Orientador: Chung Man Chin / Coorientador: Jean Leandro dos Santos / Banca: Carlota de Oliveira Rangel Yagui / Banca: Gustavo Henrique Goulart Trossini / Banca: Adelia Amelia de Almeida / Banca: João Aristeu da Rosa / Resumo: Há mais de um século de sua descrição, a doença de Chagas continua sendo um dos maiores problemas de saúde pública. Resultante da infecção pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, a doença é endêmica nos 21 países da América Latina e estima-se que 10 milhões de pessoas estejam infectadas e aproximadamente 100 milhões estão sob o risco de contaminação. Apenas dois fármacos são disponíveis para tratamento da doença, nifurtimox e benznidazol. Ambos são ativos somente na fase aguda da doença, além de causarem efeitos colaterais graves. No Brasil apenas o benznidazol é comercializado. Neste sentido, a desenvolvimento de fármacos tripanossomicidas é de extrema importância. Estudos mostraram que derivados nitrofurânicos inibem a tripanotiona redutase, considerada enzima chave do metabolismo antioxidativo do T. cruzi. Pesquisas com o hidroximetilnitrofural (NFOH) tem demonstrado maior atividade in vitro e in vivo contra T. cruzi com menor toxicidade quando comparado ao fármaco matriz, nitrofural. Um amplo espectro de atividades biológicas tem sido relatada para compostos furoxânicos (N-óxido-1,2,5-oxadiazol) e benzofuroxânicos (N-óxido-benzo[1,2-c]1,2,5-oxadiazol), sendo assim, foi obtida uma série de derivados isósteros de nitrofural, substituindo o anel nitrofurano pelos respectivos furoxanos e benzofuroxanos. Os compostos obtidos foram avaliados quanto à atividade tripanossomicida in vitro em formas epimastigotas e amastigotas de T. cruzi, capacidade de doação de óxido nítrico e mutagenicidade in vivo. Foram sintetizados, identificados e caracterizados oito compostos. Os derivados benzofuroxânicos (compostos 20 e 21) foram os mais ativos contra as formas epimastigotas de T. cruzi, entretanto no ensaio contra as formas amastigotas, sete apresentaram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: For more than a century of his description, Chagas disease remains a major public health problems. Resulting from infection flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, is endemic in 21 Latin American countries and it is estimated that 10 million people are infected and about 100 million are at risk of contamination. Only two drugs are available for treating the disease, nifurtimox and benznidazole. Both are active only during the acute phase of the disease, and cause serious side effects. In Brazil only benznidazole is marketed. In this sense, the development of drugs trypanosomicide is extremely important. Studies demonstrated that nitrofurans derivatives inhibit the trypanothione reductase, the key enzyme in the metabolism considered antioxidant T. cruzi. Research with hydroxymethylnitrofurazone (NFOH) has shown greater activity in vitro and in vivo against T. cruzi with less toxicity when compared to the drug matrix, nitrofurazone (NF). A wide spectrum of biological activities have been reported for compounds furoxans (1,2,5-oxadiazol-2-N-oxide) and benzofuroxans (benzo[1,2-c]-1,2,5-oxadiazol-1-N-oxide) and thus was obtained a series of derivatives of Nitrofural isosteres, nitrofuran ring by replacing the respective furoxans and benzofuroxans. The compounds were evaluated for in vitro trypanocidal activity in epimastigotes and amastigotes of T. cruzi, ability to donate nitric oxide and mutagenicity in vivo. Were synthesized, characterized and identified eight compounds. Benzofuroxans derivatives (compounds 20 and 21) were the most active against epimastigotes of T. cruzi, however the assay against amastigotes, seven showed IC50 higher than or equal to a drug used as reference (benznidazole) and less mutagenic potential when compared with the results obtained for the drugs nitrofurazone... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rosângela Gonçalves Peccinini / Banca: Elza Kimura / Banca: Jean Leandro dos Santos / Resumo: O pró-fármaco hidroximetilnitrofural (NFOH) apresenta atividade antichagásica com grande diminuição da toxicidade e maior atividade contra formas amastigotas do T. cruzi quando comparadas ao seu fármaco matriz nitrofural (NF). Essas vantagens tornam o pró-fármaco uma possível alternativa terapêutica tanto para o tratamento da fase aguda, quanto da fase crônica da doença de Chagas. Nesse trabalho foi investigado o perfil farmacocinético do NFOH em modelo animal não roedor, estudo necessário para a continuidade do desenvolvimento do pró-fármaco. O NF foi administrado por via intravenosa e oral nas doses de 6,35 e 63,5 mg/kg, respectivamente, e o NFOH 8,05 e 80,5 mg/kg respectivamente; em coelhos albinos (n=20). Após a administração foram realizadas coletas seriadas de sangue dos animais por punção venosa. As amostras foram processadas e analisadas por método bioanalítico validado, utilizando-se um sistema MS. O sistema operou em modos positivo e negativo para as leituras dos compostos - NF e NFOH- e do padrão interno (diclofenaco 5ug/mL em metanol), sob eluição de fase móvel composta por água:metanol (50:50). As médias dos parâmetros farmacocinéticos foram calculadas pelas curvas de concentração plasmática versus tempo e comparadas pelo teste de Mann-Whitney (p<0,05). O NF apresentou biodisponibilidade oral de 114,97% no modelo animal e na administração oral este composto apresentou meia-vida de eliminação de 276,09 minutos, estatisticamente diferente da meia vida apresentada na administração intravenosa (17,32 minutos). A administração do NFOH permitiu o cálculo dos parâmetros farmacocinéticos tanto do pró-fármaco quanto do NF liberado pelo mesmo. O perfil farmacocinético do NF administrado comparado ao do NF obtido do pró-fármaco não foi estatisticamente diferente. A biodisponibilidade oral relativa do NF a partir do pró-fármaco administrado foi