Orientador: Luciana Bolsoni Lourenço Morandini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:06:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Targueta_CintiaPelegrineti_D.pdf: 14058240 bytes, checksum: 609267a5b0419113c3e1035f998113c6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Dentre as espécies do gênero Engystomops, somente as três espécies do clado Edentulus (E. freibergi, E. petersi e E. pustulosus) e duas das seis espécies do clado Duovox (E. pustulatus e E. puyango) tinham o número diploide descrito, e a localização cariotípica das NORs (regiões organizadores de nucléolo) e das regiões heterocromáticas era conhecida apenas para E. freibergi, E. petersi e E. puyango. Os dados disponíveis mostravam que as espécies do clado Duovox já cariotipadas apresentavam 2n=20, enquanto o número cromossômico diploide de todas as espécies do clado Edentulus era 2n=22, assim como o das espécies de Physalaemus e Edalorhina, gêneros mais proximamente relacionados a Engystomops. Dessa forma, uma redução do número diploide de 2n=22 para 2n=20 era considerada na história de Engystomops, mas não era possível inferir se essa era uma sinapomorfia de E. puyango e E. pustulatus ou de todo o clado Duovox. Em relação ao clado Edentulus, algumas dúvidas também persistiam. Recentes estudos propunham a presença de um complexo de espécies amazônicas sendo confundidas com E. petersi. Citogeneticamente puderam ser reconhecidos três grupos nesse complexo, que corresponderam a populações de Puyo (Equador), Yasuní (Equador) e La Selva (Equador), diferentes ainda daquele de E. freibergi (Brasil). Nem sempre é possível a identificação de homeologias cromossômicas entre esses grupos, o que dificulta o reconhecimento dos possíveis rearranjos cromossômicos envolvidos na divergência cariotípica no gênero em questão. Também permanecia pouco explorada a diferenciação entre os cromossomos sexuais heteromórficos reconhecidos em populações de E. petersi e em E. freibergi. Os objetivos do presente trabalho foram estudar citogeneticamente as espécies de Engystomops do clado Duovox, melhor caracterizar os cromossomos sexuais de E. freibergi por meio de pintura cromossômica e buscar novos marcadores citogenéticos para auxiliar na identificação de homeologias cromossômicas nesse gênero. A análise cariotípica mostrou que as espécies E. randi, E. guayaco, E. montubio, E. pustulatus e E. coloradorum apresentaram 2n=20, assim como as espécies E. puyango e E. pustulatus, previamente cariotipadas, corroborando a hipótese de essa característica provavelmente seja uma sinapomorfia do grupo Duovox. Em E. coloradorum, foi encontrada uma fêmea triploide, que consistiu no primeiro relato de poliploidia para Engystomops. Em todas e somente nas fêmeas dessa espécie foi encontrado um heteromorfismo referente à presença de NOR dentre os cromossomos 10 homólogos o que sugere que esses sejam cromossomos sexuais e que o sistema de determinação do sexo em E. coloradorum seja ZZ/ZW. Quanto à análise dos cromossomos sexuais de E. freibergi, foi possível isolar por microdissecção os cromossomos X e Y e produzir sondas a partir da amplificação de segmentos desses cromossomos. A utilização da técnica de pintura cromossômica com tais sondas permitiu inferir que as regiões proximais do cromossomo X e do cromossomo Y de E. freibergi apresentam similaridade molecular, o que sugere a possibilidade de se tratarem de regiões pseudo-autossômicas. As sondas dos cromossomos sexuais de E. freibergi não detectaram os cromossomos X e Y de E. petersi de Puyo nem os cromossomos do par 11 homomórfico de E. petersi de Yasuní, não evidenciando, portanto, grande similaridade entre eles. O isolamento, a caracterização e a localização cariotípica do DNAr 5S das espécies pertencentes ao grupo Duovox permitiram inferir a possível homeologia do par cromossômico 6 dessas espécies entre si e com o par 6 das espécies do grupo Edentulus. Ainda, o uso de sondas PcP190EcoRI, referentes a uma família de DNA repetitivo derivada de DNAr 5S, permitiu identificar os cromossomos 5 de E. randi, E. guayaco e E. coloradorum e diferenciá-los dos cromossomos 6 dessas espécies, portadores do sítio de DNAr 5S do tipo II. Além disso, essa mesma sonda identificou a região pericentromérica do braço curto do cromossomo 3 (e do cromossomo 5 de E. petersi de Yasuní) de todas as espécies do gênero, com excessão de E. coloradorum, sugerindo outra possível homeologia entre esses cromossomos. Dessa forma, com o emprego de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares foi possível fornecer importante contribuição para o estudo da evolução do gênero Engystomops / Abstract: Of the species in the genus Engystomops, only three species of the Edentulus clade (E. freibergi, E. petersi and E. pustulosus) and two species of the Duovox clade (E. pustulatus and E. puyango) have had their diploid number described, while the NOR (nucleolus organizer region) and the heterochromatic sites were known only for E. freibergi, E. petersi and E. puyango karyotypes. The species of Duovox clade had 2n=20, while the diploid chromosome number of all species of Edentulus clade was 2n=22, which is the same diploid number of species of Physalaemus and Edalohina, genera closely related to Engystomops. Thus, the diploid number reduction from 2n=22 to 2n=20 was supposed, but it was not possible to infer if this was a synapomorphy of E. puyango and E. pustulatus or a synapomorphy of the entire Duovox clade. With regards to the Edentulus clade, some doubts also persisted. Recent studies proposed a complex of Amazonian species misidentified as E. petersi and it was possible to cytogenetically recognize three groups in this complex that corresponded to populations from Puyo (Ecuador), Yasuní (Ecuador) and La Selva (Ecuador). All of these karyotypes also differed from the E. freibergi (Brazil) karyotype. Chromosome homologies