"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maîtrise en droit (L.L.M.) Option recherche" / La découverte des cellules souches embryonnaires et de leur immense potentiel thérapeutique a fait naître de grands espoirs. De nouvelles thérapies révolutionnaires pour traiter certaines des maladies les plus graves dont souffre l'humanité sont désormais envisageables. Le traitement de la vie à son stade le plus précoce est mis en cause. Le statut juridique reconnu au foetus et à l'embryon humain a des répercussions directes sur le domaine de la recherche et sur leur utilisation à des fins thérapeutiques. Nous avons examiné l'état du droit canadien quant au statut juridique du foetus et de l'embryon. De cette étude, nous avons constaté l'incertitude qui prévaut au Canada quant à leur statut. Par la suite, nous avons étudié les différentes normes canadiennes établies pour encadrer l'utilisation des cellules souches embryonnaires à des fins thérapeutiques et nous les avons analysées et comparées pour faire ressortir leurs similitudes et leurs différences. II est ressorti de notre analyse que les textes canadiens se rejoignent généralement sur l'essentiel et qu'il y a eu peu de changements de 1993 à aujourd'hui, en regard des activités de recherche interdites au Canada. Puis, nous avons examiné les systèmes normatifs applicables à ces recherches à l'étranger, soit aux États-Unis et en GrandeBretagne. Nous avons effectué une analyse comparative des trois systèmes normatifs étudiés, en évaluant différents paramètres communs à ces systèmes. Il est ressorti de cette analyse, que la Grande-Bretagne est le pays le plus libéral relativement à ces domaines de recherche, que les États-Unis sont les plus conservateurs sur ces questions et que le Canada se situe entre les deux. / The embryonic stem cells discovery and the immense therapeutic potential glven to them has created big hopes in the world of today. The appearance of new revolutionary therapies to treat sorne of the most serious known diseases are now conceivable. However, the treatment of life to its earliest stage is questionned. The legal status recognized to the foetus and the embryo has, in fact, a direct effect to the research area and industry as weil as to its therapeutic use. Therefore, we have examined and studied the CUITent canadian law with respect to the legal status of the foetus and embryo. Following this study, we have noticed the uncertainty that prevails in Canada concerning the said legal status. Afierwards, we have examined ail the different canadian norms and regulations already established regarding the use of embryonic stem cells for therapeutic ends. We also did the comparaison between those norms and regulations so as to see their differences and similarities. It appears from our analysis that ail the canadian litterature generally treat the subject in the same way and that there have been few changes from 1993 up until now with respect to the forbidden researchs activities in Canada. We also have analysed the foreign law standards and regulations in United States and Great Britain concerning those forbidden researchs activities. We did the exercise of comparing the state of the law in these three countries with different parameters. It emerges from that that Great Britain is the most liberal country, United States being the most conservative and Canada being in between them.

Certaines brûlures oculaires graves ou d'autres pathologies oculaires rares peuvent être associées à une perte totale de cellules souches épithéliales de la cornée (DCSL), ce qui conduit à une opacification de la cornée par invasion de la conjonctive. Lorsque la DCSL est totale et bilatérale, le limbe controlatéral n'est pas disponible pour la greffe de limbe autologue ou la culture de cellules souches autologues limbiques et la transplantation allogénique de la cornée est impossible car toujours rejetée en raison de la néovascularisation. Une thérapie innovante testée avec succès au sein de notre laboratoire, en collaboration avec le service d'ophtalmologie des HCL, consiste en une greffe autologue de Feuillet Epithélial (FE) dérivé de Muqueuse Orale (MO). Cette approche permet de restaurer la transparence et autorise, si nécessaire, une greffe cornéenne complémentaire. Cette technique a montré son efficacité lors d'un essai clinique conduit dans notre hôpital mais le dispositif breveté permettant le détachement non enzymatique des feuillets cultivés n'est plus disponible en Europe. Nous avons donc mis au point un nouveau procédé de production de FE dérivant de la MO dont la preuve de concept a été obtenue à partir d'études in-vitro et ex-vivo. En effet, un détachement avec 0,5 mg / mL de collagénase n'endommage pas le FE de MO et les protéines de la membrane basale, et, dans un modèle de stroma porcin exvivo, ces feuillets adhérents au stroma, continuent à se renouveler sous la forme d'épithélium différencié. De plus, dans le cas d'une opacité stromale associée à une DCSL, une greffe secondaire de cornée est nécessaire pour améliorer