de 60,1% / Abstract: The prodrug hydroximethylnitrofurzone (NFOH) presents antichagasic activity with greatly reduced toxicity compared to its drug matrix nitrofurazone (NF). Besides these new characteristics, the prodrug was more active against the parasite T. cruzi amastigotes. These advantages make the prodrug a possible therapeutic alternative for the treatment of both acute and the chronic phase of Chagas disease. Male albino rabbits (n=20) were divided into four groups and subjected to single administration of NF and NFOH. NF was administered intravenously and orally in doses of 6.35 and 63.5 mg / kg respectively, and NFOH, in doses 8.05 and 80.5 mg / kg respectively. After administration, serial blood samples were collected by venipuncture. The samples were processed and the final product was analyzed by MS. The system operated in positive and negative modes for the determination of compounds and internal standard, under elution of the mobile phase 50:50 water: methanol. The NF presented an oral bioavailability of 114.97% in the albino rabbits and oral administration showed half-life of 276.09 minutes due to the absorption process against 17.32 obtained in the intravenous administration. The administration of NFOH allowed the calculation of pharmacokinetic parameters of the prodrug, and the NF obtained from NFOH administration. Comparing the behavior of NF administered orally and obtained from the prodrug was not evidenced significant changes in the pharmacokinetic profiles. The relative oral bioavailability of NF obtained from the NFOH was 60,1%. / Mestre

Orientador: Chung Man Chin / Banca: Cleverton Roberto de Andrade / Banca: João Aristeu da Rosa / Resumo: A tripanosomíase americana ou doença de Chagas é uma zoonose endêmica em 21 países das Américas do Sul e Central, apontada como uma grave doença parasitária resultante da infecção pelo parasito hemoflagelado denominado Trypanosoma cruzi que utilizam insetos triatomíneos como vetores. Existem dois fármacos para o tratamento dessa enfermidade, o nifurtimox (NFX) e o benznidazol (BNZ), ativos apenas na fase aguda da doença, sendo que no Brasil apenas o BNZ é comercializado. Em busca de novas alternativas para o tratamento, destaca-se o hidroximetilnitrolfural (NFOH), ativo contra as formas tripomastigotas e amastigotas em ensaio in vitro e in vivo. O objetivo deste trabalho foi realizar ensaios in vivo em camundongos Balb/c, na fase crônica da doença de Chagas. Neste sentido foi padronizado o ensaio em fase crônica, utilizando a cepa Y de T.cruzi, com inóculos de 102 formas tripomastigotas. Os animais foram tratados durante 60 dias com NFOH e BNZ seguido de imunossupressão induzida por dexametasona durante 14 dias. Ao final do protocolo os animais foram eutanasiados, pesados, realizado as análises bioquímicas (TGO, TGP, CK-MB, e GGT) e histopatológica. Os resultados demonstraram que nos animais tratados com NFOH e BZN não foi observada a reativação da parasitemia após a imunossupressão, enquanto no controle positivo houve reativação em 55,5% dos animais. Os ensaios bioquímicos não demonstraram alteração nos valores em todos os grupos. Os pesos relativos bem como a análise macroscópica do coração, vesícula biliar, baço e rins do grupo NFOH foram similares ao grupo controle negativo enquanto o grupo BZN foi semelhante ao grupo controle positivo. Na analise histopatológica, o grupo NFOH apresentou apenas a presença de um amastigota em um coração dentre oito animais (1/8) enquanto o grupo BZN foi observado presença de um à dois ninhos... / Abstract: The American trypanosomiasis or Chagas disease is an endemic zoonosis in 21 countries of South and Central America, identified as a serious parasitic disease resulting from infection by the hemoflagellate parasite called Trypanosoma cruzi, which use triatomine insects as vectors. There are two drugs for treatment of Chagas disease, nifurtimox (NFX) and benznidazole (BNZ), that are active only in the acute phase of the disease,, and in Brazil only the BNZ is marketed. In search of new alternatives for treatment, there is the hidroximetilnitrolfural (NFOH), which was active against trypomastigotes and amastigotes form during in vitro and in vivo assay. The aim of this work was to evaluate NFOH in an in vivo chronic phase assay of Chagas disease, using BALB / c. It has been standardized a chronic phase assay, using Y strains of T. cruzi with inocula of 102 trypomastigotes. The animals were treated for 60 days with NFOH and BNZ followed by immunosuppression induced by dexamethasone for 14 days. At the end of the protocol, the animals were euthanized, weighed, performed the biochemical (ALT, AST, CK-MB, and GGT) and histopathological analysis. The results showed that in animals treated with NFOH and BZN were not observed reactivation of the parasitemia after immunosuppression, while in positive control was observed reactivation in 55.5% of animals. The biochemical assays demonstrated no alteration in the values in all groups. The relative weights as well as the macroscopic examination of the heart, gallbladder, spleen, and kidneys of NFOH group were similar to negative control group while BZN group was similar to the positive control group. In the histopathological analysis, the NFOH group showed only the presence of amastigotes in one heart of eight animals (1/8), while in BZN group was observed the presence of one to two nests in four hearts (4/8) and in the liver ... / Mestre