are not easily recognized between these groups, a fact that makes difficult the identification of chromosome rearrangements involved in karyotypic divergence in this genus. Additionally, the differentiation of the heteromorphic sex chromosomes found in the E. petersi and E. freibergi karyotypes remained unexplored. The goals of the present work are (1) to cytogenetically study the species of Duovox clade, (2) to better characterize the sex chromosomes of E. freibergi by means of chromosome painting and (3) to find new cytogenetic markers to identify potential chromosome homologies in this genus. The karyotypic analysis showed that the species E. randi, E. guayaco, E. montubio, E. pustulatus and E. coloradorum had 2n=20, as previously described in E. pustulatus and E. puyango. This corroborates the hypothesis that the diploid number 2n=20 is likely a synapomorphy of the Duovox clade. Among the specimens of E. coloradorum, a triploid female was found, which is the first report of polyploidy for the genus Engystomops. In all the females of this species, there was a NOR heteromorphism in the homologous chromosomes 10, suggesting that these may be ZZ/ZW sex chromosomes. Regarding the sex chromosomes of E. freibergi, it was possible to isolate the X and Y chromosomes by microdissection and to produce probes by amplifying segments of the microdissected chromosomes. The hybridization of these probes in E. freibergi metaphases showed that the proximal regions of the X and Y chromosomes of this species had molecular similarity, thus suggesting that they may be pseudoautosomal regions. The sex chromosome probes from E. freibergi detected neither the X nor the Y chromosome of E. petersi from Puyo nor the chromosomes of homomorphic pair 11 of E. petersi from Yasuní. This implies no significant similarity between them and the E. freibergi sex chromosomes. The isolation, characterization and karyotypic localization of the rDNA 5S from the species of the Duovox clade made it possible to infer the homeology of chromosome pair 6 of those species, as well as their homeology with chromosome pair 6 of the species of the Edentulus clade. Further, the probes PcP190EcoRI, which are related to a family of satellite DNA derived from rDNA 5S, made it possible to identify chromosome 5 of E. randi, E. guayaco and E. coloradorum and to differentiate them from chromosome 6, which carry type II rDNA 5S. In conclusion, both classical and molecular cytogenetic techniques provided important contributions for the study of the evolution of the genus Engystomops / Doutorado / Biologia Celular / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-03T14:35:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3446884 bytes, checksum: a5bb307c1e391c1e8ae2a49d2cdf94b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-03T14:35:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3446884 bytes, checksum: a5bb307c1e391c1e8ae2a49d2cdf94b5 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Trigona é um dos maiores e mais amplamente distribuídos táxons de abelhas da tribo Meliponini. A citogenética comparativa permite através de suas técnicas de bandamento clássica e molecular entender sobre a evolução do cariótipo em diversos organismos. As informações citogenéticas disponíveis para o gênero Trigona mostram um número diplóide constante (2n=34), além disso, as espécies do gênero compartilham um cromossomo acrocêntrico totalmente eucromático (Ae). Este trabalho buscou (i) verificar se existem variações cromossômicas e como estas se distribuem entre as populações de espécies com ampla distribuição, Trigona spinipes (ii) descrever citogeneticamente algumas espécies do gênero e por fim, (iii) buscar alguns caracteres citogenéticos para entender a evolução cariotípica em Trigona. Os resultados obtidos neste trabalho reforçam a homogeneidade do número diploide entre as espécies do gênero Trigona. O mapeamento do microssatélite (GA)15 mostrou-se mais efetivo para separar populações de T. spinipes do que as espécies do mesmo gênero. O gene rDNA 18S apresentou variações interespecíficas, contudo não foram observadas diferenças numéricas e de posicção desse gene entre as popT. spinipes. Uma comparação usando os marcadores citogeneticos (quantidade de heterocromatina, rDNA 18S e cromossomo Ae) sugere um processo de eliminação da heterocromatina no gênero Trigona. Por fim, esse estudo ressalta a importância de se usar técnicas de citogenética molecular em estudos com populações, e de citogenética comparativa de espécies com baixo polimorfismo cromossômico, como as abelhas da tribo Meliponini. / The Trigona is a genus of the stingless bees rich in species and it is widely distributed.The comparative cytogenetics allows us understanding the karyotype evolution in various organisms. Cytogenetic informations available for Trigona showed a constant diploid number (2n = 34) and a euchromatic acrocentric chromosome (Ae) is shared among their species. This study aimed to (i) check for chromosomal variations among populations with wide distribution, such as Trigona spinipes (ii) describe cytogenetically some species of the genus and finally, (iii) seek some cytogenetic characters to understand karyotype evolution of Trigona. The results corroborate the homogeneity of chromosome number among the species of the genus Trigona. The mapping of microsatellite (GA)15 was more effective to separate populations of T. spinipes, than species of the same genus. In contrast, the location of the 18S rDNA varied among species. A comparison using cytogenetic markers (amount of heterochromatin, rDNA 18S and chromosome Ae) suggests the elimination of heterochromatin in Trigona. Therefore, this study points out the importance of molecular cytogenetics in population studies and in the comparative citogenetics of species with a few chromosomal variations, such as stingless bees.