l'Acuité Visuelle (AV), c'est pourquoi nous avons cherché à développer pour ces patients à haut risque de rejet, un stroma décellularisé. Ce stroma pourrait également répondre à la pénurie de cornées dans les pays en voie de développement grâce à sa conservation longue et facile. La lyophilisation a été combinée à la décellularisation des cornées au SDS à 0,1 %, validée sur les cornées humaines sur le maintien de leur transparence et de l'ultrastructure du stroma associé à l'absence des antigènes HLA-ABC et HLA-DR. Enfin, dans un modèle de Kératoplastie Lamellaire Antérieure Profonde (KLAP) ex-vivo, nous avons montré que les cellules épithéliales et stromales de la cornée humaine receveuse colonise le stroma décellularisé. Ainsi, nos travaux permettent de proposer un traitement des DSCL totales et bilatérales associées ou non à une atteinte du stroma / Some severe ocular burns or other rare ocular pathologies may be associated with a complete loss of corneal epithelial stem cells (LSCD), leading to an opacification of the cornea by invasion of the conjunctiva. When DCSL is total and bilateral, contralateral limbus is not available for autologous limb transplant or limbal autologous stem cell culture, and allogeneic transplantation of the cornea is not an option since neovascularization is constantly responsible for graft rejection. An innovative therapy tested with success in our laboratory, in collaboration with the ophthalmology department of the HCL, consists in an autologous Epithelial Cell Sheet (ECS) graft derived from Oral Mucosa (MO). This approach restores transparency and allows in a second step a complementary corneal graft when necessary. This technique has been shown to be effective in a clinical trial conducted in our hospital, but the patented device for the non-enzymatic detachment of cultivated ECS is no longer available in Europe. We have therefore developed a new method for the production of ECS from OM, the proof of concept of which has been obtained from in-vitro and ex-vivo studies. Indeed, detachment with 0.5 mg / mL of collagenase does not damage ECS from OM and basement membrane proteins, and in an ex-vivo porcine stroma model, these cell sheets adhered on corneal stroma, continued to self-renew and generated a differentiated epithelium. Since stromal opacity associated with DCSL requires a secondary corneal graft to improve Visual Acuity (VA), we also sought to develop for these patients with high rejection risk, a new approach for the generation of decellularized stroma. Such a procedure for the production of decellularized stroma was also aimed at allowing a money-saving and reliable long-term storage for stromal grafts and thus circumventing the shortage of corneas in developing countries. Our process, combining lyophilization with decellularization of the corneas at 0.1 % SDS, was validated on human corneas regarding the maintenance of stroma transparency, the stromal ultrastructure associated with the absence of HLA-ABC and HLA-DR antigens. Finally, in an ex-vivo model of Deep Anterior Lamellar Keratoplasty (DALK), we have shown that the epithelial and stromal cells of the recipient human cornea colonized efficiently the decellularised stroma. Overall, our work makes it possible to propose a treatment for total and bilateral LSCD associated or not with lesions of the stroma

GNAS est un locus complexe soumis à l'empreinte parentale. Il code pour cinq transcrits alternatifs dont l’expression est régulée de manière parentale, tissulaire et développementale : la sous-Unité alpha stimulatrice de la protéine G hétérotrimérique (Gαs), XLαs, NESP55, et deux ARNnc, A/B et GNAS-AS1. Gαs est une protéine clé dans la transduction hormonale partageant avec XLαs la capacité de produire l'AMPc intracellulaire après stimulation des récepteurs couplés à Gαs.Dans la première partie de ma thèse, je me suis concentrée sur l'étude du rôle des transcrits de GNAS, en particulier XLαs, dans la croissance fœtale et post-Natale. J’ai profité du modèle unique des pseudohypoparathyroïdies (PHPs), pathologies humaines rare de l’empreinte, causées par des anomalies génétiques ou épigénétiques du locus GNAS altérant le dosage génique des transcrits de GNAS. La croissance anormale est une caractéristique majeure des PHPs.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai étudié le profil épigénétique du locus GNAS (méthylation de l'ADN et expression des transcrits) dans les cellules souches humaines embryonnaires -HESCs-, dans les cellules pluripotentes induites dérivées à partir de fibroblastes de sujets sains -IPSCs- et dans les cellules redifférenciées en cellules souches neurales et mésenchymateuses. La caractérisation précise du locus humain GNAS en physiologie (cellules souches) et pathologie (PHP) est essentielle pour une meilleure compréhension des processus développementaux importants comme la croissance. L'exploration du phénotype "croissance" de différents types de PHPs a permis de mieux comprendre le rôle des transcrits du locus GNAS dans la physiologie