sur l’inhibition de la protéine RAS, une GTPase responsable de plus de 30% des cancers. À cet effet, l’approche privilégiée a été celle de la synthèse de macrocycles peptidiques se liant à la cystéine 118 de RAS d’après la structure du monobody NS1. Les structures cristallines et les données protéomiques obtenues ont permis d’identifier les interactions clés entre la protéine RAS et une série d’inhibiteurs cherchant à émuler les effets biologiques de NS1. Le second projet s’intéresse quant à lui aux effets du composé UM171 sur les cellules souches. En effet, cette petite molécule possède la capacité d’empêcher la différenciation des cellules souches hématopoïétiques et permet donc leur multiplication. Cette propriété est une source d’espoir dans le traitement des leucémies et des transplantions. Cependant, la cible biologique de ce composé reste un mystère à ce jour. Ainsi la seconde partie de ce mémoire mettra de l’avant la synthèse d’outils moléculaire à base de diazirines pour tenter de venir identifier la cible d’intérêt en utilisant la protéomique. / The human body is made up of more than 100 000 proteins which interact with each other to keep it functioning properly. However, it can happen that some of these proteins undergo a mutation which changes the balance of body functions such as cell proliferation. These mutations affecting cell proliferation can lead to cancer, a disease that is affecting more and more people around the world. To develop effective drugs against this disease, it is necessary to understand the biological mechanisms involved in order to establish a therapeutic approach. This understanding is particularly based on the use of molecular tools, small molecules with versatile chemical functions that can provide critical information for drug development. This thesis is devoted to the development of molecular tools through two projects with distinct objectives. The main objective of the first project was to deepen knowledge about the inhibition of the RAS protein, a GTPase responsible for more than 30% of cancers. To this end, the preferred approach has been the synthesis of peptide macrocycles binding to RAS cysteine 118 based on the structure of NS1 monobody. The crystal structures and proteomic data obtained have made it possible to identify key interactions between the RAS protein and a series of inhibitors seeking to emulate the biological effects of NS1. The second project focuses on the effects of compound UM171 on stem cells. Indeed, this small molecule can prevent the differentiation of hematopoietic stem cells and therefore allows their multiplication. This property is a source of hope in the treatment of leukemia and transplants. However, the biological target of this compound remains a mystery to this day. Thus, the second part of this thesis will focus on the synthesis of molecular tools based on diazirines in an attempt to identify the target of interest using proteomics.

Introduction L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques est un traitement avec un potentiel curatif chez une minorité de patients ayant un diagnostic myélome multiple. Malheureusement, ce traitement est associé à un taux élevé de complications, incluant une probabilité élevée de rechute et/ou de GVH chronique limitant. L’objectif principal de cette étude est de déterminer si un entretien au bortezomib (BTZ) post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l’hôte (GVH) chronique. Les objectifs secondaires étaient d’évaluer la prise d’immunosuppresseur, de déterminer l’atteinte d’organe et la survie (OS et PFS) chez les patients ayant reçu ou pas du BTZ en entretien. Méthodes Dans cette étude rétrospective, nous avons comparé 46 patients ayant reçu du BTZ en entretien post-allogreffe à 61 patients n’ayant pas reçu d’entretien. Nous avons étudié l’impact du BTZ sur l’incidence et la sévérité de la GVH chronique en utilisant les critères du NIH de 2014. Résultats À 2 ans, l’incidence globale (61.2% vs 83.6%, p=0.001) et modérée/sévère (44.5% vs 77.0%, p=0.001) de GVH chronique était significativement inférieure chez les patients ayant reçu du BTZ en entretien. Les atteintes buccale (43% vs 67%, p=0.018) et ophtalmique (9% vs 41%, p=0.001) étaient diminuées de manière significative lors du diagnostic initial de la GVH chronique chez ces patients ayant reçu un entretien post-allogreffe. Une diminution de l’usage des immunosuppresseurs, dont les corticostéroïdes systémiques (45.1% vs 76.4%, p<0.001), du mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) et du tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) a été observée chez les patients ayant reçu le BTZ. La probabilité d’être vivant et sans immunosuppresseur à 3 ans post-allogreffe était de 77% chez les patients de la cohorte BTZ et 56% dans la cohorte contrôle (p=0.046). Conclusion En conclusion, un entretien avec du BTZ post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la GVH chronique. Ceci devrait donc être considéré comme une option valide chez les patients avec un myélome multiple traités avec une allogreffe. / Background Allogeneic hematopoietic cell transplant (HCT) has curative potential in myeloma but remains hampered by high rates of relapse and chronic GVHD. The primary endpoint of this study was to determine if BTZ maintenance decreases the incidence and severity of chronic GVHD using NIH criteria. The secondary endpoints were to determine the immunosuppression burden, organ involvement and survival (OS, PFS) in patients receiving or not BTZ. Study Design In this retrospective study, we compared the outcome of 46 myeloma patients who received BTZ after upfront tandem auto-allo HCT to 61 patients without maintenance. We explored the impact of bortezomib (BTZ) maintenance on incidence and severity of chronic GVHD using the 2014 NIH criteria. Results At 2 years, incidences of overall (61.2% vs 83.6%, p=0.001) and moderate/severe chronic GVHD (44.5% vs 77.0%, p=0.001) were significantly lower in BTZ recipients who had less mouth (43% vs 67%, p=0.018) and eyes (9% vs 41%, p=0.001) involvement at initial diagnosis. We report a lower use of systemic steroids (45.1% vs 76.4%, p<0.001), mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) and tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) in BTZ recipients. Probability of being alive and off systemic immunosuppressants at 3 years was 77% in BTZ recipients and 56% in controls (p=0.046). Conclusion In summary, BTZ maintenance improved incidence and severity of chronic GVHD and should be considered as a valid option in myeloma patients receiving upfront tandem auto-allo HCT.

L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique. / The importance of chromatin modifiers in regulation of hematopoiesis and hematologic malignancies is illustrated by the Mixed-Lineage Leukemia (MLL) histone methyltransferase, which is essential to maintain hematopoietic stem cells (HSC) and whose corresponding gene, MLL, is rearranged in over 70% of infant leukemia. The recently discovered histone demethylases (HDM) are also involved in HSC fate and in hematologic malignancies. The purpose of this project is to study the expression of HDM in normal and leukemic hematopoietic cells to identify potential regulators of their fate. We performed a comprehensive gene expression profile of HDM by qRTPCR and transcriptome sequencing (RNA-seq) in cord blood cells (CD34+ cells enriched in HSC and differentiated cells) and in acute myeloid leukemia (AML) cells with MLL rearrangement. Both techniques revealed differential expression of HDM between these cell populations. KDM5B and KDM1A are overexpressed in CD34+ cells compared to differentiated cells. Moreover, KDM4A and PADI2 are overexpressed in leukemic cells compared to normal cells. Functional studies will determine whether modulation of these candidates can be used in HSC expansion strategies or as anti-leukemic drug target. We have also developed and validated a new diagnostic test to detect mutations of GATA2, a gene encoding a key transcription factor involved in hematopoiesis and in AML. This work highlights the importance of nuclear factors in the regulation of normal and leukemic hematopoiesis.