La membrane cellulaire est la barrière qui sépare l'intérieur des cellules de l'environnement extérieur. Elle se compose de lipides et de protéines. Les gènes codant pour les protéines membranaires représentent environ 30% des génomes. Les protéines membranaires sont synthétisées dans le cytosol par les ribosomes, mais suivent des voies spécifiques pour s'intégrer dans la membrane cellulaire. Les ribosomes en cours de traduction de protéines membranaires sont reconnus dans le cytosol et adressés à la membrane. Par la suite, les chaînes naissantes de protéines membranaires sont insérées dans la bicouche lipidique puis repliées de façons appropriées, ce mécanisme s'appelle la translocation. Le processus d'adressage est médiée par la particule de reconnaissance du signal (SRP) et son récepteur, tandis que la translocation est effectuée par un certain nombre de complexes de protéines membranaires.Cette thèse décrit deux des complexes impliqués dans cet adressage et translocation co-traductionnelle chez Escherichia coli : Le complexe ribosome-SRP-FtsY pour l'adressage en conformation «fermé» et le complexe dans lequel le ribosome est lié à l'holo-translocon (HTL) qui se compose de sept protéines membranaires. J'ai utilisé principalement la cryo-microscopie électronique pour caractériser ces complexes. La cryo-EM permet de déterminer la structure des échantillons biologiques à une résolution supérieure au nanomètre dans leur environnement natif, sans avoir à le cristalliser. Dans ce travail, j'ai bénéficié des améliorations récentes dans l'équipementet le traitement d'image.A partir d'un ensemble de données de cryo-EM obtenu par les membres du groupe, j‘ai déterminé la structure du complexe ribosome-SRP-FtsY en conformation «fermé» avec une résolution de 5.7 Å. Différentes stratégies de tri des calculsont été appliquées pour identifier la partie la plus homogène de l'ensemble des données. La structure montre un domaine bien résolu SRP ARN et SRP M avec une séquence signal liée. L'interaction entre les SRP et le ribosome pourrait être modélisée avec une grande fidélité. Cette structure révèle également que les GTPases SRP-ftsY sont détachées de la tétra-boucle de l'ARN et sont flexibles, libérant alors le site de sortie du ribosomepermettant la liaison du translocons.Dans le second projet, différentes approches ont été poursuivis pour résoudre la structure du complexe ribosome-HTL à haute résolution. Une structure initiale à 22 Å a été obtenue en mélangeant HTL solubilisés en détergent avec des ribosomes, démontrantla possibilité de préserver le complexe dans les conditions utilisées pour la préparation des grilles. J'ai ensuite exploré l'utilisation de nanodiscs et un nouveau détergent appelé LMNG pour stabiliser HTL dans des tampons sans détergent. Un deuxième ensemble de données a ensuite été recueilli à partir d'échantillon obtenu par gradient de fixation, la structure a été résolue à 17 Å. La préparation des échantillons a été optimisée utilisant entre autre les amphipoles. On a montré que deux types d'amphipole-HTL peuvent se lier au ribosome, et des structures de plus grande résolution devrait être obtenu à partir de ces échantillons. / The cell membrane is the barrier that separates the interior of cells from the outside environment. It consists of lipids and proteins. Genes encoding membrane proteins make up about 30% of the genome. Membrane proteins are synthesized in the cytosol by ribosomes, but employ special pathways to integrate into the cell membrane. Ribosomes translating membrane proteins are recognized by special factors in the cytosol and targeted to the membrane. Subsequently, nascent chains of the membrane proteins are inserted into the lipid bilayer and are folded into their proper structures, a process termed translocation. The targeting process is mediated by the signal recognition particle (SRP) and its receptor, while the translocation is performed by a number of membrane protein complexes.This thesis describes two of the complexes involved in co-translational targeting and translocation in Escherichia coli: The ribosome-SRP-FtsY targeting complex in the “closed” conformation and the complex of a ribosome with the holo-translocon (HTL) consisting of seven membrane proteins. I mainly used electron cryo-microscopy to characterize these complexes. Cryo-EM allows structural determination of biological samples at sub-nanometer