et la physiopathologie. L'analyse de cellules des PHPs a permis de mieux caractériser l’impact des anomalies moléculaires du locus GNAS en pathologie humaine. Les hiPSCs peuvent être un outil utile pour étudier les modifications épigénétiques au niveau du locus GNAS. / GNAS is a complex locus subjected to parental imprinting encoding five parental-, tissue- and developmental-Manner regulated transcripts : the alpha stimulatory subunit of the G protein (Gαs), XLαs, NESP55, and two ncRNAs, A/B and the antisens GNAS-AS1. Gαs is a key protein in hormonal signaling sharing with XLαs the ability to produce intracellular cAMP upon stimulation of Gαs-Coupled receptors. In the first part of my thesis, I focused on studying the role of the GNAS transcripts, particularly XLαs, in fetal and postnatal growth. I took advantage of the unique model of pseudohypoparathyroidism (PHP), a rare human disease, caused by genetic or epigenetic abnormalities at the GNAS locus leading to various combinations of GNAS transcripts alterations. Abnormal growth appears to be a major feature of PHP. In the second part of my thesis, I studied the epigenetic pattern of GNAS (DNA methylation and transcripts expression) in human embryonic stem cells -HESCs-, in induced pluripotent stem cells -IPSCs- derived from fibroblasts from healthy individuals, and in cells re-Differentiated from these stem cells in neuronal and mesenchymal cells. The precise characterization of the human GNAS locus in physiology (stem cells) and pathology (PHP) is critical for a better understanding of major processes like growth. Through exploration of the "growth" phenotype of different groups of PHPs we have participated to the better understanding of the role of the GNAS transcripts in the physiology and pathophysiology. Human iPSCs may be an useful tool to study epigenetic modifications at the GNAS locus.

De par leurs propriétés d’autorenouvellement et de multipotentialité, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) présentent un intérêt médical majeur et sont au cœur de nombreuses thérapies génique et cellulaire. Cependant, leur utilisation en clinique est encore limitée par leur rareté, leur hétérogénéité fonctionnelle, et leur perte durant l’étape de manipulation in vitro qui précède la transplantation.Dans ce contexte, nous avons mis au point une stratégie de marquage cellulaire par des codes-barres moléculaires afin d’évaluer simultanément et quantitativement les capacités de repopulation des CSH in vivo. Cette stratégie nous a permis de cribler 1200 composés chimiques afin d’identifier des molécules capables (1) d’améliorer l’efficacité de transduction des CSH par un vecteur lentiviral, (2) de maintenir voire d’expandre, lors de l’étape de culture in vitro, les CSH capables de repopulation à long terme. Plusieurs molécules candidates sont en cours de validation.Par ailleurs, grâce au marquage par des codes-barres, nous avons révélé l’hétérogénéité des CSH en comparant leur capacité d’autorenouvellement, la taille de la descendance qu’elles génèrent et leur capacité de différenciation. Notre technique nous a permis non seulement de confirmer l’existence de CSH biaisées vers le lignage myéloïde ou vers le lignage lymphoïde, mais aussi de quantifier leur fréquence.L’application de cette stratégie à un autre système cellulaire nous a permis d’étudier l’influence de facteurs environnementaux et génétiques sur la croissance cellulaire de populations exprimant différentiellement l’-synucléine, une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson et certains cancers. / Considerable hope is placed on the use of hematopoietic stem cells (HSC) in engineered gene- and cell- based therapy protocols. Their clinical utilization is, however to some extent, limited by their scarce representation, their heterogeneity and their loss during the ex vivo manipulation procedure. Within this context, we developed a barcode tagging strategy to simultaneously evaluate in vivo the repopulating capacity of HSC cultured in vitro. Barcode deconvolution demonstrated that our strategy constitute a powerful tool for tracking HSC quantitatively even using several dozens of different conditions. Using this strategy, we screened 1200 chemical compounds in order to identify molecules acting (1) on HSC transduction efficiency using a lentiviral vector, (2) on maintenance or even amplification during the in vitro culture step of long-term repopulating HSC. Several candidate molecules are currently under validation. In addition, using this barcoding strategy, we reveal heterogeneous behaviour of HSC examining their proliferation capacity, self-renewal ability and their differentiation lineage option. Our technique allowed us not only to confirm the occurrence of myeloid- and lymphoid-biased HSC, but also to quantify their frequency.We apply this strategy to another cell system to address the effect of different genetic and environmental factors on proliferation of cells expressing -synuclein, a protein involved in Parkinson disease and some cancers.