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-17T09:30:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 971904 bytes, checksum: 6fba372a708197c45ace38066444f048 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-17T09:30:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 971904 bytes, checksum: 6fba372a708197c45ace38066444f048 (MD5) Previous issue date: 2015-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Prochilodus argenteus, a curimatá-pacu, juntamente com a sua espécie irmã, Prochilodus costatus, representam cerca de 50% da biomassa total da pesca, sendo as espécies migratórias mais abundantes na região de Três Marias e ambas endêmicas da bacia do rio São Francisco. A construção de hidrelétricas altera o ambiente e o fluxo gênico entre populações que podiam não estar isoladas no passado. Desta forma, o objetivo deste estudo foi verifica se existem diferenças citogenéticas entre populações de Prochilodus argenteus que podem ter ficado isoladas pela barragem de Três Marias, bacia do rio São Francisco, Minas Gerais, Brasil, desde final da década de 1950. Foram coletados 44 espécimes: 14 a montante da represa, perto da cidade de Iguatama, e 30 a jusante (24 no Refugio Estadual da Vida Silvestre do rio Pandeiros e seis no município de Três Marias). O número diploide de 2n=54 e a fórmula cariotípica 40m + 14sm foram encontrados em todos os indivíduos. Em ambas as populações foram encontrados os seguintes padrões: a banda C apresentou blocos heterocromáticos centroméricos em todos os cromossomos, além de um bloco adicional pericentromérico no segundo par metacêntrico; a Ag-NOR evidenciou marcações simples no segundo par metacêntrico, coincidindo com a constrição secundária. Em aproximadamente 5% das metáfases ocorreu uma terceira marcação na região terminal de apenas um cromossomo. A técnica de Fluorescent in situ Hybridization (FISH) utilizando as sondas 18S e 5S rDNA evidenciou sintenia destas regiões no segundo par metacêntrico, coincidentes com a NOR e a constrição secundária. As sondas repetitivas (GA) 15 e (CA) 15 apresentaram marcações na região telomérica de todos os cromossomos e a sonda (CA) 15 evidenciou blocos na região pericentromérica no quarto par metacêntrico, sugerindo a ocorrência de inversão cromossômica. As sondas (CAA) 10 e (CAT) 10 apresentaram marcação na região telomérica na maioria dos braços cromossômicos e, de forma mais difusa, ao longo de alguns cromossomos. Com base nestes padrões, conclui-se que as populações, hoje isoladas pela UHE de Três Marias desde a década de 50, não sofreram diferenciação citogenética e podem ser consideradas como uma população única. / Prochilodus argenteus, the curimatá-pacu, along with its sister species, Prochilodus costatus represent about 50% of the total biomass of fish, and migratory species more abundant in the area of Three Marias, both endemic to the São Francisco River basin. The construction of hydroelectric dams changes the environment and precludes gene flow between populations that were not isolated in the past. Thus, the aim of this study was to determine if there cytogenetic differences between populations of Prochilodus argenteus that became isolated by the Três Marias Dam, São Francisco Basin, Minas Gerais, Brazil, since late 1950s. Forty-four specimens were collected: 14 upstream of the dam, near the city of Iguatama, and 30 downstream (24 in the Refugio Estadual da Vida Silvestre do rio Pandeiros and six in the Três Marias Dam channel). We found a stable karyotype formula of 40m + 14sm, 2n=54. The following patterns were observed in both populations: The C banding showed centromeric heterochromatin blocks in all chromosomes, plus an additional pericentromeric block in the second chromosome metacentric pair. The nucleolus organizer regions (Ag-NOR) occurred on the second metacentric pair, coinciding with the secondary constriction. About 5% of the metaphases showed a third mark in the telomeric region of only one chromosome complements. The Fluorescent in situ Hybridization (FISH) with the 18S and 5S rDNA probes revealed synteny of these regions on the second metacentric pair, coinciding with the NOR and the secondary constriction. The (GA) 15 and (CA) 15 repetitive DNA probes showed markings on the terminal region of most chromosomes, and the (CA) 15 repetitive DNA probe hybridized in the pericentromeric region of the fourth chromosome pair, suggesting a chromosomal inversion. The (CAA) 10 and (CAT) 10 repetitive DNA probes hybridized on the terminal region of most chromosome arms and along some chromosomes. Based on these cytogenetic patterns, we concluded that the populations now isolated by UHE Três Marias since the 50’s did not suffer cytogenetic differentiation and should be considered as a single population.