resolution in their native environment, without the need to crystallize the specimen. In this work, I took advantage of the recent advances in both the hardware and the image processing.Starting from a cryo-EM dataset obtained by group members, I have determined the structure of ribosome-SRP-FtsY complex in the “closed” conformation at 5.7 Å resolution. Different computational sorting strategies were applied to identify the most homogeneous sub-pool of the dataset. The structure shows a well-resolved SRP RNA and SRP M domain with a signal sequence bound. The interaction between SRP and ribosome could be modeled with high confidence. This structure also reveals that the SRP-FtsY GTPases are detached from the RNA tetraloop and are flexible, thus liberating the ribosomal exit site for binding of the translocation machinery.In the second project, different approaches were pursued to solve the structure of the ribosome-HTL complex at high resolution. An initial structure at 22 Å was obtained by mixing detergent-solubilized HTL with the ribosome, demonstrating that it is possible to preserve the complex under the conditions used for specimen preparation. I have then explored the use of nanodiscs and a new detergent called LMNG to stabilize HTL in detergent-free buffers. A second dataset was subsequently collected from a sample prepared by gradient-fixation, and the structure was solved at 17 Å. Sample preparation has been optimized further using amphipols. Two types of amphipol-HTL complexes were shown to bind to the ribosome, and higher resolution structures are expected to be obtained from these samples.

Au cours de mon travail de thèse, j’ai étudié la structure des deux complexes de protéines, le complexe FANCD2/FANCI et la Phosphorylase kinase (PhK). Les deux complexes ont été étudiés en utilisant la cryo-microscopie électronique combinée à l’analyse d'image. La voie anémie de Fanconi (FA) a été reconnue comme jouant un rôle important dans la réparation de liaisons inter-brin de l'ADN. Dans cette voie, les protéines FANCD2 et FANCI sont des acteurs clés. Dans mon travail de thèse, j’ai calculé la structurale du complexe FANCD2/FANCI humaine. La structure montre une cavité intérieure, assez grande pour accueillir une hélice d'ADN double brin. Nous avons aussi mis en évidence un domaine en forme de tour. Notre collaborateur (M. Cohn, Oxford) a montré que celui-ci est essentiel pour le recrutement du complexe sur l'ADN. La PhK est l'une des kinases les plus complexes. Elle est composée de quatre sous-unités (αβγδ)4. PhK régule le métabolisme du glycogène, intègre divers signaux pour catalyser la conversion du glycogène phosphorylase b (GP) vers la GP a (actif), et la dégradation ultérieure de glycogène. En utilisant un microscope performant et une caméra de détection d'électrons directe puis après plusieurs étapes de traitement d’image, de correction de mouvement de films induits par les faisceaux d'électrons, j’ai obtenu une structure du complexe en 7Å (FSC gold standard). / During my thesis work, I have investigated the structure of two protein complexes, the FANCD2/FANCI complex and the Phosphorylase Kinase complex (PhK). Both complexes were studied using cryo electron microscopy combined with image analysis. The Fanconi Anemia (FA) pathway has been implied to play a significant role in DNA interstrand crosslink repair and may be the coordinator between different DNA damage repair pathways. Within the FA pathway, the FANCD2 and FANCI proteins are key players. In my thesis work, I have calculated the structure of the human FANCD2/FANCI complex. It possesses an inner cavity, large enough to accommodate a double stranded DNA helix. We also discovered a protruding tower domain, which our collaborator (M. Cohn, Oxford) has shown to be critical for the recruitment of the complex to DNA. PhK is one of the most complex kinases. It is composed of four subunits (αβγδ)4. PhK regulates glycogenolysis, it integrates various signals to catalyze the conversion of glycogen phosphorylase (GP) b to GP a (active), and the subsequent breakdown of glycogen. PhK is a potential target for glycemic control in diseases such as diabetes. Using state of the art electron microscope with a direct electron detection camera, after multiple image processing steps and correction of beams induced motion of films, I obtained a structure of the complexe at 7Å (FSC gold standard).