L'incidence, le coût et l'issue fatale dans un nombre encore trop élevé de cas font du cancer un problème majeur en santé publique. Malgré les progrès réalisés dans le développement de thérapies ciblées, la plupart des cancers rechutent, vraisemblablement à cause de l'échappement des cellules souches cancéreuses (CSC) qui survivent et régénèrent la tumeur. L'enjeu clinique en cancérologie aujourd'hui est d'éliminer les cellules souches cancéreuses en épargnant les cellules souches normales. Pour atteindre cet objectif, il est primordial de comprendre leurs mécanismes spécifiques de transformation. Nous évaluons dans mon équipe de recherche l'implication du microenvironnement dans la transformation et la résistance des CSC épithéliales, à travers les effets de facteurs solubles et de contacts cellulaires : l'enzyme CD10, et la voie des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins).Notre équipe étudie le rôle du dialogue permanent entre la CS normale et son microenvironnement qui régule la prolifération, et la survie des CS. Nous utilisons la glande mammaire et la prostate comme systèmes modèles car ces deux types d'épithélium présentent des similitudes, ce qui nous permet d'aborder la question de l'apparition et la résistance des CSC dans deux modèles tumoraux correspondants. Des dérégulations de la voie des BMPs, comme de l'enzyme CD10 sont observées dans ces tumeurs. Enfin, nous cherchons à comprendre comment les dérégulations de la voie des BMPs apparaissent, en s'intéressant principalement aux facteurs pouvant modifier directement le microenvironnement, tels que les polluants présents dans l'environnement (bisphénols, benzoapyrène) / It has been shown for a number of cancers that a cell population characterized by stem cell (SC) properties and therapeutic resistance is likely responsible for relapse several years after treatment. Current therapies kill most of the tumor cells, but fail to eradicate the so-called cancer stem cells (CSC). Therefore a complete cure of the disease will require the eradication of the tumor-sustaining CSC. We propose to study these CSC in the context of breast cancer as the existence of CSC as already been highlighted in this epithelia.CD10 is a membrane enzyme able to cleave several peptide of the microenvironment (such as oxytocin, bombesin, enkephalin.. ) that can also interact with intracellular signalling pathway through its direct interaction with PTEN. Our results, and those of the literature, indicate that CD10 enzyme controls the fate of SC and is deregulated in normal breast and cancerous tissues. We showed that CD10 membrane expression allows the maintenance of immature cells partly through its enzymatic function that inhibits mammary stem cells differentiation. As CD10 has been described in breast cancer initiation, progression and resistance, we then decided to test the role of CD10 in tumor context. Our strategy consists in flow cytometry cell sorting for CD10+/CD10- cells to compare the functional properties of both sub-population. Only CD10+ cells are able to regenerate both CD10+ and CD10- subpopulations, and CD10+ cells exhibit higher expression of immature genes. Interestingly, modulating CD10 using stable expression of CD10 in our models and Sh strategies do not mimick the normal functions of CD10, indicating that CD10 could be more a marker of a certain population with immature properties prone to transformation rather than a driver. To better characterize the role of CD10 in luminal breast transformation, we developed a new human mammary model, initiated from immature cells to obtain transformed luminal epithelial cells and their resistant counterpart. We observed a higher level of CD10 expression during mammary epithelial cell transformation process. We then performed a microarray on CD10+ and CD10- subpopulations. Preliminary analysis seems to confirm that CD10 is a potential marker for a stem cell population prone to transformation rather than a direct driver of the cell transformation

Thèse de doctorat : Bioingénierie : Nancy 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre.