Orientadores: Crodowaldo Pavan, Neusa Diniz da Cruz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:45:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pierozzi_NeivaIzabel_D.pdf: 4714150 bytes, checksum: 5431918f3971e0566ce297d167c550b0 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Três espécies diploides de café (2n = 22 cromossomos) e autoincompatíveis, Coffea canephora, C. dewevrei e C. racemosa, foram submetidas a técnicas de bandamento-C, da enzima proteolítica tripsina, da coloração com solução diluída de Giemsa, da impregnação pela prata, além da reação nuclear de Feulgen. O objetivo foi a caracterização dos cromossomos mitóticos dessas espécies para posteriores estudos comparativos. As análises cariotípicas foram efetuadas em cromossomos de células de radículas e em cromossomos de células de endospermas jovens e de endospermas em crescimento, coleta dos a partir de frutos imaturos de café. O endosperma é um tecido triplóide, de natureza efêmera, muito macio quando jovem ou em crescimento, dispensando pré-tratamentos enzimáticos para o amolecimento, durante as preparações citológicas, procedimento obrigatoriamente usado quando os preparados provêm de raizes. As três espécies de café puderam ser identificadas (1) pelas medidas cromossômicas e ( 2 ) pelas percentagens médias da somatória dos segmentos corados pelo Giemsa (C. canephora e C. dewevrei ) . A assimetria lateral de bandas entre cromátides irmãs, ainda sem explicação aceita, foi discutida, uma vez que apareceu em alguns cromossomos nas três espécies de café, independentemente da metodologia empregada. Constatou-se também acentuada terogeneidade no número e na posição dos segmentos c:romossômicos corados, que foi atribuída a uma provável amplificação seletiva de nados segmentos da cromatina / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Oligoryzomys é o gênero mais especioso da tribo Oryzomyini e está amplamente distribuído na região Neotropical. O objetivo deste trabalho é contribuir para a citotaxonomia e investigar a evolução cromossômica no gênero. Foram analisados 117 exemplares pertencentes às espécies: O. flavescens (2n=64-66, NF=66), O. fornesi (2n=62, NF=64), O. microtis (2n=64, NF=64), O. moojeni (2n=70, NF=72), O. nigripes (2n=62, NF=78-82), O. stramineus (2n=52, NF=68) e Oligoryzomys sp. A (2n=70, NF=72). As seis primeiras possuem cariótipos espécie-específicos e, dessa forma, reiteramos a importância da informação citogenética para a citotaxonomia. A pintura cromossômica comparativa (Zoo-FISH) com sondas de O. moojeni revelou hibridação em 29 segmentos autossômicos em O. fornesi; 30 em O. microtis; 31 em O. nigripes; e 32 em O. rupestris e Oligoryzomys sp. 2. Os resultados mostraram uma extensa reorganização genômica na evolução cromossômica do gênero, decorrente de fissões, fusões em tandem, rearranjos Robertsonianos e perda/inativação, surgimento ou reposicionamento de centrômero. / Oligoryzomys is the most specious genus within the tribe Oryzomyini and it is distributed throughout Neotropical region. This work aims to contribute to citotaxonomy and to investigate the chromosomal evolution of the genus. A total of 117 individuals were cytogenetically analysed, and they belong to the species: O. flavescens (2n=64-66, FN=66), O. fornesi (2n=62, FN=64), O. microtis (2n=64, FN=64), O. moojeni (2n=70, FN=72), O. nigripes (2n=62, FN=78-82), O. stramineus (2n=52, FN=68), and Oligoryzomys sp. A (2n=70, FN=72). The first six species possess species-specific karyotypes, and therefore we emphasize the importance of cytogenetic studies for citotaxonomy. Comparative chromosome painting (Zoo-FISH) with O. moojeni probes hybridized to 29 segments on metaphases of O. fornesi, 30 on O. microtis, 31 on O. nigripes, and 32 on O. rupestris and Oligoryzomys sp. 2. The results showed an extensive genomic reshuffling, due to fissions, tandem and Robertsonian fusions, loss/inactivation or repositioning of centromeres.

El estudio de los mecanismos de reprogramación nuclear tiene actualmente una notable importancia, dado que el dominio de estos procesos constituyen la clave para actuar eficazmente en cuestiones tan dispares como el cáncer o la medicina regenerativa. También resulta muy importante este tipo de estudios sobre reprogramación cuando se pretende la obtención de animales transgénicos múltiples y orientados. Aunque para ello se pueden utilizar muy diversos modelos animales, en nuestro caso, se ha optado por el pez cebra, por sus características en el desarrollo, como la brevedad en la embriogénesis y transparencia de los embriones, su capacidad de regeneración y el conocimiento de su genoma, entre otras. Bien es cierto que a estas ventajas le acompañan cierto inconvenientes tales como no disponer hasta este momento de técnicas tales como el transplante nuclear y, a otro nivel, el quimerismo. Técnicas cuyos desarrollo se pretende en esta tesis, lo que justifica los objetivos aquí planteados. Para ello se han realizado diferentes trabajos experimentales titulados: "Ultraviolet radiation and handling medium osmolarity affect chimaerism success in zebrafish", "Evaluation of presumptive caudal fin blastema cells as candidate donors in intraspecies zebrafish (Danio rerio) chimaeras", "Definition of three somatic adult cell nuclear transplant methods in zebrafish (Danio rerio): before, during and after egg activation by sperm fertilization", "Transplant of adult fibroblast into the central region of metaphase II eggs resulted in mid blastula transition (MBT) embryos", "Electroactivation of zebrafish (Danio rerio) eggs", "Comparison of different activating stimuli efficiency in zebrafish nuclear transplant", "Reconstruction of heteroparental gynogenetic diploid condition by nuclear transplant in zebrafish". Los dos primeros relativos al quimerismo, su eficiencia final se optimizó mediante la penalización con radiación UV del embrión receptor. / Pérez Camps, M. (2009). Epigenetic reprogramming of somatic cells by nuclear transplant in zebrafish [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6902 / Palancia

