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Ondřej Zemek Organophosphorus derivatives for "click-chemistry" In this diploma thesis two new macrocyclic ligands were synthesized. They have DO3A moiety where metal (lanthanide) ion can be coordinated and terminal acetylenic or azide group connected through the phosphinic acid. Both terminal acetylenic and azide group should serve for connecting to another molecules or partitions by mean of "click chemistry" i.e. [1,3] copperI catalyzed dipolar cycloaddition between azide and acetylene. In this thesis two ligands, its complexes with some lanthanides as well as its precursors were prepared and characterized. Gd3+ complexes will be further used and studied for potential MRI contrast agents applications.

La recherche sur le cancer se tourne vers le développement de la nanomédecine, c’est-à-dire l’utilisation de nanoparticules pour augmenter l'efficacité thérapeutique et réduire la toxicité du traitement. Dans ce contexte, ces travaux ont été consacrés à la conception de nano objets pour des applications en thérapie anticancéreuse. Ces systèmes ont été élaborés à partir d'un châssis moléculaire cyclodécapeptidique présentant plusieurs ligands peptidiques RGD ciblant l’intégrine αvβ3, récepteur transmembranaire jouant un rôle clé dans l’angiogenèse. Dans un premier temps, nous avons synthétisé plusieurs composés en faisant varier la structure du châssis peptidique afin de moduler la présentation des ligands RGD lors de leur interaction avec l’intégrine αvβ3. L’évaluation biologique in vitro des différents composés synthétisés suivi d’une étape de simulation de dynamique nous a permis de déterminer une présentation optimale des ligands RGD. Nous avons ensuite développé une nouvelle voie de synthèse combinant deux réactions orthogonales catalysées au cuivre permettant l’accès à ces vecteurs peptidiques avec de meilleurs rendements et avec un temps de synthèse réduit par rapport à la voie classique. Finalement, nous avons greffé les clusters de RGD sur des nanoparticules lipidiques, puis polymériques, afin d’apporter un élément de ciblage. Ces deux projets ont été réalisés à travers des collaborations, respectivement avec le laboratoire du Prof. Patrick Couvreur (nanoparticules de squalène) et avec le laboratoire du Dr Marie-Thérèse Charreyre (nanoparticules de copolymères NAM/NAS). Ces systèmes ont ensuite été étudiés in vitro pour des applications en thérapie et en imagerie / Cancer research is now taking advantage of nanomedicine that is to say the use of nanoparticles to increase treatment efficiency and reduce toxicity. In this context, this work has been devoted to the design and synthesis of nano objects for applications in cancer therapy. These systems are based on a cyclodecapeptidic molecular scaffold presenting several RGD peptidic ligands targeting the αvβ3 integrin, a transmembrane receptor playing a key role in angiogenesis. We first synthesized several compounds by modifying the structure of the peptidic scaffold in order to alter the presentation of the RGD ligands during their interaction with the αvβ3 integrin. Biological in vitro evaluation of the different synthesized compounds followed by dynamics simulation allowed us to identify an optimal presentation of the RGD ligands. We then developed a new synthesis combining two orthogonal copper-catalyzed reactions yielding those peptidic vectors with lower reaction times and better yields compared to the classic synthesis. We finally grafted the RGD clusters on lipidic, then polymeric nanoparticles to add targeting moieties. Both projects were realized through collaborations, respectively with Prof. Patrick Couvreur’s lab (squalene nanoparticles) and Dr. Marie-Thérèse Charreyre’s lab (NAM/NAS copolymers). Those systems were then evaluated in vitro for applications in therapy and imaging.