La découverte des cellules souches embryonnaires et de leur immense potentiel thérapeutique a fait naître de grands espoirs. De nouvelles thérapies révolutionnaires pour traiter certaines des maladies les plus graves dont souffre l'humanité sont désormais envisageables. Le traitement de la vie à son stade le plus précoce est mis en cause. Le statut juridique reconnu au foetus et à l'embryon humain a des répercussions directes sur le domaine de la recherche et sur leur utilisation à des fins thérapeutiques. Nous avons examiné l'état du droit canadien quant au statut juridique du foetus et de l'embryon. De cette étude, nous avons constaté l'incertitude qui prévaut au Canada quant à leur statut. Par la suite, nous avons étudié les différentes normes canadiennes établies pour encadrer l'utilisation des cellules souches embryonnaires à des fins thérapeutiques et nous les avons analysées et comparées pour faire ressortir leurs similitudes et leurs différences. II est ressorti de notre analyse que les textes canadiens se rejoignent généralement sur l'essentiel et qu'il y a eu peu de changements de 1993 à aujourd'hui, en regard des activités de recherche interdites au Canada. Puis, nous avons examiné les systèmes normatifs applicables à ces recherches à l'étranger, soit aux États-Unis et en GrandeBretagne. Nous avons effectué une analyse comparative des trois systèmes normatifs étudiés, en évaluant différents paramètres communs à ces systèmes. Il est ressorti de cette analyse, que la Grande-Bretagne est le pays le plus libéral relativement à ces domaines de recherche, que les États-Unis sont les plus conservateurs sur ces questions et que le Canada se situe entre les deux. / The embryonic stem cells discovery and the immense therapeutic potential glven to them has created big hopes in the world of today. The appearance of new revolutionary therapies to treat sorne of the most serious known diseases are now conceivable. However, the treatment of life to its earliest stage is questionned. The legal status recognized to the foetus and the embryo has, in fact, a direct effect to the research area and industry as weil as to its therapeutic use. Therefore, we have examined and studied the CUITent canadian law with respect to the legal status of the foetus and embryo. Following this study, we have noticed the uncertainty that prevails in Canada concerning the said legal status. Afierwards, we have examined ail the different canadian norms and regulations already established regarding the use of embryonic stem cells for therapeutic ends. We also did the comparaison between those norms and regulations so as to see their differences and similarities. It appears from our analysis that ail the canadian litterature generally treat the subject in the same way and that there have been few changes from 1993 up until now with respect to the forbidden researchs activities in Canada. We also have analysed the foreign law standards and regulations in United States and Great Britain concerning those forbidden researchs activities. We did the exercise of comparing the state of the law in these three countries with different parameters. It emerges from that that Great Britain is the most liberal country, United States being the most conservative and Canada being in between them. / "Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maîtrise en droit (L.L.M.) Option recherche"

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une hémopathie myéloïde rare du sujet âgé. Les caractéristiques cliniques, génétiques et moléculaires de la maladie sont bien connues. L’expression très hétérogène de la maladie ne peut être expliquée par la seule hétérogénéité génétique du clone leucémique. Les altérations épigénétiques jouent manifestement un rôle important. Le rôle de facteurs extrinsèques issus du microenvironnement est plus obscur. La niche hématopoïétique est le siège d’interactions entre cellules. Deux schémas non-exclusifs d’altération primaire ou secondaire de la niche sont proposés. Le premier implique que l’émergence d’un clone hématopoïétique modifie son environnement. Le second postule que le premier évènement dans l’émergence d’une hémopathie clonale est une altération de l’environnement. Mon travail de thèse a étudié les altérations du microenvironnement médullaire chez les patients et leur impact sur la physiopathologie de la maladie selon 2 axes: 1) la mise au point d’un modèle murin de reconstitution de la niche hématopoïetique humaine et 2) la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses des patients. Dans une première partie, j’ai transposé un modèle rapporté en 2016 à l’étude de la LMMC. Ce modèle de greffe de cellules médullaires humaines chez la souris immunodéprimée s’est avéré difficilement reproductible. Dans la seconde partie, j’ai analysé les cellules souches mésenchymateuses de patients atteints de LMMC. J’ai identifié la production excessive d’IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2), conséquence probable d’une dérégulation épigénétique. Le séquençage des CSM à l’échelle unicellulaire a révélé une restriction de l’hétérogénéité de ces cellules dont une fraction seulement produit IGFBP2. Finalement, j’ai montré qu’IGFBP2 favorise la différenciation des progéni-teurs myéloïdes vers la lignée monocytaire. IGFBP2 pourrait donc contribuer à amplifier la monocytose caractéristique de cette maladie.En conclusion, la LMMC s’accompagne de modifications des cellules de la niche hématopoÏétique dont certaines produisent des quantités excessive d’IGFBP2. La recherche de l’origine de ce dérèglement et de son importance dans la progression de la maladie permettra d’évaluer l’intérêt potentiel d’une neutralisation de cette cytokine à des fins thérapeutiques. / Chronic myelomonocytic leukemia (CMML, is a rare myeloid hemopathy of the elderly. Clinical, genetic and molecular characteristics of the disease are well-known. The highly heterogeneous expression of the disease can’t be solely explained by genetic heterogeneity of the leukemic clone. Epigenetic alterations obviously play an important role. However, the role of extrinsic factors from the medullar microenvironment in CMML physiopathology is still poorly understood. The hematopoietic niche hosts a lot of bi-directionnal interactions between cells. Two non-exclusive schemes of primary and secondary alterations of the niche can be proposed. First postulate implies that the emergence of a hematopoietic clone alters its environment. The second one supposes that the first event causing the emergence of a clonal hemopathy is an alteration of the environment. My PhD work consisted of studying medullar alterations in patients and their impact on CMML physiopathology upon 2 axes: 1) to set up a murine model of human hematopoietic niche reconstitution 2) to caracterise mesenchymal stem cells from CMML patient ex vivo. During the first part of my PhD, I adapted a model published in 2016 to CMML. This model of human MSC graft in immunodeficient mice proved to be hardly reproducible. During the second part, I analysed of CMML patients MSC. I identified an excessive production of IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2) probably secondary to an epigenetic disregulation. Single cell RNA sequencing revealed a restriction of MSC heterogeneity of which only a fraction produces IGFBP2. Finally, I showed that IGFBP2 favors myeloid progenitors differenciation towards monocytic lineage. IGFBP2 could therefore contribute to the amplification of CMML characteristic monocytosis.To conclude, CMML goes along with modifications of hematopoietic niche cells, some of which produce excessive amounts of IGFBP2. Investigation on the origin of this alteration and its significance in disease progression should allow to evaluate the potential interest of its neutralization for therapeutic strategies.

