Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6245.pdf: 6395317 bytes, checksum: 57fdbedfc4e7e5aa206307ff7cb991be (MD5) Previous issue date: 2012-07-13 / Financiadora de Estudos e Projetos / Leishmaniasis, Chagas disease and malaria are neglected parasitic diseases responsible for high mortality in tropical low-income countries. Due to the lack of vaccines and of safe, effective and affordable treatments, there is an urgent need to reinforce the existing therapeutic arsenal against these diseases. Many potential drugs have been investigated for these diseases, including ruthenium complexes. Ruthenium complexes are very appreciated in medicinal chemistry due to the tendency to be selective to bind biomolecules, which partly accounts for the low toxicity. Thus, in this work were synthesized and characterized ruthenium complexes with ligands that have antiparasitic activity recognized as lapachol and chloroquine diphosphate, bioactive ligands such as nitric oxide and amino acids. The compounds were characterized by elemental analysis techniques, absorption spectroscopy ultraviolet visible, infrared, nuclear magnetic resonance 31P {1H}, 13C, 1H and COSY, paramagnetic resonance spectroscopy and X-ray diffraction.The complexes showed promising results against diseases evaluated (malaria, leishmaniasis, Chagas disease and tuberculosis) showing that coordination leads to the synthesis of complexes most active against the parasites and less toxicity in healthy cells. / As doenças tropicais negligenciadas causam um impacto devastador sobre, principalmente, a população mais carente do globo, sobre tudo na Àfrica onde a maior parte da população vive em condições de extrema pobreza. Muitos trabalhos científicos engajados na busca de novos fármacos para estas doenças vêem sendo apresentados, porém estes conhecimentos não conseguem se reverter em novas ferramentas terapêuticas. Diante de tais considerações a busca por novas terapias que sejam eficientes contra as doenças negligenciadas é de grande importância. Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados complexos de rutênio com ligantes que apresentam atividade antiparasitária reconhecida como lapachol e cloroquina difosfato, além de ligantes bioativos como óxido nítrico e aminoácidos. Os complexos foram caracterizados pelas técnicas de análise elementar, espectroscopia de absorção na região do ultravioleta visível, infravermelho, ressonância magnética nuclear de 31P{1H}, 13C, 1H e COSY, espectroscopia de ressonância paramagnética e difração de raios X (quando obtido monocristal dos respectivos complexos). Os complexos obtidos apresentaram resultados promissores frente às doenças avaliadas (malária, leishmaniose, doença de Chagas e tuberculose) mostrando que a coordenação levou à obtenção de complexos mais ativos frente aos parasitos e menos tóxicos frente às células normais.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseARPA.pdf: 8348697 bytes, checksum: 2d133cc93364ad78e1934fb8f60c7968 (MD5) Previous issue date: 2004-02-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work involved the bioassay-guided study of Almeidea coerulea, A. rubra, Conchocarpus heterophyllus, Galipea carinata (Rutaceae), and Trichilia ramalhoi (Meliaceae). The bioassays were carried out with T. cruzi GAPDH and L. tarentolae APRT enzymes, and trypomastigote forms of T. cruzi as model assays. The results obtained with extracts and fractions showed that selected plants are promising source for the search of antiprotozoal compounds. Chemical investigation of active fractions (or extracts) allowed the isolation of 30 substances. Among them, 6 are described for the first time: an eudesmane sesquiterpene, pyranoflavones, a tetrahydrofuroquinoline alkaloid, an indolopyridoquinazoline alkaloid, an anthranilic acid derivative, and 1,5-diphenyl-1-pentanone; and 24 substances have already been described in the literature: β-sitosterol and stigmasterol, sitostenone, β-sitosteryl benzoate, lupeol, lupenone, flavone, 7-methoxyflavone, 5-hydroxyflavone, dictamine, kokusagine, skimmianine, δ-fagarine, isokokusagine, isoskimmianine, isodutaduprine, haplotusine, 1-methyl-2-phenyl-4-quinolone, arborinine, scoparone, scopoletin, marmesine, paprazine, N-transferuloyltyramine, and siringic acid. Among these substances, furoquinolone alkaloids isokokusagine and isoskimmianine were actives on the inhibition of APRT enzyme; marmesine was active on GAPDH enzyme; and haplotusine and the 1-methyl-2-phenyl-4-quinolone alkaloid showed significant trypanocidal activities. The biological results showed that a systematic investigation of active chemical classes is needed for determination of structure-activity relationship and obtaining