Orientador: João Aristeu da Rosa / Coorientador: Reinaldo Alves de Brito / Banca: Daniel Alfredo Frías Lasserre / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: Cleber Galvão / Banca: Mara Cristina Pinto / Resumo: A doença de Chagas é uma das principais parasitoses que ocorrem na América Latina, cujo agente etiológico é o protozoário Trypanosoma cruzi, que é veiculado por triatomíneos. Estima-se que entre oito milhões de pessoas estejam infectadas. Rhodnius é um dos gêneros que pode veicular T. cruzi e inclui espécies estreitamente relacionadas com baixos níveis de diferenciação morfológica. Atualmente, existem 19 espécies conhecidas, entre elas, Rhodnius montenegrensis que é considerada a fim de Rhodnius robustus. Para investigar as diferenças genéticas interespecíficas dessas duas espécies utilizou-se a metodologia de larga escala RNA-seq. Por essa técnica foram geradas quatro bibliotecas de RNA total de cabeças e glândulas salivares de machos de R. montenegrensis e R. robustus. Após filtrar pela qualidade, foram realizadas montagens de novo de cada uma das espécies. Esse processo resultou em 64952 contigs para R. montenegrensis e 70894 para R. robustus com N50 de 2100 para as duas espécies aproximadamente. Com base na montagem de R. robustus, foi feita uma procura por SNPs e foram encontrados 3055 polimorfismos interespecíficos fixados. Foram selecionados 216 transcritos com alta divergência contendo apenas polimorfismos fixados entre as duas espécies. O teste de enriquecimento nesses transcritos revelou uma sobrerepresentação de oito termos relacionados ao complexo da proteína clatrina. Os resultados obtidos mostram que R. montenegrensis e R. robustus apresentam uma quantidade substancial de polimorfismos interespecíficos fixados o que sugere um alto grau de divergência genética entre as duas espécies. / Abstract: Chagas disease is one of the main parasitic diseases found in Latin America infecting an estimated eight million people worldwide. The protozoan Trypanosoma cruzi, its etiological agent, uses triatomines as a disease vector, among them the genus Rhodnius. This genus includes species that have been difficult to differentiate because they show low amounts of morphological differentiation. Despite that, there are currently 19 known species described, one of them Rhodnius montenegrensis, which has been confounded with Rhodnius robustus. Here we generated Large-scale RNA-sequencing data from heads and salivary glands to investigate genetic differences between these two species. We produced a total of four RNAseq libraries from heads and salivary glands of males of R. montenegrensis and R. robustus. de novo transcriptome assemblies produced for each species resulted in 64,952 contigs for R. montenegrensis and 70,894 contigs for R. robustus, with N50 of approximately 2100 for both species. We performed a search for SNPs based on the more complete R. robustus assembly and found 3,055 fixed interspecific differences. We identified two hundred and sixteen transcripts with high levels of divergence which contained fixed polymorphisms found between the two species. A Gene Ontology enrichment analysis revealed that these highly differentiated transcripts were enriched for the following terms: clathrin coat of endocytic vesicle, AP-2 adaptor complex, clathrin-coated endocytic vesicle, clathrincoated endocytic vesicle membrane, clathrin coat of coated pit, endocytic vesicle membrane, clathrin vesicle coat, and coated pit. The results reveal that  R. montenegrensis and R. robustus show a substantial quantity of fixed interspecific polymorphisms, a finding which suggests a high degree of genetic divergence between the two species, which likely corroborates their species status. / Doutor

Orientador: Sueli Aparecida Calvi / Resumo: A Doença de Chagas (DC), cujo agente etiológico é o protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), tornou-se nos últimos anos um grave problema de saúde pública, mesmo em países não-endêmicos. Um importante desafio para os pesquisadores da doença de Chagas é estabelecer os eventos que levam alguns pacientes a desenvolver a doença crônica assintomática, ou forma indeterminada, enquanto outros evoluem para uma doença severa, com lesões em tecidos cardíacos ou gastrointestinais. Alguns estudos têm sugerido que a ausência de sintomas clínicos em indivíduos com a forma crônica indeterminada está associada a um controle eficaz da resposta imune efetora contra o parasita, que evita uma resposta inflamatória excessiva, o que resultaria em lesão tecidual. Não existem estudos com o objetivo de confirmar este mecanismo em pacientes com a forma digestiva da DC, especialmente em relação ao controle modulador de mecanismos efetores envolvendo células Th17, por células Treg. No presente estudo, nós avaliamos em pacientes com a forma digestiva da DC e em pacientes com a forma indeterminada ou assintomática a taxa de ativação Th17/Treg, através da avaliação da freqüência de células Th17 e Treg por citometria de fluxo; da expressão do mRNA para Rorγt e Foxp3, fatores de transcrição envolvidos na diferenciação dessas células, respectivamente; bem como os níveis de IL-17a e IL-10 em sobrenadantes de cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC's). Foi demonstrado no presente estudo, q... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease (CD) whose etiological agent is the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi) in recent years became a serious problem of public health even in nonendemic countries. One important challenge for the researchers of Chagas disease is to establish the events that lead some patients to develop asymptomatic or indeterminate chronic disease, while others undergo severe disease with lesions in cardiac or gastrointestinal tissues. Some studies have suggested that absence of clinical symptoms in individuals with the indeterminate chronic form is associated to a fine control of effector immune responses against the parasite that avoid a perpetuated inflammatory process which results in tissue injury. There are no studies aiming to confirm this mechanism in patients with digestive form of the disease, particularly in relation to the modulatory control by Treg cells of effector mechanisms involving Th17. Here, we studied in patients with the digestive form of CD and in those with the