Orientador: Ana Paula de Souza Pardo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:44:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guedes_RogerAntoniaci_M.pdf: 960151 bytes, checksum: c0a68bdbdf663d427c182550b1d9fa14 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A periodontite é caracterizada pela inflamação do periodonto, o tecido de suporte dos dentes. Este processo inflamatório pode evoluir da fase aguda para a fase crônica, acarretando severa destruição dos tecidos periodontais como também grave perda de inserção dos dentes ao osso alveolar. É evidente que o acúmulo de patógenos periodontais sobre a superfície dos dentes desencadeia a doença, porém seu agravamento e severidade também são dependentes de fatores ambientais, socioeconômicos, tabagismo, condição de saúde sistêmica e carga genética dos indivíduos. Desta forma, vários pesquisadores têm se dedicado a estudar a influência dos polimorfismos genéticos sobre a suscetibilidade e/ou risco aumentado à doença periodontal, uma vez que estes podem exercer efeito sobre o prognóstico da periodontite crônica. Estudos têm relatado associação entre vários polimorfismos genéticos com a inflamação periodontal. Há ainda estudos em larga escala onde grande parte do genoma (GWA) foi investigado, relatando efeito da genética do hospedeiro sobre a resposta à doença. Desde modo, considerando a hipótese de associação entre periodontite e polimorfismos no gene SOCS1 que expressa uma proteína chave no controle da via intracelular JAK/STAT ativada por diversas citocinas pró-inflamatórias presentes na inflamação periodontal, nosso objetivo neste estudo foi estudar a frequência dos genótipos, alelos e haplótipos dos polimorfismos SOCS1-1478 (rs33989964) e SOCS1-820 (rs33977706) em grupo de indivíduos com saúde periodontal e indivíduos com periodontite crônica, na tentativa de observar associação entre variações no gene SOCS1 com a doença periodontal crônica. Para tal, DNA genômico foi purificado de células epiteliais bucais obtidas por meio de enxágue com dextrose a 3%. Após, os genótipos foram identificados com a utilização das técnicas de PCR/ RFLP/ eletroforese. Análises estatísticas possibilitaram a observação da associação do polimorfismo SOCS1 -820 (rs33977706) com os casos de periodontite crônica mais severa / Abstract: The periodontitis is characterized by the periodontium inflammation, the supporting tissue of the teeth. This inflammatory disorder might evolve from the acute to the chronic phase, causing severe periodontal tissue destruction as well as teeth insertion loss in the alveolar bones. It is evident that the accumulation of periodontal pathogens on the teeth surface origins the disease, yet its aggravation and severity also depend on socioeconomic and environmental factors, smoking, systemic health condition and the genetic background of the subjects. Thus, several researchers have focused their studies on the influence of the genetic polymorphisms in the susceptibility and/or increased risk to the periodontal disease, once they might play a role on the chronic periodontitis prognosis. Studies have shown association between several genetic polymorphisms and periodontal inflammation. Still, there are large-scale studies in which the majority of the genome (GWA) has been investigated, reporting genetic host roles as responses to the disease. Thus, considering the hypothesis of association between periodontitis and polymorphisms in the SOCS1 gene which expresses a key protein in the control of the intracellular JAK/STAT via activated by varied pro-inflammatory cytokines found in the periodontal inflammation, we aimed to study the frequency of genotypes, alleles and haplotypes of the polymorphisms SOCS1-1478 (rs33989964) and SOCS1-820 (rs33977706) in a healthy periodontal subjects group and in a chronic periodontal subjects group, attempting to observe association between variations in the SOCS1 gene and the chronic periodontal disease. To do so, genomic DNA was purified from mouth epithelial cells collected through 3% dextrose rinse. Afterwards, the genotypes were identified by the use of PCR/RFLP electrophoresis techniques. Statistical analysis allowed us to observe association of SOCS1-820 polymorphism (rs33977706) with more severe chronic periodontitis cases / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Asma alérgica é uma inflamação pulmonar crônica mediada por células Th2. A Hipótese da Higiene é a teoria aceita para explicar o aumento das alergias nas últimas décadas e preconiza que a menor exposição dos indivíduos a componentes microbianos prejudica a geração mecanismos imunorregulatórios. Nosso estudo abordou a modulação da resposta alérgica pulmonar induzida por ovalbumina, por cepas de bacilo Calmette-Guérin recombinantes (rBCG) que expressam fragmentos de toxinas bacterianas. Observamos que dependendo do antígeno heterólogo expresso, a imunização intranasal com rBCG pode levar tanto a supressão como a exacerbação da resposta alérgica pulmonar. Demonstramos que tanto em um contexto profilático quanto terapêutico, rBCG é capaz de suprimir os parâmetros alérgicos, e a supressão não envolve o recrutamento de células T regulatórias, é um fenômeno local, está associada a maior produção de IFN-g do que IL-4 e é dependente de IL-12. Estes dados sugerem que a infecção pulmonar por rBCG gera um milieu capaz de bloquear a migração de células Th2 inflamatórias. / Allergic asthma is an atopic disorder mediated by Th2 cells. The Hygiene Hypothesis is the accepted theory to explain the increasing in allergy in recent deacades. It states that modern health care and hygiene practices have led to a reduced exposure to microorganisms components which impairs the generation of immunoregulatory mechanisms. The present study analysed how the intranasal infection with recombinant bacillus Calmette-Guérin (rBCG) strains expressing fragments of bacterial toxins could modulate an allergic pulmonary inflammation induced by ovalbumin. We demonstrated that the rBCG strains could supress or exacerbate the allergic inflammation depending on the expressed heterologous antigen. We analysed the effect of the mycobacterial infection in a prophylactic and in a therapeutical contexts, and we have identified that for both situations the of supression allergic features does not involve the recruitment of regulatory T cells to the lungs, is a local phenomena, is associated with an increased production of IFN-g, and is an IL-12 dependent mechanism. Taken togheter, this data suggest that the rBCG pulmonary infection generates a milieu capable to supress the chemotaxis for Th2 cells, which suppress the establishment of the allergic inflammation in the lungs.

