Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-04-03T11:03:00Z No. of bitstreams: 2 Tese - Thaísa Cristina Silva - 2017.pdf: 8533061 bytes, checksum: 987601f85d9b8f33eb97a24c3e474df3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-04-03T11:05:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Thaísa Cristina Silva - 2017.pdf: 8533061 bytes, checksum: 987601f85d9b8f33eb97a24c3e474df3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-03T11:05:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Thaísa Cristina Silva - 2017.pdf: 8533061 bytes, checksum: 987601f85d9b8f33eb97a24c3e474df3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-09-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction: the high incidence and mortality rate due to fungal infections arouse interest in the search for more effective and less toxic drugs for the treatment of these infections. Medicinal plants represent a promising source of discovery of antifungal agents. Among the medicinal plants, Lafoensia pacari A. St.-Hil (Lythraceae), plant of the cerrado, stands out for having medicinal properties popularly known in Brazil. Punicalagina, a secondary metabolite extracted from L. pacari leaf, has proven biological activities. Objective: in this work the biological activity of punicalagin on yeasts belonging to the Cryptococcus neoformans species complex and Candida species was evaluated. Methods: the in vitro susceptibility of the yeast to the compound punicalagin was verified using the broth microdilution method. The possible mechanism of action was verified by different methods such as: ergosterol assay of the fungal cell membrane, by morphological and ultrastructural analyzes of the yeasts, by flow cytometry (cell cycle, cytoplasmic membrane injury, reactive oxygen species production and loss of the mitochondrial membrane potential). The in vitro cytotoxicity of punicalagin was verified using Balb/c 3T3 cells, A549 lung carcinoma cells and sheep erythrocytes. Results: the punicalagin was able to inhibit yeast growth at concentrations ≤4 μg/mL with minimum fungicidal concentration (CFM) of >256 μg/mL. The punicalagin reduced the ergosterol synthesis of the fungal cell membrane and promoted alterations in the morphology and the cellular arrangement of the yeasts. The action mechanism analyzed by flow cytometry showed alteration of the cell cycle with increase of the G0/G1 phases and reduction of the G2/M phases, interfering in the cellular division of the DNA of the fungal cells. The compound showed low toxicity on the Balb/c cells 3T3, A549 and sheep erythrocytes. Conclusion: the results presented by punicalagin showed that this compound presents low cytotoxicity to the animal cells, with important antifungal activity against the yeasts of the Cryptococcus neoformans species complex and Candida species. / Introdução: a elevada incidência e taxa de mortalidade por infecções fúngicas despertam o interesse pela busca por fármacos mais eficazes e menos tóxicos para o tratamento dessas infecções. Plantas medicinais representam uma promissora fonte de descoberta de agentes antifúngicos. Dentre as plantas medicinais, a Lafoensia pacari A. St.-Hil (Lythraceae), planta do cerrado, destaca-se por apresentar propriedades medicinais conhecidas popularmente no Brasil. A punicalagina, um metabólito secundário extraído da folha da L. pacari, apresenta comprovadas atividades biológicas. Objetivo: neste trabalho foi avaliada a atividade biológica de punicalagina sobre leveduras pertencentes ao complexo Cryptococcus neoformans e espécies de Candida. Métodos: a suscetibilidade in vitro das leveduras ao composto punicalagina, foi verificada usando-se o método de microdiluição em caldo. O possível mecanismo de ação foi verificado por diferentes métodos como: doseamento de ergosterol da membrana da célula fúngica, por análises morfológicas e ultraestruturais das leveduras, por citometria de fluxo (ciclo celular, lesão da membrana citoplasmática, produção de espécies reativas de oxigênio e perda do potencial da membrana mitocondrial). A citotoxicidade in vitro de punicalagina foi verificada utilizando-se células Balb/c 3T3, células de carcinoma pulmonar A549 e eritrócitos de carneiro. Resultados: a punicalagina foi capaz de inibir o crescimento das leveduras em concentrações ≤ 4 µg/mL com concentração fungicida mínima (CFM) de > 256 µg/mL. A punicalagina reduziu a síntese de ergosterol da membrana celular fúngica e promoveu alterações na morfologia e no arranjo celular das leveduras. O mecanismo de ação analisado por citometria de fluxo mostrou alteração do ciclo celular com aumento das fases G0/G1 e redução das fases G2/M, interferindo na divisão celular do DNA das células fúngicas. O composto mostrou baixa toxicidade sobre as células Balb/c 3T3, A549 e eritrócitos de carneiro. Conclusão: os resultados apresentados pela ação da punicalagina mostraram que este composto apresenta baixa citotoxicidade para as células animais, com importante atividade antifúngica para as leveduras do complexo Cryptococcus neoformans e Candida.