Orientador: Fausto Foresti / Resumo: Um dos tipos mais abundantes de DNA repetitivo, o DNA satélite, apresenta importantes aspectos estruturais e evolutivos, como o acúmulo diferencial entre espécies próximas e taxas de evolução molecular variadas. O satelitoma, identificado como o conjunto total de DNAs satélites (satDNA) de determinado organismo, permite uma investigação mais aprofundada em abundância e riqueza desses elementos repetitivos entre espécies, mas ainda é de conhecimento restrito entre espécies de peixes. Mapeamentos prévios de DNA repetitivo no gênero Gymnotus evidenciaram uma ampla diversificação na distribuição dessas sequências no genoma do grupo, todavia é restrita a porção de DNA repetitivo reportado pela limitação de metodologias passadas. Dessa forma, a associação recente de plataformas de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) com análises de bioinformática proporcionam um acesso mais refinado ao genoma, permitindo a anotação de um maior número de elementos repetitivos nos componentes desse grupo. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar a evolução do DNA satélite e a distribuição física de famílias de satDNAs em espécies de peixe elétrico do gênero Gymnotus, a partir da construção do satelitoma dos grupos. Os genomas das espécies dos principais clados de Gymnotus foram acessados e a metodologia de filtragem pela plataforma RepeatExplorer e satMiner permitiu a identificação do satelitoma em cada um dos grupos abordados, caracterizando massivamente as famílias de satDNAs dentro ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: One of the most relevant types of repetitive DNA, the satellite DNA, has important structural and evolutionary aspects, such as differential accumulation between close species and diverse molecular evolution rates. The satellitome, identified as the total set of satellite DNAs (satDNA) of a given organism, allows further investigation into the abundance and richness of these elements between species, but is still of limited knowledge among fish species. Previous studies of repetitive DNA mapping in the Gymnotidae fish family showed a wide diversification in the distribution of these sequences in the genome of the group. Since past methodologies have been limited in reporting this portion of repetitive DNA, there is still too much to know regarding these elements. Notably, the recent association of Next Generation Sequencing (NGS) platforms with bioinformatics analysis provides a more refined access to the genome, allowing annotation of a greater number of repetitive elements. Thus, the aim of the present study was to investigate the evolution of satellite DNA and the physical distribution of satDNA families in Gymnotus, through the construction of the satellitome of the groups. The genomes of the species from the main Gymnotus clades were accessed and the RepeatExplorer filtering methodology allowed the identification of the satellitome in each of the groups analyzed, massively characterizing the families of satDNAs within each species complex in Gymnotus, highlighting the pr... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Objetivos Los cicindélidos o escarabajos tigre son una familia de coleópteros depredadores frecuentemente estudiados. Esta tesis se centra en dos géneros de cicindélidos: el género australiano Pseudotetracha, perteneciente a la tribu Megacephalini, y el género surasiático Cosmodela, de la tribu Cicindelini. En el primer capítulo se pone a prueba, mediante métodos moleculares, la clasificación presentada en trabajos previos, basados en la morfología, sobre el complejo de especies blackburni/murchisona en el género Pseudotetracha. En el segundo capítulo se analizan las meiosis de las mismas muestras con el fin de estudiar el papel de las reorganizaciones cromosómicas en la especiación y especialización de la tribu Megacephalini, así como confirmar la separación de dos clados hallados en el capítulo anterior. En el tercer capítulo se añaden más muestras de un área mayor de distribución, con el objetivo de revelar la diversidad críptica presente en Pseudotetracha inferida en los dos primeros capítulos y estudiar los procesos que han generado su diversidad. El cuarto capítulo trata del género asiático Cosmodela, en particular la especie C. aurulenta, en la cual se pone a prueba la identidad de las dos 21subespecies descritas como especies independientes, así como el papel que las glaciaciones han tenido en su historia evolutiva. Metodología Para cumplir estos objetivos se utilizaron diversos métodos. Tomando como base la secuenciación de diversos fragmentos de ADN mitocondrial y nuclear (cox1, cox3, 16S, 18S y wingless), se realizaron análisis filogenéticos usando los métodos de Máxima Parsimonia e Inferencia Bayesiana. En los capítulos 2 a 4 se empleó además un reloj molecular para situar en una escala temporal las divergencias observadas. Adicionalmente se realizaron análisis filogeográficos para clarificar las relaciones entre las diferentes poblaciones a un nivel infraespecífico. Los métodos de delimitación de especies GMYC y bPTP, basados en datos moleculares, se usaron en el capítulo 3. En el caso de Cosmodela también se analizaron las distancias genéticas entre los principales clados. En los capítulos 1 y 2 se observaron células en meiosis de los diferentes taxones de Pseudotetracha. Resultados Los resultados obtenidos en el capítulo 1 confirmaron, mediante métodos moleculares, la validez del complejo de especies blackburni/murchisona tal como había sido propuesta previamente en base a la morfología. Estos resultados se mostraron en desacuerdo con un trabajo previo que separaba a la especie P. blackburni de este grupo. La especie P. australis quedaría incluida dentro de este clado. La observación de células en metafase II proporcionó indicios de que los dos clados observados en P. blackburni tendrían un cariotipo diferente y podrían constituir dos especies crípticas. En el capítulo 2 se confirmó este último resultado, revelando que blackburni-2 tiene una fórmula cariotípica n=11+XY y blackburni-1 ha sufrido una reorganización cromosómica resultando en un sistema de cromosomas sexuales múltiples (n=10+X1X2Y) de tipo quiasmático y con un origen reciente como consecuencia de la fusión del cromosoma Y ancestral con un autosoma. Este sistema difiere del conocido en la tribu Cicindelini, antiguo y aquiasmático. Se observó una tendencia a la reducción del número cromosómico en la tribu Megacephalini, posiblemente por repetidos ciclos de incorporación de autosomas al par de heterosomas, proceso que favorecería la especiación y explicaría la alta especialización en este grupo. La filogenia realizada en el tercer capítulo detectó nueve especies previamente conocidas y otras nueve no descritas, en algunos casos crípticas. Además se infirió el papel que tuvo la aridificación de Australia en la separación de los diferentes linajes, así como la historia de cada uno de ellos. Los resultados mostraron que es necesaria una revisión taxonómica del género Pseudotetracha para aclarar las discordancias encontradas con trabajos previos y la identidad de varios taxones crípticos o de identificación confusa. Los resultados del capítulo 4 apoyaron la separación de las dos subespecies C. aurulenta aurulenta y C. a. juxtata como especies distintas, estrechamente emparentadas con C. batesi, que divergieron durante el Pleistoceno. Se reveló que C. aurulenta se habría originado en la península Malaya, desde donde colonizó Indonesia durante los máximos glaciares, mientras que C. juxtata habría colonizado secundariamente la península Malaya, donde coexiste con C. aurulenta. Aims Tiger beetles are a commonly studied family of predatory coleopterans. / This thesis focuses on two cicindelid genera: Australian genus Pseudotetracha, in the tribe Megacephalini, and southern Asian genus Cosmodela, in the tribe Cicindelini. In the first chapter, the classification