Le renouvellement de l’épithélium intestinal repose sur la prolifération incessante de cellules souches intestinales (CSI) capables de régénérer l’intégralité de l’épithélium en 3 à 5 jours. Des altérations de ces dernières sont à l’origine de la transformation tumorale. L’étude des mécanismes impliqués dans la protection des CSI face à différents stress est donc essentielle pour mieux comprendre l’homéostasie et les pathologies intestinales. Dans un modèle de souris prédisposées à développer des tumeurs suite à la perte du gène Apc, notre équipe a pu précédemment démontrer une activation de l’autophagie nécessaire à la croissance tumorale. Nos travaux visent à étudier le rôle de ce processus catabolique dans l’homéostasie des CSI. Pour ce faire, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés et des cultures d’organoïdes afin d’étudier les effets de l’inhibition de l’autophagie dans l’homéostasie intestinale et en particulier dans les CSI.Nos travaux indiquent que l’inhibition de l’autophagie par l’invalidation du gène Atg7 conduit à une activation de p53 et de l’apoptose spécifique des CSI. L’invalidation simultanée du gène Tp53 empêche la mort des CSI déficientes en autophagie. De plus, au long terme, ces souris développent des tumeurs, contrairement aux souris invalidées uniquement pour les gènes Atg7 ou Tp53. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’inhibition de l’autophagie sensibilisait les CSI à l’apoptose suite à une accumulation de dommages cytotoxiques. Par une analyse d’expressions géniques des CSI issues de cryptes contrôles et invalidées pour le gène Atg7, nous avons mis en évidence une altération des réponses associées au stress oxydant et à la réparation de l’ADN. Confirmant ces signatures, nous avons observé des dommages de l’ADN dans les cryptes déficientes en autophagie et un défaut de réparation de ces dommages suite à une irradiation. Nous observons également une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène dans les CSI déficientes en autophagie associée à une atténuation de la réponse antioxidante médiée par NRF2. Des traitements antibiotiques à large-spectre ou antioxydants améliorent la survie des CSI déficientes en autophagie et soutiennent l’influence des espèces réactives de l’oxygène et de la flore intestinale sur la mort des CSI. Nos travaux indiquent donc un rôle important de l’autophagie dans la protection et le maintien des CSI, de par son contrôle des espèces réactives de l’oxygène, du microenvironnement bactérien et des voies de réparation de l’ADN. / The renewal of the intestinal epithelium relies on the continuous proliferation of stem cells capable of regenerating the entire epithelium every 3 to 5 days. These intestinal stem cells (ISC) are thought to be the cell of origin for colorectal cancer. Thus, characterizing the mechanisms involved the protection of ISC against different stresses is key to understanding both intestinal homeostasis and tumor development. In tumoral tissue from mice predisposed to intestinal tumor development following the loss of the tumor suppressor gene Apc, our laboratory previously showed an upregulation of autophagy required for tumor growth. Our work aims to understand the role this catabolic mechanism in the homeostasis of ISC. To this end, we use genetically modified mouse models and intestinal organoid culture to study the effects of autophagy inhibition in intestinal homeostasis and in particular in ISC.We found that the inhibition of autophagy upon deletion of the gene Atg7 results in p53 activation and apoptosis of ISC specifically. The simultaneous deletion of Tp53 prevents the death of autophagy-deficient ISC. Moreover, over time, mice deficient for both Atg7 and Tp53 develop tumors, contrary to those deficient for either Atg7 or Tp53 alone. We therefore hypothesized that the inhibition of autophagy sensitizes ISC to p53-mediated apoptosis as a result of accumulated pro-tumorigenic damages. Transcriptomic analysis on sorted control or Atg7-deficient ISC revealed aterations in oxidative stress and DNA damage responses. Confirming these signatures, we observed DNA damages in autophagy-deficient crypts along with a defect in the repair of induced damages following irradiation. We additionally observed an accumulation of reactive oxygen species in autophagy-deficient ISC linked to a downregulation of the NRF2-mediated antioxidant response. Wide-spectrum antibiotic or antioxidant treatments improve the survival of autophagy-deficient ISC and support the contribution of both reactive oxygen species and the intestinal microbiota to the death of ISC. Our work therefore reveals we find an important function of autophagy in the integrity and maintenance of ISC by controlling reactive oxygen species, the microbial microenvironment and DNA repair pathways.

