Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-03-26T15:15:34Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jéssica Fernanda Bertolino - 2018.pdf: 1738703 bytes, checksum: 494fae0cabd867aa9612c7de9a5f3a96 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-27T12:09:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jéssica Fernanda Bertolino - 2018.pdf: 1738703 bytes, checksum: 494fae0cabd867aa9612c7de9a5f3a96 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-27T12:09:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jéssica Fernanda Bertolino - 2018.pdf: 1738703 bytes, checksum: 494fae0cabd867aa9612c7de9a5f3a96 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-01 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Recent researches in bioscience have been focusing in the development of biocompatible materials to replace parts or function of living organisms. Moreover, versatility, low cost and minimally tissue recctiveness are some of the major interest in biomaterial research. Several synthetic and natural resources have been developed. Biometareial components’ features and particularities must be thoroughly assessed to assure standardization and quality of the final product. The purpose of this research was to develop and assess physicochemical and biological features of a chitosan, pequi oil and gelatine based membrane for use in tissue regeneration. Components were mixed in a proportion that kept homogeneity and integrity of the membrane. Membrane’s thermal analysis, scanning electron microscopy, cytotoxicity and bactericidal/bacteriostatic and fungicidal/fungi- static features were evaluated. It was observed that the membrane presented compatible characteristics to be used in soft tissues and that there was no interaction between the components. The presence of pequi oil did not interfere in the biomaterial cytotoxicity. Tests with microorganisms revealed that there was no death or reduction of microorganism proliferation. It was concluded that the mixture of the components allows to obtain a material in the membrane format, however, new investigations are necessary to understand the mechanisms involved in the presented cytotoxicity, as well as the behavior towards the microorganisms in the presence of enzymes that degrade the material, simulating conditions of the animal organic fluid. / Nas últimas décadas houve aumento nas pesquisas para criação de materiais biocompatíveis que possam substituir parte ou função de organismos vivos, de maneira prática e de baixo custo, sem causar injúrias teciduais. O objetivo desse estudo foi o desenvolvimento, caracterização físico-química e biológica de membrana constituida por quitosana, óleo de pequi e gelatina, visando a possível utilização para auxiliar na regeneração tecidual. Para isto, foram obtidas misturas dos componentes em proporções que mantivessem o material homogêneo e não fragmentado. Para a caracterização, utilizou-se análise térmica, microscopia eletrônica de varredura, testes de citotoxicidade e atividade bactericida/bacteriostática e fungicida/fungiostática das membranas. Observou-se que a membrana apresentou características compatíveis para emprego em tecidos moles e que não houve interação química entres os componentes. A presença do óleo de pequi não interferiu na citotoxicidade do biomaterial. Os testes com microrganismos revelaram que não houve morte e nem redução da proliferação de micro-organismos. Concluiu-se que a mistura dos componentes permite a obtenção de um material no formato de membrana, no entanto são necessárias novas investigações para compreender os mecanismos envolvidos na citotoxicidade apresentada, bem como o comportamento frente aos micro-organismos na presença de enzimas que degradem o material, simulando condições do fluido orgânico animal.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-12T19:32:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Sandra Stival dos Santos Lemes - 2008.pdf: 7357278 bytes, checksum: 783dfa4660c8b2298763eff63fd6a65b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-12T19:33:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Sandra Stival dos Santos Lemes - 2008.pdf: 7357278 bytes, checksum: 783dfa4660c8b2298763eff63fd6a65b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T19:33:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Sandra Stival dos Santos Lemes - 2008.pdf: 7357278 bytes, checksum: 783dfa4660c8b2298763eff63fd6a65b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / The alloys used in the orthodontic therapy are subject to the corrosion process in the oral environment. Orthodontic mini-implants Ti-6Al-4V are an excellent source for intraoral anchorage; however, their corrosion resistance in the presence of fluoride is currently unknown. The purpose of this in vitro study was to evaluate the cytotoxic effects of the corrosion extracts of mini-implants Ti-6Al-4V from three different manufacturers when exposed to 200 g/L of sodium fluoride containing artificial saliva for 30, 90 or 180 days. The cytotoxic effects of their corrosion products on L929 cell culture was evaluated by MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay, for cell metabolism and proliferation. The extracts were not cytotoxic and the cytotoxicity assay demonstrated a similar behavior for the samples immersed in artificial saliva in the three evaluated periods. The qualitative analysis, through SEM did not show characteristics of corrosion. The results indicated that the mini-implants tested presented a high corrosion resistance and biocompatibility. / As ligas metálicas utilizadas na terapia ortodôntica estão sujeitas ao processo de corrosão na cavidade bucal. Mini-implantes de Ti-6Al-4V utilizados em ortodontia tornou-se um ótimo recurso de ancoragem intrabucal, contudo, sua resistência à corrosão na presença de flúor é pouco conhecida. O objetivo deste trabalho in vitro foi avaliar a citotoxicidade dos extratos da corrosão de mini-implantes ortodônticos de Ti-6Al-4V de três diferentes marcas comerciais, quando expostos em saliva artificial fluoretada contendo 200 µg/L de fluoreto de sódio, por 30, 90 ou 180 dias. A citotoxicidade dos extratos foi avaliada, em cultura de células L929, por meio da análise do ensaio do MTT (3-{4,5-dimetiltiazol-2il} -2,5-difenil brometo de tetrazólio). Os extratos não foram citotóxicos e o ensaio de citotoxicidade revelou não haver diferenças entre as amostras, demonstrando um comportamento semelhante para os extratos provenientes dos mini-implantes imersos em saliva nos três períodos avaliados. A análise qualitativa, por meio do MEV não revelou áreas com características de corrosão propriamente dita. Os resultados demonstraram que os mini-implantes testados apresentam alta resistência à corrosão e sugerem que são biocompatíveis.