made in previous works, based on morphology, about the blackburni/murchisona species complex in the genus Pseudotetracha is tested. In the second chapter, meiosis from the same samples are analyzed in order to study the role of chromosomic rearrangements in speciation and the specialization of the tribe Megacephalini, and to confirm the separation of two clades found in the previous chapter. In the third chapter, more samples from a wider area are included in order to unveil the cryptic diversity in Pseudotetracha inferred in the two first chapters, and to study the processes that generated their diversity. The fourth chapter deals with the Asian genus Cosmodela, concretely the species C. aurulenta, in which the identity of its two described subspecies as independent species, and the role of the glaciations in their evolutionary history, are tested. Methods Several methods were used in order to achieve these goals. Phylogenetic analyses using the methods of Maximum Parsimony and Bayesian Inference were carried out, based on the sequencing of mitochondrial and nuclear DNA fragments (cox1, cox3, 16S, 18S and wingless). In chapters 2 to 4 a molecular clock was used in order to trace in a chronological scale the observed divergences. Additionally, phylogeographic analyses were carried out in order to clarify the intraspecific relationships among populations. The species delimitation methods GMYC and bPTP, based on molecular data, were used in chapter 3. The genetic distances between the Cosmodela main clades were analyzed. In chapters 1 and 2, meiotic cells from the Pseudotetracha taxa were observed. Results The results obtained in chapter 1 confirmed, by means of molecular methods, the validity of the blackburni/murchisona species complex as it was previously proposed according to morphology. These results were in disagreement with a preceding work that separated P. blackburni from this group. P. australis would be included in this clade. The observation of metaphase II cells provide evidence that the two observed clades in P. blackburni could actually represent two cryptic species. Chapter 2 confirmed this result, showing that blackburni-2 has a n=11+XY karyotypic formula while blackburni-1 underwent a chromosomal rearrangement that produced a recent and chiasmatic multiple sex chromosome system (n=10+X1X2Y) as a consequence of a fusion between the ancestral Y chromosome with an autosome. This chromosome system differs from the ancient and achiasmatic multiple sex chromosome system known in tribe Cicindelini. A tendency towards the reduction in the chromosome number was observed in the tribe Megacephalini, probably by repeated cycles of incorporation of autosomes to the heterosomal pair. This process would favor speciation and would explain the high specialization found in this group. The phylogeny that was carried out in the third chapter detected nine previously known species and nine undescribed taxa. Moreover, the role of the aridification of Australia in the divergence of the lineages and the history of each clade were inferred. The results showed that a taxonomic revision of the genus Pseudotetracha is needed in order to clarify the discrepancies found in relation to previous works and the identity of several cryptic of difficult to identify taxa. The results of chapter 4 support the separation of the subspecies C. aurulenta aurulenta and C. a. juxtata as different species, closely related with C. batesi, that diverged during the Pleistocene. C. aurulenta was revealed to originate in the Malay peninsula, from which it colonized Indonesia during the glacial maxima, whereas C. juxtata would have secondarily colonized the Malay peninsula where it coexists with C. aurulenta.

Introducción: La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la alteración hepática de mayor prevalencia en los países occidentales y se caracteriza principalmente por la acumulación de lípidos en el hígado en ausencia de un consumo excesivo de alcohol. La obesidad, diabetes tipo 2, dislipemia e hipertensión suponen importantes factores de riesgo, hasta tal punto que la NAFLD es considerada la manifestación hepática del síndrome metabólico. La fisiopatología de la NAFDL comprende alteraciones tales como la acumulación de triglicéridos en el hígado -consecuencia de la resistencia a la insulina-, que junto con procesos de estrés oxidativo, peroxidación lipídica y aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias pueden conducir a complicaciones como esteatohepatitis (NASH), fibrosis o incluso cirrosis. Los factores dietéticos pueden modular la esteatosis hepática. De hecho, la modificación del estilo de vida, incluyendo dieta y ejercicio, es crucial para conseguir importantes mejoras. En este sentido, la dieta mediterránea se ha propuesto como estrategia dietética para esta enfermedad por su abundancia en frutas y verduras y menor ingesta de grasas saturadas y azúcares refinados. Entre los alimentos que forman parte de esta dieta, los tomates son una importante fuente natural de antioxidantes, especialmente de licopeno. Estudios previos han mostrado que el consumo de tomates y productos derivados fortalecen el sistema antioxidante e inhiben la peroxidación lipídica en humanos. Además, se ha observado un efecto preventivo del desarrollo de NASH inducida por la ingesta de una dieta alta en grasa en modelos animales, así como un efecto inhibitorio de la peroxidación lipídica en el hígado de los mismos, tras la ingesta de licopeno. Objetivo: El principal objetivo de la presente Tesis Doctoral fue evaluar el efecto del consumo de zumo de tomate sobre el metabolismo lipídico en el hígado para explicar los posibles mecanismos de acción del licopeno procedente del tomate in vivo. Para ello, se llevaron a cabo 2 experimentos empleando ratas Sprague Dawley. El primero se llevó a cabo con ratas normocolesterolémicas, y el segundo en ratas con esteatosis inducida mediante el consumo de una dieta de alto contenido en grasa y colesterol. Diseño experimental: En el estudio 1, 24 ratas macho de 12 semanas fueron divididas aleatoriamente en tres grupos (n=8) y alimentadas durante 3 semanas con dieta estándar de roedor y diferentes bebidas: agua (grupo control), zumo de tomate comercial con bajo contenido en licopeno (grupo 1) y zumo de tomate comercial con alto contenido en licopeno (grupo 2). Tras el sacrificio se extrajeron muestras de sangre e hígado. Además, se recogieron muestras de heces al inicio y final del periodo experimental. En el segundo estudio, 24 ratas macho de 8 semanas de edad fueron divididas aleatoriamente en cuatro grupos (n=6) y alimentadas durante 5 semanas del siguiente modo: dieta estándar y agua (NA) o zumo de tomate (NL), dieta alta en grasa y colesterol y agua (HA) o zumo de tomate (HL). Tras este periodo, los animales fueron sacrificados y se extrajeron muestras de sangre, tejido adiposo, aorta e hígado. Además, se recogieron muestras de orina y heces semanalmente. Resultados: En el estudio 1, se observó