more active substances, that could be used as targets for the development of new antichagasic and antileishmaniasis drugs. / Esse trabalho envolveu o estudo fitoquímico de Almeidea coerulea, A. rubra, Conchocarpus heterophyllus, Galipea carinata (Rutaceae) e Trichilia ramalhoi (Meliaceae), biomonitorado através de três modelos biológicos: enzimas GAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae; e ensaios in vitro nas formas tripomastigotas de T. cruzi. Os testes biológicos de extratos e frações mostraram que as plantas selecionadas são promissoras na procura de compostos antiparasitários. O estudo químico das frações (ou extratos) ativas permitiu o isolamento de 30 substâncias, sendo 6 inéditas: sesquiterpeno eudesmano, piranoflavonas, alcalóide tetraidrofuroquinolínico, alcalóide indolopiridoquinazolínico, derivado do ácido antranílico e 1,5-difenil-1-pentanona; e 24 já descritas na literatura: β- sitosterol e estigmasterol, sitostenona, benzoato de β-sitosterila, lupeol, lupenona, flavona, 7-etoxiflavona, 5-hidroxiflavona, dictamina, kokusagina, esquimianina, δ-fagarina, isokokusagina, isoesquimianina, isodutaduprina, haplotusina, alcalóide 2-fenil-1-metil-4-quinolona, arborinina, escoparona, escopoletina, marmesina, paprazina, N-trans-feruloitiramina e ácido siríngico. Dentre essas substâncias, os alcalóides furoquinolônicos isokokusagina e isoesquimianina mostraram ser inibidores potentes da enzima APRT; a cumarina marmesina ocasionou uma inibição considerável da atividade da enzima GAPDH; e os alcalóides haplotusina e 2-fenil-1-metil-4-quinolona, e o triterpeno lupeol apresentaram atividades tripanocidas significativas. Os resultados biológicos indicaram a necessidade de um estudo sistemático posterior das classes dos compostos ativos, para a determinação da relação estrutura-atividade e, desta forma, de substâncias mais ativas, que possam ser utilizadas como protótipos no desenvolvimento de novos quimioprofiláticos e/ou quimioterápicos para a doença de Chagas e leishmanioses.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1979.pdf: 2208972 bytes, checksum: e233199cf0f55587baf4e545b627b83a (MD5) Previous issue date: 2008-08-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work reports the quantification of NADH formed by an immobilized enzyme reactor (IMER) of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of T. cruzi using multidimensional high-performance liquid chromatography. For this, The IMER was used in the first dimension while an analytical C8 column was used in the second dimension. The conditions of the pre-treatment of the fused silica capillary tubes and the covalent immobilization of the enzyme into the capillary were successfully optimized, resulting in increased enzymatic activity and stability. Kinetic studies for the T. cruzi GAPDH-IMER were carried out to verify the influence of the immobilization over the enzyme affinity for the substrate and cofactor. The kinetic results for the IMERs of human and parasite GAPDH enzymes were compared to those obtained with the enzymes in solution, and showed that the covalent immobilization method used affected mainly the affinity of the human enzyme for the substrate. The human and parasite GAPDH-IMERs were employed for the ligand screening. The ligands recognized by the IMERs were the same identified by the enzymes in solution, showing that the immobilized enzymes kept the ability of recognizing the activity compounds modulators. The IMERs demonstrated to be a useful tool also for inhibitors binding reversibility characterization. In view of the high costs and difficulties involved on enzyme purification, the methods described in this work represents a valuable way of preserving enzyme activity and carrying out a variety of biochemical experiments. / Este trabalho descreve a quantificação do NADH formado pela reação do biorreator da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de T. cruzi usando cromatografia liquida de alta eficiência multidimensional. Para isto, o biorreator foi usado na primeira dimensão e uma coluna analítica C8 na segunda dimensão. As etapas de pré-tratamento dos capilares de s匀ica fundida e da imobilização covalente da enzima, neste suporte, foram otimizadas com sucesso, resultando no aumento da atividade e da estabilidade da enzima. Os estudos cin騁icos para a enzima GAPDH-Tc imobilizada foram realizados para verificar se o método de imobilização empregado afetou a afinidade da enzima pelo substrato ou cofator. Os resultados obtidos com os biorreatores das enzimas GAPDH-Tc e humana foram comparados 瀲ueles obtidos com as enzimas em solução, e evidenciaram que o método de imobilização covalente afetou principalmente a afinidade da