La recherche sur le cancer se tourne vers le développement de la nanomédecine, c’est-à-dire l’utilisation de nanoparticules pour augmenter l'efficacité thérapeutique et réduire la toxicité du traitement. Dans ce contexte, ces travaux ont été consacrés à la conception de nano objets pour des applications en thérapie anticancéreuse. Ces systèmes ont été élaborés à partir d'un châssis moléculaire cyclodécapeptidique présentant plusieurs ligands peptidiques RGD ciblant l’intégrine αvβ3, récepteur transmembranaire jouant un rôle clé dans l’angiogenèse. Dans un premier temps, nous avons synthétisé plusieurs composés en faisant varier la structure du châssis peptidique afin de moduler la présentation des ligands RGD lors de leur interaction avec l’intégrine αvβ3. L’évaluation biologique in vitro des différents composés synthétisés suivi d’une étape de simulation de dynamique nous a permis de déterminer une présentation optimale des ligands RGD. Nous avons ensuite développé une nouvelle voie de synthèse combinant deux réactions orthogonales catalysées au cuivre permettant l’accès à ces vecteurs peptidiques avec de meilleurs rendements et avec un temps de synthèse réduit par rapport à la voie classique. Finalement, nous avons greffé les clusters de RGD sur des nanoparticules lipidiques, puis polymériques, afin d’apporter un élément de ciblage. Ces deux projets ont été réalisés à travers des collaborations, respectivement avec le laboratoire du Prof. Patrick Couvreur (nanoparticules de squalène) et avec le laboratoire du Dr Marie-Thérèse Charreyre (nanoparticules de copolymères NAM/NAS). Ces systèmes ont ensuite été étudiés in vitro pour des applications en thérapie et en imagerie / Cancer research is now taking advantage of nanomedicine that is to say the use of nanoparticles to increase treatment efficiency and reduce toxicity. In this context, this work has been devoted to the design and synthesis of nano objects for applications in cancer therapy. These systems are based on a cyclodecapeptidic molecular scaffold presenting several RGD peptidic ligands targeting the αvβ3 integrin, a transmembrane receptor playing a key role in angiogenesis. We first synthesized several compounds by modifying the structure of the peptidic scaffold in order to alter the presentation of the RGD ligands during their interaction with the αvβ3 integrin. Biological in vitro evaluation of the different synthesized compounds followed by dynamics simulation allowed us to identify an optimal presentation of the RGD ligands. We then developed a new synthesis combining two orthogonal copper-catalyzed reactions yielding those peptidic vectors with lower reaction times and better yields compared to the classic synthesis. We finally grafted the RGD clusters on lipidic, then polymeric nanoparticles to add targeting moieties. Both projects were realized through collaborations, respectively with Prof. Patrick Couvreur’s lab (squalene nanoparticles) and Dr. Marie-Thérèse Charreyre’s lab (NAM/NAS copolymers). Those systems were then evaluated in vitro for applications in therapy and imaging.

Au cours de ces dernières années, les sesquiterpénoïdes de type eudesmane et leurs activités biologiques font l'objet de nombreuses études phytochimiques et pharmacologiques, ainsi que des recherches de voies de synthèse et d'hémisynthèse. Pour notre part, nous nous sommes intéressés à la synthèse des analogues de types eudesmanes par fonctionnalisation des constituants majoritaires de Dittrichia Viscosa. Dans le premier chapitre, nous avons donné un rappel bibliographique sur l’aspect botanique de Dittrichia Viscosa, ainsi qu’une description phytochimique qui montre que cette plante renferme différents constituants : terpénödes, flavonoïdes, phénylpropanoïdes et polycétides présentant des propriétés pharmacologiques variés. Dans le deuxième chapitre, et après un rappel bibliographique sur les différents types d’eudesmane et l’extraction et la purification des produits majoritaires de Dittrichia Viscosa (l'acide α-costique, l'acide ilicique et la tomentosine), nous avons réalisé l’étude des réarrangements des époxy-eudesmanes par catalyse acide et la synthèse de l'aldéhyde α-costal et ses analogues. Nous avons aussi mise au point des conditions réactionnelles de fonctionnalisation de la double liaison C11-C13 par couplage de Heck permettant l’accès à des librairies d'eudesmanes arylés en position 13. En fin, le dernier chapitre est consacré à l’étude de la réactivité de la tomentosine vis-à-vis des additions nucléophiles (type Addition de Michael) et des additions 1,3 dipolaire (des nitrones et des oxydes de nitrile) sur la double liaison conjuguée exo-cyclique. / In recent years, the sesquiterpenoids eudesmane type and their biological activities are subject to numerous phytochemical and pharmacological studies and research of synthetic and semisynthetic routes. For our part, we are interested in the synthesis of similar