un aumento de las concentraciones de colesterol HDL tras el consumo de tomate. A pesar de que las concentraciones de colesterol en el hígado fueron muy similares en los tres grupos, se observó una menor actividad de la enzima HMG-CoA –enzima limitante de la síntesis de colesterol- en hígado en el grupo 2. Respecto a los ácidos grasos de cadena corta analizados en heces, únicamente se halló una concentración de butirato significativamente mayor en el grupo 2. En el estudio 2, se observó esteatosis en grado 2 en las muestras de hígado de los grupos alimentados con dieta grasa (HA, HL), que se confirmó por las elevadas concentraciones de las enzimas alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa, el examen histológico y la presencia de dislipemia. Tras el consumo de tomate se observó una mejoría en la concentración de colesterol HDL en el grupo HL en comparación con HA y una disminución del estrés oxidativo, revelada por la reducción de isoprostanos en orina. En el grupo HL se observó una sobreexpresión de varios genes relacionados con el transporte de ácidos grasos, la hidrólisis lipídica y la β-oxidación mitocondrial y peroxisomal, lo que sugiere una mejoría en el metabolismo lipídico hepático asociada a la ingesta de tomate. Por otra parte, se observó una interesante modificación del perfil peptidómico urinario en el grupo HL, quedando este en una situación intermedia entre los grupos N y el grupo HA, lo cual evidencia que el consumo de zumo de tomate mejora el patrón metabólico en el grupo alimentado con dieta alta en grasa, dirigiéndolo hacia un estado más fisiológico Conclusiones: Estos resultados sugieren que el licopeno procedente del zumo de tomate ejerce un efecto protector frente a la NAFLD y por tanto, el tomate y derivados deberían ser considerados dentro de las estrategias dietéticas recomendadas para su tratamiento. Sin embargo, se necesitan más estudios para elucidar los mecanismos de acción del licopeno en el metabolismo lipídico del hígado, así como para desarrollar un panel de biomarcadores específicos que permitan el diagnóstico y prevención de NAFLD. / ABSTRACT Background: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common liver disorder in Western countries with a high prevalence. It covers a spectrum ranging from hepatic steatosis to steatohepatitis (NASH), fibrosis and cirrhosis. Obesity, type 2 diabetes, dyslipidaemia and hypertension are most important risk factors; in fact, NAFLD is considered the hepatic manifestation of metabolic syndrome. The hallmark of NAFLD is hepatic lipid accumulation in the absence of significant ethanol consumption. Two steps or hits have been proposed for the pathophysiology of NAFLD and NASH: the first hit is owed to the triglycerides accumulation as consequence of insulin resistance. The second hit includes oxidative stress, lipid peroxidation, increased cytokine production and inflammation, resulting in NASH. Dietary factors may modulate liver steatosis. Indeed, lifestyle modification including diet and exercise are crucial to achieve significant improvements. In this regard, the Mediterranean diet has been suggested as the dietary strategy for this disease due to the high consumption of plant-based foods and low intake of saturated fats and refined sugars. Tomato products are a dietary source of natural antioxidants, especially, lycopene. Previous studies have shown the consumption of tomatoes and tomato products strengthened the antioxidant system and inhibited lipid peroxidation in humans. Moreover, lycopene has displayed to have a preventive effect on the development of NASH induced by a high fat diet in animal models, as well as, an inhibitory effect of lipid peroxidation in the liver tissues. Objective: On this basis, the main objective of the present Doctoral Thesis was to evaluate the effect of tomato juice on liver lipid metabolism in order to elucidate the possible mechanisms of action of tomato lycopene in vivo, using a Sprague Dawley rat model. For that, we carried out 2 experiments involving the intake of tomato juice; firstly with rats fed a standard rodent diet and secondly with rats with diet-induced hepatic steatosis (high-fat and high cholesterol diet). Experimental design: In study 1, 24 male Sprague Dawley rats (12 weeks old) were randomly divided in three groups (n=8) fed to standard diet for rodents and different drink as follows: control group (tap water as drink), group 1 (commercial tomato juice with a low content of lycopene) and group 2 (commercial tomato juice with a high content of lycopene). After three weeks, rats were sacrificed and blood and liver samples were collected. Furthermore, faeces samples were collected and the beginning and at the end of the experimental period. In study 2, 24 male Sprague Dawley rats (8 weeks old) were randomly divided in four groups (n=6) fed to standard diet (N) or hypercholesteraemic and high fat diet (H) for 5 weeks and were provided water (A) or tomato juice (L) as drink. After this period, rats were sacrificed and blood, adipose tissue, aorta and liver samples were collected. Moreover, urine and faeces samples were collected weekly. Results: In study 1, significant differences were found in HDL-cholesterol between control and experimental groups, being higher in latter groups. Despite of cholesterol levels in liver were very similar in three groups, an inhibitory effect of the activity of HMG-CoA-R in liver was shown in group 2. Finally, regarding short chain fatty acids (SCFA) analysed in the faeces, only a significantly higher concentration of butyrate was observed in group 2. In study 2, steatosis grade 2 was observed in groups H which was confirmed by the levels of plasma alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), histological examination and presence of dyslipidaemia. A significant improvement of HDL-c was observed in HL compared with HA, as well as an alleviation of oxidative stress through reduction of urine isoprostanes. In relation to fatty acid gene expression analysed in liver, an overexpression of several genes related to fatty acid transport, lipid hydrolysis and mitochondrial and peroxisomal β-oxidation was observed in HL. Interestingly, tomato juice intake partially reverted the metabolic pattern from a high-fat diet to a standard diet even in metabolites not related to the redox state. Furthermore, tomato juice consumption originated an interesting modification in patterns of urinary peptidomic biomarkers in group HL, staying in an intermediate position between group N and HA. Conclusions: In summary, these results suggest that lycopene from tomato juice has a protective effect on NAFLD and therefore, tomato and tomato products should be taken into consideration in the dietary strategies of treatment of NAFLD. However, further researches should be carried out to elucidate the mechanisms of lycopene in liver lipid metabolism in NAFLD and to develop a panel of specific peptidomic biomarkers to lead an early diagnosis and prevention of NAFLD.