indeterminate or asymptomatic form of the disease, the ratio Th17/Treg activation by evaluating the frequency of Th17 and Tregs cells by flow cytometry, mRNA expression for Rorγt and Foxp3, the transcription factors involved in the differentiation of these cells respectively as well as the levels of IL-17a and IL-10 in peripheral blood mononuclear cells culture supernatants. We showed that in patients with digestive form of the disease there is an imbalance in the ratio Th17/Treg cells activation ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-17T19:39:43Z No. of bitstreams: 1 2014_JulianaChedidNogaredRossi.pdf: 7113671 bytes, checksum: 4017fc3403a015a46153059d956c2873 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-25T19:10:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JulianaChedidNogaredRossi.pdf: 7113671 bytes, checksum: 4017fc3403a015a46153059d956c2873 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T19:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JulianaChedidNogaredRossi.pdf: 7113671 bytes, checksum: 4017fc3403a015a46153059d956c2873 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, por intermédio do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical. / Em 2006 a interrupção da transmissão de Trypanosoma cruzi pelo principal vetor doméstico, Triatoma infestans, foi certificada no Brasil. No entanto, casos agudos de doença de Chagas continuam sendo registrados e persistem espécies de triatomíneos nativas em ambiente domiciliar. A compreensão dos fatores associados à infestação domiciliar por essas espécies pode identificar alvos de intervenção e minimizar os riscos de transmissão. O objetivo deste estudo foi estimar a associação de fatores estruturais, bióticos e de manejo com a presença de triatomíneos em unidades domiciliares (UDs) de localidades rurais do município de Posse, Goiás. A pesquisa foi realizada em duas localidades (Trombas e Periquito) em abril de 2013. Foram realizadas pesquisas manuais de triatomíneos em 100% das UDs habitadas (n=134). A partir da contagem e identificação dos insetos coletados foram calculados os indicadores de infestação, densidade, aglomeração e colonização. A infecção natural dos triatomíneos foi detectada a partir do exame de fezes a fresco e confirmada por PCR. Em cada UD, um formulário foi preenchido para obter variáveis relacionadas a fatores estruturais, bióticos e de manejo. A presença ou ausência da infestação nas UDs por triatomíneos foi explorada por modelos de regressão logística para estimar os fatores de risco mais importantes. No total, 1059 triatomíneos foram capturados, com o predomínio da espécie T. sordida; apenas duas ninfas de T. costalimai foram capturadas no peridomicílio de uma UD. Em Trombas, T. sordida ocorreu em 39 UDs (infestação: 55,7%, densidade: ~11 espécimes/UD, aglomeração: ~20 espécimes/UD infestada, colonização: 77%), totalizando 783 espécimes (99% no peridomicílio, principalmente em galinheiros). Somente quatro adultos foram detectados no intradomicilio e apenas seis (0,9%) dos 698 espécimes examinados estavam infectados por T. cruzi. Na localidade de Periquito, T. sordida ocorreu em 24 UDs (infestação: 37,5%, densidade: ~4 espécimes/UD, aglomeração: ~11 espécimes/UD infestada, colonização: 87%), totalizando 274 espécimes, sendo 100% capturados no peridomicílio (principalmente em galinheiros). Nenhum dos 247 triatomíneos examinados estava infectado. A probabilidade de uma UD estar infestada foi cerca de duas vezes maior em Trombas (OR= 2,09, 95% IC = 1,05-4,19, p=0,03). A ocorrência de T. sordida nas UDs foi associada com presença de animais domésticos (gato, cachorro, galinhas), pilhas de telhas, madeira e tijolos no peridomicílio, estrutura dos galinheiros e currais e variáveis de manejo, por exemplo, a distância dos galinheiros e currais para a casa e a frequência de limpeza desses anexos peridomiciliares. O modelo final de regressão logística indicou que a probabilidade de ocorrência de T. sordida é maior na localidade de Trombas e nas UDs com galinheiros de madeira, presença de curral com muitos animais, presença de pilhas de madeira e dispensa alimentar. Os dados mostram a persistência de T. sordida no peridomicílio das duas localidades, no entanto a ausência de colonização intradomiciliar e as taxas mínimas de infecção encontradas sugerem que T. sordida não tem potencial para sustentar altas taxas de transmissão domiciliar de T. cruzi para os moradores dessas localidades. Recomenda-se reforçar a vigilância entomológica para controle do T. sordida. Ações de manejo de ecótopos artificiais do peridomicílio são necessárias para diminuir a infestação. / In 2006 Brazil was declared free from Trypanosoma cruzi transmission by the domestic vector Triatoma infestans. However, human acute cases of Chagas disease are still being registered and native species of triatomine bugs persist in domestic environment. Understanding the factors associated with domestic/peridomestic infestation by these species can identify targets of intervention and minimize the risk of transmission. The aim of this study was to estimate the factors (structural, biotic, management) of artificial environments (houses and peridomestic areas) associated with infestation of those environments by triatomines in domiciliary units (DUs) of rural localities in the municipality of Posse, state of Goiás. The survey was conducted at two localities (Trombas and Periquito) in April 2013. Triatomine manual searches were performed in 100% of the inhabited DUs (n=134). After counting the insects, the indicators of infestation, density, crowding and colonization were calculated. Natural infection of triatomines was detected from fresh stool examination and confirmed by PCR. For each DU, a form was filled to obtain variables related to structural, biotic and management factors. The presence or absence of triatomine infestation in DUs was explored