Um material obturador deve apresentar boas propriedades biológicas e físico-químicas, uma vez que ficará em íntimo contato com os tecidos periapicais. Sendo assim, não deve ser irritante aos tecidos adjacentes, possibilitando, ou mesmo favorecendo, o reparo da região periapical, para isso não devem alterar o processo inflamatório. O presente estudo avaliou a citotoxicidade dos cimentos AH Plus, Sealapex, MTA Fillapex e Sealepox em neutrófilos humanos. Neutrófilos humanos cultivados na presença ou ausência de LPS foram tratados com os cimentos em diferentes diluições (1:1, 1:4, 1:8, 1:16 e 1:32) e tempo de presa (24 e 48 horas) durante 24 horas. A viabilidade celular foi analisada por citometria de fluxo, a dosagem de CXCL8 pelo método de ELISA, e Óxido Nítrico na absorvância de 540nm. Os dados foram analisados com o auxílio do programa GraphPad Prism5 por ANOVA a 1 critério seguido pelo teste de Tukey, e os valores considerados significantes quando p<0,05. O cimento AH Plus interferiu apenas na síntese de NO, estimulando-a, tendo a diluição 1:16 melhor comportamento biológico, em ambos períodos experimentais. O Sealapex diminuiu a produção de NO, sendo significante para 1:32 em 48 horas. O MTA Fillapex induziu apoptose, a produção de CXCL8 (1:4 e 1:8 em 48 horas) e diminuiu a síntese de NO (1:32 em 48 horas). Sealepox diminuiu a apoptose (1:16 e 1:32 em 24 horas) e interferiu na produção de CXCL8, diminuindo-a (1:8 em 48 horas, e 1:16 em ambos os períodos). A citotoxicidade em ordem crescente dos cimentos foram: AH Plus, Sealapex, MTA Fillapex e Sealepox. Nosso estudo concluiu que os cimentos AH Plus e Sealapex foram os menos citotóxicos, que menos interferiram na viabilidade celular e na sua função (não indução de CXCL8 e na produção de NO), tanto em 24 horas como em 48 horas. MTA Fillapex e o Sealepox, apesar de causarem mais morte celular e interferirem na produção de NO e CXCL8, seus efeitos podem ser aceitáveis, uma vez que os níveis dessas alterações são, de tal maneira discretos, não agressivos. / A filling material must have good biological and physicochemical, since you\'ll be in close contact with the periapical tissues. Thus it should not be irritating to the surrounding tissues, allowing, or even encouraging, the repair of the periapical region, for it must not alter the inflammatory process. The present study evaluated the cytotoxicity of AH Plus, Sealapex, MTA and Fillapex Sealepox in human neutrophils. Human neutrophils cultured in the presence or absence of LPS cements were treated with different dilutions (1:1, 1:4, 1:8 , 1:16, 1:32) and setting time (24 and 48 hours) for 24 hours. Cell viability was analyzed by flow cytometry, the dosage of CXCL8 by ELISA and nitric oxide in absorbance at 540 nm. Data were analyzed with the aid of GraphPad Prism5 ANOVA for the first criterion followed by Tukey test, and values considered significant when p < 0.05. The AH Plus sealer interfered only in NO synthesis , stimulating it , having a 1:16 dilution better biological behavior , in both experimental periods . The Sealapex decreased production of NO, with 1:32 significant to within 48 hours. The MTA Fillapex induced apoptosis, production of CXCL8 (1:4 to 1:8 within 48 hours) and reduced NO synthesis (1:32 in 48 hours). Sealepox decreased apoptosis (1:16 and 1:32 in 24 hours) and interfere with the production of CXCL8, reducing it (1:8 in 48 hours, and 1:16 in both periods). The cytotoxicity of the cements in ascending order were: AH Plus, Sealapex, MTA and Fillapex Sealepox. We conclude that AH Plus and Sealapex cements were less cytotoxic than less interfered with cell viability and function ( CXCL8 and noninduced NO production ) both in 24 hours and in 48 hours. MTA and Fillapex Sealepox, although most causing cell death and interferes the production of NO and CXCL8, their effects may be acceptable, since the levels of these changes are so mild, non-aggressive.

