Introdução: Colite Ulcerativa (UC) é uma Doença Inflamatória Intestinal (DII) caracterizada por uma resposta imune exacerbada, com sintomas como diarreia, perda de peso e sangue nas fezes. Apesar dos medicamentos disponíveis, a remissão da doença nem sempre consegue ser alcançada e há a necessidade de terapias alternativas. A colite induzida por DSS (Dextran Sulfate Sodium) é um modelo animal utilizado na investigação de novas terapias por sua semelhança à UC humana. DSS provoca dano à barreira epitelial do cólon, induzindo uma resposta imune exacerbada; entretanto, o exato mecanismo não está totalmente esclarecido. O Ultrassom Terapêutico (TUS) foi utilizado para tratamento de injúria renal em modelo experimental, sua ação se dá através da estimulação do nervo vago (VN) e consequente ativação da via antiinflamatória colinérgica (CAIP). Uma vez que pacientes com DII podem exibir atividade disfuncional do VN, TUS pode ser investigado como terapia alternativa. Objetivos: Investigar temporalmente o perfil clínico, proteômico, histológico e imunológico da colite aguda induzida por DSS; e determinar os efeitos de TUS na colite induzida por DSS. Métodos: No primeiro estudo, a severidade da colite foi avaliada pela administração de DSS 1-3%, observando a resposta clínica e histológica. A análise temporal de DSS 3% incluiu uma avaliação proteômica e histológica do cólon, e a resposta imune celular no baço, linfonodo mesentérico (MLN) e cólon. No segundo estudo, utilizando o modelo de DSS 2%, TUS foi aplicado no abdômen dos animais e foram observados os sintomas clínicos, dano histológico, proteômica do cólon e respostas imunes celulares no baço, MLN e cólon. Animais esplenectomizados ou knockout para a7nAChR (marcador clássico para ativação de CAIP) foram utilizados. Resultados: No primeiro estudo, observou-se que a severidade da doença foi aumentada seguindo concentrações de 1-3% DSS. A análise temporal de DSS 3% demonstrou que os macrófagos (F4/80+) se apresentam como a primeira resposta celular, seguidos por células T CD25+, CD4+ e CD8+. A piora clínica da doença correspondeu ao aumento progressivo de fatores pró-inflamatórios e dano tecidual no cólon, exceto no dia 8. Foram observados menores níveis dos marcadores de células T CD25+, CD4+ e CD8+ no MLN e/ou baço, sugerindo a ocorrência de tropismo destas células para o intestino. No segundo estudo, a aplicação de TUS diminuiu a severidade da doença através da melhora de sintomas clínicos, danos teciduais e encurtamento do cólon. A proteômica do cólon demonstrou uma resposta anti-inflamatória durante a fase de injúria (D0-7), induzindo uma resolução acelerada da doença na fase de recuperação (D8-14). TUS diminuiu os níveis de células T CD8+ e normalizou os níveis de células T CD25+ no cólon. Animais esplenectomizados não demonstraram melhora clínica ou histológica, enquanto animais a7nAChR KO apresentaram piora da colite experimental. Além disso, TUS aumentou os níveis de células F4/80+a7nAChR+ no intestino de animais WT DSS 2%. Conclusão: Nossos resultados demonstram que a severidade da doença depende da concentração de DSS, relacionada com as respostas clínica, proteômica e imune no modelo animal de DSS 3%; e TUS diminuiu a severidade da colite induzida por DSS presumidamente pela da estimulação do VN e consequente ativação de CAIP através do baço. / Introduction: Ulcerative Colitis (UC) is an Inflammatory Bowel Disease (IBD) characterized by uncontrolled immune response, presenting with symptoms of diarrhea, weight loss and bloody stools. Despite available treatments, UC sustained remission is not achievable and there is still the need for alternative therapies. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-induced colitis is a mouse model used to investigate novel therapies, since it closely mimics human UC. DSS damages the colonic epithelial barrier, leading to an exacerbated immune response. However, the exact mechanism is not totally understood. Previous studies showed the use of Therapeutic Ultrasound (TUS) to prevent kidney injury in mice through stimulation of the vagus nerve (VN) and activation of the cholinergic anti-inflammatory pathway (CAIP). Since IBD patients can present with dysfunctional VN activity, TUS could be studied as an alternative therapy. Objectives: To investigate the temporal clinical, proteomic, histological and cellular immune profiles of DSS-induced acute colitis; and to determine the effects of TUS directed toward the VN and spleen in the course of DSS-induced colitis. Methods: First, we analyzed DSS-induced colitis severity by administration of 1-3% DSS, observing the clinical course and histological damage. A time course analysis was performed at 3% DSS, including colon proteomics, colon histology and immune cell responses in the spleen, MLN (mesenteric lymph node) and colon. Next, utilizing 2% DSS in drinking water, we applied TUS over the mice abdomen and analyzed clinical symptoms, histological damage, colon proteomics and immune cell responses in the spleen, MLN and colon. Splenectomized and a7nAChR (key indicator of CAIP activation) KO animals were also used. Results: In the first study, we observed worsening of the disease when increasing DSS concentrations