by logistic regression models to estimate the most important risk factors. Overall, 1059 triatomines were captured, with the predominance of T. sordida; only two peridomestic nymphs of T. costalimai were captured in one DU. In Trombas, T. sordida occurred in 39 DUs (infestation: 55.7 %, density: ~11 specimens/UD , crowding: ~20 specimens/infested UD, colonization: 77%), totaling 783 specimens (99% in peridomiciles, mainly chicken houses). Only four adults were found in houses and only six (0.9%) of 698 specimens examined were infected with T. cruzi. In the locality of Periquito, T. sordida occurred in 24 DUs (infestation: 37.5%, density: ~4 specimens/DU, crowding: ~11 specimens/infested DU, colonization: 87%), totaling 274 specimens, 100 % captured in peridomiciles (mostly chicken houses). None of the 247 insects examined were infected. The probability of a DU be infested was about two times higher in Trombas locality (OR = 2.09, 95% CI = 1.05 to 4.19, p = 0.03). The occurrence of T. sordida in DUs was associated with presence of domestic animals (cats, dogs, chickens), brick, tile and wood piles in peridomiciles, structure of chicken coops and pens and management variables such as distance of the chicken coops and pens for the house and cleaning frequency of these peridomestic habitats. The final logistic regression model indicated that the probability of occurrence of T. sordida was higher in the locality of Trombas, in DUs with chicken wooden, presence of many animals in the corral and presence of wood piles and storage shelters. The data show the persistence of T. sordida in peridomestic habitats of two localities, however, a low household colonization and minimum infection rates found suggest that T. sordida has no potential to sustain high rates of domestic transmission of T. cruzi to residents of these localities. It is recommended to strengthen entomological surveillance for control of T. sordida. Management actions of the peridomestic habitats are necessary to reduce the infestation.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas, 2012. / Submitted by Liliane Simões (miix007@gmail.com) on 2013-04-08T12:03:48Z No. of bitstreams: 1 2012_RozeneideMagalhaesAlves.pdf: 3353342 bytes, checksum: c912abe9692a9ba2ec498d82124c6c94 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-08T14:20:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RozeneideMagalhaesAlves.pdf: 3353342 bytes, checksum: c912abe9692a9ba2ec498d82124c6c94 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-08T14:20:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RozeneideMagalhaesAlves.pdf: 3353342 bytes, checksum: c912abe9692a9ba2ec498d82124c6c94 (MD5) / Este estudo foi conduzido em linhagens B12/B12 e B4/B4 de aves congênicas de Praga geneticamente idênticas em todos os loci exceto no MHC relacionado às respostas imunes que conferem resistência ou susceptibilidade à oncogênese induzida pelo vírus (RSV). As linhagens de aves de Praga foram doadas ao LMPDC/UnB pelo Instituto de Genética Molecular da Academia de Ciências de Praga. Ovos férteis de galinha foram inoculados com 100 tripomastigotas de Trypanosoma cruzi e os pintos nasceram sem a infecção, mas eles retiveram sequências de minicírculos de kDNA mitocondrial do parasito em vários cromossomos. As aves com as mutações (kDNA+) desenvolveram cardiomiopatia com os aspectos similares aqueles vistos na doença de Chagas humana. Tendo estabelecido o modelo transfilo refratário ao T. cruzi foi possível investigar a autoimunidade e determinar a patogêneses da rejeição do coração. A transferência passiva das lesões mediante injeções de células mononucleares do sangue de aves mutadas (kDNA+) para aves receptoras controles sadias mostrou pequenos focos inflamatórios no miocárdio. A ausência de tais achados em aves controles (kDNA-) mostrou que apenas linfócitos de aves mutadas (kDNA+) aderiam ao miocárdio. Mas não foi obtida cardiomiopatia mediante transferência de células mononucleares do sangue de aves mutadas para aves sadias. Entretanto, a destruição de células da medula óssea de aves mutadas (kDNA+) com drogas, e sua substituição pelo enxerto de medula óssea sadia de aves controle (kDNA-) inibiu a cardiomiopatia na ave kDNA+. Este experimento foi monitorado pelo enxerto de coração repórter no subcutâneo da ave receptora, cujo estudo histopatológico aos onze dias pós-enxerto revelou ausência de lesão inflamatória. Em experimento reverso, foi feita transferência da patologia de aves mutadas (kDNA+) para aves controle (kDNA-), sadia que tiveram a medula óssea destruída com drogas. Nesse experimento, o enxerto de medula óssea de aves kDNA+ em aves receptoras kDNA- revelou infiltrado inflamatório e lesão no coração repórter enxertado no subcutâneo. O estudo imunocitoquimico revelou no coração repórter patologia similar a lesão no coração da ave adulta, onde a destruição do miocárdio era feita pelos infiltrados de linfócitos T citotóxicos CD8-α, CD8-β, CD8-γδ, CD8-vβ1, e CD8-vβ2 que lisa as células alvo. As aves kDNA+ que sucumbiram a cardiomiopatia e aquelas que foram sacrificadas aos 12 meses de idade revelaram lesões inflamatórias autoimunes no coração adulto e no coração repórter. Os resultados que mostraram inibição da patologia autoimmune no coração das aves kDNA+ pela substituição da medula óssea doente pela medula óssea de ave sadia sugerem a possibilidade de tratamento da cardiomiopatia chagásica pela transferência de medula óssea. / The study was conducted in lineages B12/B12 and B4/B4 of congenic birds of Prague, showing complete genetic identity in all loci but different MHC carrying on the immune responses that afford resistance and/or susceptibility to RSV induced oncogenesis. The congenic birds were donated by the Czech Republic Academy of Sciences Institute of Molecular Genetics our Laboratory at the University of Brasilia. Fertile chicken eggs were inoculated with 100 