Os procedimentos descritos por Draize são a base dos testes de irritação ocular e cutânea adotados internacionalmente para avaliar produtos e substâncias. Entretanto, eles têm sido criticados por motivos éticos, devido à crueldade com os animais e, por isso, metodologias alternativas têm sido estudas para avaliar a toxicidade de produtos que entram em contato com o ser humano. Sendo assim, um estudo comparativo foi realizado entre testes de irritação ocular, cutânea e mucosa oral usando coelhos e testes in vitro pelos métodos de difusão em ágar e de captura do vermelho neutro, ambos usando as linhagens celulares NCTC clone 929, FPC-IAL e SIRC. Os cosméticos avaliados foram batons, bases faciais, pós compactos, blushes, sombras para os olhos, máscaras para os cílios, lápis ou delineadores para os olhos, e sabonetes líquidos de uso adulto e infantil. Os testes in vivo e as linhagens celulares utilizadas no método de difusão em ágar foram escolhidas de acordo com o local de uso dos produtos, com exceção da linhagem NCTC clone 929 que foi utilizada na avaliação de todas as amostras. Das 204 amostras, 141 foram avaliadas pelo teste de irritação cutânea e linhagem FPC-IAL, 80 pelo teste de irritação ocular e linhagem SIRC e 78 pelo teste de irritação de mucosa oral e linhagem FPC-IAL. Somente as amostras de sabonetes líquidos foram avaliadas também pelo método de captura do vermelho neutro com as três linhagens celulares. Na avaliação in vitro as amostras foram analisadas em diferentes concentrações e o parâmetro observado foi viabilidade celular com o corante vermelho neutro. Os resultados obtidos permitiram observar que as amostras positivas no método de difusão em ágar que apresentaram até índice de zona 3 ou seja, halo de morte celular variando de 0,5 a 1,0 cm a partir da amostra, segundo a Farmacopéia Americana, não apresentaram irritação ocular, cutânea ou de mucosa oral. As amostras que apresentaram índice de zona 4, apresentaram diferentes graus de irritação ocular e cutânea com exceção de 2 sabonetes líquidos de uso infantil que não apresentaram reações in vivo, embora apresentaram citotoxicidade até a concentração de 10%. Este método apresentou correlação significante com o teste de irritação ocular, inclusive para os valores individuais da córnea e conjuntiva. Quanto ao método de captura do vermelho neutro obteve-se correlação significante para o teste de irritação cutânea e ocular, podendo inferir que quando as amostras de sabonetes líquidos apresentarem IC50 maior que 0,085% não irão induzir irritação cutânea e ocular nos coelhos. Não foi observada relação entre a origem das linhagens celulares usadas e o tecido alvo utilizado no teste in vivo, sendo que todas as linhagens mostraram correlação significante com a linhagem NCTC clone 929. De acordo com os dados, conclui-se que os métodos in vitro são mais sensíveis e que o método de difusão em ágar usando a graduação da Farmacopéia Americana, pode ser adotado como ensaio de triagem na avaliação de cosméticos. Isto resulta de sua capacidade de predizer a irritação, contribuindo significativamente para a redução dos testes que utilizam animais. / The procedures described by Draize are the basis of both ocular and cutaneous irritation tests and have been adopted internationally for in vivo evaluation of products and substances. However, they have been criticized for ethical reasons, due to their cruelty towards animals. Therefore, alternative methodologies are being studied to evaluate the toxicity of products, which have contact with human beings. Thus, a comparative study was performed between ocular, cutaneous and oral mucosa irritation tests using rabbits and in vitro tests through agar diffusion method and neutral red uptake method, both with the use of NCTC clone 929, FPC-IAL and SIRC cell lines. Lipsticks, makeup base, face powder, blushes, eye shadows, mascara, pencils and eyeliners, as well as liquid soap for children and adult use were evaluated. The in vivo tests and the cell lines used in the agar diffusion test were chosen according to the place where the products are used. Only the NCTC clone 929 linage was used in the evaluation of all the samples. From the 204 analyzed samples, 141 were evaluated through the cutaneous irritation test and FPC-IAL lineage, 80 through the ocular irritation test and SIRC lineage, and 78 through the oral mucosa irritation test and FPC-IAL lineage. Only the samples of liquid soap were also evaluated through the neutral red uptake method with the three cells lines. The samples submitted to the in vitro evaluation were analyzed in different concentrations and the observed parameter was cellular viability with the use of neutral red. The results obtained revealed that the agar diffusion test positive samples which presented up to degree 3 zone rate, that is cellular death halo varying from 0,5 to 1,0cm from the samples, according to USP 25, didn’t provoke ocular, cutaneous or oral mucosa irritation. The samples which presented degree 4 zone also showed different degrees of ocular and cutaneous irritation, except to two units of liquid soap for children use which didn’t present in vivo reactions, although citotoxicity up to 10% concentration. This method showed significant correlation with the ocular irritation test and also concerning the individual values of cornea and conjunctiva. As for the neutral red uptake test, it presented significant correlation in the ocular and cutaneous irritation test, what make it possible to infer that when the liquid soap samples present IC50 above 0,085% they won’t cause ocular and cutaneous irritations in rabbits. No relation was observed between the origin of the cell lines and the target tissue used in the in vivo test, having all the cellular lines shown significant correlation with the NCTC clone 929 line. According to the data, the in vitro methods are more sensitive and the diffusion agar method, using the American Pharmacopeia graduation, can be adopted as a sorting procedure in the evaluation of cosmetics. This is a result of its capacity of predicting irritation, what largely contributes for the reduction of animal using tests.