enzima humana pelo substrato. Os biorreatores das enzimas do parasita e humana foram empregados para a triagem de ligantes. Os ligantes reconhecidos pelos biorreatores foram os mesmos identificados pelas enzimas em solução, evidenciando que a enzima imobilizada reteve a capacidade de reconhecer os compostos capazes de modular a atividade enzim疸ica. Os biorreatores mostraram-se uma ferramenta 偀il na caracterização dos inibidores quanto ・reversibilidade da ligação. Considerando os altos custos e as dificuldades envolvidas na purificação de enzimas, os procedimentos descritos neste trabalho representam um valioso método para preservar a atividade enzim疸ica e para a realização de uma variedade de ensaios bioquímicos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3759.pdf: 3526304 bytes, checksum: 5340c2ab2de2d5301e6ee064d889911f (MD5) Previous issue date: 2011-08-11 / Universidade Federal de Sao Carlos / Chagas disease is a tropical neglected illness; nearly 10 million people are infected, in 2008 it was responsible for the deaths of about 10 thousand people. At present, only two medicines (benznidazol and nifurtimox) are available to treat this disease and they lack of efficacy/safety in chronic phase. This scenario is changing due to advances in the search for new trypanocidal agents. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), a glycolytic enzyme of Trypanosoma cruzi appears as a suitable target for drug discovery. In the present work, a kinetic study using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) were carried out to investigate the activity of eight NAD+ analogs against GAPDH. ITC was been used to measure the heat exchange during reactions making it a powerful tool of identification of bioactive compounds. Study compounds showed inhibitory activity on TcGAPDH enzyme and its homologous human GAPDH. The apparent inhibition constant values (Ki app) were in the range from 15,98 to 91,25 M describing competitive inhibition mechanisms. Important steps in medicinal chemistry maybe biochemical followed by cell-based assays were, for instance, Saccharomyces cerevisiae could be used as a model to assess the cytotoxic activity of compounds. The technique used to study the action of chemical compounds in yeast was the fluorescence spectroscopy. Five out of eight compounds showed no activity against S. cerevisiae. This is a good indication that study compounds have low cytotoxicity, which makes them candidates for in vitro studies on the parasite. / A doença de Chagas e uma doença tropical negligenciada que afeta aproximadamente 10 milhões de indivíduos, no ano de 2008 foi responsável pela morte de cerca de 10 mil pessoas. Os tratamentos que existem atualmente são empregados apenas na fase aguda da doença, utilizando os fármacos benzonidazol e o nifurtimox, demonstrando ambos diversos efeitos indesejáveis. Apesar da existência de alguns estudos na área, não ha registro de nenhum novo fármaco para o tratamento da doença de Chagas. Dessa forma, a busca por novas moléculas bioativas para o tratamento desta doença e de fundamental importância. A enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Trypanosoma cruzi aparece como um alvo promissor para pesquisa de novos fármacos para doença de Chagas, uma vez que essa enzima participa da via glicolitica, que a principal via para obtenção de energia do parasito. Neste trabalho foram realizados ensaios de inibição utilizando uma classe de compostos contra a TcGAPDH. A técnica utilizada para o estudo dos compostos foi a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), que mede a troca de calor observada durante uma reação e vem sendo utilizada atualmente para a determinação de parâmetros termodinâmicos e cinéticos. Os compostos estudados apresentaram atividade inibitória frente a enzima TcGAPDH e sua homologa GAPDH de humanos. Foram estudados oito compostos análogos ao cofator NAD+. Os valores da constante de inibição aparente (Ki app) dos compostos estão no intervalo de 15,98 a 91,25 M com mecanismo de inibição competitivo. A descoberta e desenvolvimento de fármacos baseiam-se em sistemas modelos introduzidos no inicio dos projetos em química medicinal. A otimização in vitro usando ensaios bioquímicos e cultura de células representa uma opção viável no novo paradigma da química medicinal moderna. No caso dos estudos celulares, modelos são estudados para mimetizar as células humanas, especialmente com relação a atividade da GAPDH. Dessa forma, o Saccharomyces cerevisiae foi usado como modelo para que a atividade VII citotóxica dos compostos fosse detectada por espectroscopia de fluorescência. Cinco dos oito compostos não apresentaram atividade contra a levedura, sendo um bom indicativo que as moléculas apresentam baixa cito toxidade tornando-as candidatas para os estudos in vitro no parasito T.cruzi.