La mégakaryopoïèse est un processus complexe, qui prend naissance à partir des cellules souches hématopoïétiques (HSC). Ces dernières se différencient par étapes successives en mégakaryocytes (MKs) qui, suite à leur maturation, libèrent les plaquettes. Afin de modéliser le sort des HSCs lors de la mégakaryopoïèse en culture, un nouveau modèle mathématique a été développé, basé sur un programme de différenciation tridimensionnelle (3-D) où chaque sous-population est représentée par un compartiment. Dans le but d’évaluer la prolifération, la différenciation des MKs immatures puis matures, la cinétique de mort cellulaire ainsi que le nombre de plaquettes produites, à partir des cellules de sang de cordon (CB) ombilical enrichies en CD34+, un ensemble d'équations différentielles a été déployé. Les cellules CD34+ ont été placées en culture dans un milieu optimisé pour la différenciation mégakaryocytaire. Les paramètres cinétiques ont été estimés pour deux températures d'incubation (37°C versus 39°C). Les résultats des régressions ont été validés par l'évaluation de l'estimabilité des paramètres, en utilisant des analyses de sensibilité locale et globale, puis la détermination d'un intervalle de confiance. Ceux-ci ont été comparés par le biais de tests statistiques et d’analyses en composante principale (ACP). Le modèle proposé pourrait permettre de mieux comprendre les phénomènes complexes observés. Les MKs sont uniques parmi les cellules hématopoïétiques, étant les seules à devenir polyploïdes au cours de leur développement par l’entremise de l’endomitose, un processus mitotique qui se termine prématurément durant la cytocinèse. Pour obtenir une image plus complète et exhaustive de la mégacaryopoïèse, une approche d’imagerie cellulaire à grand champ et à long terme a été développée permettant de suivre individuellement l'évolution des HSCs lors de leur différenciation ex vivo. Cela a permis de démontrer que les MKs polyploïdes sont encore capables de se diviser et de produire des cellules filles polyploïdes, et que ce processus est plus fréquent chez les MKs issues de CB que de moelle osseuse d'adulte. De plus, le processus de formation des proplaquettes semble également réversible. Les phénomènes énoncés plus haut étaient inversement proportionnels au niveau de ploïdie des MKs. En conclusion, cette étude a dévoilé de nouvelles propriétés jusqu’ici inconnues des MKs. / Megakaryopoiesis is a complex process, which is initiated with the proliferation and the differentiation of hematopoietic stem cells (HSC) into megakaryocytes (MK), followed by the maturation of MK and ended by platelet release. To describe the fates of HSC during ex vivo megakaryopoiesis, a new mathematical model was developed based on a 3-dimensional kinetic developmental program. To address this, a set of differential equations was applied to analyze the proliferation, differentiation and death kinetic rates of purified cord blood (CB)-CD34+ cells, immature and mature MKs, as well as platelet number and productivity. CB-CD34+ cells were placed in culture optimized for MK differentiation. The kinetic parameters were estimated for two incubation temperatures (37°C vs. 39°C). The regression results have been validated by assessing the parameter identifiability using local and global sensitivity analyses and confidence intervals, and compared using statistical tests and principal component analysis (PCA). Furthermore, PCA was applied on the solution matrix to construct a simplified MK differentiation pathway model, and to reveal dependencies among the model parameters. The proposed model provides insight into phenomena that would be otherwise difficult to interpret. MKs are unique among mammalian marrow cells as they polyploidize during their natural development. It is universally accepted that MK becomes polyploid by repeatedly deviating from normal cell cycling, where it ceases to complete cytokinesis and divide. To challenge this long-standing hypothesis and to obtain a more comprehensive picture of megakaryopoiesis, a long-term and large-field live cell imaging approach of in vitro MK culture was developed. Using CB- and bone marrow (BM)-CD34+ as starting cells, the direct observation of cells undergoing differentiation and maturation over a 5-day culture period is reported for the first time. Herein, direct visual proof that polyploid MKs can complete cytokinesis during its normal development is presented. This phenomenon was found not restricted to CB- as the BM-derived polyploid MK also underwent division. However the latter showed significantly lower proliferation rate. This new finding explains in part the unresolved issue of low ploidy levels observed in CB-MK and contests the notion that polyploid MKs do not divide.