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristina Pessoa Veloso Freire.pdf: 2819799 bytes, checksum: 8919fceb66aefa886139385d2b54aae1 (MD5) Previous issue date: 2010-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / the species most frequently at least seven species, has been associated with diseases in humans: Candida albicans, Candida. tropicalis, Candida stellatoidea, Candida pseudotropicalis (now called C. Kefyr), Candida parapsilosis, Candida guilliermondii and Candida krusei. There is an increased occurrence of infections by Candida species, caused by population growth that immunosuppression with high predisposition to develop infections. Also, there was an increased use of antifungal agents, where some Candida showed a decline in sensitivity to these agents. Increasing numbers of fungal strains are becoming resistant to the drugs available. As a result, there is a constant search for new antifungal drugs more effective and safer than existing ones. The naphthoquinones are widely distributed in nature, with the known activities, the antibacterial, antifungal and antitumor. Thus the objective of this study was to evaluate the antifungal activity and cytotoxicity of naphthoquinones semisynthetic in Candida strains isolated from the oral cavity. The strains studied were C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. kefyr, C. tropicalis and C. dubliniensis. The susceptibility of semi-synthetic naphthoquinones was tested initially by using the simple diffusion from the hole in the culture medium (hole plate), to obtain a quantitative analysis, and then for a quantitative analysis technique was used in broth. Patterns known antifungals were used, for comparison of antifungal activity. The semi-synthetic naphthoquinone that showed the best antifungal activity in the hole plate technique was NORALFA, followed by IVS322 with average of inhibition zone against C. albicans 21,26 mm and 16,62 mm respectively, and quantitative analysis of antifungal activity, substances NORALFA and IVS322 stood out with MIC against C. albicans 0,125 μg/ml and 0.5 μg/ml. It was found that none of the substances tested at a concentration of 50 μg/ml caused hemolysis and fibroblasts tested remained viable at a concentration of 12,5 μg/ml. This result is favorable, since the hemolysis test is a measure of toxicity and a positive result would preclude the therapeutic use of these substances. Through this work we determine the potential antifungal and cytotoxic profile of the compounds tested. / A candidíase é uma doença infecciosa causada pelo fungo Candida, sendo a espécie albicans a mais freqüentes. Sete espécies pelo menos, tem sido associadas a doenças no homem: Candida albicans, Candida. tropicalis, Candida stellatoidea, Candida peseudotropicalis (hoje chamada de C. Kefyr), Candida parapsilosis, Candida guilliermondii e Candida krusei. Há um aumento da ocorrência das infecções por espécies de Candida, causada pelo crescimento da população com imunodepressão que grande predisposição ao desenvolvimento de infecções.Números cada vez maiores de cepas fúngicas estão se tornando resistentes aos fármacos disponíveis no mercado. Em virtude disso, existe uma constante procura de novos fármacos antifúngicos mais eficazes, e mais seguros que os já existentes. As naftoquinonas são amplamente distribuídas na natureza, tendo como atividades conhecidas, a atividade antibacteriana, antifúngica e antitumoral. Desta forma o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica e citotoxicidade de naftoquinonas semi-sintéticas em cepas de Candida isoladas da cavidade oral. As cepas estudadas foram de C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. kefyr, C. tropicalis e C. dubliniensis. A suscetibilidade das naftoquinonas semisintéticas foi testada inicialmente, através do teste difusão a partir de orifício no meio de cultura (hole plate). Posteriormente para uma analise quantitativa foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo. Padrões antifúngicos conhecidos foram usados, para comparação da atividade antifúngica. A citotoxicidade foi avaliada em hemácias de camundongos através do teste de hemólise e através do teste de viabilidade celular em fibroblastos, utilizando o Alamar Blue. A naftoquinona semisintética que apresentou melhor atividade antifúngica na técnica hole plate foi a NORALFA, seguida da IVS322 com médias do halo de inibição frente a C. albicans de 21,26 e 16,62 mm respectivamente, e na análise quantitativa da atividade antifúngica, as substâncias NORALFA e IVS322 se destacaram com CIM frente a C. albicans 0, 125 μg/ml e 0,5 μg/ml. Verificou-se que nenhuma das substâncias testadas a uma concentração de 50 μL/ml provocou hemólise e os fibroblastos testados permaneceram viáveis na concentração de 12,5 μL/ml. Este resultado é favorável, uma vez que o teste de hemólise é um parâmetro de toxicidade e um resultado positivo poderia impossibilitar o uso terapêutico dessas substâncias. Com a realização deste trabalho conseguimos determinar o potencial antifúngico e o perfil citotóxico das substâncias testadas.