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3869.pdf: 12129966 bytes, checksum: 7f17c5b063ae127e4d58be4e1f14b434 (MD5) Previous issue date: 2011-07-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Chagas disease, described in 1909 by the Brazilian sanitary physician, scientist and bacteriologist Dr. Carlos Chagas, is caused by the Trypanosomatid parasite Trypanosoma cruzi. Current treatments involve the use of drugs benznidazole and nifurtimox, which are effective only in the early stage of the disease (acute phase), but have severe side effects. The enzyme cruzain is a validated target for searching small molecules to act against Chagas disease. Cruzain inhibition has been studied for the discovery and development of new drugs. In this work, the planning strategy was based on molecular fragments, using a computational approach for selecting them. Using GRID/CPCA, important residues such as Ser207 and Asp69 were identified in an adjacent cavity to the S2 sub-site of the enzyme. These residues can take part on hydrogen-bond interactions and have not been explored in the search for inhibitors for this target. In addition, we identified patterns of molecular recognition of the enzyme, based on the structures deposited in the Protein Data Bank, which are co-crystallized with inhibitors at the site of the enzyme. These inhibitors were used to guide the search via SMARTS pattern to build a fragment database. Docking and molecular dynamics were used to select the fragments for an in vitro assay. Many fragments were acquired and tested against cruzain using the technique of fluorescence spectroscopy. One fragment (Nequimed147) showed activity, inhibiting the enzyme with IC50 equal to 2.39 mM, resulting in a ligand efficiency of 0.23 kcal mol-1 weight atom-1. Based on this fragment, new inhibitors were identified with IC50 between 1.25 and 4.29 mM. Their ligand efficiencies were in the range of 0.21 and 0.26 kcal mol-1 weight atom-1 whose molecular recognition features are suitable for the search of new enzyme inhibitors likely to bind the cavity near the S2 sub-site that has not been explored yet. / A Doença de Chagas, descrita em 1909 pelo médico sanitarista brasileiro Dr. Carlos Chagas, é causada pelo parasito tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi. Os tratamentos atuais consistem no uso dos fármacos benzonidazol e nifurtimox que são eficazes apenas no estágio inicial da doença (fase aguda), mas possuem efeitos colaterais severos. A enzima cruzaína constitui um alvo validado contra a doença de Chagas e sua inibição vem sendo estudada para o planejamento de fármacos. Neste trabalho a estratégia adotada foi o planejamento baseado em fragmentos moleculares, através de uma abordagem computacional para a seleção dos mesmos. Utilizando a técnica GRID/CPCA, foram identificados resíduos importantes, como Ser207 e Asp69, em uma região adjacente ao sub-sítio S2 da enzima. Estes resíduos são capazes de realizar interações do tipo ligação de hidrogênio e ainda não foram explorados na busca de inibidores para esse alvo. Além disso, foram identificados padrões de reconhecimento molecular da enzima, baseado nas estruturas depositadas no Protein Data Bank com inibidores cocristalizados no sítio da enzima, que foram utilizados para fazer uma busca guiada com a utilização de padrão SMARTS para construção de um banco de fragmentos. As técnicas de docagem e dinâmica molecular foram usadas para selecionar os fragmentos, os quais foram adquiridos para os ensaios in vitro. Vários fragmentos foram testados contra a enzima cruzaína utilizando a técnica de fluorimetria, sendo que um deles (Nequimed147) mostrou-se capaz de inibir a enzima com IC50 igual a 2,39 mM, resultando em uma eficiência do ligante de 0,23 kcal mol-1 átomo pesado-1. Baseado nesse fragmento, novos inibidores foram identificados com potência entre 1,25 e 4,29 mM e eficiência do ligante entre 0,21 e 0,26 kcal mol-1 átomo pesado-1, com características apropriadas para o reconhecimento molecular pela enzima cruzaína na região do sub-sítio S2.