Les lésions cartilagineuses survenant majoritairement dans un contexte de traumatisme, ne se réparent pas spontanément. Les traitements chirurgicaux et les techniques d'ingénierie cellulaire, utilisés en clinique, donnent des résultats perfectibles. L'ingénierie tissulaire du cartilage fait l'objet de nombreux travaux dans le but de produire au sein de la lésion un tissu de réparation dont les caractéristiques structurales et fonctionnelles sont similaires à celles du cartilage natif. Le diagnostic précoce de ces lésions et l'évaluation du tissu de réparation sont également des enjeux majeurs en orthopédie. L'IRM est une technique d'imagerie non invasive et à haute résolution permettant une évaluation du cartilage tant d'un point de vue architectural que biochimique en utilisant des séquences dédiées. En raison de leurs potentialités chondrogéniques, les cellules souches, provenant de différents tissus, sont une piste encourageante pour induire la régénération du cartilage lésé par des traumatismes articulaires. Des cellules provenant de différents tissus (moelle osseuse, membrane synoviale) ainsi que des chondrocytes dédifférenciés ont été ensemencés dans une structure tridimensionnelle poreuse à base de collagène I (éponge de collagène I) et soumis à un environnement chondrogénique afin de produire un implant fonctionnalisé. L'évaluation de la qualité de la synthèse matricielle in vitro dans l'implant a démontré le potentiel chondrogénique des différents contingents. La faisabilité d'un marquage de cellules souches mésenchymateuses (CSM) par des particules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO), diminuant le signal en IRM a été démontrée in vitro à 3 Teslas (3T) et 7 Teslas (7T). Des concentrations inférieures à 25 µg Fe/mL peuvent être utilisées sans endommager massivement la synthèse d'une matrice cartilagineuse par des CSM osté-médullaires. L'implantation des biomatériaux fonctionnalisés en site ectopique chez la souris nude a conduit à une dérive phénotypique ostéoïde de l'implant. En revanche, en site articulaire, chez le rat nude, les implants induisent la production d'un tissu de réparation comblant l'intégralité de la lésion et présentant des caractéristiques proche du cartilage sain environnant / Cartilaginous lesions mainly occur from a traumatic background and do not heal spontaneously. The chirurgical treatment and the cellular engineering techniques, usually used in clinic, produce perfectible results. Cartilage tissue engineering is the subject of many works in order to produce a repair tissue into the lesion. This repair tissue aims to have the same structural an functional characteristics as the native cartilage. In orthopaedic field, the early diagnostic of chondral lesions and the evaluation of the repair tissue are major issues. MRI is a high resolution and non invasive imaging technique that could be used to evaluate the architectural and biochemical structures of the cartilage by using dedicated sequences. Because of their chondrogenic capacities, stem cells provide a promising avenue to regenerate damaged cartilage in articular traumas. The stem cells from various origins (bone marrow, synovium) and the dedifferentiated chondrocytes were seeded into a porous 3D scaffold in collagen I (collagen I sponge). These cells were cultivated in chondrogenic conditions to produce a functionalized implant. The quality of the matrix synthesis was evaluated in vitro and demonstrated the chondrogenic potential of these various cell types. Superparamagnetic iron oxid particle (SPIO) labelling of the mesenchymal stem cells (MSC) is feasible in vitro at 3 Teslas (3T) and 7 Teslas (7T). A SPIO concentration lower than 25 ?g Fe/mL could be used without reducing the cartilaginous matrix synthesis by bone marrow MSC. The functionalized biomaterial implantation in an ectopic site in a nude mouse model showed an osseous split. However, in articular site in a nude rat model, the implants produced a repair tissue filling the totality of the lesion. This tissue seems to have similar characteristics of the surrounding healthy cartilage

Différents domaines en Chirurgie Plastique et Esthétique ont évolué au cours de ces dernières années et notamment le transfert et injection de Tissu Adipeux autologue. Les premières données cliniques ont été présentées sans véritable appui scientifique. Cette thèse a pour objet de confirmer les données cliniques retrouvées et de permettre d’améliorer cette technique par des preuves scientifiques. Deux questions sont à considérer : 1) Le tissu adipeux a t-il selon son origine anatomique des caractéristiques différentes et certaines régions seraient-elles à privilégier lors d’une autogreffe ? 2) Existe t-il des facteurs de croissances autologues permettant de stimuler la prise de greffe, la prolifération et la différenciation des cellules greffées ? La première partie de ce travail a consisté à analyser le tissu adipeux en fonction du site de prélèvement. A cet effet, nous avons analysé le tissu adipeux provenant de 2 sites anatomiques : le genou et le menton. Le choix topographie découle d’une raison technique et d’une raison théorique. Nos résultats suggèrent que les deux sites étudiés ont des origines embryonnaires différentes, et montrent que ces deux sites présentent une signature moléculaire et une fonctionnalité différentes. La seconde partie porte sur l’effet in vitro de facteurs de croissances autologues humains. Nous avons analysé la prolifération et la différenciation de cellules souches adipogéniques (ASCs) humaines. Nous avons pour cela utilisé des concentrés plaquettaires issus de prélèvements sanguins autologues, et donc utilisables en pratique thérapeutique humaine. Il s’agit du PRF (plaquette riche en fibrine) et du PRP (plaquette riche en plasma). Les résultats de l’étude montrent que la présence de PRF ou de PRP dans le milieu de culture permet une augmentation drastique de la prolifération cellulaire d’environs 4 à 5 fois. A contrario, les résultats