A erliquiose monocitotrópica canina é caracterizada como uma infecção persistente, podendo evoluir para doença fatal. Mecanismos imunopatogênicos estão implicados no desenvolvimento da doença, porém não é completamente compreendido o papel da resposta imune celular nas infecções causadas por Ehrlichia canis transmitida pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus. A infecção do vetor ocorre somente durante o repasto em cães riquetsêmicos, porém não é reconhecido o nível de riquetsemia infectante durante o curso da infecção nos cães. O objetivo desse estudo foi verificar os níveis de riquetsemia relativa capazes de infectar o vetor (R. sanguineus) durante o curso da erliquiose canina; e avaliar a resposta imune celular induzida por exposição de cães a carrapatos infectados com Ehrlichia canis. Um cão foi utilizado para produção do inoculo e infecção de ninfas de R. sanguineus. Subseqüentemente, os carrapatos adultos infectados, oriundos das ninfas que se alimentaram nos cães infectados, foram utilizados para infecção dos cães dos grupos I (n=3) e II (n=3). Cães do grupo III (n=3) foram inoculados com sangue infectado com E. canis, por via intravenosa. Os grupos IV (n=3) e V (n=3) foram compostos por cães não infectados. Os grupos II e IV foram reinfestados periodicamente com ninfas não infectadas de R. sanguineus. Foram observadas, alterações clínicas como febre, apatia e disorexia nos cães infectados, durante a fase aguda da infecção, porém de forma mais intensa e precoce nos cães infectados por inoculação intravenosa (grupo III). As alterações hematológicas mais evidentes foram redução do número de plaquetas, leve redução na série vermelha e branca. Todos os animais infectados soroconverteram aos 14 dias após inoculação ou infestação com carrapatos infectados (dpi), mantendo títulos entre 10240 e 81920. Os níveis de riquetsemia foram variáveis durante o curso da infecção, persistindo até 364 dpi, porém mais constante na fase aguda da doença. Um pequeno número de carrapatos alimentados nos cães infectados apresentou amplificação de DNA de E. canis, porém foram demonstrados até 308 dpi. Foi observada uma redução na relação CD4:CD8 nos animais infectados, no 28° dpi, mantendo-se de forma mais branda até 252 dpi. Uma maior proporção de linfócitos T CD4+ produtores de IFN-γ e IL-4 foi observada no tempo zero de cães que não adquiriram infecção após infestação com carrapatos infectados. Os níveis séricos de citocinas mostraram de forma mais evidente a elevação de IL-10 e TNF-α em um cão que desenvolveu doença fatal, podendo indicar a participação de mecanismos imunes na apresentação clínica e na persistência do agente no organismo hospedeiro. / The canine monocytic ehrlichiosis is characterized as a persistent infection, which can develop fatal disease. Immunopathogenic mechanisms are implicated in the development of the disease, however it is not completely understood the role of cellular immune in the infection caused by Ehrlichia canis transmitted by the tick Rhipicephalus sanguineus. The vector becomes infected only while feeding on rickettsemic dogs, however the level of rickettsemia is not recognized during the course of the infection in the dogs. The objective of this study was to verify the level of relative rickettsemia capable to infect the vector (R. sanguineus) during the course of the canine ehrlichiosis; and to evaluate the cellular immune induced in dogs exposed to Ehrlichia canis-infected ticks. A dog was used for production of the inoculum and infection of nymphs of R. sanguineus. Infected adult ticks that had fed as nymphs on the infected dog were used to feed on and transmit the infection to dogs of groups I (n=3) and II (n=3). Group III dogs (n=3) were intravenously inoculated with E. canis-infected dogs. Group IV (n=3) and V (n=3) dogs were the control groups, never exposed to E. canis. Dogs of groups II and IV were reinfested periodically with uninfected R. sanguineus nymphs. Clinical alterations such as fever, apathy and dysorexia were observed in the infected dogs during the acute phase of the infection, however in a more intense and precocious form in the dogs infected by intravenous inoculation (group III). The more evident hematological alterations were reduction of the number of platelets, mild reduction in the red and white cells series. All infected animals soroconverted by 14 days after inoculation or infestation by infected ticks (dpi), showing titers between 10240 and 81920 during the study. The rickettsemia levels were variable during the course of the infection, persisting up to 364 dpi, however more constant in the acute phase of the disease. A small number of ticks that fed on infected dogs presented amplification of E. canis DNA, however they were demonstrated up to 308 dpi. A reduction in the relationship CD4:CD8 in the infected animals was observed in 28th dpi, keeping in a mild form up to 252 dpi. A larger proportion of lymphocytes T CD4+ producing IFN-γ and IL-4 it was observed in the zero time of dogs that did not acquire infection after infestation with infected ticks. The cytokine seric levels showed the elevation in a more evident form of IL-10 and TNF-α in a dog that developed fatal disease, what could indicate the participation of immune mechanisms in the clinical presentation and in the persistence of the agent in the organism host.