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-26Bitstream added on 2014-06-13T18:45:15Z : No. of bitstreams: 1 martins_gz_dr_arafcf.pdf: 1489447 bytes, checksum: 0af9b576dfb9149599192bc470b24ff5 (MD5) / Devido ao negligenciamento e ao aumento de números de casos das doenças microbianas e parasitárias no Brasil, o aprimoramento da investigação científica e tecnológica na área de plantas medicinais faz-se indispensável para à busca de novos produtos antimicrobianos e antiparasitários. A Solanum lycocarpum St. Hill. (Solanaceae) é uma planta medicinal tradicionalmente utilizada na forma de polvilho de lobeira como terapia complementar para o tratamento do Diabetes Mellitus, hipocolesterolêmico e na hipertensão. Os efeitos terapêuticos são atribuídos aos dois glicoalcaloides predominantes nas espécies do gênero Solanum, a solamargina e a solasonina. Em face ao exposto o objetivo desta pesquisa foi o isolamento de solasonina e solamargina de frutos maduros de S. lycocarpum e o screening de atividades antimicrobiana, antiparasitária, antioxidante e citotóxica do extrato etanólico 96 % bruto, frações e dos glicoalcaloides. O extrato etanólico 96 % bruto foi obtido por refluxo utilizando como solvente etanol 96 ºGL e seco sobre pressão reduzida. O isolamento dos glicoalcalóides foi realizado por meio de sequência de técnicas cromatográficas. Foram analisadas as atividades, antimicrobiana (E. faecalis, S. salivarius, S. sobrinus, S. mutans, S. mitis, S. sanguinis, L. casei, B. subtilis, P. aeruginosa, Salmonella enterican, E. faecalis, S. aureus, E. coli, C. albicans, A. niger, A. flavus e Fusarium sp.), antiparasitária (Giardia lamblia, Leishmania infantum, Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei), antioxidante e citotóxica. No processo de purificação foram obtidas 6 frações e nas sub-frações 2.5 e 2.7 foram isolados os glicoalcalóides solasonina (Rf = 0,46) e solamargina (Rf = 0,57), respectivamente. Apresentaram atividade parasitária para Giardia lamblia (extrato etanólico 96 % (v/v) bruto, fração etanólica 40 % (v/v) frações F1 e F2), Leishmania infantum... / The neglect and increased of the numbers of cases of microbial and parasitic diseases in Brazil and the improvement of scientific and technological research in the medicinal plants has contributed for the search of new antimicrobials and antiparasitic. The Solanum lycocarpum St. Hill. (Solanaceae) is a medicinal plant traditionally used as complementary therapy for the treatment of Diabetes Mellitus, hypocholesterolemic and hypertension. The therapeutic effects are attributed to the two predominant glycoalkaloids in Solanum species, the solamargine and the solasonina. In view of the above, the objective of this research was to isolate solasonina and solamargine of ripe fruits of S. lycocarpum and screening of antimicrobial, antiparasitic, antioxidant and cytotoxicity activities of crude extract 96% ethanol, fractions and glycoalkaloids. The crude extract 96% ethanol was obtained by reflux with as solvent ethanol 96 º GL and reduced pressure dried. The isolation of glycoalkaloids was performed by chromatographic techniques. We analyzed the activity, antimicrobial (E. faecalis, S. salivarius, S. sobrinus, S. mutans, S. mitis, S. sanguinis, L. casei, B. subtilis, P. aeruginosa, Salmonella enterican, E. faecalis, S. aureus, E. coli, C. albicans, A. niger, A. flavus and Fusarium sp.), antiparasitic (Giardia lamblia, Leishmania infantum, Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei), antioxidant and cytotoxicity. In the purification process were obtained six fractions and the in the sub-fractions 2.5 and 2.7 were isolated the glycoalkaloids, solasonina (Rf = 0.46) and solamargine (Rf = 0.57). Showed activity for parasite Giardia lamblia (crude extract 96% ethanol, ethanol fraction 40%, fractions F1 and F2), Leishmania infantum (crude extract 96% ethanol, ethanol fraction 40%, fractions F1, F2 and F3)... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-28T16:26:07Z No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / A doença de Chagas é considerada uma das principais endemias da América Latina, existindo cerca de oito milhões de pessoas infectadas com o Trypanosoma cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. A associação entre a transferência gênica lateral de minicírculos de kDNA do T. cruzi para o genoma hospedeiro e o surgimento de manifestações clínicas da doença de Chagas está descrita na literatura. Entretanto os mecanismos que levariam ao desenvolvimento das reações autoimunes ainda precisam ser elucidados. No presente estudo, desenvolveu-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) que permitiu a quantificação das integrações de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, confirmando, dessa forma, a transferência dos minicírculos ao genoma de célula hospedeira. Verificou-se que há um acúmulo das integrações ao longo do tempo em células J774.A1. À medida que ocorre a inserção dos minicírculos de kDNA no genoma hospedeiro, observa-se alteração da temperatura de dissociação das amostras, indicando mudança na composição ou no tamanho dos fragmentos integrados. De fato, a clonagem e o sequenciamento dos amplicons demonstrou o truncamento da região