obtenus montrent un blocage partiel de la différenciation adipocytaire, quelque soit le moment et le temps de mise en contact. Nous avons alors étudié par quelle voie de blocage la différenciation était induit et avons montré l’implication de la voie du TGFB qui dans ces conditions de culture induit un blocage partiel de la différenciation des ASCs vers un adipocyte mature. Notre étude montre qu’en parallèle à l’effet antiadipogénique, la différenciation s’oriente vers des cellules myofibroblastes-like. Nous avons alors testé l’effet de l’ajout d’un inhibiteur du TGFB (SB431542) dans le milieu de culture et avons observé une relance de la différenciation cellulaire vers la voie adipogénique confirmant que le PRP a un effet antiadipogénique et promyofibroblastique. Par ailleurs, nous avons analysé la composition du PRP utilisé en dosant les taux de facteurs de croissance présents. En conclusion, ce travail permet de confirmer l’augmentation de la prolifération cellulaire des ASCs en présence de PRP autologue. Ceci nous permet donc une transposition clinique immédiate en utilisant en peropératoire l’association PRP et prélèvement de tissu adipeux lors d’un lipofilling. Ce travail permet également de mettre en lumière la probable différence de fonction des adipocytes prélevés en fonction de leur site anatomique d’origine. Ceci a probablement une conséquence sur l’évolution long terme de ces greffes de tissu adipeux en fonction d’une modification pondérale. / Different fields in plastic and aesthetic surgery have evolved in recent years including the transfer and injection of autologous adipose tissue. The first clinical data was presented without any real scientific support. The purpose of this thesis is to improve this technic by adding scientific evidence. There are two questions to consider: 1) Do adipose tissues have different characteristics according to their anatomical origin, and should certain regions be preferred for autografting? 2) Are there autologous growth factors to stimulate engraftment, proliferation and differentiation of grafted cells? The first part of this work consisted in analyzing the adipose tissue according to the fat depot. For this purpose, we analyzed the adipose tissues from 2 anatomical sites: the knee and the chin. The rational of this choice comes from a technical reason and a theoretical reason. Our results suggest that the two sites studied have different embryonic origins, and show that these two sites have a different molecular signature and functionality. The second part of the work deals with the in vitro effect of autologous human growth factors. on the proliferation and differentiation of human adipose stem cells (ASCs). For this purpose, we used platelet concentrates from blood samples, which can therefore be used in human therapeutic practice. It is the PRF (fibrin-rich platelet) and the PRP (platelet-rich plasma). The results of the study show that the presence of PRF or PRP in the culture medium allows a drastic increase in ASC proliferation of about 4 to 5 times. In contrast, the results show a partial inhibition of adipocyte differentiation, whatever the period and the time of contact. We analyzed the composition of different PRP sources and we identified the involvement of the TGFB pathway in the anti adipogenic effects of PRP. In contrast, the antiadipogenic effect was concomitant with the differentiation of ASCs towards myofibroblasts-like cells. In conclusion, this work allows us immediate clinical transposition using PRP during lipofilling. This work also makes it possible to highlight the probable difference in function of the adipocytes taken according to their original anatomical site. This likely has a consequence on the long term evolution of these adipose tissue grafts in case of a weight change.

. / Articular cartilage is made up of dense, connective tissue localized at the junction of several locations in the skeleton. It covers the surface of the joints to ensure that bones can move. It is an avascular tissue that is not innervated and is composed primarily of a single cell type, the chondrocyte, which synthesizes an abundant extracellular matrix (ECM). Osteoarthritis (OA), a degenerative disease of articular cartilage, is characterized by the degradation of the ECM, associated with increased secretion of matrix metalloproteinases (MMPs) and aggrecanases. In addition, the OA process induces chondrocyte dedifferentiation characterized at least in part by increased synthesis of type I collagen, an atypical isoform in articular cartilage. Moreover, due to the poor intrinsic healing capacity of articular cartilage, there is currently no treatment to restore the chondrocyte phenotype and, in the most advanced stages of OA, the joint must be replaced with a prosthesis, requiring surgery. Therefore, various drug and surgical treatments have been developed in an attempt to prevent the destruction of cartilage which, in light of their relative success, then lead to new, improved therapeutic strategies. One of the most promising approaches is the cartilage tissue engineering based on the procedure described by Brittberg using autologous chondrocyte implantation (ACI). Applied in the earliest stages of OA or chondral lesions, ACI is based on the use of chondrocytes from a healthy, non-bearing region of the diseased joint. The cells are then amplified in monolayer culture and then re-implanted in the lesion. However, amplification of autologous chondrocytes in two-dimensional culture mimics, at least in part, some of the characteristics of the OA process and is accompanied by cell dedifferentiation leading to the formation of nonfunctional fibrocartilage. The numerous pharmaceutical approaches and surgical techniques developed to repair cartilage lesions have revealed their limitations. Ideally, traumatic cartilage lesions should be treated earlier to prevent OA and postpone prosthetic surgery. In the interest of preventing OA, cartilage cell therapy has proven to be