O urubu-de-cabeça-preta (Coragyps atratus) é uma ave de vida livre com ampla distribuição no Brasil. Esta espécie é comumente encontrada em áreas urbanas concentrando-se em locais de deposição de lixo. O fato de se alimentarem de carcaças em decomposição facilita o contato de urubus-de-cabeça-preta com muitos patógenos. No entanto, ainda não está clara qual a real implicação de muitos desses microrganismos para a saúde dos mesmos. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar a ocorrência de alguns patógenos selecionados, avaliar o perfil hematológico e a microbiota cloacal de C. atratus em ambiente urbano. Para isso, amostras de sangue, soro e swab cloacal foram obtidos de 120 urubus de vida-livre capturados na Fundação Parque Zoológico de São Paulo, SP. A prova de soroaglutinação rápida (SAR) foi utilizada na detecção de anticorpos contra Salmonella Pullorum/Gallinarum, Mycoplasma synoviae e M. gallisepticum. O teste de aglutinação em látex (AL) foi utilizado para a pesquisa de antígeno de Cryptococcus neoformans. Foram utilizadas técnicas convencionais de hematologia, microbiologia e testes de sensibilidade microbiana. Das amostras de soro analisadas pela SAR, 15% foram reagentes para M. gallisepticum. Anticorpos contra S. Pullorum/Gallinarum e M. synoviae não foram detectados. Nenhuma amostra foi positiva para C.neoformans ou para hemoparasitas. A média e o desvio padrão dos seguintes valores hematológicos foram obtidos para 61 aves: eritrócitos (1.8x10¹²/L); leucócitos (13,11x10/L); hemoglobina (10,4 g/dL); hematócrito (48,44%); VCM (275,1 fL); HCM (42 pg); CHCM (15,8 g/dL); proteína sérica total (3,76 g/dL); heterófilos (78%); linfócitos (13,5%); eosinófilos (5,4%); monócitos (2,8%); basófilos (0,1%); trombócitos (14,14x10/L). De 75 colônias bacterianas isoladas de 20 swabs cloacais, 78,7% foram Gram-positivas e 21,3% Gram-negativas, sendo Enterococcus sp. o gênero mais frequente. Aproximadamente 86,7% das cepas isoladas foram resistentes a pelo menos um dos antibióticos testados. Cepas de Bacillus sp. e Enterococcus casseliflavus apresentaram resistência a sete dos oito antibióticos testados. Leveduras não foram isoladas em nenhumas das culturas. As informações obtidas nessa pesquisa são de suma importância, uma vez que poucos estudos avaliam o estado de saúde de urubus no mundo. / Black vulture (Coragyps atratus) is a free-living bird widely distributed across Brazil. These birds feed on rotting carcasses and large groups are commonly found in urban areas, including rubbish dumps. By feeding on decomposing carcasses, they are often exposed to innumerous pathogens. However, the role of infectious microorganisms on vultures health still need to be clarify. Thus, the aim of this study was to investigate the occurrence of selected infectious agents, the hematological profile and cloacal microbiota of black vulture in urban areas. Therefore, blood, serum and cloacal swabs were obtained from 120 free-living vultures trapped in Fundação Parque Zoológico de São Paulo, SP. The rapid seroagglutination test (RST) was performed for detection of antibodies against Salmonella Pullorum/Gallinarum, M. synoviae and M. gallisepticum. Furthermore, latex agglutination test was used to detect Cryptococcus neoformans \' antigen. Conventional techniques for hematology, microbiology and antimicrobial susceptibility testing were performed. From the serum samples analyzed by RST, 15% were positive for M. gallisepticum, antibodies against S. Pullorum/Gallinarum and M. synoviae were not detected. None sample was positive to Cryptococcus neoformans or hemoparasites. Mean and standard deviation from the following hematological values were obtained for 61 birds: erythrocytes (1.8x10¹²/L); leukocytes (13.11x10/L); hemoglobin (10.4 g/dL); hematocrit (48.44%); MCV (275,1 fL); MCH (42 pg); MCHC (15,8 g/dL); total serum protein (3.76 g/dL); heterophils (78%); lymphocytes (13.5%); eosinophils (5.4%); monocytes (2.8%); basophils (0,1%); thrombocyte (14.14x10/L). From 75 bacterial colonies isolated from 20 cloacal swabs, 78.7% were Gram-positive and 21.3% were Gram-negative. Enterococcus sp. was the most frequent genus. Approximately 86.7% of the isolated strains were resistant to at least one of the antibiotic tested. Bacillus sp. and Enterococcus casseliflavus strains shown resistance to seven in eight antibiotics tested. Yeasts were not isolated. The information obtained in this research is of paramount important since few studies have been carried out on the vultures health condition in the world.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:17:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Juan Rojas Pereira.pdf: 760746 bytes, checksum: 1798bbe7196bc85bf9d9b42cb797bfc4 (MD5) Previous issue date: 2006-03-17 / The aim of this work was to verify the isolation of Cryptococcus neoformans from bird droppings at some petshops trading in Rio de Janeiro borough-RJ, as well as to perform biochemical serogruping and to evaluate the virulence in vitro . 1268 samples from several birds at 25 commercial establishments distributed on 16 neighbourhoods in Rio de Janeiro Borough-RJ were collected.The biochemical serogrouping was carried out in CGB culture medium plates while protease and phospholipase production indicating virulence factors through specific media containing bovine soralbumin and yolk were performed in vitro respectively. Both virulence and serogrouping assays for 64 strains were carried out. From the total of samples, 85 (6,7%) were considered positive. Positivity feature was verified for birds, as well as Melopsittacus undulatus birds droppings, Serinus canaria and other sort of birds showed a greater member of seedlings. According to serogrouping, from the total of 56 samples, 54 were classified as serogrouping AD (Cryptococcus neoformans var. neoformans) and just two of them to serogrouping BC (Cryptococcus neoformans var gattii) possibly.All the strains showed to be protease and phospholipase producers and most as hard ones. Of the isolated 56 all were fit in the biotypes "Killer" I and II (var neoformans). Talking into account the possibility of high level infection for human and animal helth, the presence of this ethiological agent on such kind of establishments, it might be a great concern to sanitary surveillance policy for controllling the infection, furthermore. / O objetivo do presente trabalho foi verificar o isolamento de Cryptococcus neoformans em excretas de aves comercializadas em pet-shops localizados no Munic?pio do Rio de Janeiro RJ, realizar a sorogrupagem bioqu?mica e avaliar a virul?ncia in vitro . Foram colhidas 1268 amostras de diversas aves em 25 estabelecimentos distribu?dos em 16 bairros do referido munic?pio. A sorogrupagem bioqu?mica foi realizada em meio CGB, enquanto a determina??o da produ??o de protease e de fosfolipase como fatores de virul?ncia, foi realizada in vitro pelo emprego de meios espec?ficos contendo respectivamente soroalbumina bovina e gema de ovo. Do total de amostras avi?rias coletadas, 85 (6,70%) mostraram-se positivas. A positividade foi verificada isoladamente para as aves, sendo que as excretas de Melopsittacus undulatus, Serinus canaria e outras aves de maior procura destacaram-se pelo maior n?mero de isolados. A sorogrupagem realizada para 56 cepas revelou que 54 amostras pertencem ao sorogrupo AD (Cryptococcus neoformans variedade neoformans) e duas, possivelmente ao sorogrupo BC (C. neoformans var gattii). Todas as cepas mostraram-se produtoras de protease e de fosfolipase e a maioria revelou-se forte produtora destas enzimas. Dos 56 isolados todos se encaixaram nos bi?tipos Killer I e II (var neoformans). A presen?a deste agente em tais estabelecimentos comerciais deve ser motivo de preocupa??o para as autoridades sanit?rias, considerando-se a possibilidade de infec??o para o homem e para outros animais ali comercializados.