from 1 to 3%. Time course analysis of 3% DSS revealed macrophages to be the first responders, followed by CD25+, CD4+ and CD8+ T cells. Worsening of the disease corresponded to a progressive increase in pro-inflammatory colonic factors and histological damage, except at day 8. Lower levels of CD25+, CD4+ and CD8+ T cells in MLN and/or spleen suggest an immune cell tropism to the gut. In the second study, TUS attenuated DSS induced colitis through amelioration of clinical symptoms, histological damage and colon shortening. Proteomic colon analysis demonstrated an antiinflammatory profile during the injury phase (D0-7), whilst inducing an early resolution of the disease during the recovery phase (D8-14). TUS decreased CD8+ and normalized CD25+ T cell levels in the gut. Splenectomized animals demonstrated no improved clinical and pathological outcomes, and a7nAChR KO mice presented with worsening of the disease. Furthermore, there were increased levels of F4/80+a7nAChR+ cells in the colon of 2% DSS WT mice under TUS treatment. Conclusion: Our results demonstrate that the severity of colitis is dependent on DSS concentration, correlated with clinical, proteomic and cellular immune responses on 3% DSS; and TUS significantly improved DSS-induced acute colitis presumably through stimulation of the VN and consequent activation of CAIP through the spleen.

Introdução: A inflamação constitui um dos fatores mais importantes da fisiopatologia da asma brônquica, caracterizada por uma resposta eosinofílica com produção de citocinas de perfil Th2. A persistência desta inflamação induz no pulmão um processo de reparo associado à redução progressiva da função pulmonar, que nem sempre é revertida pelos tratamentos disponíveis. O sistema colinérgico anti-inflamatório é descrito como um mecanismo neural que suprime a resposta imune e controla a inflamação principalmente pelo efeito da acetilcolina em receptores nicotínicos do tipo alfa7 (alfa7nAChR) encontrados em células do sistema imune. A acetilcolina (ACh) exerce um importante efeito na asma e recentemente demonstramos que a redução parcial da liberação da acetilcolina induz per se a inflamação pulmonar. Embora se saiba que os receptores muscarínicos (mAChRs) exercem um efeito pró-inflamatório e broncoconstritor na asma, a ativação de receptores nicotínicos (nAChRs) poderia ter um efeito benéfico reduzindo a inflamação pulmonar, fato demonstrado em modelos de inflamação sistêmica e aguda. O efeito da ativação do alfa7nAChR na fisiopatologia da asma ainda não está claramente elucidado. Objetivo: Investigar o efeito do tratamento com PNU-282987 (PNU), um agonista específico do alfa7nAChR, em um modelo murino de inflamação alérgica crônica das vias aéreas. Metodologia: Camundongos BALB/c foram submetidos ao protocolo de indução alérgica crônica das vias aéreas com ovoalbumina (OVA) ou salina intraperitoneal (i.p.) e posterior desafios inalatórios. A partir do 22° dia, os animais receberam diariamente tratamento com PNU ou veículo (Ve) até o 28° dia. Foram testadas três doses de PNU (0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg). A fim de evidenciar se o efeito obtido no tratamento com PNU era dependente do receptor alfa7nAChR, um grupo de animais foi tratado com MLA (antagonista do alfa7nAChR), previamente ao tratamento com PNU. No 29° dia do protocolo, os animais foram eutanasiados e foram avaliados o número de células inflamatórias no lavado broncoalveolar (LBA) e no sangue, os níveis de citocinas no LBA, a expressão do alfa7nAChR e mAchRs do tipo 3 (M3) e a ativação do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) no pulmão. O remodelamento brônquico foi avaliado por morfometria. As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA), onde um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: Houve expressão do alfa7nAChR e M3 no homogenato de pulmão de animais controle e sensibilizados. Determinamos por meio da redução de eosinófilos que a dose de 0,5 mg/Kg do tratamento com PNU foi a mais efetiva. Assim, observamos que o tratamento com PNU0,5 nos animais sensibilizados reduziu o número de células totais, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos no LBA, assim como número de eosinófilos no sangue periférico e ao redor das vias aéreas. O tratamento com PNU reduziu os níveis de IgE no sangue e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-17 no LBA. Todos estes efeitos foram revertido com o pré-tratamento com MLA, exceto para a citocina IL-17. Alem disso, o tratamento com PNU reduziu o remodelamento brônquico (área de edema, de epitélio e de músculo liso e deposição de fibras colágenas) assim como o número de células positivas para MMP-9 e TIMP-1 ao redor das vias aéreas. No pulmão a expressão do p-65-NF-kB, STAT3 fosforilado e o SOCS3 foram inibidas pelo PNU. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o alfa7nAChR está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar alérgica e de remodelamento brônquico em modelo experimental de asma alérgica e portanto é um novo alvo com potencial terapêutico a ser explorado na fisiopatologia da asma brônquica / Background: Inflammation is one of the most important features in asthma pathophysiology, characterized by eosinophilic response with production of Th2 cytokine profile. The persistence of this inflammation can induce a lung repair process associated with a progressive reduction in lung function, which is not always reversed by available treatments. The anti-inflammatory cholinergic system was described as a neural mechanism that suppresses the immune response and controls inflammation mainly by the activaction of acetylcholine alfa7 nicotinic receptors (alfa7nAChR) found on immune cells. Acetylcholine (ACh) is an important mediator in asthma and we recently demonstrated that partial reduction on ACh release induced lung inflammation per se. Although it is known that muscarinic receptors (mAChRs) has a pro-inflammatory action and causes bronchoconstriction in asthma, the activation of nicotinic receptors (nAChRs) could have a beneficial effect reducing pulmonary inflammation as demonstrated in models of acute and systemic inflammation. The effects of alfa7nAChR activation in the pathophysiology of asthma have not been clearly elucidated. Aim: To investigate the effects of PNU- 282987 (PNU) treatment, a specific alfa7nAChR agonist, in a murine model of chronic allergic airway inflammation. Methods: BALB/c mice were subjected to a protocol of chronic allergic inflammation induced by intraperitoneal ovalbumin (OVA) or saline and subsequent challenges with inhalation. From the 22th day, the animals daily received PNU or vehicle (Ve) until the 28th day. PNU were tested in three differents doses (0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg). In order to demonstrate that the effects obtained by PNU treatment was dependent on alfa7nAChR, a group of animals was treated with MLA (antagonist of alfa7nAChR) prior to the PNU treatment. On the 29th day of the protocol, the animals were euthanised and the number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) fluid and blood, cytokine levels in BALF, the expression of alfa7nAChR and mAChRs type 3 (M3), and activation of nuclear transcription factor kB (NF-kB) in the lung were evaluated. Bronchial remodeling was assessed by morfometric methods. Statistical analyses were performed using the SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) and P < 0.05 is considered statistically significant. Results: ?7nAChR and M3 expression was detected in control and sensitized lung homogenate. The most effective dose of PNU treatment was 0.5 mg/kg evaluated by the effects on eosinophil reduction. Thus, we observed that treatment with PNU0,5 reduced the number of total cells, eosinophils, neutrophils, macrophages and lymphocytes in BALF, as well as number of eosinophils in peripheral blood and around the airways of sensitized animals. The treatment with PNU also reduced IgE levels in the blood, and cytokines IL-4, IL-13 and IL-17 in BALF. All these effects were reversed by pretreatment with MLA, except for IL-17 cytokine. Furthermore, treatment with PNU reduced bronchial remodeling (edema, epithelium and smooth muscle area and airway collagen deposition) as well as the number of positive cells for MMP-9 and TIMP-1 around the airways. The lung p-65-NF-kB, phosphorylated STAT3 and the SOCS3 expression were inhibited by PNU-282987. Conclusion: These data clearly demonstrate that the alfa7nAChR is involved in the control of allergic pulmonary inflammatory response and in bronchial remodeling in an experimental model of allergic asthma and it can be a new target with therapeutic potential to be explored in the pathophysiology of asthma

o óxido nítrico tem sido apontado como um importante fator de desenvolvimento neural, participando ativamente como sinalizador espacial durante o processo de refinamento sináptico. Avaliamos nesse estudo a participação do óxido nítrico durante esse processo em tectos ópticos de embriões de pintos (Gallus gallus). Para tal avaliamos a imunorreatividade dos neurônios para as proteínas que formam os receptores colinérgicos e glutamatérgicos em diferentes fases do desenvolvimento embrionário, com e sem o bloqueio farmacológico da enzima de síntese do óxido nítrico (NOS). Durante o desenvolvimento embrionário, as subunidades GluR2/3 dos receptores glutamatérgicos são as que aparecem mais precocemente, no 6°dia de desenvolvimento embrionário (E6), juntamente com os neurônios imunorreativos para NOS e somente a partir de E8 é possível identificar a arquitetura laminar típica do tecto óptico.O bloqueio farmacológico da NOS mostrou diferentes padrões de marcação dependendo do tempo de sobrevida do animal. Em animais eutanasiados 24 h após o bloqueio farmacológico observou-se uma alteração na organização das camadas e no padrão radial de organização dos neurônios imunorreativos. Esse dado sugere que haja um atraso no refinamento sináptico, que se reflete em desorganização das camadas do tecto e alterações morfológicas nos neurônios. / O óxido nítrico tem sido apontado como um importante fator de desenvolvimento neural, participando ativamente como sinalizador espacial durante o processo de refinamento sináptico. Avaliamos nesse estudo a participação do óxido nítrico durante esse processo em tectos ópticos de embriões de pintos (Gallus gallus). Para tal avaliamos a imunorreatividade