a pivotal approach for repairing damaged tissue. Cell therapy consists not only in filling the cartilage lesion with healthy chondrocytes, but also in reconstituting the structure, the physico-chemical properties and the functionality of the hyaline matrix. The transplantation of autologous chondrocytes is the foundation of cell therapy and cartilage tissue engineering and there have been several generations of ACI, each improving on the previous one. However, even the most recent ACI techniques are showing limitations and consequently, research efforts are now focused on improving this technique in order to obtain, after amplification, a differentiated and stable chondrocyte phenotype. This is to be achieved by using new types of biomaterials that can fill more important lesions, molecules and growth factors to better control the chondrogenic differentiation and more suitable cell sources that avoid morbidity at the donor site as it is the case with articular chondrocytes. Today, MSCs hold much promise for biomedical research because they are able to recapitulate many tissues, including cartilage. However, for future advances in the field of regeneration and tissue engineering it is important to know the exact nature of these cells. With this goal, in this work, we first fully characterized 4 categories of serum free amplified mesenchymal stem cells extracted from adipose tissue (AT), bone marrow (BM), dental pulp (DP) and Wharton’s jelly (WJ) of the umbilical cord. The cells were characterized in terms of efficiency of isolation, amplification kinetics and according to an extensive immunophenotyping using flow cytometry... [etc]

La microcéphalie est une maladie neurologique du nouveau-né qui se traduit par une circonférence réduite de la tête, une déficience intellectuelle et des défauts anatomiques du cerveau. La microcéphalie peut être la conséquence d’une infection, de stress environnementaux ou de mutations génétiques.Le cerveau commence à se former dès la cinquième semaine de grossesse et est majoritairement constitué de cellules souches neuronales, cellules qui conservent une capacité a se reproduire a l’identique sans se spécialiser. Cette première phase de prolifération est importante pour générer suffisamment de cellules. Suit une phase de différenciation, durant laquelle les cellules préalablement formées se différencient en deux groupes : les neurones, qui permettent de partager l’information grâce à des influx électriques, et les cellules gliales, qui soutiennent activement les fonctions des cellules neuronales.Je m’intéresse à un gène en particulier, KNL1, muté chez certains patients microcéphales. Grace aux nouvelles techniques d’édition du génome, j’ai reproduit la mutation retrouvée chez les patients dans des cellules souches pluripotentes humaines. En utilisant un modèle tridimensionnel (mini-cerveaux en culture), à partir de cellules souches neuronales, j’ai analysé de manière quantitative les étapes-clés de développement: les phases de prolifération et de différenciation.Mes travaux de recherche ont montré que les cellules souches neuronales portant la même mutation que les patients prolifèrent moins, réduisant le nombre de cellules initiales nécessaires au développement cérébral normal. Par ailleurs, les cellules souches neuronales se différencient prématurément en neurones et cellules gliales, ce qui réduit davantage le nombre le nombre final de cellules. Cette hypothèse a été confirmée par l’utilisation du modèle tridimensionnel, ou les mini-cerveaux sont plus petits que la normale.Cette étude est essentielle non seulement pour comprendre le développement de la maladie, mais également pour comprendre les étapes clés du développement du cerveau humain, et ne pourrait pas être mener à bien sur des modèles animaux. En outre, l’utilisation de cellules souches induites nous permet de ne pas utiliser de cellules embryonnaires, si nécessaire pour raisons d’éthique. / Microcephaly is a neurological condition, resulting in patients having a small head circumference, intellectual impairment and brain anatomical defects. A pre-requisite for achieving a better understanding of the cellular events that contribute to the striking expansion of the human cerebral cortex is to elucidate cell-division mechanisms, which likely go awry in microcephaly. Most of the mutated genes identified in microcephaly patient encode centrosomal protein, KNL1 is the only gene that encodes a kinetochore protein, it plays a central role in kinetochore assembly and function during mitosis. While the involvement of centrosome functions is well established in the etiology of microcephaly, little is known about the contribution of KNL1.In an attempt to assess the role of KNL1 in brain development and its involvement in microcephaly, we generated isogenic human embryonic stem cell (hESC) lines bearing KNL1 patient mutations using CRISPR/Cas9-mediated gene targeting. We demonstrated that the point mutation leads to KNL1 reduction in neural progenitors. Moreover, mutant neural progenitors present aneuploidy, an increase in cell death and an abrogated spindle assembly checkpoint. Mutant fibroblasts, derived from hESC, do not have a reduced expression of KNL1 and do not present any defect in cell growth or karyotype, which highlight a brain-specific phenotype.The subsequent differentiation of mutant neural progenitors into two-dimensional neural culture leads to the depletion of neural progenitors in the favor of premature differentiation. We developed a three-dimensional neural spheroids model from neural progenitors and reported a reduced size of mutant neural spheroids, compare to control. Lastly, using knockdown and rescue assays, we proved that protein level of KNL1 is responsible of the premature differentiation and the reduced size.These data suggest that KNL1 has a brain-specific function during the development. Changes in its expression might contribute to the brain phenotypic divergence that appeared during human evolution.