variável do kDNA. O Benznidazol é capaz de eliminar a infecção, porém não previne a integração e o acúmulo das sequências de kDNA. Já o AZT, droga inibidora de retrotransposição, mostra-se efetivo no controle dos eventos de integração. Os experimentos in vivo corroboraram os achados in vitro, demonstrando uma maior quantidade de integrações em animais que se encontravam na fase crônica da doença de Chagas. Outros estudos são necessários para determinar o papel do acúmulo de integrações de kDNA e a severidade das manifestações clínicas. Entretanto, o real significado de tais mutações não fica restrito à doença de Chagas, mas, sim, estende-se ao longo do processo da evolução, em que a aquisição de DNA exógeno ajudaria a impulsionar um fluxo genético introdutor de complexidade crescente às espécies. / Chagas' disease is considered a major endemic disease in Latin America, and there are approximately eight million people infected with Trypanosoma cruzi worldwide, especially in Latin America. The association between lateral gene transfer of T. cruzi kDNA minicircle into host genome and the onset of clinical manifestations of Chagas disease is described in the literature. However, the mechanisms that lead to autoimmune reactions are to need to be elucidated. In the present study, we have developed a protocol quantitative PCR (qPCR), which permitted quantitation of kDNA minicircle integrations T. cruzi into the host genome, confirming thus the transfer of the minicircle into the genome of the host J774.A1 cells. It was found that there is an accumulation of integrations over time J774.A1 cells. As kDNA insertions occur, there is change in melting curve, indicating change in composition or size of the integrated fragments. In fact, cloning and sequencing of amplicons showed loss of nucleotides in kDNA variable region. Benznidazole is able to eliminate the infection, but does not prevent the integration and accumulation of kDNA sequences. AZT, an inhibitory drug for retro transposition, shows to be effective in controlling integration events. In vivo experiments confirmed in vitro findings, showing a greater amount of integrations in animals that were in the chronic phase of Chagas disease. Further studies are needed to determine the role of kDNA accumulation in severity of clinical manifestations. However, the real significance of such date is not restricted to Chagas disease, but rather extends throughout the evolutionary process, where the acquisition of exogenous DNA would help boost a genetic flow introducing higher complexity to species.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:55Z : No. of bitstreams: 1 000864103.pdf: 4214125 bytes, checksum: 96b80eb0d58d2e5a5f75758824bad053 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A doença de Chagas, também conhecida como Tripanossomíase Americana, causada pelo parasita hemoflagelado Trypanosoma cruzi, é tipicamente endêmica em países das Américas Central e Latina, mas devido ao processo de migração, a doença já atinge outros países como Estados Unidos e alguns países europeus. Estima-se que haja aproximadamente 7 - 8 milhões de pessoas infectadas no mundo e mais de 25 milhões correm risco de infecção. Os fármacos aprovados para o tratamento da doença são o benznidazol e o nifurtimox, ambos ativos somente na fase aguda da doença. No Brasil, apenas o benznidazol está disponível na terapêutica. Neste sentido, o presente projeto propõe a obtenção de duas séries de compostos. A série 1 é constituída de sete derivados inéditos híbridos de furoxanos e primaquina. Já a série 2 constitui-se de seis derivados inéditos bioisósteros de nitrofural, substituindo o núcleo nitrofurânico pelo núcleo furoxânico. Os derivados furoxânicos apresentam a capacidade de doação de NO, propriedade anti-inflamatória e tem demonstrado atividade antiparasitária interessante. A primaquina é um fármaco antimalárico, que foi previamente avaliado e demonstrou potencial atividade tripanossomicida. Foram obtidos seis derivados furoxânicos intermediários e caracterizados por espectrometria de infravermelho (IV) e por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e seis compostos finais, sendo caracterizados por espectrometria de infravermelho (IV) e por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Os compostos finais obtidos foram avaliados quanto a atividade tripanossomicida em formas epimastigotas e amastigotas, a capacidade de doação de óxido nítrico e quanto a mutagenicidade in vivo. Os compostos apresentaram boa atividade tripanossomicida contra as formas epimastigotas e também se mostraram não mutagênicos no ensaio realizado. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, caused by the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi, is typically endemic in countries of Central and Latin America. However, due to the migration process, this disease has already reached other countries like the United States and some European countries. It is estimated that there are approximately 7 - 8 million people infected worldwide and more than 25 million are at risk of infection. The drugs approved for the treatment are benznidazole and nifurtimox, both active only in the acute phase of the disease. In Brazil, only benznidazole is available. Due to the above, this project proposes to obtain two series of compounds. The Series 1 consists of seven new compounds derived from furoxanos and primaquine. The second series consists of six new bioisosters of nitrofurazone, replacing the nitrofuran group with furoxan. Furoxans derivatives have the ability to donate NO, anti-inflammatory properties and have shown interesting anti-parasitic activity. Primaquine is an antimalarial drug, which was previously demonstrated to have potential trypanocidal activity. Six furoxans intermediates and six finals derivatives were synthesized and characterized by infrared spectrometry (IR) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Was evaluated the trypanocidal activity against epimastigote form of T. cruzi, the capability of NO donation and the mutagenicity in an in vivo assay. They presented good activity against epimastigote forms of parasite and show no mutagenicity in the in vivo assay.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-30. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:58Z : No. of bitstreams: 1 000863716.pdf: 3896142 bytes, checksum: 956d75511f2ff2d224cbafdf08facf84 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Animais silvestres são importantes fontes de infecção de leishmanioses e doença de Chagas, para espécies domésticas e o homem. A PCR com emprego de iniciadores da região ITS1 associando-se clonagem e seqüenciamento de DNA alvo permite caracterizar espécies parasitas. Pelo uso de imunorreagentes específicos também possibilitam a investigação da infecção natural entre diferentes espécies de animais silvestres para ambas enfermidades. Foram avaliados isolados flagelares em meio LIT (hemocultura) de 103 animais procedentes do Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira/SP e 118 amostras de soros. Em ensaios imunoenzimáticos utilizaram-se as proteínas recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi e rK39 de Leishmania infantum. Conjugados espécie-específicos foram produzidos para diferentes espécies e empregados no teste de ELISA indireto e a proteína A conjugada foi avaliada para testes sorológicos com emprego da rK39. Soros de cães reagentes para leishmaniose visceral e de humanos para doença de Chagas foram testados para verificar a reatividade contra estas proteínas. Observou-se na hemocultura, flagelados para as seguintes espécies de vida livre: cotia, gambá e tatu-galinha; espécie em cativeiro: bugio-preto. Produtos foram amplificados pela PCR (585 pb) a partir de hemocultura em animais de vida livre e de um animal em cativeiro (650 pb) em amostra de sangue total. Os amplificados foram inseridos em vetor de clonagem e sequenciados resultando-se em 97% de similaridade com T. cruzi para gambá e cotia (acesso nº: AF362825.1) e tatu-galinha (acesso nº: GQ258720.1) com 98%. No isolado de bugio-preto houve 90% de similaridade com T. minasense (acesso nº: AB362411.1). Estes resultados apresentam o primeiro relato destas espécies parasitárias de importância epidemiológica na área de estudo e demonstraram vantagem ao associar-se a hemocultura às técnicas moleculares para caracterização de... / Wild animals are important sources of infection of leishmaniasis and Chagas disease to domestic animals and humans. The employment of PCR with ITS1 primers plus cloning and sequencing target DNA allows to characterize parasitic species. By using specific immunoreagents also enable investigation of natural infection between different species of wild animals for both diseases. Flagellate isolates in LIT medium (blood culture) were assessed of 103 animals coming from the Wildlife Conservation Center of Ilha Solteira -SP and 118 serum samples. In immunoassays, recombinant proteins CRA and FRA fromTrypanosoma cruzi and rK39 from Leishmania infantum were used. Species -specific conjugates were produced for different animal species and used in indirect ELISA and the protein A conjugate was evaluated for serological tests with use of rK39. Sera from dogs reagents for visceral leishmaniasis and for humans reagents for Chagas disease were tested for reactivity against these proteins. Flagellate protozoa were observed in