dos neurônios para as proteínas que formam os receptores colinérgicos e glutamatérgicos em diferentes fases do desenvolvimento embrionário, com e sem o bloqueio farmacológico da enzima de síntese do óxido nítrico (NOS). Durante o desenvolvimento embrionário, as subunidades GluR2/3 dos receptores glutamatérgicos são as que aparecem mais precocemente, no 6°dia de desenvolvimento embrionário (E6), juntamente com os neurônios imunorreativos para NOS e somente a partir de E8 é possível identificar a arquitetura laminar típica do tecto óptico.O bloqueio farmacológico da NOS mostrou diferentes padrões de marcação dependendo do tempo de sobrevida do animal. Em animais eutanasiados 24 h após o bloqueio farmacológico observou-se uma alteração na organização das camadas e no padrão radial de organização dos neurônios imunorreativos. Esse dado sugere que haja um atraso no refinamento sináptico, que se reflete em desorganização das camadas do tecto e alteração morfológicas nos neurônios.

Introdução: A inflamação constitui um dos fatores mais importantes da fisiopatologia da asma brônquica, caracterizada por uma resposta eosinofílica com produção de citocinas de perfil Th2. A persistência desta inflamação induz no pulmão um processo de reparo associado à redução progressiva da função pulmonar, que nem sempre é revertida pelos tratamentos disponíveis. O sistema colinérgico anti-inflamatório é descrito como um mecanismo neural que suprime a resposta imune e controla a inflamação principalmente pelo efeito da acetilcolina em receptores nicotínicos do tipo alfa7 (alfa7nAChR) encontrados em células do sistema imune. A acetilcolina (ACh) exerce um importante efeito na asma e recentemente demonstramos que a redução parcial da liberação da acetilcolina induz per se a inflamação pulmonar. Embora se saiba que os receptores muscarínicos (mAChRs) exercem um efeito pró-inflamatório e broncoconstritor na asma, a ativação de receptores nicotínicos (nAChRs) poderia ter um efeito benéfico reduzindo a inflamação pulmonar, fato demonstrado em modelos de inflamação sistêmica e aguda. O efeito da ativação do alfa7nAChR na fisiopatologia da asma ainda não está claramente elucidado. Objetivo: Investigar o efeito do tratamento com PNU-282987 (PNU), um agonista específico do alfa7nAChR, em um modelo murino de inflamação alérgica crônica das vias aéreas. Metodologia: Camundongos BALB/c foram submetidos ao protocolo de indução alérgica crônica das vias aéreas com ovoalbumina (OVA) ou salina intraperitoneal (i.p.) e posterior desafios inalatórios. A partir do 22° dia, os animais receberam diariamente tratamento com PNU ou veículo (Ve) até o 28° dia. Foram testadas três doses de PNU (0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg). A fim de evidenciar se o efeito obtido no tratamento com PNU era dependente do receptor alfa7nAChR, um grupo de animais foi tratado com MLA (antagonista do alfa7nAChR), previamente ao tratamento com PNU. No 29° dia do protocolo, os animais foram eutanasiados e foram avaliados o número de células inflamatórias no lavado broncoalveolar (LBA) e no sangue, os níveis de citocinas no LBA, a expressão do alfa7nAChR e mAchRs do tipo 3 (M3) e a ativação do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) no pulmão. O remodelamento brônquico foi avaliado por morfometria. As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA), onde um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: Houve expressão do alfa7nAChR e M3 no homogenato de pulmão de animais controle e sensibilizados. Determinamos por meio da redução de eosinófilos que a dose de 0,5 mg/Kg do tratamento com PNU foi a mais efetiva. Assim, observamos que o tratamento com PNU0,5 nos animais sensibilizados reduziu o número de células totais, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos no LBA, assim como número de eosinófilos no sangue periférico e ao redor das vias aéreas. O tratamento com PNU reduziu os níveis de IgE no sangue e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-17 no LBA. Todos estes efeitos foram revertido com o pré-tratamento com MLA, exceto para a citocina IL-17. Alem disso, o tratamento com PNU reduziu o remodelamento brônquico (área de edema, de epitélio e de músculo liso e deposição de fibras colágenas) assim como o número de células positivas para MMP-9 e TIMP-1 ao redor das vias aéreas. No pulmão a expressão do p-65-NF-kB, STAT3 fosforilado e o SOCS3 foram inibidas pelo PNU. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o alfa7nAChR está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar alérgica e de remodelamento brônquico em modelo experimental de asma alérgica e portanto é um novo alvo com potencial terapêutico a ser explorado na fisiopatologia da asma brônquica / Background: Inflammation is one of the most important features in asthma pathophysiology, characterized by eosinophilic response with production of Th2 cytokine profile. The persistence of this inflammation can induce a lung repair process associated with a progressive reduction in lung function, which is not always reversed by available treatments. The anti-inflammatory cholinergic system was described as a neural mechanism that suppresses the immune response and controls inflammation