types of eudesmanes by functionalization of the major constituents of Dittrichia Viscosa. In the first part we gave a bibliographical recall on the botanical aspect of Dittrichia Viscosa and a phytochemical description shows that this plant contains various constituents: terpénödes, flavonoids, phenylpropanoids and polyketides with various pharmacological properties. In the second part, and after giving a bibliographical recall of the different types of eudesmane and extraction and purification of major products of Dittrichia Viscosa (α-costique acid, ilicique acid and tomentosin), we realized the study of epoxy eudesmanes rearrangements by acid catalysis and the synthesis of α-costal aldehyde and its analogues. We also focus on the reaction conditions for functionalization of C11-C13 dual link Heck coupling allowing access to libraries eudesmanes aryl in position 13. In the last part, we are interested to the study of the reactivity of the tomentosin with nucleophilic additions (type Michael Addition) and 1,3-dipolar additions (nitrones and nitrile oxides) on the double link exo-cyclic combined.

This thesis is focussed on the biosynthesis of three toxins: fluoroacetate, 4-fluoro-L-theronine and β-ethynyl-L-serine which are biosynthesised by the soil bacteria Streptomyces cattleya. The two fluorinated metabolites originate from a common biosynthetic pathway and the thesis describes studies carried out on an aldose-ketose isomerase enzyme of the pathway. The biosynthetic origin of β-ethynyl-L-serine is not known. A total synthesis of this acetylenic amino acid is descibed along with the development of a new analytical method for identifying the metabolite and for future isotope-labelling based biosynthetic studies. Chapter 1 presents the background of this research. It is focussed on the biosynthesis of fluoroacetate and 4-fluoro-L-threonine by S. cattleya and it also introduces alkyne-containing natural products and their biosynthesis. Chapter 2 describes the work carried out on crystallisation of the aldose-ketose isomerase of the fluorometabolite pathway in S. cattleya. Crystals of the isomerase were obtained and they were diffracted by X-ray, however a structure could not be solved. Chapter 3 contains site-directed mutagenesis studies of the isomerase from S. cattleya. Chapter 4 describes an enantioselective total synthesis of β-ethynyl-L-serine. A robust analytical technique based on derivatisation using 'Click' chemistry and LC-MS was developed for the detection of this amino acid directly from the fermentation broth. Chapter 5 details the experimental procedures for compounds synthesised in this thesis and the biological procedures for gene cloning and protein purification.

La Tomographie par émission de positons (TEP) constitue l’une des techniques d’imagerie médicale les plus novatrices pour la visualisation in vivo des processus biologiques. Elle intervient comme technique de choix pour le diagnostic dans de nombreux domaines notamment, en oncologie, cardiologie ou encore en neurologie. La conception et l’élaboration de nouveaux radiotraceurs sont en perpétuel développement. L’utilisationd’oligonucléotides (ODN) modifiés (aptamères) possédant une grande affinité et spécificité pour une cible (gène,protéine, principe actif), comme radiotraceur pour l’imagerie in vivo apparait comme une alternative intéressante. A ce jour, quelques rares exemples d’oligonucléotides marqués, par un radioisotope, ont été décrits dans la littérature.Dans ce contexte, il a été développé deux méthodologies d’introduction du radioisotope (11C ou 18F) en dernièreétape de synthèse par chimie ‘‘click’’ pour le marquage de nucléosides et d’oligonucléotides envisagés commeradiotraceurs pour la TEP. / Positron Emission Tomography (PET) is a powerful molecular-imaging technique for physiological and biologicalinvestigations in various areas, such as oncology, cardiology, and neurosciences, as well as for drug development.Due to the increasing need of this technique for in vivo applications, there is always a demand for the developmentof new tracers and radiolabeling strategies. Furthermore, because of their excellent targeting capacities and easysynthesis along with a high level of diversity, oligonucleotides are already extensively used in vitro as ligands fornucleic acids (antisense oligonucleotides), proteins, and small related molecules (aptamer oligonucleotides). Theuse of aptamers for in vivo imaging appears especially promising, because of the wide range of possibilitiesavailable to introduce variations in their structure through defined chemical modifications. However, only fewexamples of oligonucleotide labeling for PET have been reported. In this context, we have developed twomethodological ways to introduce the radioisotope (11C, 18F), by ‘‘click’’ chemistry, at the last radiosynthesis stepin order to label nucleoside and oligonucleotide as potential radiotracers for PET.