De l’organisme unicellulaire aux organismes multicellulaires complexes, la spécification cellulaires est un aspect fondamental de la biologie de l'adaptation et du développement. Les cellules souches pluripotentes (CSP) telles que les embryonnaires (CSE) fournissent un modèle approprié pour étudier les mécanismes de régulation et la spécification du sort des cellules chez les mammifères. Les ESC de souris sont connus pour être de nature hétérogènes et sont rapportées comme étant composées de multiples états de cellules souches ressemblant à des stades distincts du développement embryonnaire précoce, tels que totipotentes, pluripotentes, préparées et endoderme primitif. Malgré des études approfondies sur les CSE, les mécanismes moléculaires régulant leur hétérogénéité et l'état totipotent, en particulier, ne sont pas bien compris. Le travail présenté dans cette thèse utilise les CSE de souris comme modèle intéressant pour déterminer les mécanismes de signalisation et de régulation génique qui conduisent à l'hétérogénéité cellulaire et l'état cellulaire totipotent des CSE. Dans une première étude, nous avons utilisé la cytométrie en flux de masse pour analyser simultanément de multiples protéines régulatrices des cellules souches, en mettant l'accent sur les facteurs de transcription clés, les protéines de signalisation et les modificateurs de la chromatine qui régissent les CSE de souris. Les données de cytométrie en flux de masse ont révélé des variations dans les niveaux protéiques cellulaires individuels des régulateurs des cellules souches et ont souligné la vaste coactivation des voies de signalisation cellulaire dans des conditions de culture définies des CSE. De plus, l'application de la cytométrie en flux de masse a facilité l'identification d'états cellulaires distincts et de leurs caractéristiques moléculaires au sein des CSE, offrant des aperçus de leurs variations selon différentes conditions de culture, validant ainsi la présence d'hétérogénéité cellulaire dans les CSE de souris. Dans une deuxième étude, nous avons identifié la signalisation du facteur de croissance des os (BMP) comme inducteur de l'état totipotent. Nous avons également constaté que le rôle du BMP dans la totipotence est réprimé par la coactivation des voies FGF, NODAL et WNT. En inhibant ces voies coactivées, nous démontrons l'amélioration de l'induction de cellules totipotentes et la suppression des états préparés et d'endoderme primitif. Nous avons validé les changements d'état cellulaire au niveau cellulaire unique grâce à un séquençage d'ARNm à cellule unique. De plus, nous avons également démontré que les cellules totipotentes reprogrammées in vitro imitent les cellules totipotentes de l'embryon préimplantatoire avec la capacité de générer des blastocystes in vitro (Blastoïdes) et de s'intégrer dans les lignées embryonnaires et extra-embryonnaires chez la souris. Ensemble, ces résultats ont révélé les mécanismes de signalisation du BMP pour réguler à la fois l'état totipotent et l'hétérogénéité des CSE. Pour la troisième étude, nous avons utilisé les observations clés de nos données de cytométrie en flux de masse (première étude) pour évaluer le rôle des protéines régulatrices clés pour promouvoir l'état cellulaire totipotent. Ici, nous démontrons que NACC1, un régulateur transcriptionnel des CSE, agit également comme un régulateur important des cellules totipotentes. Après avoir identifié NACC1 comme un régulateur potentiel à partir de données de protéines cellulaires à cellule unique et de transcriptome en vrac, nous avons validé sa fonction en utilisant une suppression médiée par CRISPR en combinaison avec des conditions de reprogrammation cellulaire pluripotente à totipotente. Ensuite, nous avons intégré une combinaison d'approches génomiques pour étudier les changements au niveau du système dépendants de NACC1 dans le transcriptome, l'accessibilité à la chromatine et la liaison à l'ADN génomique. Ensemble, ces données ont révélé que NACC1 induit à la fois les programmes d'expression génique codant et de gènes de rétrotransposons pour promouvoir l'état cellulaire totipotent. Enfin, nous avons montré que NACC1 régule les éléments rétrotransposables MERVL-int et MT2_Mm pour moduler l'expression des gènes codants de l'état totipotent. En conclusion, cette thèse révèle la nature hétérogène des CSE de souris au niveau protéique à cellule unique, élucide le rôle significatif et les mécanismes de la voie de signalisation BMP pour réguler l'état totipotent et l'hétérogénéité des CSE, et dévoile les mécanismes de régulation génique dépendants de NACC1 pour promouvoir l'état totipotent. Ces résultats ouvrent la voie à des études ultérieures visant à