Os ensaios celulares têm ganhado relevância na gênese planejada de fármacos, devido a sua utilização nas diversas etapas envolvidas neste processo. Estes ensaios envolvem a caracterização da atividade farmacológica, propriedades farmacocinéticas e atividade tóxica para compreender a atividade biológica das moléculas de interesse. Neste trabalho, os ensaios celulares foram usados para identificar a atividade anticancerígena e a atividade tóxica de moléculas, uma vez que a morte celular é o parâmetro avaliado em ambos os casos. No presente estudo foram avaliados 34 compostos, sendo dezessete moléculas do grupo NEQUIMED, determinando-se sua atividade citotóxica na célula neoplásica de fígado (HepG2) e na célula de fibroblasto (V79-4). A determinação da atividade citotóxica dos compostos bioativos foi realizada por o método colorimétrico de triagem envolvendo o MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), que é metabolizado pela mitocôndria da célula viva, com confirmação da atividade biológica realizada por citometria de fluxo para a linhagem de fibroblasto. As triagens iniciais foram estabelecidas para determinar a atividade biológica, sendo que as moléculas Neq256, Neq385 e Neq388 apresentaram atividade citotóxica frente à célula HepG2 (caracterizando assim a atividade anticancerígena), enquanto que Neq385 apresentou seletividade em relação a atividade nas células de fibroblasto. Dentre as moléculas de referência, YM-155 apresentou os melhores resultados de atividade citotóxica com IC50 (HepG2) de 0,094 &micro;mol L-1 e IC50 (V79-4) > 100 &micro;mol L-1, sendo muito seletiva para a linhagem cancerígena. Os resultados demonstraram que as moléculas Neq265, Neq385 e Neq388 são promissoras e serão usadas para o planejamento de modificações estruturais que visa obter moléculas com maior potência e seletividade frente às células cancerígenas. Outra vertente do trabalho envolve o planejamento de inibidores da survivina, que apresentam grande potencial para a descoberta e desenvolvimento de estratégias quimioterápicas seletivas. / Cell-based assays are gaining relevance in the drug discovery and development area, being in use almost throughout the whole process. These assays are applied to characterize the pharmacological, pharmacokinetic and toxic activities of new molecules. In this work, cell-based assays were performed to identify anticancer and toxic activities of novel compounds, once the cell death process is the parameter that was evaluated in both cases. In this work, 34 compounds were evaluated (17 of them from the NEQUIMED database) in which the cytotoxic activity in liver cancer cells (HepG2) and hamster fibroblast cells (V79-4) were determined by means of the MTT colorimetric screening. The biological activity in fibroblast cells was further confirmed by using flow cytometry. Out of the whole set, molecules Neq256, Neq385 e Neq388 were cytotoxic to HepG2 (having anticancer activity). Neq385 was selective towards the liver hepatocellular carcinoma when compared with the fibroblasts. Among the reference compounds, YM-155 was the most selective and potent anticancer molecule: IC50 (HepG2) 0.094 &micro;mol L-1 and IC50 (V79-4) > 100 &micro;mol L-1. Taken together, these results provide promissing new molecules (Neq265, Neq385 e Neq388) for further optimization of the potency and selectivity using drug design. Another important outcome for further exploration is the design of survivin inhibitors bearing a huge potential for novel selective chemotherapeutic approaches.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2017-08-29T16:32:41Z No. of bitstreams: 2 Dissertação completa - CDALINE.pdf: 1677578 bytes, checksum: 70a6d704ab40032dc2f9a1952477236e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T16:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação completa - CDALINE.pdf: 1677578 bytes, checksum: 70a6d704ab40032dc2f9a1952477236e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In the pharmaceutical area, plants and plant extracts are very important because they can serve as prototypes for the development of new drugs and as a source of pharmaceutical raw materials. Public health problems such as Chagas' disease and bacterial resistance to antimicrobials show a constant need for more efficient and safe drugs and active principles. In this context, the pharmacological study of plant species is extremely important. Among the plants with high medicinal potential, those of the genus Lonchocarpus stand out with several biological activities reported. The plant Lonchocarpus cultratus (Fabaceae) has proven action against sarcoma 180 and against Gram-positive bacteria. The main chemical