L’anémie de Fanconi (FANC) est une maladie génétique humaine causant chez les patients une anémie sévère, une susceptibilité accrue à certains cancers, ainsi que des anomalies du développement dont un hypogonadisme. La voie FANC est impliquée dans la réponse au stress réplicatif et la réparation de l’ADN, et joue un rôle potentiel dans la régulation physiologique des cellules souches fœtales et adultes. Dans les modèles murins de la voie FANC, le phénotype majeur est une infertilité liée à un problème de développement du lignage germinal, qui est un paradigme pour l’étude des mécanismes contribuant à la pathologie. Notre étude a porté sur la caractérisation du défaut des cellules germinales primordiales (CGP) dans les embryons murins fancg-/-. Nous avons mis en évidence un défaut numérique des CGP très tôt dans le développement du lignage germinal dès les stades 9,5-10,5 jours post coïtum (jpc). Les CGP présentent un léger défaut de la prolifération à 10,5-11,5 jpc, mais aucun blocage de cycle. L’atteinte proliférative semble trop faible pour expliquer à elle seule la diminution drastique du nombre de CGP, ainsi que le profil mosaïque des gonades embryonnaires avec la présence de cordons dépourvus de CGP observé à 13,5 jpc. L’étude in vivo et ex vivo du comportement migratoire des CGP fancg-/- a permis de mettre en évidence des anomalies de la motilité des CGP, probablement liée à une activation anormale de la GTPase RAC1. Nous avons observé à 11,5 jpc une diminution du nombre de cellules au niveau du front de migration de la population de CGP. Ces anomalies entraîneraient ainsi un retard de migration et l’incapacité pour une fraction des GCP fancg-/- d’atteindre correctement les crêtes génitales à 11,5 jpc. La déplétion des CGP semble ainsi liée principalement à un défaut migratoire conduisant à une augmentation de la mort des CGP à 11,5 jpc, associé au défaut prolifératif intrinsèque des CPG fancg-/-. / Fanconi Anemia (FANC) is a genetic human disease, causing in patient a severe anemia, a higher risk to develop some cancers, and developmental anomalies including hypogonadism. The FANC pathway is involved in the replicative stress response and DNA repair, and has a potential role in the physiological regulation of fetal and adult stem cells. In mice models of the FANC pathway, the main phenotype is the sterility issue, associated to a developmental defect of the germ cell lineage, and is so a paradigm to study the pathology. Our study aimed to characterize the primordial germ cell (PGC) defect in fancg-/- mouse embryos. We showed a numerical defect of PGC early in the germ cell lineage development, as soon as 9.5–10.5 days post coitum (dpc). PGC show a mild defect of proliferation at 10.5–11.5 dpc, but no cell cycle arrest. This low proliferative defect can neither fully explain the drastic decrease of the PGC number, nor the mosaic profile of fetal gonads displaying cords without PGC at 13.5 dpc. In vitro and ex vivo studies of the migration behavior of fancg-/- PGC highlight abnormalities of the PGC’s motility, probably linked to abberant RAC1 GTPase activity. We also observed at 11.5 dpc a decrease of the cell number at the front of migration of the PGC population in 11.5 dpc fancg-/- embryos. Those motility defects could induce a migration delay, preventing a fraction of the fancg-/- PGC population to reach correctly the genital crests by 11.5 dpc. Hence, PGC depletion seems mainly linked to a migratory defect leading to increased cell death in PGC at 11.5 dpc, associated to an intrinsic proliferation defect of fancg-/- PGC.

Le couple CXCL12/CXCR4 joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPHs) et constitue un axe clé par lequel les niches et les CSPHs communiquent au sein de la moelle osseuse (MO). Des mutations hétérozygotes du gène CXCR4, qui tronquent le domaine C-terminal de la protéine et entraînent un défaut de désensibilisation homologue de CXCR4 et une hypersensibilité à CXCL12, ont été identifiées dans le Syndrome WHIM (SW), une immunodéficience rare caractérisée notamment par une lymphopénie. Les mécanismes sous-jacents de cette anomalie restaient inconnus. Grâce à un modèle murin porteur d’une mutation gain de fonction de Cxcr4 identifiée chez certains patients et phénocopiant la lymphopénie du SW, nous avons exploré la possibilité qu’un défaut de domiciliation, de différenciation ou d’expansion des CSPHs dans la MO soit à l’origine de la lymphopénie circulante. Nous avons mis en évidence que la désensibilisation de Cxcr4 régule la balance quiescence/cycle des CSHs à court terme ainsi que leur différenciation en progéniteurs multipotents et progéniteurs engagés vers le lignage lymphoïde. Nos travaux révèlent donc que la désensibilisation de Cxcr4 est requise à la différenciation lymphoïde des CSPHs et suggèrent que l’absence de ce processus soit à l’origine de la lymphopénie observée chez les souris mutantes et, par extrapolation, chez les patients. Ces altérations lymphoïdes impliquaient à la fois des défauts intrinsèques (CSPHs) et extrinsèques (stroma), ce qui nous a conduit à considérer l’impact de la mutation gain de fonction de Cxcr4 sur le stroma médullaire. Dans ce contexte, l’objectif principal de mon projet de thèse a consisté à investiguer à l’aide du modèle murin du SW le rôle de la désensibilisation de Cxcr4 dans le maintien des composantes mésenchymateuses au sein de la MO. Nos données ont permis de mettre en lumière que la désensibilisation de Cxcr4 