Este estudo clínico avaliou a quantidade de bactérias e endotoxinas, antes e após o tratamento endodôntico utilizando ativação ultrassônica de solução de hidróxido de cálcio e sua correlação com a indução de citocinas pró-inflamatórias por fibroblastos humanos. Vinte e três pacientes com dentes com periodontite apical primária foram submetidos ao tratamento endodôntico. O preparo químico-cirúrgico (PQC) foi realizado com instrumentos reciprocantes, utilizando NaOCl 2,5% durante o preparo e EDTA 17% para remoção do magma dentinário; complementado com a ativação ultrassônica de uma solução de hidróxido de cálcio. Os canais radiculares foram preenchidos com pasta de hidróxido de cálcio por 14 dias e obturados. Foram realizadas coletas microbiológicas dos canais antes (S1) e após o PQC (S2), após o protocolo de ativação ultrassônica (S3) e após a medicação intracanal (S4). As amostras foram analisadas por: PCR quantitativo (qPCR) utilizando iniciadores universais para quantificação de bactérias após extração de DNA; teste turbidimétrico de LAL para quantificação de endotoxinas; e ELISA para quantificação de citocinas (IL-1?, IL-6, CCL2) em cultura de fibroblastos humanos após indução com o conteúdo do canal radicular. Os dados foram analisados pelos seguintes testes estatísticos: teste de Wilcoxon e Q de Cochran para análise quantitativa de bactérias e endotoxinas; ANOVA e teste de Tukey, para quantificação dos níveis de citocinas; e teste de Pearson para correlação entre os níveis de endotoxinas e citocinas (todos com nível de significância de 5%). Bactérias e endotoxinas foram observadas em todas as amostras iniciais com uma mediana de 3,61 x 104 e 109 EU/ml, respectivamente. Após o preparo químico-cirúrgico, houve uma redução significativa (p <0,05) dos níveis de DNA bacteriano (mediana 7,84 x 103) e endotoxina (mediana 20,2 EU/ml). Entretanto, não houve redução de DNA bacteriano após as etapas seguintes. Com relação a endotoxina, houve redução significativa (p <0,05) após a medicação intracanal (9,58 EU/mL). Correlação positiva foi observado entre os níveis de endotoxina e a indução de citocinas pró-inflamatórias. Produção de IL-1?, IL-6, CCL2 foram observadas em todas as etapas do tratamento. Não houve diferença estatística dos níveis de IL-1 ? detectados nas diferentes amostras (p >0,05). Houve diminuição significativa de IL-6 e CCL-2 entre S1 e S2 (p <0,05). Entretanto, não houve redução dessas citocinas nas amostras S3 ou S4 em relação às amostras S2 (p >0,05). Conclui-se que o PQC foi eficaz na redução de bactérias e endotoxinas dos canais radiculares; enquanto a medicação intracanal influenciou apenas na redução de endotoxina. As amostras após o PQC induziram menores níveis de IL-6 e CCL-2 em fibroblastos humanos do que as amostras antes do tratamento endodôntico. Por outro lado, as demais etapas do tratamento não foram capazes de promover uma redução adicional dessas citocinas. / This clinical study analyzed bacteria and endotoxins levels before and after endodontic treatment using ultrasonic activation of a calcium hydroxide solution and an intracanal medication and its correlation with pro-inflammatory cytokines induction by human fibroblasts. Twenty-three patients with teeth with primary apical periodontitis were submitted to endodontic treatment. The root canal preparation of all the teeth was carried out with reciprocating files and 2.5% NaOCl during preparation; and 17% EDTA for smear layer removal, supplemented with the ultrasonic activation of a solution of calcium hydroxide. The root canals were medicated with calcium hydroxide for 14 days and then obturated. Microbiological sampling were performed before (S1) and after the root canal preparation (S2), after ultrasonic activation protocol (S3) and after intracanal medication (S4). The samples were analyzed by quantitative PCR (qPCR) using universal primers quantification of bacteria after DNA extraction; LAL turbidimetric test for detection and determination of endotoxin and ELISA for evaluate the cytokine production (IL-1?, IL-6, CCL2) by humam fibroblasts culture. Data was analyzed by Wilcoxon and Q cochran tests for the quantitative analysis of bacteria and endotoxins. ANOVA and tukey test, with significance level of 5%, were used for quantification of cytokine levels and Pearson\'s test for correlation between endotoxins and cytokine levels. Bacteria and endotoxins were observed in all initial samples with a median of 3.61 x 104 and 109 EU/ml respectively. After root canal preparation, there was a significant reduction (p<0,05) of bacterial DNA (median 7.84 x 103) and endotoxin (median 20.2 EU/ml). However, there was no reduction of bacterial DNA after following steps. Regarding endotoxin, there was a significant reduction (p <0.05) after intracanal medication (9.58 EU / mL), A positive correlation was observed between endotoxins and cytokine induction. Production of IL-1?, IL-6, CCL2 were observed in all stages of treatment.. There was no statistical difference between the presence of IL-1? in each step of the treatment (p >0.05). There was a significant decrease in the presence of the proinflammatory cytokine IL-6 and CCL-2 between the initial stage of endodontic treatment (S1) and the next step (S2) (p <0.05). However, in the following steps (S3 and S4) there was no reduction (p >0.05). It was concluded that the root canal preparation was effective in reducing bacteria and endotoxins, and intracanal medication only influenced in endotoxin reduction. Samples after the root canal preparation induced lower levels of IL-6 and CCL-2 in human fibroblasts than samples before endodontic treatment, whereas other stages of the endodontic treatment were not able to promote an additional reduction.