constituents identified are cordoin, isocordoin, derricin and triterpenes. The objective of this study was to investigate the anti-bacterial action of the extracts of the seeds and roots from the L. cultratus species, to evaluate the anti-T.cruzi activity and the respective hemotoxicity of the extracts of the plant seeds and to carry out the chemical characterization of these extracts. The extracts hexane (LHS), dichloromethane (LDS) and methanolic (LMS) were obtained from plant seeds by successive macerations. The chemical characterization was performed by qualitative analytical methods and by 1H NMR. The anti-bacterial activity was evaluated by disc diffusion test, anti-T. Cruzi by direct counting method of the parasites in the Neubauer chamber and the hemotoxicity by UV method. Qualitative chemical tests showed that alkaloids, chalcones, coumarins, triterpenes and saponins are present in the roots and seeds of L. cultratus, flavonoids and steroids, only in the roots and tannins were not observed. Chalcones were identified by 1H NMR in LDS and LHS and steroids and terpenes in LMS. The LDS and LHS extracts showed activity against the epimastigote form of T. cruzi protozoan. The LDS results were better, showing inhibition of protozoan growth of 92.30% at the concentration of 175 μg.mL-1. The IC 50 value for this extract was 6.16 μg.mL-1 and at this concentration did not show toxicity to the red blood cells. The extracts studied did not present antimicrobial activity. The absence of anti-bacterial activity in the extracts of L. cultratus, especially in the root extract previously reported, suggests problems related to the stability or low concentration of bioactive chalcones in the extract. Although there is a need for additional research, anti-T. Cruzi and hemotoxicity obtained with the dichloromethane extract show an alternative potential for the treatment of Chagas' disease / Na área farmacêutica, as plantas e os extratos vegetais são muito importantes, pois podem servir como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos e como fonte de matérias-primas farmacêuticas. Problemas de saúde pública, como a doença de Chagas e a resistência bacteriana aos antimicrobianos, mostram a necessidade constante na busca de novos medicamentos e princípios ativos mais eficientes e seguros. Neste contexto, o estudo farmacológico de espécies vegetais é de extrema importância. Dentre as plantas com alto potencial medicinal, as do gênero Lonchocarpus destacam-se com diversas atividades biológicas relatadas. A planta Lonchocarpus cultratus (Fabaceae) possui ação comprovada frente ao sarcoma 180 e contra bactérias Gram-positivas. Os principais constituintes químicos identificados são a cordoina, a isocordoina, a derricina e triterpenos. Por ser uma planta pouco estudada e dando continuidade a estudos do grupo de pesquisa, o presente trabalho teve o objetivo de investigar a ação anti-bacteriana dos extratos das sementes e raízes da espécie L. cultratus, avaliar a atividade anti-T.cruzi e respectiva hemotoxicidade dos extratos das sementes da planta e realizar a caracterização química desses extratos. Os extratos hexânico (LHS), diclorometânico (LDS) e metanólico (LMS) foram obtidos de sementes da planta através de macerações sucessivas. A caracterização química foi realizada por meio de métodos analíticos qualitativos e por RMN 1H. A atividade anti-bacteriana foi avaliada por teste de difusão em disco, a anti-T. cruzi por método de contagem direta dos parasitas em câmara de Neubauer e a hemotoxicidade por método UV. Os testes químicos qualitativos mostraram que alcaloides, chalconas, cumarinas, triterpenos e saponinas estão presentes nas raízes e nas sementes da planta L. cultratus, flavonoides e esteroides, somente não foram observados nas raízes e taninos. Chalconas foram identificadas por RMN 1H, em LDS e LHS e esteroídes e terpenos em LMS. Os extratos LDS e LHS apresentaram atividade contra a forma epimastigota do protozoário T. cruzi. Os resultados do LDS foram melhores, mostrando inibição de crescimento do protozoário de 92,30% na concentração de 175 μg.mL-1. O valor de CI50 para este extrato foi 6,16 μg.mL-1 e nesta concentração não apresentou toxicidade para as hemácias. Os extratos estudados não apresentaram atividade antimicrobiana. A ausência de atividade anti-bacteriana nos extratos de L. cultratus, principalmente no extrato das raízes cuja propriedade foi reportada anteriormente, sugere problemas relacionados à estabilidade ou baixa concentração de chalconas bioativas no extrato. Embora haja necessidade de pesquisas adicionais, os resultados anti-T. cruzi e de hemotoxicidade obtidos com o extrato diclorometânico mostram potencial alternativa para o tratamento da Doença de Chagas.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