mainly by the activaction of acetylcholine alfa7 nicotinic receptors (alfa7nAChR) found on immune cells. Acetylcholine (ACh) is an important mediator in asthma and we recently demonstrated that partial reduction on ACh release induced lung inflammation per se. Although it is known that muscarinic receptors (mAChRs) has a pro-inflammatory action and causes bronchoconstriction in asthma, the activation of nicotinic receptors (nAChRs) could have a beneficial effect reducing pulmonary inflammation as demonstrated in models of acute and systemic inflammation. The effects of alfa7nAChR activation in the pathophysiology of asthma have not been clearly elucidated. Aim: To investigate the effects of PNU- 282987 (PNU) treatment, a specific alfa7nAChR agonist, in a murine model of chronic allergic airway inflammation. Methods: BALB/c mice were subjected to a protocol of chronic allergic inflammation induced by intraperitoneal ovalbumin (OVA) or saline and subsequent challenges with inhalation. From the 22th day, the animals daily received PNU or vehicle (Ve) until the 28th day. PNU were tested in three differents doses (0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg). In order to demonstrate that the effects obtained by PNU treatment was dependent on alfa7nAChR, a group of animals was treated with MLA (antagonist of alfa7nAChR) prior to the PNU treatment. On the 29th day of the protocol, the animals were euthanised and the number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) fluid and blood, cytokine levels in BALF, the expression of alfa7nAChR and mAChRs type 3 (M3), and activation of nuclear transcription factor kB (NF-kB) in the lung were evaluated. Bronchial remodeling was assessed by morfometric methods. Statistical analyses were performed using the SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) and P < 0.05 is considered statistically significant. Results: ?7nAChR and M3 expression was detected in control and sensitized lung homogenate. The most effective dose of PNU treatment was 0.5 mg/kg evaluated by the effects on eosinophil reduction. Thus, we observed that treatment with PNU0,5 reduced the number of total cells, eosinophils, neutrophils, macrophages and lymphocytes in BALF, as well as number of eosinophils in peripheral blood and around the airways of sensitized animals. The treatment with PNU also reduced IgE levels in the blood, and cytokines IL-4, IL-13 and IL-17 in BALF. All these effects were reversed by pretreatment with MLA, except for IL-17 cytokine. Furthermore, treatment with PNU reduced bronchial remodeling (edema, epithelium and smooth muscle area and airway collagen deposition) as well as the number of positive cells for MMP-9 and TIMP-1 around the airways. The lung p-65-NF-kB, phosphorylated STAT3 and the SOCS3 expression were inhibited by PNU-282987. Conclusion: These data clearly demonstrate that the alfa7nAChR is involved in the control of allergic pulmonary inflammatory response and in bronchial remodeling in an experimental model of allergic asthma and it can be a new target with therapeutic potential to be explored in the pathophysiology of asthma

Thesis (M.Sc. (Pharmacology))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2007.

Palmoplantar pustulosis (PPP) is a chronic disease of unknown pathogenesis. Most of the patients were smokers. High prevalence of a number of autoimmune diseases was observed among the patients (thyroid disease 14%, gluten intolerance 8%, diabetes type 1 3%). Eosinophils and neutrophils were found in large numbers in the pustules. Massive infiltrates of lymphocytes and mast cells in the dermis below the pustule and an abnormal acrosyringial pattern indicate that the acrosyringium is the target for the inflammation. Immunofluorescence (IF) revealed decreased innervation of the sweat gland, outward migration of substance P-positive granulocytes in the acrosyringium and an increased number of contacts between mast cells and nerve fibres in the dermis. Distributions of choline acetyltransferase (ChAT) and acetylcholinesterase (AChE) were studied, since they regulate the level of acetylcholine, the main inducer of sweating. The most intense AChE-like immunoreactivity (LI) was observed in the acrosyringium in the lowest part of the stratum corneum, corresponding to the site of the pustule in PPP. ChAT-LI in granulocytes and AChE-LI in mast cells were demonstrated, which may have implications for inflammatory processes in general. Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) are activated by acetylcholine but also by nicotine. Immunohistochemstry of α-3 and α-7 subtypes of the nAChRs showed that the nAChR expression in healthy skin was influenced by smoking. A highly abnormal α-7 nAChR distribution in PPP skin was observed. The levels of nAChR antibodies were elevated in 42% of the PPP sera, and 68% of these sera gave specific endothelial IF in the papillary dermis in skin from non-smokers. Positive IF in the acrosyringium was also noted in skin from smokers. Conclusions: Smoking seems to induce up-regulation of an antigen in palmar skin. The results indicate that PPP is an autoimmune disease and that nicotine might have a role in the onset of the inflammation.