As distrofias musculares (DM) se caracterizam por degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Dentre estas, a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), constitui doença letal ligada ao cromossomo X, caracterizada pela ausência de distrofina na membrana das fibras musculares, afetando um em cada 3.000 meninos nascidos vivos, sendo que a maioria será confinada à cadeira de rodas a partir dos 6 anos de idade e com sobrevida, sem cuidados especiais, em torno dos 25. Apesar do uso de técnicas modernas de diagnóstico, ainda não existe tratamento eficaz para essas doenças. Alguns trabalhos das décadas de 70 e 80 sugeriram que a inibição do hormônio do crescimento (GH) poderia retardar a evolução do processo distrófico de pacientes com DMD. Entretanto, como essas observações não foram comprovadas cientificamente até a presente data, neste trabalho estudamos os efeitos do excesso e da inibição do GH na evolução do quadro distrófico em modelo murino de distrofia muscular: i) administrou-se GH (10&#956;g/ camundongo/dia, i.p., por 10 dias) em camundongos: a) distróficos dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J) com fenótipo, resultando na aceleração dos sintomas da doença, traduzida pela piora das performances de 17% no teste de deambulação (TD), 64% no teste de sustentação (TS), 28% no teste da esteira (TE) e 55% no teste de força máxima (TFM), em relação aos distróficos que não tomaram GH; apenas no teste de resistência à inclinação (TRI) não houve diferença significativa; entretanto, cortes histológicos do músculo gastrocnêmico desses camundongos, não mostraram alterações significativas em relação aos distróficos que não tomaram a droga; quanto aos marcadores de degeneração e regeneração (MDR) na musculatura desses animais, o GH não alterou os níveis de Pax7, MyoD, Laminina e Desmina, mas aumentou de 90% os níveis de TGF&#946;-1, uma citocina inflamatória que induz fibrose; b) já nos camundongos normais, o GH, ao contrário dos resultados acima, aumentou as performances de 13% no TD e de 28% TS, e ligeiramente, de forma não significativa, em outros dois testes; cortes histológicos revelaram que o GH aumentou de 16,5% a área de secção transversal dos músculos desses animais, o que poderia explicar os resultados descritos acima; já os níveis dos MDR, incluindo o de TGF&#946;-1, estavam semelhantes aos dos animais controles; ii) desenvolveu-se um novo modelo experimental resultante de cruzamentos de camundongos geneticamente deficientes em GH (Ghrhrlit) com os distróficos dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J), mostrando um retardo na evolução da doença: as performances dos anões distróficos em relação aos anões normais foram melhores que aquelas dos distróficos em relação aos animais normais, ou sejam, 14% maior TD, 71% maior no TS, 18% maior no TE, 5,5% maior no TRI e 102% maior no TFM; cortes histológicos mostraram que a área do interstício nos músculos dos anões distróficos foi 29% menor que a dos distróficos não anões; os níveis de TGF&#946;-1 nestes animais, foram os únicos entre aqueles dos MDR estudados, que encontravam-se diminuidos de 36% em relação àqueles dos distróficos não anões; iii) a inibição da liberação do GH pela octreatida, análogo da somatostatina, mostrou também uma relativa melhora ou uma estabilização na evolução do quadro distrófico, traduzido pelo aumento, após 60 dias de tratamento, das performances nos testes funcionais da musculatura em relação àquelas dos animais distróficos sem tratamento: foi 12% maior no TD enquanto os distróficos controles diminuíram em 14%; foi 27% maior no teste de Rota Rod, enquanto os distróficos controles diminuíram em 32%; mantiveram a mesma performance no TE, enquanto os distróficos controles pioraram em 23%, e foram 29% maiores no TS, e 43% no teste de força de preensão, enquanto os distróficos controles não melhoram as suas performances nestes testes. Esses resultados sugerem um efeito patológico do GH na musculatura distrófica, com seu excesso levando a uma piora da doença, possivelmente através do aumento dos níveis de TGF&#946;-1. A diminuição do GH, consequentemente, poderia levar a um retardo da evolução da doença. Estes estudos experimentais abrem perspectivas bastante promissoras para se testar inibição dos efeitos do GH na evolução das doenças distróficas humanas. / Muscular dystrophies (DM) are characterized by progressive and irrevertible degeneration of the skeleton muscles. Among them, Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) consitutes lethal disease linked to chromossome X, distinguished by the absence of dystrophyn in the muscular fibers membrane, affecting one in each 3,000 boys born alive, who, most of them, will be confined to wheel chairs since the age of 6 and with life expectance, without special care, of 25 years. Despite modern diagnosis techniques, there is not an efficient treatment for these diseases. Some works from the 1970´s and 1980´s suggested that the inhibition of the growth hormone (GH) could retard the dystrophy process evolution in DMD patients. Nevertheless since this observation has not been proven scientifically, in the present work, the GH excess and inhibition effects on a murino model of muscular dystrophy, were studied: i) GH (10&#956;g/mouse/day, i.p., for 10 days) was given to mice: a) dystrophic dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J), with phenotype , resulting in the acceleration of the disease symptoms, confirmed by the performance worsening by 17% in the deambulation test (DT), 64% in the sustaining test (S), 28% in the mat test and 55% in the maximum strength test (MST), in relation to dystrophic mice which had not taken GH; only in the inclination resistance test (IRT) there was no significant difference; however, histological cuts of the gastrocnemius muscle of these mice did not show significant alterations, comparing to dystrophic mice which had not taken the drug: as to degeneration and regeneration markers (DRM) in these animals muscles, the GH did not alter Pax7, MyoD. Laminin and Desmin levels, although it increased by 90% the TGF&#946;-1 levels, an inflammatory cytokine, that induces fibrosis b) in normal mice, the GH, opposite to the results above, increased the performances by 13% in the DT and by 28% in the ST, and slightly, not