est intrinsèquement requise à la régulation de l’équilibre quiescence/cycle des cellules souches mésenchymateuses (CSMs), ainsi qu’à la préservation de leur potentiel ostéogénique en contrôlant l'expression et la biodisponibilité de Cxcl12 de manière autocrine. Par conséquent, nos travaux suggèrent que les actions autocrines et paracrines de l’axe de signalisation Cxcl12/Cxcr4 au sein des CSMs régulent leur différenciation en ostéoblastes tout en contribuant au maintien des niches des CSPHs et au processus d’hématopoïèse. / The CXCL12/CXCR4 signaling axis plays an essential role in the maintenance of hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) homeostasis and constitutes a key pathway through which the niches and HSPCs communicate in the bone marrow (BM). Heterozygous gain-of-function mutations of CXCR4, which engender a truncated receptor and affect its homologous desensitization in response to CXCL12, have been reported in the WHIM Syndrome (WS); a rare immunodeficiency notably characterized by lymphopenia. The mechanisms underpinning this remain obscure. Using a mouse model harboring a naturally occurring WS-linked Cxcr4 gain-of-function mutation, we explored the possibility that the lymphopenia in WS arise from defects at the HSPC level in the BM. We showed that Cxcr4 desensitization is required for proper quiescence/cycling balance of short-term HSCs as well as their differentiation into multipotent progenitors and downstream lymphoid-biased progenitors. Thus, our results suggest that efficient Cxcr4 desensitization is critical for lymphoid differentiation of HSPCs, and its impairment is a key mechanism underpinning the lymphopenia observed in WS mice. The role of Cxcr4 desensitization in regulating such lympho-hematopoiesis process implicated both intrinsic and extrinsic properties, thus raising the question of the impact of a gain-of-Cxcr4-function mutation on BM stroma. Therefore, the main part of my PhD project was dedicated to evaluate using this relevant knock-in model the impact of Cxcr4 desensitization on maintenance of BM mesenchymal elements. We have found unexpectedly that such regulatory mechanism is intrinsically required for regulating quiescence/cycling balance of mesenchymal stem cells (MSCs) and preserving their osteogenic potential through the control of Cxcl12 expression and availability in an autocrine manner. Therefore, these findings support autocrine and paracrine actions of the Cxcl12/Cxcr4 signaling axis within MSCs to regulate osteoblast differentiation while contributing to HSPC niches and hematopoiesis.

La phosphoinositide 3-kinase p110δ (PI3Kδ) est principalement exprimée dans les cellules hématopoïétiques et son inhibiteur, l'idélalisib est approuvé pour le traitement de la leucémie et du lymphome. Cependant, la fonction de cette isoforme dans les cellules non hématopoïétiques reste insaisissable. Dans cette étude, nous rapportons que la formation des canalicules biliaires est dépendante de l’activité de la PI3Kδ lors de la culture en 3D de cellules de carcinome hépatocellulaire. Une étude in-vitro reposant sur la différenciation de cellules souches embryonnaires humaines en hépatocytes révèle que la PI3Kδ est enrichie dans les cellules souches et que son expression diminue au fur et à mesure que les cellules se différencient. Lorsqu’elle est surexprimée, la PI3Kδ reprogramme ces cellules en cellules ressemblant à des cellules souches formant des rosettes polarisées et perdant des marqueurs d’hépatocytes pour acquérir des traits de cholangiocytes. Dans le foie murin, la réexpression de la PI3Kδ entraine des modifications de la morphologie de cellules jouxtant la veine porte, ainsi que l’augmentation de l’expression du gène codant pour EpCAM. Cette reprogrammation dépendante de la PI3Kδ est associée à l'activation de la voie de Notch et requiert l'activation de la protéine Src. Enfin, la PI3Kδ est exprimée dans les lignées cellulaires dérivées d’hépatoblastome humain et le traitement des souris par l’idélalisib diminue la taille des tumeurs formées par les PDX d’hépatoblastome. La PI3Kδ représente donc une cible thérapeutique prometteuse dans ce cancer pédiatrique avec des caractéristiques de cellules souches. / The phosphoinositide 3-kinase p110δ (PI3Kδ) is primarily expressed in the hematopoietic cells and its inhibitor, Idelalisib, is approved for leukemia and lymphoma treatments. Nevertheless, the function of PI3Kδ in the non-hematopoietic cells is still elusive. Here we report that the formation of bile canaliculi is dependent on the PI3Kδ activity using hepatocellular carcinoma (HCC) cells grown in a 3D culture. In-vitro study based on hepatocytes differentiation from human Embryonic Stem Cell (hESC) highlights that PI3Kδ is enriched in hESC and increasingly reduces over time while cells are differentiating. When PI3Kδ is overexpressed, it reprograms those cells into stem-like cells forming polarized rosette structures and losing hepatocyte markers to gain cholangiocyte characteristics. These changes were observed in mice liver overexpressing PI3Kδ. The aforementioned reprogramming, dependent on PI3Kδ, is associated with the Notch pathway activation and requires the Src protein activation. Finally,PI3Kδ is expressed in hepatoblastoma cell lines and idelalisib efficiently reduces tumor size formed by patient derived xenograft (PDX). Therefore, PI3Kδ represents a promising therapeutic target for this pediatric cancer with stem cell features.