Posttraumatic stress disorder (PTSD) is an anxiety disorder that may follow exposure to severe emotional trauma and presents with various symptoms of anxiety, hyperarousal and cognitive anomalies. Interestingly, only 10-30% of an exposed population will go on to develop full-blown PTSD. Cholinergic neurotransmission is implicated in anxiety as well as other typical manifestations of PTSD, particularly cognitive changes. The frontal cortex and hippocampus regulate and in turn are affected by stress, and have also been implicated in the underlying neuropathology of PTSD. These areas are densely innervated by cholinergic neurons originating from the basal forebrain. In this study, the time dependent sensitization (TDS) model was used to induce symptoms of PTSD in animals. The study was designed to determine the long-term effects of an intense, prolonged aversive procedure on central muscarinic acetylcholine receptor (mAChR) characteristics and the correlation if any of those findings to cognitive aspects and general arousal as characteristics associated with PTSD. In order to achieve this goal, male Sprague-Dawley rats were exposed to the TDS stress paradigm with behavioral/neuro-receptor assessments performed on day 7 post re-stress (duration of each experiment in whole is 14 days). Acoustic startle reflex (ASR) was used to determine emotional state (hyperarousal), while the conditioned taste aversion (CTA) paradigm was implemented in order to assess aversive memory. Muscarinic receptor binding studies were performed in the frontal cortex and hippocampus. Moreover, both the stress-exposed and control animals were pre-tested in the acoustic startle chamber in order to attempt to separate stress sensitive from stress-resilient animals based on predetermined ASR criteria. The ASR niodel was previously validated in our laboratory, while the CTA model was validated in this project before application. In the CTA model, an i.p. injection with lithium chloride (LiCl) (associated with digestive malaise), was used as unconditioned stimulus (US) and was paired with a saccharinlcyclamate drinking solution as conditioned stimulus (CS) to induce aversion to the novel taste (CS) when presented in the absence of the US. Population data of animals tested in the ASR experiment indicated no statistical significant difference between stressed and control animals. However, when each animal was assessed individually, 22.5 % of the exposed population displayed all increase above the predetermined criteria of 35 % in startle response, indicating a state of heightened arousal. In contrast, only 4.2 O h of control animals (no stress) displayed an increase in arousal based on the above mentioned criteria. Muscarinic receptor densities (Bm,) in the total population of animals exposed to stress showed a statistical significant increase in both the hippocampus and frontal cortex when compared to controls, with no changes in & values observed in either one of the areas. In the CTA experiment, TDS stress was implemented as US paired with a saccharinlcyclamate drinking solution as CS. An acute session of prolonged stress (as used in the TDS model) effectively induced aversion to a novel taste and a subsequent reminder of the stress (restress) paired with the CS sustained the acquire adversive memory. Furthermore, LiCl was reintroduced as US in order to assess the effect of prior exposure to two types of stress (acute and TDS) on subsequently acquired CTA memory. Prior exposure to acute stress had no significant effect on subsequently acquired aversive memory when measured either 3- or 7 days post-conditioning (CS-US). Stress-restress (TDS) exposure, however, indicated a significant decrease in aversive memory from 3- to 7 days post-conditioning (CS-US) as well as a significant decrease in aversive memory between the control- and the TDS group 7 days post-conditioning. The mAChR density (B,,) in the frontal cortex; but not in the hippocampus, was elevated at the same point in time (7 days post CS-US pairing) that CTA memory was impaired following TDS stress (stress-restress). Ultimately, these data support an association between altered cholinergic receptors and hyperarousallanxiety in an animal model of PTSD. The data also support the phenomenon of individual susceptibility to stress in animals that parallels that observed in humans exposed to severe trauma. Impaired aversive memory (CTA) is a consequence of prior exposure to TDS stress, but not acute stress, and is likewise mediated by an altered central cholinergic transmission displayed as an increase in mAChRs in the frontal cortex. The lack of studies regarding the influence of the cholinergic system in PTSD related behavior earns ,this project value as inimitable PTSD research. / Thesis (M.Sc. (Pharmacology))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2007.