significantly, in other two tests; histological cuts revealed that the GH increased by 16.5% the transversal section area of these animals muscles, what could explain the results described above; as to the MDR levels, including those of the TGF&#946;-1, they were similar to the control animals; ii) a new experimental model, resulting from the crossing of GH genetically deficient mice (Ghrthlit) with dystrophic dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J), showing retardation in the disease evolution; the performances of the dystrophic dwarfs, compared to the normal dwarfs, were better than those of the dystrophic compared to normal animals, namely, 14% larger DT, 71% superior in the ST, 18% larger in the MT, 5.5% larger in the IRT and 102% superior in the MST; histological cuts showed that the interstice area in the dystrophic dwarfs muscles was 29% smaller than that of non-dwarfs dystrophic; the TGF&#946;-1 levels in these animals were the only MDR studied, which were found to be diminished by 36%, compared to those of the non-dwarfs dystrophic; the GH release inhibition by octreotide, somatostatin analogous, also showed a relative improvement or stabilization in the dystrophy evolution, demonstrated by the increase, ater 60 days treatment, of the performances in the muscle functional tests, compared to those of the dystrophic animals, without treatment: it was 12% larger in the DT, while the control dystrophic animals worsened by 32%; they maintained the same performance in the ST, and 43% in the seizing strength test, while the control dystrophic did not improve their performances in these tests. These results suggest a GH pathologic effect, possibly through the TGF&#946;-1 levels increase. The GH diminishing, consequently, could lead to the retardation in the disease evolution. These experimental studies open promissing perspectives to test the GH effects inhibition in human dystrophic diseases evolution.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-05T21:05:38Z No. of bitstreams: 1 Bruno de Bezerril Andrade - 2010.pdf: 74164438 bytes, checksum: a1cccf3d1f924ff7710fc4a73a190f0a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-05T21:05:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno de Bezerril Andrade - 2010.pdf: 74164438 bytes, checksum: a1cccf3d1f924ff7710fc4a73a190f0a (MD5) / Universidade Federal da Bahia. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A malária é considerada uma das mais importantes doenças infecciosas do mxmdo. Esta doença é causada por diversas espécies do protozoário Plasmodium sp., principalmente o Plasmodium falciparum e o Plasmodium vivax, transmitido por mosquitos do gênero Anopheles. Apesar dos esforços governamentais e privados para o desenvolvimento de estratégias para o controle da doença, o panorama atual da malária está piorando, muito em razão do aparecimento de cepas de parasitas resistentes aos medicamentos. Os casos fatais são relatados principalmente na Áfiica e são causados pelo Plasmodium falciparum. Apesar de ser menos letal, a malária causada pelo Plasmodium vivax é mais amplamente distribuída e pode apresentar também alta morbidade e mortalidade. Na maioria das áreas endêmicas, estudos têm identificado vários fatores relacionados à imunidade clínica ou susceptibilidade aos parasitas. Assim, pelo menos quanto à malária causada pelo Plasmodium falciparum, idade, polimorfismos genéticos e exposição repetida ao parasita são considerados importantes determinantes da evolução da doença. Infelizmente, pouco tem sido feito na identificação de fatores preditores consistentes que poderiam ser usados para avaliação clínica. Este quadro é ainda pior para malária causada pelo Plasmodium vivax, provavelmente porque muitos pesquisadores consideram que é uma doença benigna. Além disso, como a maioria do conhecimento atual sobre a patogênese da malária não ajudou a reduzir a ocorrência da infecção e suas complicações, novas abordagens são necessárias para superar este cenário desfavorável. Esta Tese reúne um conjunto de seis manuscritos que visam identificar potenciais determinantes da gravidade da malária em uma área endêmica da Amazônia Ocidental Brasileira. Em primeiro lugar, um método preciso e eficaz para o diagnóstico da malária foi rastreado através da comparação de vários testes, incluindo um software baseado em redes neurais artificiais. O ensaio molecular mostrou-se o mais eficiente para o diagnóstico da malária sintomáticos e assintomáticos. Além disso, a utilização racional de um teste rápido para diagnóstico da malária pode ser promissora em áreas onde há dificuldade na formação continuada dos técnicos diagnósticos. A rede neural artificial indicou que o balanço de citocinas é um forte determinante do quadro clínico. Em outro estudo, uso de sorologia para mensuração de anticorpos IgG contra o sonicado de glândula salivar do vetor Anopheles darlingi mostrou-se útil para a avaliação da exposição ao Plasmodium vivax e também para estimar a imunidade clínica á malária. Em um terceiro estudo com foco na identificação de outros fatores relacionados à imunidade clínica, a exposição natural ao vírus da hepatite B mostrou-se associada à redução da gravidade clínica da malária causada tanto pelo Plasmodium vivax quanto pelo Plasmodium falciparum. No que diz respeito exclusivamente à malária vivax, os casos graves apresentaram uma intensa e desregulada resposta inflamatoria sistêmica. Nestes pacientes, a enzima antioxidante superóxido dismutase-1 surgiu como um excelente marcador da gravidade e mostrou-se envolvida na patogênese da doença grave, na qual há uma liberação de grandes quantidades de heme livre. Em conjunto, os manuscritos desta tese adicionam importantes informações no entendimento dos mecanismos determinantes da gravidade da malária, extremamente / Malaria is considered one of the most important infectious diseases that ever threaten the world. This disease is caused mainly by the infection with Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax transmitted by Anopheles mosquitoes. Despite governmental and private efforts for the development of key strategies for the disease control, the actual panorama of the Plasmodium infection is getting worse due to the emergence of drug resistMt parasite strains. The lethal cases are reported mostly in Africa and