RÉSUMÉ en françaisLes systèmes de délivrance de médicaments sont fortement investigués dans le but d’obtenir la meilleure efficacité thérapeutique et la plus faible toxicité possible. De nombreux systèmes existent à l’heure actuelle qu’ils soient mécaniques ou chimiques. Dans ce travail, nous nous sommes tout d’abord intéressés à une nouvelle approche basée sur la macropinocytose pour augmenter l’internalisation d’agents thérapeutiques aussi bien dans des cellules cibles de médicaments que dans des cellules souches mésenchymateuses d’origine musculaire (mdMSCs) actuellement de plus en plus étudiées comme nouveaux systèmes de délivrance. La macropinocytose est en effet une voie d’endocytose clathrine-indépendante permettant l’internalisation non sélective de fluide extracellulaire. Ce processus semble contribuer à l’agressivité des cancers en favorisant leur apport en nutriments, le recyclage de la membrane plasmatique et de ses récepteurs ainsi que l’internalisation d’exosomes. La macropinocytose est déclenchée notamment par l’activation des récepteurs epidermal growth factor receptor (EGFR) et platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) qui sont des marqueurs connus d’agressivité des gliomes. Au cours de ce travail, nous nous sommes demandé si la macropinocytose ne pourrait pas être utilisée pour améliorer l’internalisation d’agents chimiothérapeutiques dans les cellules de glioblastomes. Nous avons tout d’abord montré que l’expression des acteurs clés de la macropinocytose au niveau de leur ARNm est fortement altérée en fonction du grade de la tumeur en utilisant des bases de données publiques d’échantillons de tumeurs gliales humaines. Une « signature » basée sur l’expression de 38 gènes liés à la macropinocytose permet la discrimination des échantillons de glioblastomes, c’est-à-dire des tumeurs les plus agressives. Nous avons ensuite comparé les effets induits par le MOMIPP et le Vacquinol-1, deux inducteurs connus de macropinocytose, à ceux de l’Honokiol qui induit également une vacuolisation sévère au sein de cellules de gliomes. Malgré de fortes similarités morphologiques, l’Honokiol se distingue par l’induction de vacuoles provenant à la fois d’endocytose mais aussi du réticulum endoplasmique. Chacun des trois composés induit néanmoins une nette augmentation de l’internalisation de dextrans de 10 kDa. Le marquage à l’acridine orange suggère pourtant des différences dans le devenir des vacuoles induites par ces trois molécules. Il a récemment été démontré que le MOMIPP agit en empêchant la maturation des macropinosomes ce qui concorde avec notre observation d’une fusion avec les lysosomes qui serait très limitée. Si les trois molécules permettent bien d’augmenter également la concentration de témozolomide (traitement de référence) au sein des cellules de gliomes, leur impact sur l’internalisation de la doxorubicine est plus faible. L’augmentation de l’internalisation des médicaments par l’induction de macropinocytose ne semble donc pas toujours efficace et pourrait dépendre de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leur voie d’internalisation basale. Étant donné que l’induction soutenue de macropinocytose peut également déclencher la mort cellulaire tant de cellules de glioblastome chimio-sensibles que chimio-résistantes, nous proposons d’envisager la macropinocytose dans des approches combinées pour bénéficier d’une augmentation de l’internalisation de médicaments et d’effets additifs/ synergiques. Comme les cellules souches mésenchymateuses sont intensément étudiées pour leur utilisation en tant que transporteur de médicaments en plus de leur potentiel intrinsèque pour la médecine régénérative, les effets de ces inducteurs de vacuolisation ont également été étudiés sur des mdMSCs. Ces dernières sont caractérisées par un niveau basal de macropinocytose plus élevé que les modèles de gliomes utilisés et elles semblent mieux répondre au Vacquinol-1 qui permet d’ailleurs d’augmenter plus efficacement la concentration intracellulaire en doxorubicine que le MOMIPP, avec une internalisation environ 2 fois plus importante qu’en absence de stimulation. Ces cellules pouvant être utilisées comme véhicule pour le transport de molécules ayant une faible biodisponibilité afin d’améliorer leur usage en clinique, nous avons ensuite évalué l’impact du chargement de mdMSCs avec de la curcumine, un polyphénol naturel bien connu pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires dont le potentiel clinique reste limité notamment par sa faible solubilité. Pour cette raison, l’utilisation du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine et d’hydroxy-propyl-bêta-cyclodextrine qui présente une bien meilleure solubilité dans l’eau, a été préférée. Nous avons observé que l’internalisation de la curcumine, provenant du NDS27, dans les mdMSCs est concentration-dépendante et non temps-dépendante. De plus, elle ne peut pas être augmentée par l’utilisation d’inducteurs de macropinocytose. De plus amples investigations des effets de l’internalisation de la curcumine à partir du NDS27 en fonction de la concentration sur leur viabilité, prolifération, propriétés mésenchymateuses et leur fonction mitochondriale nous ont permis de montrer qu’un chargement de 2 h avec 7 µM de NDS27 était acceptable en vue de préserver la possibilité de bénéficier des mdMSCs en tant qu’agent de thérapie cellulaire régénérative en sus de leur aspect de délivrance. L’investigation du potentiel thérapeutique de telles mdMSCs chargées en curcumine pour traiter l’arthrose chez le cheval est toujours en cours. / SUMMARYDrug delivery systems are highly investigated with the aim to promote the best therapeutic efficacy and the lowest possible toxicity. Nowadays, several systems either mechanical or chemical exist. In this work, we were