LIT culture medium, at the following free-living species: common agouti (D. agouti), white-eared opossum (D. albiventris) and nine-banded armadillo (D. novemcinctus); and from a captive black howler monkey (A. caraya). Products were amplified by PCR (585bp) from blood culture in wild animals and from an animal in captivity (650bp) in whole blood sample. The amplified products were inserted into cloning vector and sequenced resulting in 97% similarity with T. cruzi to white-eared opossum an common agouti (acess number: AF 362825.1) and 98% to nine-banded armadillo (acess number: GQ 258720.1). The isolated from black howler monkey was 90% similar to T. minasense (acess number: AB 362411.1). The results present the first report of these parasitic species of epidemiological importance in the studied area and demonstrated advantage in the association of blood culture to molecular techniques to characterize flagellates. For ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-05Bitstream added on 2014-06-13T20:59:18Z : No. of bitstreams: 1 melo_mff_me_arafcf.pdf: 1115008 bytes, checksum: 9a5a596fd14f6e615ac5cc20ccd8fe88 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A doença de Chagas representa um dos mais sérios problemas médico-sanitários da América Latina. Nos 21 países endêmicos, estima-se que 18 a 20 milhões de pessoas estejam infectadas e cem milhões estão sob risco. No Brasil apenas o benznidazol está disponível para o tratamento apresentando alta incidência de efeitos adversos e ineficácia na fase crônica da doença. O desenvolvimento de fármacos mais eficazes e com menor toxicidade contra a doença de Chagas é necessário, e para tal é importante o conhecimento dos alvos terapêuticos para o planejamento racional por novos compostos. Estudos demostraram que a tripanotiona redutase (TR) é a enzima chave do metabolismo anti-oxidativo do T. cruzi. Os nitrofuranos atuam como substratos da TR e são também efetivos inibidores enzimáticos da redução do tripanotiona dissulfeto. Entre os compostos nitrofurânicos, o nitrofural apresentou atividade contra T. cruzi, mas alta toxicidade por via oral e severos efeitos adversos. A latenciação de fármacos é um dos métodos de modificação molecular que tem como objetivo melhorar as características de fármacos protótipos. Sabendo disto, Chung (1996) sintetizou uma série de pró-fármacos recíprocos seletivos de nitrofural e primaquina, culminando na obtenção do derivado hidroximetilnitrofural (NFOH). Este se mostrou mais ativo de todos os derivados sintetizados, tanto em formas amastigotas quanto em tripomastigotas nos ensaios in vitro contra T. cruzi. Os compostos que possuem grupos nitro na sua molécula geralmente apresentam atividade mutagênica, estudos indicaram que a latenciação do nitrofural em NFOH foi capaz de diminuir a atividade mutagênica em aproximadamente 4 vezes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi iniciar os estudos de toxicidade do derivado... . / The Chagas' disease represents one of the most serious sanitary medical problems of Latin America. In the 21 endemic countries, it is estimated that 18 to 20 million people are infected and 100 million are under risk. Only one drug is available in Brazilian market: benznidazole, which shows high side effects and is ineffective in the chronic phase of the disease. The development of more efficient drugs with lower toxicity against the Chagas disease is necessary and for it, it is important the knowledge of therapeutic targets for the design of new compounds. Studies showed that trypanothione reductase (TR) is a key enzyme of the antioxidant metabolism of T. cruzi. Nitrofurans act as substrates of TR and are also effective enzymatic inhibitors of the reduction of trypanothione disulfide. Among the nitrofurans conpounds, nitrofurazone presented activity against T cruzi, but showed high toxicity by oral route and severe side effects. Latentiation is one process of molecular modification, which has the purpose to improve pharmaceutical and physical-chemical properties and decrease drug toxicity. In this way, Chung (1996) has synthesized the prodrug hydroxymethylnitrofurazone (NFOH), showing high activity in amastigotes forms in vitro assay against T. cruzi. Nitrocompounds generally presents mutagenic activitys. Studies suggested that the latentiantion of nitrofurazone giving NFOH was able to reduce toxicity activity in four times. According to this, the purpose of this work was to accomplish toxicity studies of the derivative compound. The results obtained in the tests acute toxicity in mice and rate suggested a lower toxicity of NFOH, obtaining a median lethal dose in relation to NF...(Complete abstract, click electronic address below).