Ce travail de thèse avait pour objectif d’élaborer un système vecteur ciblantl’endothélium pathologiquement activé dans les tissus enflammés, infectés ou tumoraux.Ce vecteur est sous forme de nanoparticules décorées de ligands glycosides capablesd’interagir avec l’E-sélectine, un récepteur exprimé sur les cellules endothélialesactivées.Nous avons mis au point une synthèse de copolymère amphiphile avec une architectureà bloc muni sur sa partie hydrophile d’un ligand glucidique. Ce copolymère a été par lasuite utilisé pour la préparation de nanoparticules de type coeur/couronne. La partiehydrophobe centrale est entourée d’une couronne hydrophile dont l'encombrementstérique et la mobilité limitent l'opsonisation de la particule. Le ciblage actif a été assurépar la présence d’un ligand du récepteur de l’E-sélectine aux extrémités des chaînes depolymères hydrophiles à la surface du vecteur.Avec ces nanoparticules dont les propriétés de surface sont prédéfinies, nous avonsmontré in vitro l’association efficace avec les cellules endothéliales activées, ce qui apermis de valider ce concept de ciblage moléculaire actif par l’intermédiaire du couplerécepteur/ ligand. Un tel système permettra d’améliorer l’indice thérapeutique et labiodistribution des principes actifs anti-inflammatoire et/ou anticancéreux. / The objective of this work was to develop a delivery system targeting pathologically activated endothelium within inflamed, infectious, and some tumoral tissues. This system is composed of nanoparticles bearing sugar residues that are able to recognize and interact with E-selectin, a receptor expressed on the activated endothelial cells.We synthesized an amphiphilic block copolymer with the hydrophilic part terminated by a carbohydrate ligand. The construction was achieved by a combination of click chemisty, ring-opening polymerization and atom transfer radical polymerization. This copolymer was used to prepare nanoparticles of the core/shell type where the central hydrophobic body is surrounded with the hydrophilic shell that can stabilize the particles in aqueous media and limit their opsonisation. Active targeting was achieved by coupling an analogue of sialyl Lewis X, the physiological ligand of E-selectin to the end of the hydrophilic polymer chains on the surface of the particles.We were able to demonstrate in vitro the efficient association of these nanoparticles with defined surface properties with activated endothelial cells. This allowed us to validate our concept of active molecular targeting using this couple receptor/ligand couple. Such a system could be used to improve the therapeutically index and the biodistribution of anti-inflammatory and anti-tumor drugs.