La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action. / The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways.

Les aminopeptidases représentent un groupe d’enzymes qui possèdent une fonction cellulaire clef dans les mécanismes physiologiques et pathologiques. Elles interviennent dans la cascade enzymatique après l’action des endoprotéases, dans l’homéostasie au travers le renouvellement du pool d’acides aminés, dans le métabolisme énergétique, la régulation de l’activité des peptides bioactifs, la présentation antigénique ainsi dans une diversité de mécanismes pathologiques tels que les maladies neurologiques et les infections virales et parasitaires. Les aminopeptidases TETs sont capables de former des macro-assemblages tétraédriques comprenant douze sous-unités. En vue de mieux comprendre leur fonction biologique et leur mode d'action, nous avons étudié les propriétés fonctionnelles et structurales de deux nouveaux complexes TETs issus d'archées hyperthermophiles. L'archée hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii ne possède qu'une version de TET (MjTET) qui a été produite dans Escherichia coli et purifiée sous forme de dodécamère. La recherche de son activité enzymatique et de ses substrats peptidiques par des tests chromogéniques et fluorogéniques, ainsi que des études par HPLC en phase inverse, montre que cette enzyme est une leucine aminopeptidase activée par le cobalt se distinguant des autres aminopeptidases M42 par son très large spectre d'action qui s'étend aux résidus aromatiques. Une structure complète de cette aminopeptidase a été résolue en combinant la cristallographie (2.4 Å) et la cryo-EM (4,1 Å). L'analyse de la poche de spécificité de MjTET permet de mieux comprendre les bases structurales de la discrimination de substrat chez les TETs. De plus, l'analyse de la structure interne de la particule permet de proposer un nouveau mécanisme de navigation des peptides à l’intérieur des particules tétraédriques de la famille TET.L'archée hyperthermophile Pyrococcus horikoshii comporte trois types de complexes TETs. L'étude d'une protéine présentant ~20 % d'identité avec ces systèmes, nous a permis d'identifier une quatrième version du système TET dans cet organisme : PhTET4. La protéine recombinante a été purifiée. Elle forme un complexe dodécamérique tétraédrique. Les études biochimiques révèlent que l'enzyme possède une spécificité très étroite dirigée exclusivement vers l'hydrolyse des résidus glycines de l'extrémité N-terminale des peptides. De plus, elle estactivée par le nickel. Ces caractéristiques permettent de proposer que, chez les archées, la multiplication et la spécialisation des enzymes TETs seraient associées au caractère hétérotrophes alors que le système des archées autotrophes se réduirait à une TET unique apte à assurer une fonction de « ménage ». / Aminopeptidases represent a group of enzymes displaying key cellular function inphysiological and pathological mechanisms. They are involved in the enzymatic cascade beyond the action of endoproteases, in homeostasis through the renewal of the amino acid pool, in the energy metabolism, in the regulation of bioactive peptide activities, in the antigen presentation and in a diversity of pathological mechanisms such as neurological diseases as well as viral and parasitic infections. Aminopeptidases TET are able of forming tetrahedral macro-assemblies built by twelve subunits. In order to better understand their biological function and their mode of action, we studied the functional and structural properties of two novel TET complexes derived from hyperthermophilic archaea. The hyperthermophilic archaeon Methanocaldococcus jannaschii has only one version of TET (MjTET) that was produced in Escherichia coli and purified as dodecameric macromolecule. The search for its enzymatic activity and peptide substrates by using chromogenic/fluorogenic assays and reverse phase HPLC studies, demonstrated that this enzyme is a cobalt-activated leucine aminopeptidase, discriminated from other M42 aminopeptidases by its very broad activity spectrum, that extends to aromatic residues. Complete structure of this aminopeptidase was determined by combining X-ray crystallography (2.4 Å) and cryo-electron microscopy (4.1 Å). Analysis of MjTET specificity pocket indicated possible molecular bases for substrate discrimination in TET peptidases. In depth investigation of the particle internal structure allowed to propose a novel peptide trafficking mechanism for the TET family tetrahedral particles. Three types of TET complexes are present in the hyperthermophilic archaea, Pyrococcus horikoshii. The study of an unassigned protein displaying ~20% identity with the PhTETs systems allowed us to identify a fourth version of TET complex in this organism: PhTET4. The recombinant protein was purified. It formed tetrahedral dodecameric complex. Biochemical studies indicated that the enzyme has a very narrow hydrolytic specificity directed exclusively toward the peptide N-terminal glycine residues. In addition, this enzyme is activated by nickel ions. These features allowed proposing that, in archaea, the multiplicity of specialized TET systems could be associated with heterotrophy while unique TET system displaying “housekeeping” function is present in autotrophic organisms.