tripomastigotes of Trypanosoma cruzi and the chicks hatched were parasite-free, but they retained the parasite mitochondrial kDNA minicircle sequences in various chromosomes. The chicken with mutations (kDNA+) developed Chagas-like heart disease with features similar to those seen in the human disease. Having established the transkingdom model system to study the pathogenesis, it was possible to investigate the autoimmune rejection of the kDNA+ chicken heart. The passive transfer of blood mononuclear cells from mutated (kDNA+) birds to naive recipients revealed small inflammatory infiltrates in the myocardium, but the cardiomyopathy was not observed. The absence of lymphocyte infiltrates in the control chicken (kDNA-) heart showed that only kDNA+ lymphocytes adhere to the myocardium. Moreover, the Chagas-like cardiomyopathy was not obtained by injections of blood mononuclear cells from kDNA+ chickens, and, therefore, other experiments of transfer of bone marrow cells were conducted, aiming at production of the heart disease in the recipient chicken. In this regard, kDNA- mutated chicken bone marrow cells, which were destroyed with drugs, were replaced by healthy bone marrow cells from sick (kDNA+) chicken. This experiment was monitored by a reporter heart grafted in the subcutaneous pouch of a recipientbird. Eleven days after grafting, the histopathology study revealed inflammatory cell infiltrates and destruction of the myocardium by cytotoxic T- lymphocytes T CD8-α, CD8-β, CD8-γδ, CD8-vβ1, e CD8-vβ2 that lyse the target cells . The kDNA+ birds that succumbed to natural death and those that did not succumb to heart disease were sacrificed at 12 months of age. The kDNA+ (mutated) birds‟ revealed autoimmune inflammatory lesion similar to that in the reporter heart. The results of these experiments suggested a reverse experiment, aiming at the inhibition of the pathology. The replacement of the sick (kDNA+) bone marrow by healthy bone marrow from a naive (kDNA-) donor inhibited the inflammatory autoimmune lesions in the heart of the kDNA- mutated, sick chicken.The inhibition of the heart pathology in the kDNA+ chicken experiments deciphered a treatment possible for the human Chagas heart disease.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-04-08T15:22:25Z No. of bitstreams: 1 2012_MariaCarolinaCambraiaGuimaroDiniz.pdf: 3847057 bytes, checksum: 0125863da5f90bb3fcf083c0aadcc000 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-08T16:25:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MariaCarolinaCambraiaGuimaroDiniz.pdf: 3847057 bytes, checksum: 0125863da5f90bb3fcf083c0aadcc000 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-08T16:25:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MariaCarolinaCambraiaGuimaroDiniz.pdf: 3847057 bytes, checksum: 0125863da5f90bb3fcf083c0aadcc000 (MD5) / A base da teoria autoimune da doença de Chagas é a rejeição acelerada das células do coração pelos linfócitos efetores do sistema imune. Estudos do nosso Laboratório sugerem que uma transferência de minicírculos de kDNA de T. cruzi para o genoma do hospedeiro pode explicar a origem da patogênese da doença. Mas, como o hospedeiro mamífero retém a infecção chagásica ao longo da vida, decidimos empregar um modelo trans-filo que elimina a infecção e permite analisar com segurança a transferência do kDNA e sua possível relação com a rejeição autoimune do coração chagásico. Aves são refratárias ao Trypanosoma cruzi, mas a infecção pode ser estabelecida na primeira semana, antes do desenvolvimento do embrião. Pintos que eclodem de ovos inoculados com formas tripomastigotas de T. cruzi são livres da infecção, mas retêm DNA do cinetoplasto (kDNA) do parasita no genoma; os exames de PCR revelam positividade para kDNA na ausência de DNA nuclear (nDNA). O kDNA integrado no genoma das aves parentais foi transferido verticalmente para as progênies. A identificação das seqüências de minicírculos integradas no genoma das aves foi feita com auxilio da técnica tpTAIL PCR, e as quimeras kDNA-DNA hospedeiro foram mapeadas em vários cromossomos. Esses resultados também mostraram o kDNA integrado em retroelementos CR1 em 28% das sequências. As mutações foram localizadas em diversos loci, e as mutações nos genes CNNM2, tetraspaninas-18, e distrofina foram analisadas. As bandas desses genes nas hibridizações pelo Southern blot mostraram variações no padrão de migração, e este achado foi atribuído a recombinações e deleção na progênie. Ademais, as estruturas das seqüências nas regiões variáveis dos minicírculos de kDNA nos genes CNNM2 e distrofina dos parentais diferia daquelas presentes nas progênies. Tais diferenças, decorrentes da diversidade dos minicírculos, hitchhiking, recombinações, e mosaicismos sugerem um tipo de herança semiconservativa, não-Mendeliana. As aves kDNA-mutadas desenvolveram cardiomegalia e o exame histopatológico revelou lesão típica da doença de Chagas, com destruição de células cardíacas pelos linfócitos efetores do sistema imune. Aves controle não tinham lesão. Os resultados apresentados sugerem que as mutações de kDNA nos parentais são transferidas verticalmente e fixadas no genoma das progênies, podendo estar associadas às lesões autoimunes no coração do hospedeiro. A origem genética da patogênese da cardiopatia autoimune explica a variabilidade das manifestações clínicas semelhantes à doença de Chagas no modelo das aves sem o parasitismo. / The autoimmune theory suggests an accelerated rejection of heart cells by immune system effectors lymphocytes and Chagas heart disease. Studies of our Laboratory shows that transfer of Trypanosoma cruzi kDNA minicircles to the host genome may explain the origin of the autoimmunity. To eliminate any role played by parasite persistence in the chronic Chagas disease, we used the chicken model to shed light further on the origin of the autoimmune rejection of target cells in