A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

The fungal infections are becoming an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised patients. Here we have studied the activity of new antifungal agents as ravuconazole, albaconazole, micafungin as well as fluconazole tpathogenic yeasts as Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Candida glabrata and Candida krusei. We have also included clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans. The susceptibilities tests indicated that the majority of the strains were sensible to the antifungal agents studied but Candida albicans (6.6%) and C.tropicalis (3.3%) were classified as resistant to fluconazole. These results show the importance of monitoring of the susceptibility in yeast like fungi from clinical source and emphasize that new and constant susceptibility studies deserve be applied to Candida and Cryptococcus neoformans to reduce the mortality among immunocompromised patients. / As infecções fúngicas têm-se tornado uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes, principalmente os imunocomprometidos. Na tentativa de se transpor esta realidade, têm-se buscado estabelecer e avaliar novas drogas antifúngicas eficazes e com melhor tolerabilidade e segurança. O presente estudo foi objetivado a verificar a atividade dos triazólicos fluconazol, ravuconazol e albaconazol e da micafungina, frente a um banco de fungos leveduriformes incluindo as espécies C.albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. glabrata e C. krusei, todas de origem clínica e Cryptococcus neoformans de origens clínica e ambiental. De modo geral, as espécies de Candida spp. e Cryptococcus foram sensíveis aos antifúngicos testados, com exceção da Candida albicans e Candida tropicalis frente ao fluconazol, onde 6,6% e 3,3%, respectivamente dos isolados, foram resistentes a este azólico. Estes resultados demonstram a necessidade de uma constante vigilância da suscetibilidade dos fungos e maiores pesquisas em relação às drogas antifúngicas, pois, desta forma, estaremos contribuindo para a menor morbidade e maior sobrevida dos pacientes.

Cryptococcus neoformans et les levures du genre Candida sont fréquemment impliqués dans les infections fongiques opportunistes chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Les données sur l'épidémiologie moléculaire et la sensibilité de ces levures aux antifongiques sont rares au Cameroun. Les objectifs de ce travail ont été (i) d'obtenir et caractériser génétiquement les isolats de Cryptococcus et de Candida issus des PVVIH à Yaoundé, (ii) d'étudier leur profil de sensibilité à divers antifongiques, (iii) d'étudier l'activité antifongique des extraits de 3 plantes médicinales (Terminalia mantaly, Terminalia catappa et Monodora tenuifolia). Vingt-cinq souches de C. neoformans et 317 isolats Candida dont 113 C. albicans ont été isolés respectivement de 171 et 402 PVVIH à l'Hôpital Central de Yaoundé. Ces isolats ont été identifiés sur la base de leurs caractères phénotypiques, biochimiques, par spectrométrie de masse et par PCR quantitative. La diversité génétique de 150 isolats (25 prélèvement initiaux et 125 colonies) de C. neoformans a été réalisée par séro-génotypage, PCR-RFLP et polymorphisme de séquences microsatellites. La diversité génétique des 113 isolats de C. albicans a été réalisée par génotypage et par analyse du polymorphisme de séquences microsatellites. La recherche des espèces du complexe C. albicans s'est effectuée par amplification du gène Hwp1. La sensibilité des isolats de C. neoformans aux antifongiques (posaconazole, voriconazole, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, amphotéricine B et 5-fluorocytosine) a été évaluée par microdilution en milieu liquide grâce au kit « Sensititre YeastOne® ». Le protocole CLSI M27-A3 été utilisé pour l'étude de la sensibilité des isolats de C. albicans à l'amphotéricine B, au fluconazole, au ketoconazole et à l'itraconazole. L'étude de l'activité antifongique des extraits de plantes s'est déroulée en 3 étapes : (i) screening préliminaire avec détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits bruts, (ii) fractionnement bio-guidé, (iii) étude des interactions synergiques dans les combinaisons de ces subfractions. C. neoformans var grubii est la seule espèce de cryptocoque isolée des liquides céphalorachidiens. Quinze espèces de Candida ont été isolées et C. albicans reste l'espèce majoritaire. C. africana a été isolée et identifiée pour la première fois au Cameroun. La diversité génétique des isolats de C. neoformans a montré 14 types moléculaires, et 24% de patients étaient infectés par deux types moléculaires différents. Le génotype A est majoritaire dans les isolats de