L'apparition croissante de bactéries pathogènes multi-résistantes à la plupart des antibiotiques disponibles apparaît comme un problème mondial de santé publique. Malheureusement, un usage excessif à la fois en médecine humaine et animale a conduit à l’apparition de souches multi-résistantes à la plupart des antibiotiques disponibles sur le marché. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes mis en place par les bactéries pour résister aux antibiotiques afin de trouver des solutions pour combattre les souches multi-résistances.Dans ce contexte, le projet de la thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires de l’efflux actif de drogues chez Pseudomonas aeruginosa, qui est un des plus importants mécanismes utilisés par la bactérie pour lutter contre l’action de plusieurs antibiotiques. Les systèmes d’efflux forment des complexes protéiques situés dans la paroi de la bactérie et expulsent de manière active les antibiotiques avant même qu’ils aient pu atteindre leur cible intracellulaire, les rendant ainsi inactif.L’étude structurale se focalise sur le système RND (Resistance-Nodulation and cell Division) MexA-MexB-OprM qui est constitutivement exprimé chez la bactérie sauvage et est surexprimé chez les souches résistantes. Ce complexe tripartite est composé d'un transporteur inséré dans la membrane interne, d'une protéine canal insérée dans la membrane externe et d’une protéine adaptatrice périplasmique qui relie les deux autres protéines pour former un conduit étanche traversant le périplasme. En l’absence de la connaissance de la structure du complexe tripartite, l’objectif de la thèse a été de développer une stratégie originale pour reconstituer in vitro le complexe entier dans un environnement lipidique à partir des trois composants natifs produits séparément.L’assemblage du complexe tripartite est réalisé en mélangeant MexB et OprM en Nanodisque avec MexA mimant les deux bicouches lipidiques. La structure de ce complexe tripartite a été obtenu en combinant la cryo microscopie électronique et à l’approche dite ‘des particules isolées’. La structure tridimensionnelle du complexe calculée à une résolution inférieure à 4 Å a permis de construire un modèle atomique du complexe tripartite assemblé entre deux Nanodisques.Le complexe tripartite est composé d’un trimère d’OprM, d’un trimère de MexB et d’un hexamère de MexA entourant MexB et en interaction avec OprM. Ces données ont permis de résoudre la structure complète de MexA dans le complexe dont la partie N-terminale jusqu’alors inconnue car trop flexible et décrivent pour la première fois l’ancrage de MexA dans une membrane lipidique. Les changements conformationnels sont observés sur OprM et MexB lorsqu’ils sont engagés dans le complexe avec l’ouverture de l’extrémité périplasmique d’OprM et le basculement d’une boucle de MexB permettant d’établir un contact supplémentaire avec MexA.Pour replacer cette structure tripartite dans le cycle d’efflux de l’antibiotique, celle-ci décrit un état qui s’apparente probablement à un état au repos, sachant qu’aucun ligand spécifique n’a été ajouté au cours de l’assemblage. De plus, le complexe forme un canal ouvert à son extrémité extracellulaire, fournissant le conduit pour évacuer les drogues transportées par MexB qui utilise la force protomotrice comme source d’énergie.Ce travail ouvre la perspective à des études structurales d’autres états conformationnels du système d’efflux en condition « énergisé » pour compléter la compréhension du mécanisme du cycle d’efflux. Par ailleurs, la connaissance de cette première structure du complexe natif tripartite constitue le premier pas vers le