L’intérêt grandissant porté au cours de ces dix dernières années aux monolithes organiques pour des applications électroséparatives se justifie en partie par leur préparation aisée au sein de systèmes miniaturisés, le large choix des monomères précurseurs disponibles, ainsi que la possibilité d’ajuster les paramètres structuraux du matériau final par un contrôle judicieux des conditions opératoires. Au cours de ce travail, la synthèse de nouvelles phases monolithiques a été mise au point selon une stratégie en deux étapes. Dans une première étape, la copolymérisation radicalaire photo-initiée du Nacryloxysuccinimide avec le diméthacrylate d’éthylène glycol réalisée en présence de toluène, a permis l’élaboration de monolithes macroporeux réactifs et hautement perméables. La présence d’esters de succinimide dans la structure chimique du monolithe polymère a été mise à profit pour fonctionnaliser la surface du monolithe par des greffons de nature variée par réaction de substitution nucléophile faisant intervenir des dérivés aminés. Le choix judicieux des greffons a permis la mise au point rapide de phases stationnaires présentant des propriétés électrochromatographiques ciblées. Ainsi, le contrôle du caractère hydrophobe des supports obtenus par greffage d’alkylamines de taille variable a été mis en évidence par la séparation de dérivés benzéniques selon un mécanisme à polarité de phase inversée avec de très bonnes efficacités (200000 plateaux par mètre). L’utilisation de phases stationnaires monolithiques greffées par des sélecteurs aromatiques a été proposée comme alternative aux monolithes aliphatiques hydrophobes. La synthèse de monolithes organiques hydrophiles a été possible par la fonctionnalisation du support réactif par des alkyldiamines. La préparation d’une phase stationnaire chirale a été réalisée selon une approche originale de chimie click consistant à immobiliser un dérivé de cyclodextrine. Dans le but d’étendre l’application des monolithes à base de NAS au greffage de biomacromolécules, une nouvelle matrice monolithique incorporant dans sa structure chimique un co-monomère hydrophile a été élaborée. Les résultats préliminaires ont montré que l’augmentation du caractère hydrophile du squelette monolithique permet d’accroître sensiblement la réactivité des esters de Nhydroxysuccinimide en milieu aqueux / The continuously growing interest observed over the past ten years in the field of organic monoliths dedicated to electroseparation applications is mainly due to their easy preparation methods which are also well-suited to the development of miniaturized systems, the wide range of available monomers and the possibility of tuning the structural parameters of the final material by a judicious control of the synthesis conditions. In the present work, the synthesis of new monolithic stationary phases has been developed using a two-stage strategy. In a first step, the photo-initiated free radical copolymerization of Nacryloxysuccinimide with ethylene glycol dimethacrylate was performed in the presence of toluene allowing the preparation of reactive and macroporous monoliths with high permeability properties. The presence of succinimide esters in the chemical structure of the polymer monolith was used to functionalize the surface of the monolith by various grafts through nucleophilic substitution reaction involving amino derivatives. The judicious choice of the grafts permits the fast development of stationary phases with target electrochromatographic properties. Indeed, the tuning of the hydrophobic nature of the monolithic materials was obtained by the grafting of varied alkylamines and was demonstrated by the separation of benzene derivatives by reversed phase mechanism with very good efficiencies (200 000 plates per meter). The use of monolithic stationary phases grafted with aromatic selectors has been proposed as an alternative to the aliphatic-grafted hydrophobic monoliths. The synthesis of organic hydrophilic monoliths was possible by functionalization of the reactive support by alkyldiamines. The preparation of a chiral stationary phase was performed using an original click chemistry approach involving the immobilization of a cyclodextrin derivative. With the aim to extend the application range of NAS-based monoliths to the grafting of biomacromolecules for selective capture and enzymatic digestion applications, a new monolithic matrix incorporating in its chemical structure a hydrophilic comonomer was prepared. Preliminary results showed that the increase in the hydrophilic character of the polymeric skeleton allows increasing significantly the reactivity of N-hydroxysuccinimide esters in aqueous medium