C. albicans et 65 types moléculaires différents ont été observés. L'analyse du polymorphisme du gène Hwp1 a permis de définir de nouveaux génotypes (H1-H6). Les souches de C. neoformans sont sensibles aux antifongiques testés. Une souche présente une sensibilité réduite à la 5-fluorocytosine et une autre au fluconazole. Des isolats issus du même patient peuvent présenter des sensibilités différentes aux antifongiques testés. Les isolats de C. albicans présentent une sensibilité aux antifongiques similaire à celle décrite dans la littérature. Il a été montré qu'il existe une relation entre la sensibilité à l'itraconazole et le génotype H chez les isolats de C. albicans (p-value <0,05). Les extraits de plantes présentent des activités inhibitrices contre les levures testées. Les fractions obtenues par fractionnement bio-guidé ont permis l'amélioration de l'activité de 7 extraits. La combinaison de ces subfractions a donné une combinaison synergique et fongicide dérivée de T. mantaly et de M. tenuifolia. En conclusion, ce travail apporte de nouvelles données sur la compréhension de l'épidémiologie moléculaire et de la sensibilité des isolats de C. neoformans et de Candida aux antifongiques à Yaoundé. L'étude des extraits de plantes semble être une voie prometteuse dans le développement de thérapies antifongiques alternatives. / Cryptococcus neoformans and Candida species are the main causative agents of yeast opportunistic infections among HIV infected persons. However, information on molecular their epidemiology and antifungal susceptibility are scarce in Cameroon. The main objective of this work was to study the genetic diversity and the antifungal susceptibility against antifungal drugs and plant extracts of C. neoformans and Candida isolates from Yaoundé HIV patients. C. neoformans (25) and Candida (317 among which 113 C. albicans) Isolates were obtained, from 171 and 402 HIV patients at the Yaoundé Central Hospital respectively. They were identified by phenotypic and biochemical characters, by mass spectrometry and quantitative PCR. The genetic diversity of 150 C. neoformans isolates (25 initial isolates and 125 colonies) was carried out by serotyping, microsatellite length polymorphism and PCR-RFLP. The genetic diversity of the 113 C. albicans isolates was performed by genotyping and microsatellite length polymorphism. The identification of C. albicans complex species was achieved by PCR amplification of the Hwp1 gene. The antifungal susceptibility testing of C. neoformans against posaconazole, voriconazole, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, amphotericin B and 5-fluorocytosine was carried out by the broth microdilution test using the « Sensititre YeastOne® » kit. The CLSI M27-A3 protocol was used for the determination of the C. albicans isolate's susceptibility against amphotericin B, ketoconazole, fluconazole and itraconazole which are frequently used in Cameroon. The antifungal activity of extracts from Terminalia mantaly, Terminalia catappa and Monodora tenuifolia was performed by a preliminary screening with the determination of minimal inhibitory concentrations (MIC) of crude extracts. Selected extracts were therefore submitted to the bio-guided fractionation. Selected subfractions were submitted to combination assays. C. neoformans var grubii was the lonely Cryptococcus species isolated in cerebrospinal fluids. Fifteen Candida species were isolates from mucosae with C. albicans remaining the most frequent. C. africana has been isolated for the first time in Cameroon. C. neoformans and C. albicans provided 14 and 65 major molecular types respectively. It was also found that a patient can be infected by 2 different molecular types of C. neoformans. C. albicans genotype A was the most frequent. The PCR amplification of the Hwp1 gene allowed the identification of a novel molecular profile among the C. albicans complex and named H (H1-H6). C. neoformans isolates were susceptible to the tested drugs. However, one isolate exhibited reduced susceptibility to fluconazole and one another to 5-fluorocytosine. C. albicans isolates expressed various susceptibility profiles similar to what described in the literature. Furthermore, there was a relationship between the H-typing and the antifungal susceptibility of C. albicans isolates against itraconazole (p-value<0.05). T. mantaly, T. catappa and M. tenuifolia extracts exhibited antifungal activity against tested yeasts. Bioguided fractionation allowed improves of the antifungal activity from crude extracts to subfractions. Synergism was observed, and the most active combination from T. mantaly and M. tenuifolia was also fungicidal on tested yeasts. Conclusively, the present work brings new tools for the comprehension and the better management of C. neoformans and Candida infections among Yaoundé HIV positive patients. The antifungal resistance emergence of yeasts isolates could be compensated by the development of a new antifungal medicine from subfractions combinations of T. mantaly and M. tenuifolia.