comprendre la spécification de l'état des cellules souches et leur transition via la modulation des voies de signalisation / facteurs de transcription. De plus, ces mécanismes peuvent réguler l'état cellulaire totipotent chez l'homme, éclairant l'hétérogénéité cellulaire dans les CSE humaines et dans des contextes pathologiques, tels que le cancer. / From unicellular entities to intricate multicellular organisms, the omnipresent process of cell fate specification is a fundamental aspect of adaptation and developmental biology. Pluripotent stem cells (PSCs) such as embryonic stem cells (ESCs) provide a suitable model to study the regulatory mechanisms and cell fate specification in mammals. Intriguingly, mouse ESCs are known to be heterogenous in nature and are reported to consist of multiple stem cell states resembling distinct stages of early embryogenesis, such as totipotent, pluripotent, primed, and primitive endoderm. Despite extensive study of ESCs, the molecular mechanisms regulating their heterogeneity and the totipotent state in particular are not well understood. The work presented in this thesis utilizes mouse ESCs as an attractive model to delineate the signaling and gene regulatory mechanisms driving the cellular heterogeneity and the totipotent cell state of ESCs. In the first study, we utilized mass cytometry (cytometry by time of flight) to concurrently analyse multiple stem cell regulatory proteins, focusing on key transcription factors, signaling proteins, and chromatin modifiers that govern mouse ESCs. Mass cytometry data revealed variations in the single-cell protein levels of stem cell regulators and highlighted the extensive cross-activation of cell signaling pathways across defined culture conditions of ESCs. Furthermore, the application of mass cytometry facilitated the identification of distinct cell states and their molecular features within ESCs, offering insights into their variations across different culture conditions, thereby validating the presence of cellular heterogeneity in mouse ESCs. In the second study, we identified bone morphogenetic protein (BMP) signaling as an inducer of the totipotent state. We also found that, BMP’s role for totipotency is repressed by the cross-activation of FGF, NODAL, and WNT pathways. Through rational inhibition of these cross-activated pathways, we demonstrate the enhancement in the induction of totipotent cells and suppression of primed and primitive endoderm states. We validated the cell state changes at the single-cell level through single-cell mRNA sequencing. Furthermore, we also demonstrate that the in-vitro reprogrammed totipotent cells mimic the totipotent cells of preimplantation embryo with the potency to generate in-vitro blastocyst (Blastoids) and to integrate into both embryonic and extra-embryonic lineages in the mice. Together these results revealed BMP signaling mechanisms to regulate both the totipotent state and the heterogeneity of ESCs. For our third study, we utilized the key observations from our mass cytometry data (first study) to evaluate the role of key regulatory proteins to promote the totipotent cell state. Here, we demonstrate that NACC1, a transcriptional regulator of ESCs, also acts as an important regulator of totipotent cells. Following identification of NACC1 as a potential regulator from both single-cell protein and bulk transcriptome data, we validated its function using CRISPR-mediated knock-out in combination with pluripotent-to-totipotent cell reprogramming conditions. Next, we integrated a combination of genomic approaches to study the NACC1 dependent system’s level changes in the transcriptome, chromatin accessibility and genomic DNA binding. Together, these data revealed that NACC1 induces both the coding gene and retrotransposon gene expression programs to promote the totipotent cell state. Finally, we showed that NACC1 regulates MERVL-int and MT2_Mm retrotransposable elements to modulate the expression of coding genes of the totipotent state. In conclusion, this thesis reveals the heterogeneous nature of mouse ESCs at the single-cell protein level, elucidates the significant role and mechanisms of BMP signaling pathway to regulate the totipotent state and ESC heterogeneity, and unveils NACC1 dependent gene regulatory mechanisms to promote the totipotent state. These findings open the door for subsequent studies aimed at understanding stem cell state specification and their transition occurring via modulation of signaling pathways / transcription factors. Moreover, these mechanisms may regulate the totipotent cell state in humans, shedding light on the cellular heterogeneity in human ESCs and in disease contexts, such as cancer.