Los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello (CECC) ocupan el octavo lugar entre las neoplasias del sexo masculino, presentando el Principado de Asturias una de las tasas de incidencia más altas de España. Aunque se han realizado importantes avances en su diagnóstico y tratamiento, la supervivencia se ha modificado poco en los últimos años debido a que se diagnostican en estadios avanzados. El desarrollo de metástasis en los ganglios linfáticos cervicales es el factor que más influye en la supervivencia. Los carcinomas epidermoides de laringe y faringe (CLF) son tumores sólidos que presentan un gran número de alteraciones cromosómicas. Se han diseñado modelos basados en LOH, que proponen pérdidas progresivas desde lesiones preinvasivas (9p21, 3p21, 17p13) hasta tumores avanzados (11q13, 13q21, 14q31), pero que no tienen en cuenta el papel de las ganancias cromosómicas, ni los cambios asociados al desarrollo de metástasis.Los objetivos de esta tesis han sido la detección de las alteraciones genético-moleculares asociadas al desarrollo de metástasis de los CLF relacionándolas con los datos clínico-patológicos y de seguimiento de los pacientes.Se han estudiado los cambios cromosómicos en 56 pacientes con carcinoma epidermoide de laringe-faringe mediante Hibridación Genómica Comparativa (CGH) y las alteraciones génicas de los 56 tumores primarios y las 25 correspondientes metástasis ganglionares utilizando la técnica de MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification)Con CGH todos tumores primarios presentaron gran número de alteraciones cromosómicas, destacando las pérdidas en las regiones 3p13-24, 11q23-25, 4p15-16, 18q21-23, 5q31-35, 8p21-22, 21q22, 17p12-13, 4q31-34 y 9p21-23, las ganancias en 3q25-27, 7q21-31, 8q11-qter, 5p12-14, 11q11-13, 2q24-32, 12p11-12, 17q11-23, 6q12-15, 4q12-13 y 18p11-pter y las amplificaciones en 3q26-qter, 11q13, 11q22, 3q12-13, 8q24.3, 2q32-33, 18p11.3, 18q11.2, 1p31, 4q11-13, 5p11-14, 8p11, 13q33-34, 22q13, las 8 últimas descritas por primera vez asociadas a CLF. La amplificación en 11q13 se asoció de forma significativa con el estadio tumoral avanzado y la presencia de metástasis ganglionares, aunque no con la supervivencia.Los 56 tumores primarios de nuestra serie presentaron como alteraciones génicas más frecuentes detectada por MLPA las pérdidas en CDKN2A y MLH1 (154pb) y las ganancias en CCND1 y EMS1, mientras que en las metástasis ganglionares lo fueron las pérdidas en CTNNB1 y CDKN2A y las ganancias en CCND1 y EMS1.Los tumores primarios metastáticos presentaron un patrón génico diferente de los no metastáticos con pérdidas en los genes TP53, N33 y STK11.Las metástasis ganglionares presentaron un patrón génico diferente del grupo completo de los tumores primarios con pérdidas en CTNNB1, RB1, MFHAS1, PTPN1, NRAS, LMNA, CDH2 y RENT2 y ganancias en STK11, IGSF4 y N33.En los pacientes con tumor primario metastático y su correspondiente metástasis ganglionar la pérdida de CDKN2A y la ganancia de EMS1 fueron alteraciones génicas comunes, siendo el patrón génico metastático el de las pérdidas en CTNNB1, LMNA, MFHAS1, IGF1R, RECQL4 y RENT2 y las ganancias en CDKN2D, N33 y TP53. Los tumores con estadios avanzados se correlacionaron con pérdidas génicas en N33 y TP53 y ganancias en EMS1 y CCND1, mientras que los ganglios metastáticos lo hicieron con pérdidas en N33, TP53 y STK11. La supervivencia sólo se correlacionó con la pérdida en N33.En el grupo de pacientes estudiados hemos encontrado múltiples alteraciones cromosómicas y génicas, algunas ya descritas, pero otras nuevas, que se han asociado a las diferentes etapas del desarrollo del tumor, principalmente en la fase hacia metástasis ganglionar. Aunque los tumores primarios y las metástasis ganglionares presentan cambios genéticos comunes, existen unos patrones de alteraciones específicas asociadas a los tumores con ganglios linfáticos positivos y a las metástasis ganglionares. La adquisición de estas alteraciones podría ser el desencadenante del desarrollo de metástasis linfáticas. Estudios adicionales son necesarios para confirmar su posible valor pronóstico y aplicación terapéutica.