Myopia is a refractive defect of the eye in which collimated light produces images focused in front of the retina. Myopia can be artificially induced in animal models by form deprivation (form deprivation myopia, FDM) or by application of negative lenses (lens induced myopia, LIM). In this study myopia was induced using diffusers. The project had two main aims: 1. To determine if there is an interaction between the GABAergic system and dopaminergic system in the retina in terms of myopia? 2. To determine if there is an interaction between the GABAergic system and cholinergic system in the retina in terms of myopia? Firstly, an experiment focusing on the interaction between dopaminergic receptors antagonists and GABAC receptor antagonist was developed. Comparison of the different drug treated eye with the control was found and the effects of combination injections were compared to individual drug injections. Use of different blockers for various subtype of receptors simplified the understandings the underlying pharmacological interventions for GABAC receptor antagonist TPMPA. The D1 subtype of receptors was found to be involved in transmission of signals from GABAC receptors. Our results showed that D1 receptor antagonist SCH-23390 antagonizes the actions of TPMPA. In addition to this it was also found that possibly 5HT receptor may also play an important role in modulation of signaling from GABA receptor to dopaminergic receptors in the retina. These results were consistent with the drug combination effects for agonists. GABA A/C receptor agonist muscimol negativate the efficacy of D1 receptor agonist SKF-38393 but the activity of D2/4 receptor agonist quinpirole was not affected by muscimol. Although dopaminergic receptors are found to interact with GABAergic signaling, but an alternative interaction with anticholinergic (most widely studied antimyopic agents) could not be ruled out. This problem led to a follow-up experiment, in which GABA receptors intervention in anticholinergic agents was studied. The GABAergic receptor agonist muscimol when injected with anticholinergics (atropine and pirenzepine) showed a moderate interaction. As muscimol interacted with atropine to a lesser extent a more specific M1/5 receptor antagonist pirenzepine (earlier found to inhibit myopia) was used under these circumstances. The second aim to study the interaction between muscimol and pirenzepine showed more interaction with GABAA/C receptor agonist. There were data suggesting that there is a muscarinic and GABAergic interaction in retina, such that each modulation of each receptor had an effect on FDM. However, a drug combination treatment helped in understanding the underlying mechanism. Several previous studies have indicated that there exist a strong interaction between excitatory neurotransmitter acetylcholine and inhibitory transmitter GABA in retina. The results of this study indicate a similar finding. Thus results of this study may be summarized as: 1. D1 antagonists and not D2 antagonists blocks the antimyopic effects of GABAC antagonist TPMPA 2. GABA A/C agonist muscimol partially blocks the antimyopic activity of anticholinergics (e.g. atropine and pirenzepine).

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O câncer de esôfago (CE) é uma doença extremamente agressiva e é um dos tumores mais incidentes e letais no Brasil e no mundo, sendo o carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) o principal subtipo histológico, apresentando como principais fatores de risco o etilismo e o tabagismo na população ocidental. A exposição concomitante desses dois fatores representa um risco multiplicador para o desenvolvimento de CEE, sendo que o fumo parece ter um papel importante tanto na iniciação quanto na promoção do tumor, enquanto o álcool teria um papel mais relevante na promoção. Componentes do tabaco, como a nicotina e as nitrosaminas são potentes carcinógenos e agonistas de alta afinidade dos receptores colinérgicos nicotínicos (CHRNs), podendo atuar ativando vias de sinalização celular fundamentais para a progressão tumoral. Pouco se sabe sobre a expressão e regulação dos CHRNs na mucosa esofágica e no processo de carcinogênese desse tecido. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar a expressão gênica dos CHRNs no epitélio esofágico normal e em CEE, bem como sua regulação pelos fatores de risco associados ao tumor. Foi observado que as subunidades &#945;3, &#945;5, &#945;7 e &#946;4 são expressas no epitélio esofágico saudável humano enquanto as subunidades &#945;1, &#945;4, &#945;9 e &#945;10 apresentaram baixa ou nenhuma expressão nesse mesmo tecido. Além disso, foram encontradas diferenças de expressão das subunidades &#945;3 e &#945;7 em indivíduos etilistas e tabagistas quando comparados com indivíduos não-etilistas (subunidade &#945;3) e não-tabagistas (subunidade &#945;7). Nas amostras de CEE, as subunidades CHRNA5 e CHRNA7 foram encontradas superexpressas no tumor quando comparado ao tecido normal adjacente e observou-se diferença de expressão da subunidade &#945;7 no tumor comparado com o tecido saudável e a subunidade &#946;4 apresentou-se mais expressa no tecido tumoral e no tecido normal adjacente ao tumor do que no epitélio esofágico saudável. Entretanto, não foram encontradas diferenças de expressão de nenhuma das subunidades avaliadas nas linhagens CEE quando submetidas a tratamento com nicotina ou etanol. Os resultados obtidos sugerem uma participação dos CHRNs na fisiologia do epitélio esofágico e que os fatores de risco associados ao desenvolvimento de CEE parecem ser capazes de afetar a expressão desses receptores no epitélio esofágico. / Esophageal cancer (EC) is an extremely aggressive disease and it is one of the most incident and lethal cancers in the world and in Brazil. Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is the main histological type of EC, being associated with alcohol and tobacco consumptiom. In Western countries, the concomitant use of these two factors provides a multiplying risk for the development of ESCC, and smoking seems to play an important role in both tumor initiation and promotion, while alcohol seems to have a more important role in promoting the tumor. Tobaccos components like nicotine and nitrosamines are powerful carcinogens as well as high-affinity agonists of nicotinic cholinergic receptors (CHRNs). The activation of CHRNs by tobacco components results in the activation of key cellular signaling pathways for cancer progression. Very little is known about the expression and regulation of CHRNs in esophageal mucosa and carcinogenesis process. Thus, the objective of this study was to analyze the expression of CHRNs subunits in healthy esophageal mucosa and ESCC. Furthermore, we aimed to investigate whether etiologic factors associated with ESCC development could affect the expression of these receptors. According to our results, &#945;3, &#945;5, &#945;7 and &#946;4 subunits are expressed in human normal esophagus whereas &#945;1, &#945;4, &#945;9 e &#945;10 subunits showed very low or no expression in the same tissue. Besides, there were differences in the expression of &#945;3 and &#945;7 subunits in alcoholic and smokers when compared with non- alcoholic (&#945;3 subunit) and nonsmokers (&#945;7 subunit). Regarding ESCC analyses, CHRNA5 and CHRNA7 were found overexpressed in tumor tissues when compared to surrounding mucosa. There were differences in the expression of &#945;7 subunit in tumor tissues compared to healthy tissue and of &#946;4 subunit in tumor tissue and surrounding mucosa compared to healthy tissue. No differences were found in the expressions of these subunits in esophageal cancer cell lines exposed to nicotine or ethanol. These results suggest that CHRNs play a role in esophageal physiology and that ESCC etiological factors seem to be able to affect the expression of these receptors.

o óxido nítrico tem sido apontado como um importante fator de desenvolvimento neural, participando ativamente como sinalizador espacial durante o processo de refinamento sináptico. Avaliamos nesse estudo a participação do óxido nítrico durante esse processo em tectos ópticos de embriões de pintos (Gallus gallus). Para tal avaliamos a imunorreatividade dos neurônios para as proteínas que formam os receptores colinérgicos e glutamatérgicos em diferentes fases do desenvolvimento embrionário, com e sem o bloqueio farmacológico da enzima de síntese do óxido nítrico (NOS). Durante o desenvolvimento embrionário, as subunidades GluR2/3 dos receptores glutamatérgicos são as que aparecem mais precocemente, no 6°dia de desenvolvimento embrionário (E6), juntamente com os neurônios imunorreativos para NOS e somente a partir de E8 é possível identificar a arquitetura laminar típica do tecto óptico.O bloqueio farmacológico da NOS mostrou diferentes padrões de marcação dependendo do tempo de sobrevida do animal. Em animais eutanasiados 24 h após o bloqueio farmacológico observou-se uma alteração na organização das camadas e no padrão radial de organização dos neurônios imunorreativos. Esse dado sugere que haja um atraso no refinamento sináptico, que se reflete em desorganização das camadas do tecto e alterações morfológicas nos neurônios. / O óxido nítrico tem sido apontado como um importante fator de desenvolvimento neural, participando ativamente como sinalizador espacial durante o processo de refinamento sináptico. Avaliamos nesse estudo a participação do óxido nítrico durante esse processo em tectos ópticos de embriões de pintos (Gallus gallus). Para tal avaliamos a imunorreatividade dos neurônios para as proteínas que formam os receptores colinérgicos e glutamatérgicos em diferentes fases do desenvolvimento embrionário, com e sem o bloqueio farmacológico da enzima de síntese do óxido nítrico (NOS). Durante o desenvolvimento embrionário, as subunidades GluR2/3 dos receptores glutamatérgicos são as que aparecem mais precocemente, no 6°dia de desenvolvimento embrionário (E6), juntamente com os neurônios imunorreativos para NOS e somente a partir de E8 é possível identificar a arquitetura laminar típica do tecto óptico.O bloqueio farmacológico da NOS mostrou diferentes padrões de marcação dependendo do tempo de sobrevida do animal. Em animais eutanasiados 24 h após o bloqueio farmacológico observou-se uma alteração na organização das camadas e no padrão radial de organização dos neurônios imunorreativos. Esse dado sugere que haja um atraso no refinamento sináptico, que se reflete em desorganização das camadas do tecto e alteração morfológicas nos neurônios.