the heart. Birds are refractory to T. cruzi but the infection can be established in the early embryo. The inoculation of T. cruzi trypomastigotes into the air chamber of fertile egg generates parasite-free chickens at hatching: The exams revealed the presence of kDNA and absence of nuclear DNA (nDNA). Crossbreeding vertically transferred the kDNA mutations to progeny. The sequencing of minicircle kDNA was made by the tpTAIL PCR technique, and the chimera sequences showed kDNA conserved and variable regions at several chromosomes. These results also revealed that the kDNA integrated into retrotransposons CR1 in 28% of those sequences. The kDNA mutations were mapped to several loci, but the CNNM2, tetraspanin-18 and dystrophin genes were analised with more detail. Southern blot hybridization revealed bands with various migration patterns, possibly, due to recombination and deletion occurring over time. The kDNA mutations in CNNM2 and dystrophin loci showed structural differences in kDNA variable regions in parental and progeny. Additionally to mutation differences stemming from minicircle diversity, hitchhiking, recombination and mosaicisms also account for the semi-conservative, non-Mendelian, pattern observed. The kDNA-mutated birds showed cardiomegaly and the histopathology documented typical Chagas disease lesions, whereby parasite-free target heart cells were rejected by the immune system mononuclear cells. Control birds did not show these lesions. These findings highlight the association between the heart disease and genotype modifications, resulting from the kDNA integrations in the chicken genome. The genetically driven pathogenesis of Chagas-like heart disease explains a gamut of clinical manifestations in the parasite-free chicken model.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-06-12T16:14:53Z No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / A primeira microepidemia pelo Trypanosoma cruzi na Amazônia brasileira foi publicada em 1969 e, desde então, outras têm sido observadas em famílias residentes em vários municípios dos Estados daquela região. Em 2007 e 2009 foram identificados casos clínicos de doença de Chagas aguda (DCA) em famílias dos municípios de Barcarena e Breves, Estado do Pará. Este estudo mostrou anticorpos da classe IgG contra antígenos do T. cruzi em 35,7% (39/109) das pessoas, sendo 29,5% (13/44), 26,6% (4/15), 20,6% (6/29), respectivamente, das famílias A, B, e C residentes no município de Barcarena, e em 76,1% (16/21) da família D do município de Breves; em 66,6% (14/21) dos casos dessa família foram identificados anticorpos IgM anti-T. cruzi. Os resultados de PCR com iniciadores de nDNA do parasito foram positivos em 76,1% (83/109) dos casos: Família A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8% e D, 57,1%. De grande interesse, em 21 casos de DCA o exame parasitológico positivo foi convalidado pela PCR com iniciadores de nDNA de T. cruzi. Ademais, nas células germinativas do sêmen foi confirmada infecção ativa pelo T. cruzi, também presente nas células somáticas do sangue, pela PCR com iniciadores específicos de nDNA e kDNA. Adicionalmente, 16,5% (18/109) casos positivos apenas para kDNA, sem a infecção ativa, retiveram seqüências de minicírculos integradas no genoma. Nesses 18 casos as mutações de kDNA foram transferidas para as progênies pela reprodução sexuada. Com esse respeito, a diferença de 53% (44/83) entre os resultados obtidos pela PCR para nDNA e aqueles dos testes imunológicos contra antígenos de T. cruzi tem importância epidemiólogica ainda não apreciada em outra investigação. Pois, a presença de nDNA e kDNA foi encontrada na ausência de anticorpos contra antígenos de T. cruzi nos hospedeiros tolerantes aos antígenos do parasito. Ademais, em todos esses casos de infecção ativa também ocorreu transferência vertical de seqüências de minicírculos de kDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada e as mutações foram prontamente identificadas no genoma humano. Então, a larga diferença entre os resultados de testes imunológicos e de PCR pode ser explicada pela aquisição da infecção via sexual ou transplacentária, durante a fecundação ou na fase inicial da gestação, antes do desenvolvimento do sistema imune do embrião, e o indivíduo nasce tolerante aos antígenos de T. cruzi. As mutações de kDNA foram identificadas nos cromossomos, e o principal sítio de integração foi retrotransposon LINE-1 em 70% (301/430) das quimeras identificadas. Em 83,3% (50/60) dos casos as mutações ocorreram no gene do receptor olfatório OR1-17, e em apenas 16,6% (10/60) foram encontradas em genes com outras funções reconhecidas. O achado mais relevante neste estudo foi a documentação de transmissão do kDNA e do nDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / By 1969, a microepidemic of Trypanosoma cruzi was recognized in the Brazilian Amazonia, and lately they have been constantly reported in families from several counties in the region. By 2007 and 2009, clinical cases of acute Chagas disease were identified in families living in counties of Barcarena and Breves, Estado do Pará. The exams revealed IgG antibodyes against T. cruzi antígens in 35,7% (39/109) cases of the study population: Family A, 29,5% (13/44); B, 26,6% (4/15); C, 20,6% (6/29) of Barcarena county, and Family D, 76,1% (16/21) of Breves; Anti-T. cruzi IgM antibody was identified in 66,6% (14/21) of family D cases. The PCR assays with specific nDNA primer sets yielded positive results in 76,1% (83/109) cases: Family A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8%; and D, 57,1%. Of interest, 21 cases showing symptoms of acute Chagas disease had parasitologic demonstration of T. cruzi and these were convalidated by the PCR assays with nDNA primer sets. Moreover, germline cells from male gametes showed T. cruzi nDNA and kDNA as well as somatic mononuclear cells from blood. Additionally, 