développement de molécules capables de bloquer l’assemblage du complexe à des fins thérapeutiques. En effet, de telles molécules inhiberaient l’efflux actif et restauraient l’efficacité perdue des antibiotiques actuels. / The increasing appearance of multi-drug-resistant pathogenic bacteria to most available antibiotics is emerging as a global public health problem. Unfortunately, excessive use in both human and animal medicine has led to the emergence of multi-drug-resistant strains for most antibiotics available on the market. It is therefore urgent to better understand the underlying mechanisms by which bacteria resist to antibiotics to combat multi-resistance strains. In this context, this work aims at better understanding the molecular basis of active drug efflux in Pseudomonas aeruginosa, which is one of the most important mechanisms used by the bacterium to resist to several antibiotics. Efflux systems form protein complexes in the bacterial wall and actively expel antibiotics even before they reach their intracellular target, rendering them inactive. The structural study focuses on the MexA-MexB-OprM RND (Resistance-Nodulation and cell Division) system that is constitutively expressed in wild-type bacteria and is over-expressed in resistant strains. This tripartite complex is composed of a transporter inserted into the inner membrane, a channel protein inserted in the outer membrane and a periplasmic adapter protein that connects the other two proteins to form a sealed conduit through the periplasm. In the absence of knowledge of the structure of the tripartite complex, the aim of the thesis was to develop an original strategy to reconstitute the whole complex in vitro in a lipid environment from the three native components produced separately.The assembly of the tripartite complex is made by mixing MexA with MexB and OprM in Nanodisc mimicking the two lipid bilayers. The structure of this tripartite complex was obtained by combining cryo electron microscopy and the so-called 'isolated particles' approach. The three-dimensional structure of the complex, calculated at a resolution of less than 4 Å, was used to build an atomic model of the tripartite complex assembled between two Nanodiscs. The tripartite complex is composed of an OprM trimer, a MexB trimer and a MexA hexamer surrounding MexB and interacting with OprM. We solve the complete structure of MexA whose N-terminal part hitherto unknown because of a high flexibility and describe for the first time the anchoring of MexA in a lipid membrane. The conformational changes are observed on OprM and MexB when they are assembled in the complex with the opening of the periplasmic end of OprM and the spatial re-orientation of a MexB loop to establish additional contact with MexA.To integrate this tripartite structure into the antibiotic efflux cycle, it describes a state that is probably a resting state, knowing that no specific ligand was added during assembly. In addition, the complex forms an open channel at its extracellular end, providing the conduit to evacuate the drugs carried by MexB that uses the proton motive force as a source of energy. This work opens new perspective for structural studies of other conformational states of the efflux system in "energized" conditions to fulfill our understanding of the efflux cycle mechanism. Moreover, the knowledge of this first tripartite native complex structure constitutes the first step towards the development of molecules capable of blocking the assembly of the complex for therapeutic uses. Indeed, such molecules would inhibit active efflux and restore the lost efficiency of current antibiotics.