La chimie de clic est devenue indispensable dans les nombreux domaines de chimie associée à la conception de médicament. Dans ce contexte, comme nous savons(connaissons) l'étude concernant l'impact d'insertion triazole sur la conformation de peptaibol est limitée, nous avons conduit l'étude pour examiner l'impact et l'adaptabilité de 1, 1 4-disubstituted, 2, l'insertion 3-triazole dans peptaibols différent. Selon le résultat de cette expérience touchant à l'activité réduite et la conformation perturbée de l'analogue peptaibol, le substitut dipeptide décoré du fragment triazole portant substituents hydrophobe divers a été inséré à très N-ter la partie du peptaibol. L'amélioration du bioactivity et de la restauration de la conformation pour les analogues peptaibol a été observée et le fait a été aussi soutenu par les résultats obtenus de l'étude biophysique des analogues choisis d'ALM F50/5. Nous avons plus loin prolongé notre étude pour employer notre stratégie à être appliqué sur le peptide P42 thérapeutique qui souffre de la limitation de manque de perméabilité et de stabilité. Le peptide P42 est impliqué dans le pathophysiology de la maladie d'Huntington neurodégénératif. Un total de 12 analogues de peptide de P42-camelote a été synthétisé par SPPS par notre protocole optimize. Dans la deuxième partie, nous avons développé une stratégie pour synthétiser lipopeptide cyclique produit de l'espèce cynaobacterial marine. Notre objectif principal était de synthétiser Hormothamnin A, undecapeptide cyclique consistant de plusieurs acides aminés artificiels incluant dehydroamino acide (Dhaa) qui fait la synthèse de ce peptide compliqué. En raison de cette raison, premièrement, nous avons voulu appliquer notre stratégie de synthétiser Trichormamide A, une sorte relativement plus simple de cylic lipopeptide. Après l'accomplissement de cette tâche, une première tentative a été faite pour synthétiser Hormothamnin A. Le résultat préliminaire de ceci est présenté dans cette section. Enfin, nous avons essayé de développer une méthodologie robuste pour synthétiser Fmoc-Dhaa dans la phase de solution et son insertion dans l'ordre peptaibol par une norme(un standard) SPPS le protocole. Les résultats préliminaires que nous avons concernant la synthèse Dhaa et son insertion dans peptaibol sont aussi discutés ici de plus avec la synthèse de phase solide de Bergofungin naturel D. / The click chemistry has become indispensible in the many areas of chemistry associated with drug design. In this context, as we know the study concerning the impact of triazole insertion on the conformation of peptaibol is limited, we have conducted the study to investigate the impact and adaptability of the 1, 4-disubstituted 1, 2, 3-triazole insertion into different peptaibols. Depending on the outcome of this experiment relating to reduced activity and perturbed conformation of the peptaibol analogue, the dipeptide surrogate decorated with the triazole moiety bearing various hydrophobic substituents was inserted at the very N-ter part of the peptaibol. The improvement of the bioactivity and restoration of the conformation for the peptaibol analogues was observed and the fact was also supported by the results obtained from the biophysical study of the selected analogues of ALM F50/5. We have further extended our study to employ our strategy to be applied on the therapeutic P42 peptide which suffers from the limitation of lack of permeability and stability. P42 peptide is involved in the pathophysiology of neurodegenerative Huntington’s disease. A total of 12 analogues of P42-TAT peptide were synthesized through SPPS by our optimized protocol. In the second part, we have developed a strategy for synthesizing the cyclic lipopeptide originated from marine cynaobacterial species. Our main objective was to synthesize Hormothamnin A, a cyclic undecapeptide consisting of several unnatural amino acids including dehydroamino acid (Dhaa) which makes the synthesis of this peptide complicated. Due to this reason, firstly, we have chosen to apply our strategy to synthesize Trichormamide A, a relatively simpler kind of cylic lipopeptide. After accomplishing this task, a first attempt was made to synthesize Hormothamnin A. The preliminary result of this is presented in this section. At last, we have tried to develop a robust methodology to synthesize Fmoc-Dhaa in solution phase and its insertion into the peptaibol sequence through a standard SPPS protocol. The preliminary results we have got concerning the Dhaa synthesis and its insertion into peptaibol are also discussed here in addition with the solid phase synthesis of natural Bergofungin D