16,5% (18/109) of kDNA positive cases in absence of active infection retained the minicircle sequences in the genome. In these cases the kDNA mutations were vertically transfered to progenie by sexual reproduction. With this respect, the reported differences 53% (44/83) between results of antibody assays and those obtained by PCR with primer sets to T. cruzi nDNA have broad epidemiologic importance not yet reported by previous investigation. The presence of nDNA and kDNA was documented in the absence of antibody against T. cruzi antigens in hosts’ immue tolerant to the parasite antigens. Furthermore, vertical transfer of T. cruzi minicircle occurs by sexual reproduction in every case nDNA and kDNA are present in the course of an active infection. Insofar, the reported differences herein can be explained by the acquisition of the infection during fecundation or in the early gestational period, via sexual transmissão or transplacenta from mother to offspring before embryo immune system development; and the newborn becomes tolerant to T. cruzi antigens. The kDNA mutations were identified in several chromosomes, and the main integration hotspot was LINE-1 in 70% (301/430) cases. The mutations entered at the olfactory ORI-17 gene in (50/60) cases (83,3%) and in (10/60) cases (16,6%) they were found in genes with annotated functions. A highly relevant finding in this study was the documentation of transmission of kDNA, and of nDNA from T. cruzi active infection by sexual reproduction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-27T18:16:44Z No. of bitstreams: 1 2011_VivianeFragosodeMoura.pdf: 5516564 bytes, checksum: 1b1c091113de81ab04eec5f549dae9a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-06-27T20:33:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_VivianeFragosodeMoura.pdf: 5516564 bytes, checksum: 1b1c091113de81ab04eec5f549dae9a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-27T20:33:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_VivianeFragosodeMoura.pdf: 5516564 bytes, checksum: 1b1c091113de81ab04eec5f549dae9a3 (MD5) / A doença de Chagas, após 100 anos de sua descrição, ainda é considerada uma enfermidade negligenciada e de grande importância social, sendo destacada como uma das doenças mais endêmicas da América Latina. O cenário epidemiológico associado à ausência de quimioterapia adequada tem incentivado programas governamentais de prevenção e controle e influenciado grupos de pesquisadores a buscarem o desenvolvimento de novos fármacos. A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização molecular de proteases como potenciais alvos de drogas, Nesse sentido, este trabalho descreve o estudo de uma metionina aminopeptidase de T.cruzi (MAPTc). MAPTc é uma enzima putativa de 476 resíduos de aminoácidos com a massa molecular esperada de 47 kDa, sendo altamente conservada em cinetoplastídeos. O alinhamento de sequências protéicas de metionina aminopeptidases (MAPs) de humano e de T. cruzi demonstrou identidade reduzida, o que contribui para tornar a MAPTc um alvo promissor para desenvolvimento de drogas. A proteína recombinante foi expressa solúvel e inativa em E.coli BL 21(DE3) e purificada para produção de anticorpos em camundongos. Os soros obtidos após as imunizações foram utilizados nos experimentos de immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da proteína. A expressão da proteína foi confirmada nas formas epimastigotas do parasita e a mesma parece estar localizada no citoplasma. Para verificar a atividade de MAPTc, foram realizados ensaios enzimáticos com o substrato fluorogênico MET-AMC. No entanto, não foram alcançados resultados satisfatórios nas condições testadas, indicando que a proteína recombinante foi produzida na sua forma inativa. Testes com TNP470, um inibidor conhecido de metionina aminopeptidases, em formas epimastigotas do parasito, não revelaram um efeito inibitório. Por fim, foi proposto um modelo para MAPTc baseado na estrutura cristalográfica da Metionina Aminopeptidase Humana tipo I, PDB 2B3H. / Chagas’ disease even after 100 years of its depiction is still considered a neglected disease of great social importance, being highlighted as one of the endemic diseases in Latin America. The absence of an appropriate chemotherapy and its epidemiology have motivated government programs to prevent its transmission and stimulated groups of researchers to pursue the development of new drugs with reduced side effects. Our research group aims the identification and molecular characterization of proteases as potential drug targets. In that sense, this master’s thesis describes the study of a methionine aminopeptidase of Trypanosoma cruzi (MAPTc). MAPTc is a putative enzyme of 476 amino acid residues with an expected molecular mass of 47 kDa and highly conserved in the kinetoplastids. Protein sequence alignment of human and T. cruzi methionine aminopeptidase (MAPs) showed reduced identity, which helps to make MAPTc a promising target for drug development. The recombinant protein was expressed in its soluble and inactive form in E.coli BL 21 (DE3). It was purified and employed in the production of antibodies in mice that were used to investigate MAPTc expression.In experiments of immunobloting and immunocytolocalization revealed that the protein is expressed by epimastigote forms and located in the cytoplasm of the parasite. Assays with fluorogenic substrate MET-AMC were performed to access the activity of MAPTc. However, no success was achieved under the conditions tested, suggesting that the recombinant protein was produced in its inactive form. Also, tests were performed with TNP470, a well-known inhibitor of methionine aminopeptidase, on epimastigote forms of the parasite. However, these tests did not show an inhibitory effect. Finally, a model was proposed to MAPTc based on the crystal structure of the human methionine aminopeptidase type I, PDB 2B3H.