La cryo-microscopie électronique est une technique tomographique permettant de reconstituer la structure 3D d’un objet complexe en biologie à partir d’un jeu d’acquisitions. Ces images de l’objet complexe sont appelées les projections et sont acquises sous orientations inconnues. Un des avantages de la cryo-microscopie électronique est l’obtention d’un modèle 3D de très haute résolution de l’objet dans un état naturel. La procédure de reconstruction comporte plusieurs étapes telles que l’alignement, la classification des projections, l’estimation de leurs orientations et le raffinement des projections. Lors de ces étapes, la distance entre deux projections est fréquemment mesurée. Le travail réalisé au cours de cette thèse s’organise autour de la recherche théorique d’une distance entre des projections non-orientées avec comme objectif l’amélioration de la procédure de reconstruction tomographique en cryo-microscopie électronique. La contribution de ce travail de thèse est une méthode permettant d’estimer la différence angulaire entre deux projections dans les cas 2D et 3D. Notre méthode est basée sur la construction d’un graphe de voisinage dont les sommets sont les projections, dont les arêtes relient des projections voisines et sont pondérées par une approximation locale de la différence angulaire. Le calcul de ces poids repose sur les propriétés des moments de projection. Notre méthode est testée sur des images simulées de différentes résolutions et de différents niveaux du bruit. La comparaison avec des autres méthodes d’estimation de la différence angulaire est aussi réalisée. / Cryo-electron microscopy is a tomographic technique allowing to reconstruct a 3D model of complex structure in biology from a set of acquired images. These images are known as the tomographic projections and are taken at unknown directions. The advantage of the cryo-electron microscopy is the 3D reconstruction at very high resolution. The reconstruction procedure consists of many steps such as projection alignment, projection classification, orientation estimation and projection refinement. During these steps, the distance between two projections is frequently measured. The work in this thesis aims at studying the distances mesured between two unknown-direction projections with the objective of improving the reconstruction result in the cryo-electron microscopy. The contribution of this thesis is the developement of a method for estimating the angular difference between two projections in 2D and 3D. Our method is based on the construction of a neighborhood graph whose vertices are the projections, whose edges link the projection neighbors and are weighted by a local approximation of the angular difference. The calculation of the weights relies on the projection moment properties. The proposed method has been tested on simulated images with different resolutions and at different noise levels. The comparison with others estimation methods of angular difference has been realised.

Nous avons utilisé la méthode de CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy Of Vitreous Sections) pour étudier l’ultrastructure des cellules HT29 (lignée cancéreuse colique humaine) et plus particulièrement l’organisation de la chromatine au sein du noyau. Pour améliorer la méthode, nous avons développé un micromanipulateur qui facilite la collecte des coupes et leur transfert sur la grille. Nous avons également cherché à préparer de nouveaux films métalliques (en remplacement du carbone) permettant une meilleure adhésion des coupes sur le support Au vu des premiers tests réalisés, les films de TiO2 que nous avons fabriqués au laboratoire et caractérisés par microscopie électronique (HR, spectroscopie et cartographie EELS) semblent offrir des perspectives intéressantes que nous attribuons à leur propriétés de conducteur électrique à basse température (ce qui reste à démontrer). Les organites cellulaires (noyaux, réseaux de filaments du cytosquelette, systèmes multilamellaires) ont été identifiés in situ. Les conditions d’imagerie choisies nous ont permis d’obtenir une résolution permettant d’identifier les deux feuillets des bicouches membranaires. Dans le noyau, nous avons observé des motifs striés, distants de 2.7 à 3.5 nm que nous attribuons à la molécule d’ADN enroulée autour du cœur d’histones. Comparées aux images de phases denses de nucléosomes, ces images suggèrent que les nucléosomes (jamais identifiés in situ jusqu’à présent) présentent un ordre très local au sein de la chromatine, que nous discutons à la lumières des modèles polymériques actuels. / The ultrastructure of HT29 cells (human epithelial adenocarcinoma cell line) was studied by CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections) with a special emphasis on chromatin organization in the cell nucleus. We proposed methodological improvements for this technique:- We first developed a grid holding micromanipulator to facilitate both cryosections collect and deposition on carbon-coated TEM grids.- We also developed new metallic thin films (to replace carbon-base supports) to enhance the adhesion of cryosections on their support. The TiO2 thin films that we produced and analysed by electron microscopy (high resolution imaging, EELS and chemical mapping) seem to be an interesting alternative to carbon films for the deposition of cryosections. Their adhesive properties could be due to Titanium high electric conductance at low temperature (although this relation has not been clearly demonstrated yet).In HT 29 cells, we indentified cell organites (nucleus; cytoskeleton filament bundles, multilamellar bodies) in situ. Selected imaging conditions provide for a high enough resolution to visualise the two membrane leaflets. In the cell nucleus, we observed striated patterns separated from 2.7 to 3.5 nm that we assume to be DNA molecule turns wrapped around the histone protein core. Compared with the dense phases formed in vitro by nucleosome core particle in solution, our images suggest that nucleosomes are locally ordered in chromatin. This observation is discussed regarding the chromatin polymeric models.