Micosporinas são substâncias pertencentes a um grupo de compostos naturalmente encontrados em algas e fungos, que são utilizadas por estes organismos como mecanismo de defesa. São potentes bloqueadores químicos de radiação ultravioleta (UV), atuando principalmente na faixa espectral da radiação UVA, com absorção máxima variando entre 300 e 360 nm, dependendo de sua composição estrutural. Quimicamente, são caracterizadas por um cromóforo ciclohexenona ou ciclohexenimina conjugado com o nitrogênio substituinte de um aminoácido ou aminoálcool. Em alguns membros deste grupo também foi evidenciada uma moderada atividade antioxidante, podendo estes atuarem como antioxidantes naturais em organismos marinhos. Os processos sintéticos utilizados, com o objetivo de obtenção de forma não natural destas moléculas, se basearam em princípios de química verde e evitaram a utilização de solventes orgânicos bem como a produção de intermediários tóxicos. As reações envolvendo uma dicetona cíclica e diferentes aminoácidos foram testadas por diferentes metodologias \"verdes\". A partir destes processos foram obtidos 11 análogos das micosporinas, dos quais 9 tiveram seus potenciais farmacológicos e toxicológicos avaliados. Para verificação do potencial farmacológico das moléculas, foi determinado um espectro de absorção de radiação ultravioleta para cada um dos compostos, que posteriormente tiveram seus potenciais antioxidantes verificados através das atividades sequestrantes de radicais DPPH e de radical superóxido. Os espectros obtidos dos compostos demonstram uma absorção máxima variando de 255 a 309 nm para os diferentes compostos. No ensaio antioxidante de DPPH, dois compostos atingiram a IC50, em concentrações de 1,597 e 1,387 mM, e no ensaio de sequestro de radical superóxido, todos os compostos testados atingiram a IC50, em concentrações que variam de 0,204 a 1,164 mM. O potencial citotóxico das moléculas foi testado em culturas celulares de fibroblastos 3T3, através da incorporação das substâncias em diferentes concentrações e verificação de viabilidade celular, pelo método de redução de MTT, após exposição por 24 horas. O ensaio fototóxico procedeu da mesma forma, porém com a exposição das células a radiação ultravioleta concomitantemente à aplicação dos compostos. Os resultados obtidos demonstraram que nenhum dos compostos pode ser considerado citotóxico, porém um dos compostos é ativado com a exposição a radiação UVA, sendo assim, considerado fototóxico. / Mycosporines are substances belonging to a group of compounds naturally found in algae and fungi, which are used by these organisms as a defense mechanism. They are potent chemical blockers of ultraviolet radiation (UV), acting mainly in the spectral range of UVA, with maximum absorption ranging from 300 to 360 nm, depending on its structural composition. Chemically, they are characterized by a cyclohexenone or cyclohexenimine chromophore conjugated with the nitrogen substituent of an amino acid or an amino alcohol. Some mycosporines present a moderate antioxidant activity; in this case, they can act as natural antioxidants in marine organisms. Our synthesis was based on green chemistry principles and avoided the use of organic solvents and the production of toxic intermediates. The reactions involving a cyclic diketone and different amino acids were tested by different clean methods. Eleven mycosporines analogues were obtained. Nine of them had their pharmacological and toxicological potential evaluated. In order to verify the pharmacological potential of molecules, we determined the UV absorption spectrum of each mycosporine analogue. In addition, we evaluated their antioxidant activity by DPPH and superoxide radical scavenging potential methods. The compounds spectra show an absorption maximum ranging from 255 to 309 nm for different compounds. In the DPPH assay, two compounds reached the IC50 at concentrations of 1.597 e 1.387 mM. In the superoxide scavenging assay, all compounds tested reached the IC50 at concentrations ranging from 0.204 to 1.164 mM. The cytotoxic potential of these molecules was tested in cell cultures (3T3 fibroblasts) through the incorporation of different concentrations of the analogues and checking cell viability by MTT reduction method. The phototoxic test was conducted similarly, but adding the exposure of cells to UV radiation after addition of mycosporines analogues. The results showed that none of the compounds can be considered cytotoxic, but one of the compounds is activated by exposure to UVA radiation, becoming phototoxic.