first interested in studying a new approach based on macropinocytosis to increase the internalisation of therapeutic agents in both target cells of drugs and skeletal muscle-derived mesenchymal stem cells (mdMSCs) currently more and more studied as new deliverance systems. Macropinocytosis is indeed a clathrin-independent endocytosis pathway allowing the nonselective internalisation of extracellular fluid. This process seems to contribute to cancer aggressiveness by favouriting nutrient supply, recycling of plasma membrane and its receptors, and exosome internalisation. Macropinocytosis may notably be triggered by epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), two well-known markers of glioma aggressiveness. During this work, we wondered whether macropinocytosis could be used to improve the internalisation of chemotherapeutic agents into glioblastoma cells. We first showed that the mRNA expression levels of key actors of macropinocytosis are strongly altered according to the grade of the tumour using public datasets of human glioma tumour samples. A “signature” based on the expression of 38 macropinocytosis-related gene allows the discrimination of the glioblastoma samples, i.e. the most aggressive tumours. We next compared the effects induced by MOMIPP and Vacquinol-1, two well-known macropinocytosis inducers to those of Honokiol which also induces a severe vacuolisation within glioma cells. Despite high phase-contrast morphological similarities, Honokiol appeared different from the others by the induction of vacuoles from both endocytosis and endoplasmic reticulum origins. Each of the three compounds nevertheless induces a marked increase in 10 kDa dextran internalisation. Acridine orange staining however suggested differences in the fate of vacuoles induced by those three molecules. MOMIPP has recently been shown to prevent the macropinosomes maturation which is consistent with our observation ofthe lack of acridine orange staining of the vacuoles that may be attributed to a limited fusion with lysosomes. Although each of the three compounds allows nevertheless a marked increase of temozolomide (i.e. first-line treatment) concentration into glioma cells, their impact on the internalisation of doxorubicin is poor. The increased internalisation of drugs by inducing macropinocytosis does not seem to be always efficient and could depend on their physicochemical properties and their basal way of internalisation. Considering that sustained macropinocytosis induction may also trigger cell death of both chemo-sensitive and chemo-resistant glioblastoma cells, we proposefor future perspectives to consider macropinocytosis in combination approaches to benefit from an increased drug uptake and additive/synergistic effects. As mesenchymal stromal / stem cells are increasingly studied for their use as drug-carrier in addition to their intrinsic potential for regenerative medicine, the effects of these vacuolisation inducers were also studied on mdMSCs. These lasts are characterised by a higher basal level of macropinocytosis than the glioma models used in this work. They seem to better respond to Vacquinol-1 which allows to increase more efficiently the intracellular concentration of doxorubicin than MOMIPP, with an uptake approximatively 2-fold higher than without stimulation. Given that these cells can be used as vehicle to transport molecules with a poor bioavailability in order to improve their clinical usage, we evaluated the impact of the loading of mdMSCs with curcumin, a natural polyphenol well-known for its antioxidant and anti-inflammatory properties whose clinical potential remains limited notably by reason of its poor solubility. Therefore, the use of NDS27, a complex of curcumin lysinate and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin displaying an increased solubility in aqueous solution, was preferred. We observed that the uptake of curcumin from NDS27 into mdMSCs is concentration-dependent and not time-dependent. Moreover, it cannot be improve using macropinocytosis inducers. Further investigations of the effects of curcumin internalisation from NDS27 depending on the concentration used on their viability, proliferation, mesenchymal properties and their mitochondrial function allowed us to show that a loading of 2 h with NDS27 at 7 µM seems acceptable to preserve the possibility to benefit from mdMSCs as a cellular therapy agent in addition to the delivery aspect. The investigation of the double potential therapeutic benefits of such curcumin-loaded mdMSCs to treat osteoarthritis in horses is still ongoing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'érythropoïèse est un mécanisme complexe responsable de la formation des erythrocytes à partir des cellules souches hématopoïétiques. Notre équipe a précédemment montré que l'hyperthermie légère favorise l'expansion et accélère la différenciation des cellules mégacaryocytes en culture. Le but de mes travaux était de caractériser les effets de l'hyperthermie légère sur les autres voies de différenciation myéloïdes (cellules érythroïdes, granulocytes et monocytes) et d'identifier les mécanismes d'action responsables des effets observés sur l'érythropoïèse. Nous montrons que l'hyperthermie légère permet un accroissement de l'expansion sur la majorité des lignées testées et accélère leur différenciation et maturation. De plus, nos résultats montrent que l'hyperthermie légère favorise une entrée rapide des cellules CD34+ quiescentes en cycle cellulaire et augmente l'expression de plusieurs protéines de choc thermique. En conclusion, nos résultats suggèrent que les effets observés de l'hyperthermie légère sur l'érythropoïèse sont en partie dus à l'activation de plusieurs sentiers de signalisation intracellulaire ainsi que du facteur proérythrocytaire GATA-1.