are caused by Plasmodium falciparum. Albeit being less lethal, Plasmodium vivax infections are more widely distributed can cause high morbidity and eventually death. In most endemic areas, studies have indentified a number of factors related to clinical immunity or susceptibility to the parasites. Thus, at least regarding the falciparum malaria, age, genetic polymorphisms and repeated exposure to Plasmodium are considered most important determinants of the disease outcome. Unfortunately, little has been made in the screening of reliable predicting factors that could be ultimately used for clinical evaluations. This landscape is even worse for vivax malaria, probably because many researches consider it as a benign disease. Moreover, as most of the current knowledge about the malaria pathogenesis did not truly help to relieve the disease burden, new insights are necessary to overcome this unfavorable scenario. This thesis brings together a set of six manuscripts that aim to identify potential determinants of the disease severity linked to the immunopathogenesis in an endemic area from the western Brazilian Amazon. First, a precise and effective method for malaria diagnosis was screening by comparing multiple tests, including a software based of artificial neural networks. The molecular assay showed to be the most efficient for the diagnosis of symptomatic and asymptomatic malaria. In addition, the rational use of a rapid test for the diagnosis of malaria may be promising in areas where there is difficulty in continued training of technical human resources. The artificial neural network indicated that the cytokine balance is a strong determinant of the clinical presentation. In another study, the use of serology for measuring IgG antibodies against the sonicate salivary gland of Anopheles darlingi vector is a promising marker of exposure to Plasmodium vivax and can also estimate the clinical immunity. Intriguingly, the natural exposure to the hepatitis B virus appeared as an important factor associated with reduced clinical severity for both vivax and falciparum malaria. Concerning solely the vivax malaria, severe cases have an intense and unregulated inflammatory response. In these patients, the antioxidant enzyme superoxide dismutase-1 has emerged as an excellent marker of severity and was involved in the pathogenesis of the severe disease in which there is a release of large amounts of free heme. Together, the manuscripts of this thesis add important information in understanding the mechanisms that determine the severity of malaria.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-09-18T13:07:03Z No. of bitstreams: 1 Gabriela da Silva Cruz. Avaliação... 2014.pdf: 1237079 bytes, checksum: 7beefa52e21bd18ac4325a1c493249ba (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-18T13:07:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriela da Silva Cruz. Avaliação... 2014.pdf: 1237079 bytes, checksum: 7beefa52e21bd18ac4325a1c493249ba (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / O Trypanosoma cruzi é um parasita intracelular e agente causador da doença de Chagas, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Sabe-se que durante os processos de inflamação, regeneração e fibrose desencadeados pelo T. cruzi no hospedeiro há a participação de diversos mediadores e fatores. O objetivo deste trabalho foi avaliar a associação entre polimorfismos de nucleotídeos únicos com as formas clínicas e o grau de fibrose em pacientes com doença de Chagas. Os polimorfismos foram analisados por PCR em tempo real. Foram incluídos no estudo 55 pacientes com diagnóstico de doença de Chagas e classificados de acordo com a forma clínica da doença, sendo que 17 apresentavam a forma indeterminada, 15 a forma cardíaca sem disfunção ventricular e 23 a forma cardíaca com disfunção ventricular. Os genótipos CA dos polimorfismos do gene LGALS3 (rs4644 e rs4652); AG e GG do SOCS3 (rs4969170); CT e TT do IL-28B (rs12979860 e 8099917, respectivamente); AG, AG, CC, AG e AG do CLDN-1 (rs10212165, rs3909582, rs9865082, rs9880018 e rs9848283, respectivamente); e CC do CCL5 (rs2280789) foram estatisticamente mais frequentes em pacientes com a forma cardíaca do que com a forma indeterminada da doença. Com relação ao grau de fibrose, os genótipos CC dos polimorfismos do gene LGALS3 (rs4644 e rs4652); AA do SOCS3 (rs4969170); CC do rs12979860 e TT do rs8099917 do IL-28B; AA do rs10212165, AA, AG e GG do rs3909582, CC e CT do rs9865082, AG e GG do rs9880018 e AA do rs9848283 do gene CLDN1; e CC do CCL5 (rs2280789) foram estatisticamente mais frequentes em indivíduos com fibrose cardíaca <15% quando comparados com o grupo com fibrose ≥15%. Diante do exposto concluimos que os polimorfismos analisados podem ser úteis como futuros biomarcadores para estadiamento e conduta terapêutica em pacientes com doença de Chagas. / Trypanosoma cruzi is an intracellular parasite and the agent that causes Chagas disease, which affects millions of people worldwide. Several factors and mediators are known to actively participate in the inflammation, fibrosis and tissue regeneration, which is triggered by T. cruzi within the host. The aim of this study was to evaluate the association of single nucleotide polymorphisms with clinical forms and rate of fibrosis in Chagas disease patients. The polymorphisms were analyzed by real-time PCR. The study consisted of 55 Chagas disease patients that were classified according to the clinical form of the disease, including 17 patients presenting the indeterminate form, 15 patients presenting the cardiac form without ventricular dysfunction and 23 patients presenting the cardiac form with ventricular dysfunction. The genotypes of CA of LGALS3 gene polymorphisms (rs4644 and rs4652); AG and GG of SOCS3 (rs4969170); CT and TT of IL-28B (rs12979860 and 8099917, respectively); AG, AG, CC, AG and AG of CLDN-1 (rs10212165, rs3909582, rs9865082, rs9880018 and rs9848283, respectively); and CC of CCL5 (rs2280789) were significantly more frequent in patients presenting the cardiac form compared to patients presenting the indeterminate form. Regarding the degree of fibrosis, the CC genotype of polymorphisms of the genes LGALS3 (rs4644 and rs4652); AA of SOCS3 (rs4969170); CC of rs12979860 and TT of rs8099917 of the IL-28B; AA of rs10212165 and AA, AG and GG of rs3909582, CC and CT of rs9865082, AG and GG of rs9880018 and AA of rs9848283 of the gene CLDN1; and CC of CCL5 (rs2280789) were statistically more frequent in patients presenting <15% cardiac fibrosis when compared to patients presenting fibrosis ≥15%. Taken together, our results suggest that the polymorphisms analyzed may be useful biomarkers for therapeutic management of patients with Chagas disease.