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O desenvolvimento e a validação do método para LGT e das três impurezas foram realizados por CLAE acoplada a um detector de arranjo de diodo (DAD), utilizando coluna C8 (5 μm - 4,6x100 mm), fase móvel eluída em modo gradiente, constituída de uma mistura de ácido fórmico 0,1% pH 3,5 e acetonitrila (ACN) eluída com uma rampa crescente de 10% na proporção de ACN de (0) zero ao 4 min (30% para 70%) e decrescente de 10% na proporção de ACN de 5 a 8 min (70% para 30%), vazão de 0,6 mL/min, volume de injeção de 20 μL e temperatura do forno de 30°C. Os comprimentos de onda de detecção utilizados foram 294, 278, 268 e 280 nm para LGT, impureza 1, 2 e 3, respectivamente. O método apresentou-se seletivo e específico para a LGT e as impurezas, pois não houve interferência dos produtos de degradação por Ultravioleta A, hidrólise básica (hidróxido de sódio 1,0 mol/L) e ácida (ácido clorídrico 1,0 mol/L), peróxido hidrogênio 30%, temperatura 60 °C e hidrólise básica e ácida em condições térmicas à 80 °C e dos excipientes na quantificação do fármaco. A resposta foi linear na faixa de 2,41-144,0 μg/mL (r = 0,9996) para a LGT e na faixa de 0,06-3,6 μg/mL para as impurezas testadas (r = 0,9963, 0,9994 e 0,9991 para impureza 1, 2 e 3, respectivamente). O método demonstrou exatidão, com teores de recuperação de 99,79, 93,12, 92,92 e 93,99% para a LGT e impureza 1, 2 e 3, respectivamente. A precisão intra e inter-dia foi satisfatória (RSD 1,36, 4,14, 3,50 e 4,08% para a LGT e impureza 1, 2 e 3, respectivamente) e a robustez não apresentou diferenças significativas com pequenas alterações nas condições analíticas (pH, fase móvel, temperatura, fluxo e detector). A cinética de degradação em condição alcalina associada a temperatura de (80 ºC), apresentou resultados de primeira ordem. A avaliação da segurança biológica foi realizada por meio da citotoxicidade, mutagenicidade e genotoxicidade através dos testes de viabilidade celular, micronúcleo e cometa, respectivamente. Nos testes de segurança biológica a LGT apresentou-se apenas citotóxica na concentração 10 vezes superior a concentração plasmática máxima, enquanto as impurezas 1 e 3 apresentaram-se citotóxica, mutagênica e genotóxica em uma concentração equivalente a 10% concentração plasmática máxima do fármaco e a impureza 2 evidenciou sua citotoxicidade e genotoxicidade na concentração equivalente a 10% da concentração plasmática máxima do fármaco. De acordo com os resultados obtidos, pode-se observar que o método proposto foi indicativo de estabilidade por CLAE para LGT e ainda demonstrou-se adequado para análise quantitativa das impurezas de síntese do fármaco. Além disso, evidenciou-se que a LGT e as impurezas de síntese estão em conformidade com os testes de segurança biológica empregados, desde que utilizadas nas concentrações adequadas. / Linagliptin (LGT) is an inhibitor of DPP4 used for glycemic control of type 2 mellitus diabetes. Since the drugs used in the production process of the pharmaceutical formulations are not considered totally pure, the Regulatory Guides describing the need of the drug quantification and impurities potentials. Therefore, the aim of this study was to develop a method by highperformance liquid chromatography to quantify the drug and three potential synthetic impurities and biological safety studies. The development and validation of the method for LGT and the three impurities were carried out by HPLC coupled to a photodiode array detector. The chromatographic separation was performed in a RP8 column (150 x 4.6 mm, 5 μm), at 30°C. The separation was performed by means of a linear gradient elution (eluent A: formic acid 0.1% pH 3.5; eluent B: acetonitrile). The gradient obeys the following sequence: 3070% of B (0 - 4 minutes) and 7030 of B (4,01 - 8 minutes) at a flowrate of 0.6 mL min1 and run time of 10 minutes. The injection volume was 20 μL and detection at 294, 278, 268 e 280 nm for LGT, impurity 1, 2 and 3, respectively. The method showed selectivity and specific for the LGT and synthetic impurities, therefore no interference of degradation products (UV-A, basic hydrolysis (sodium hydroxide 1.0 mol L1) and acid (hydrochloric acid 1.0 mol L1), peroxide (30%), temperature (60 ° C) and acidic and basic hydrolysis under thermal conditions (80° C)) and the excipients in the quantification of the drug. The response was linear from 2.41 to 144.0 μg mL1 (r = 0.9996) for the LGT and in the range of 0.06 to 3.6 μg mL1 (r = 0.9963, 0.9994 and 0.9991 for impurity 1, 2 and 3, respectively ). The method showed accuracy, with recovery levels of 99.79, 93.12, 92.92 and 93.99% for LGT and impurity 1, 2 and 3, respectively. The intra and inter-day precision was suitable (RSD 1.36, 4.14, 3.50 and 4.08% for LGT and impurity 1, 2 and 3, respectively) and the robustness showed no significant differences with small changes in the analytical conditions (pH of the mobile phase, temperature, flow-rate and detector). The kinetics of degradation in alkaline conditions associated with temperature (80° C), showed results of the first order. The evaluation of the biological was performed by cytotoxicity, mutagenicity and genotoxicity through the cell viability test, micronucleus and comet, respectively. In biological safety testing LGT had only cytotoxic activity at a concentration of 10 times the maximum plasma concentration, while the impurity 1 and 3 set out cytotoxic, mutagenic and genotoxic in a concentration equivalent to 10% maximum plasma concentration of the drug and impurity 2 showed cytotoxicity and genotoxicity in concentration equivalent to 10% of the maximum plasma concentration of the drug. According to the results, it can be seen that the proposed method by HPLC is stability-indicating and suitable for quantitative analysis of the drug and synthetic impurities. Furthermore, it was observed that the LGT and synthetic impurities are in accordance with biological safety studies, if they are used in appropriate concentration.