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLCN.pdf: 1049732 bytes, checksum: 3b15cb5910d99ba0eb9ffc041a1a9a86 (MD5) Previous issue date: 2006-10-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Boophilus microplus tick affects cattle productivity causing economic losses in the order of billions of dollars annually. It is know that tick saliva exert immunomodulatory effects, an evolutionary adaptation to the immune response of the host that can counteract tick feeding. It has been suggested that the outcome of many parasitic infections with regard to resistance or susceptibility is determined by the pattern of response involving Th1 and Th2 cells, which produce specific cytokines that may direct the immune response towards different mechanisms. Limited information is available regarding to the host response to B. microplus tick infestation. In an attempt to improve our knowledge about cattle immune-response to ticks, this work determined the expression levels of cytokines mRNAs in two groups of Nelore (Bos indicus) calves: one control and other challenged by tick infestation. Our results demonstrated a down-regulation of IL-2 (P < 0.03) mRNA levels in challenged animals, while no effect of tick challenge was observed for IL-4, IL-8, IL-12p35, TNF-&#945; and MCP-1. The down regulation of an important Th1 cytokine suggests a tendency towards a Th2 response pattern, which is in agreement with similar studies conducted with other tick-host models. / O carrapato Boophilus microplus afeta a produtividade bovina causando perdas econômicas na ordem de bilhões de dólares anualmente. Sabe-se que a saliva do carrapato exerce efeitos imunomodulatórios, uma adaptação evolutiva à resposta do hospedeiro que pode prejudicar a alimentação do carrapato. Tem sido sugerido que o resultado de muitas infecções parasitárias, com relação a resistência ou suscetibilidade, é determinada pelo padrão de resposta das células TH1 e TH2, as quais produzem citocinas específicas que podem direcionar a resposta imune para diferentes mecanismos. As informações relacionadas à resposta do hospedeiro ao B. microplus ainda é bastante limitada. Na tentativa de ampliar os conhecimentos sobre a resposta imune dos bovinos ao carrapato, este trabalho determinou os níveis de mRNA de algumas citocinas em dois grupos de bezerros da raça Nelore (Bos indicus): um grupo controle e um grupo desafiado por infestação de carrapatos. Nossos resultados demonstraram uma redução dos níveis de mRNA de IL-2 (P < 0.03) nos animais desafiados, enquanto nenhum efeito foi observado para IL-4, IL-8, IL-12p35, TNF-&#945; and MCP-1. A redução na expressão de uma importante citocina TH1 sugere uma tendência para o padrão de resposta TH2, o que está de acordo com estudos similares conduzidos em outros modelos carrapatohospedeiro.

A erliquiose monocitotrópica canina é caracterizada como uma infecção persistente, podendo evoluir para doença fatal. Mecanismos imunopatogênicos estão implicados no desenvolvimento da doença, porém não é completamente compreendido o papel da resposta imune celular nas infecções causadas por Ehrlichia canis transmitida pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus. A infecção do vetor ocorre somente durante o repasto em cães riquetsêmicos, porém não é reconhecido o nível de riquetsemia infectante durante o curso da infecção nos cães. O objetivo desse estudo foi verificar os níveis de riquetsemia relativa capazes de infectar o vetor (R. sanguineus) durante o curso da erliquiose canina; e avaliar a resposta imune celular induzida por exposição de cães a carrapatos infectados com Ehrlichia canis. Um cão foi utilizado para produção do inoculo e infecção de ninfas de R. sanguineus. Subseqüentemente, os carrapatos adultos infectados, oriundos das ninfas que se alimentaram nos cães infectados, foram utilizados para infecção dos cães dos grupos I (n=3) e II (n=3). Cães do grupo III (n=3) foram inoculados com sangue infectado com E. canis, por via intravenosa. Os grupos IV (n=3) e V (n=3) foram compostos por cães não infectados. Os grupos II e IV foram reinfestados periodicamente com ninfas não infectadas de R. sanguineus. Foram observadas, alterações clínicas como febre, apatia e disorexia nos cães infectados, durante a fase aguda da infecção, porém de forma mais intensa e precoce nos cães infectados por inoculação intravenosa (grupo III). As alterações hematológicas mais evidentes foram redução do número de plaquetas, leve redução na série vermelha e branca. Todos os animais infectados soroconverteram aos 14 dias após inoculação ou infestação com carrapatos infectados (dpi), mantendo títulos entre 10240 e 81920. Os níveis de riquetsemia foram variáveis durante o curso da infecção, persistindo até 364 dpi, porém mais constante na fase aguda da doença. Um pequeno número de carrapatos alimentados nos cães infectados apresentou amplificação de DNA de E. canis, porém foram demonstrados até 308 dpi. Foi observada uma redução na relação CD4:CD8 nos animais infectados, no 28° dpi, mantendo-se de forma mais branda até 252 dpi. Uma maior proporção de linfócitos T CD4+ produtores de IFN-&gamma; e IL-4 foi observada no tempo zero de cães que não adquiriram infecção após infestação com carrapatos infectados. Os níveis séricos de citocinas mostraram de forma mais evidente a elevação de IL-10 e TNF-&alpha; em um cão que desenvolveu doença fatal, podendo indicar a participação de mecanismos imunes na apresentação clínica e na persistência do agente no organismo hospedeiro. / The canine monocytic ehrlichiosis is characterized as a persistent infection, which can develop fatal disease. Immunopathogenic mechanisms are implicated in the development of the disease, however it is not completely understood the role of cellular immune in the infection caused by Ehrlichia canis transmitted by the tick Rhipicephalus sanguineus. The vector becomes infected only while feeding on rickettsemic dogs, however the level of rickettsemia is not recognized during the course of the infection in the dogs. The objective of this study was to verify the level of relative rickettsemia capable to infect the vector (R. sanguineus) during the course of the canine ehrlichiosis; and to evaluate the cellular immune induced in dogs exposed to Ehrlichia canis-infected ticks. A dog was used for production of the inoculum and infection of nymphs of R. sanguineus. Infected adult ticks that had fed as nymphs on the infected dog were used to feed on and transmit the infection to dogs of groups I (n=3) and II (n=3). Group III dogs (n=3) were intravenously inoculated with E. canis-infected dogs. Group IV (n=3) and V (n=3) dogs were the control groups, never exposed to E. canis. Dogs of groups II and IV were reinfested periodically with uninfected R. sanguineus nymphs. Clinical alterations such as fever, apathy and dysorexia were observed in the infected dogs during the acute phase of the infection, however in a more intense and precocious form in the dogs infected by intravenous inoculation (group III). The more evident hematological alterations were reduction of the number of platelets, mild reduction in the red and white cells series. All infected animals soroconverted by 14 days after inoculation or infestation by infected ticks (dpi), showing titers between 10240 and 81920 during the study. The rickettsemia levels were variable during the course of the infection, persisting up to 364 dpi, however more constant in the acute phase of the disease. A small number of ticks that fed on infected dogs presented amplification of E. canis DNA, however they were demonstrated up to 308 dpi. A reduction in the relationship CD4:CD8 in the infected animals was observed in 28th dpi, keeping in a mild form up to 252 dpi. A larger proportion of lymphocytes T CD4+ producing IFN-&gamma; and IL-4 it was observed in the zero time of dogs that did not acquire infection after infestation with infected ticks. The cytokine seric levels showed the elevation in a more evident form of IL-10 and TNF-&alpha; in a dog that developed fatal disease, what could indicate the participation of immune mechanisms in the clinical presentation and in the persistence of the agent in the organism host.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Estudos anteriores mostraram que indivÃduos expostos à Leishmania amazonensis apresentam resposta diferenciada em relaÃÃo à produÃÃo de IFN&#947;. Aqueles com baixa produÃÃo geram uma resposta Th2 e os que apresentam alta produÃÃo desta citocina, desde as primeiras horas de infecÃÃo, uma resposta Th1. Com o objetivo de avaliar o mecanismo de supressÃo induzido por L. amazonensis, foi determinado o perfil e a cinÃtica da expressÃo de quimiocinas e receptores de quimiocinas, como tambÃm de citocinas em culturas de cÃlulas mononucleadas do sangue perifÃrico de indivÃduos sadios, estimuladas com promastigotas vivas de L. amazonensis. A anÃlise semiquantitativa da expressÃo de RNAm das quimiocinas e seus receptores, atravÃs de RT-PCR, e a quantificaÃÃo das citocinas foi determinada por ELISA, apÃs 12 horas, 48 horas e 120 horas de infecÃÃo. Verificaram-se dois padrÃes de resposta em relaÃÃo à secreÃÃo de IFN&#947;. IndivÃduos com produÃÃo superior a 145,8 pg/mL foram classificados como alto respondedor (AR) e aqueles com produÃÃo inferior, como baixo respondedor (BR). Observou-se no grupo AR o desenvolvimento de uma resposta mista, com predomÃnio de Th1. Esta resposta està associada à expressÃo de quantidades relevantes de MIP-1&#945; (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), IP-10 (CXCL10), IL-8 (CXCL8), CCR1, CCR2 e CXCR3 em 12 e 48 horas de infecÃÃo. IL-12, IL-13 e IL-10 foram observadas em altas concentraÃÃes. Em relaÃÃo ao grupo BR, observou-se diminuiÃÃo da expressÃo de MIP-1&#945; (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), I-309 (CCL1), CCR2, CXCR3 e CCR5 durante todo o perÃodo avaliado e de IP-10 (CXCL10) nas primeiras 48h de infecÃÃo. IL-10 e IL-13 encontravam-se em elevadas concentraÃÃes desde 12h, tendo um pico de produÃÃo com 48h de infecÃÃo. Os resultados sugerem que apÃs 48 horas de exposiÃÃo à o momento em que hà diferenciaÃÃo na expressÃo das molÃculas. IL-10 e IL-13 parecem ter papel relevante na modulaÃÃo da supressÃo de INF&#947; induzida nos BR por L. amazonensis. / Previous studies have shown that individuals exposed to Leishmania amazonensis respond differentially with regard to interferon gamma (IFN)_ production. Individuals who have a low production of IFN_ develop a Th2 response, while those who produce high amounts of this cytokine during the early stages of infection show the Th1 response. In order to evaluate the mechanism of suppression induced by L. amazonensis, the profile and kinetics of chemokines and theirs receptors were determined, as also the cytokines in the cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy individuals, stimulated with live promastigotes of L. amazonensis. A semiquantitative analysis of mRNA expression for the chemokines and their receptor was performed by RT-PCR, and the cytokines were quantified by ELISA, at 12, 48 and 120 hours after infection. The two patterns of IFN_ response were studied. Individuals with a production higher than 145,8 pg/mL were classified as high responders (HR), and those with lower levels of production were considered as low responders (LR). Individuals in the HR group developed a mixed response, with a predominance of Th1, which was associated with the expression of relevant quantities of MIP-1_, RANTES, MCP-1, IP-10, IL-8, CCR1, CCR2 and CXCR3, within 12 and 48 hours after infection. IL-12, IL-13 and IL-10 were observed in significant quantities. In the LR group, the suppression of expression of MIP-1_, RANTES, MCP-1, I-309, CCR2, CXCR3 and CCR5 during the entire period of study, and that of IP-10 during the first 48 hours of infection, was observed. IL-10 and IL-13 were found in elevated concentrations from 12 hours of infection onwards, with a peak production at 48 hours. These results suggest that the pattern of response apparently is defined around 48 hours of infection. IL-10 and IL-13 appear to exercise a relevant role in the modulation of suppression of IFN_, induced in the LR group by L. amazonensis.