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de Ni2+que hidrolisam ureia para produzir amônia e CO2. Estas enzimas são encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilhando estruturas similares. Nosso grupo vem demonstrando que ureases possuem propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica que potencialmente contribuem para a patogenicidade de micro-organismoss produtores de urease. A presença de urease em bactérias patogênicas (p.e. Helicobacter pylori, Proteus mirabilis) está correlacionada com a patogênese em algumas doenças humanas. Alguns fungos de importância médica também são produtores de urease entre eles Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii. Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose em humanos e animais e acomete mais frequentemente indivíduos imunocompetentes. A maioria dos isolados produzem urease e vários autores sugerem que a liberação de amônia pela atividade da urease de Cryptococcus tem papel importante na patogenia da doença favorecendo uma maior permeabilidade que proporciona a transmigração das leveduras para o sistema nervoso central (SNC). No presente trabalho, para analisar o potencial de virulência da urease de C. gattii foram construídos mutantes com inativação do gene estrutural URE (ure1) e dos genes que codificam as proteínas acessórias (URED, UREF – ure4 e ure6 respectivamente). Assim como já descrito para H. pylori, a urease de C. gattii desempenha papel importante na virulência independente da atividade enzimática. Esta função ocorre anterior a invasão do SNC diminuindo a multiplicação da levedura em macrófagos, aumentando a carga infecciosa no sangue e atenuando a mortalidade tanto no mutante ure1Δ como no mutante ure6Δ em camundongos infectados por via intranasal. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes Ni2+ dependents that hydrolyze urea to produce ammonia and CO2. These enzymes are found in fungi, bacteria and plants, show very similar structures. Our group has shown that plant and bacterial ureases display biological properties independent of their ureolytic activity that may contribute to the pathogenesis of urease-producing microrganisms. The presence of urease in pathogenic bacteria (e.g. Helicobacter pylori, Proteus mirabilis) strongly correlates with pathogenesis in some human diseases. Many medically important fungi also produce urease, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii. Cryptococcus gattii is one of the etiologic agent that causes criptococcosis in human and animals, which often affects immunocompromised patients. The majority of clinical isolates produce large amounts of urease, and several authors suggest that the ammonia realease from urease activity might introduce a local damage of the endothelium, thus increasing permeability which provides yeast transmigration to central nervous system (CNS). To analyse virulence potential of C. gattii urease, mutants inactivating structural URE (ure1) gene and coding genes for accessory proteins required to assemble the Ni2+-containing active site (URED, UREF – ure4 and ure6 respectively ). As already described to H. pylori urease, the C. gattii urease play important roles in virulence independent of ureolytic activity before CNS invasion, reducing yeast multiplication in macrophage, decreasing blood burden and also attenuating mortality either ure1Δ and accessory ure6Δ mutant in mice intranasal infection.

A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bernardina_morales_ipec_dout_2013.pdf: 4097768 bytes, checksum: a3e4244f0c2be9b0d8d257c5f8921c52 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies / Cryptococcosis is a system ic mycosis acquired by inhalation of dried yeasts or basidiospores of Cryptococus neoformans and Cryptococus gattii , these species can cause cryptococcosis opportunistic and primary respectively. C. neoformans is composed of molecular types VNI - VNIV and C. gattii VGI - VGIV they have different geographical distribution, the VNI type is cosmopolitan and is associated with AIDS, VGI type is predominant in Australia and the USA; while VGII type occurs in Brazil and Latin America. This paper aims to conduct a comparative study of the molecular types VNI C. neoformans and VGI, VGII C. gattii analyzing different aspects such as : 1 – The susceptibility profile in vitro of fluconazole ( FLZ ), itraconazole ( ITZ ), 5 - fluorocytosine ( 5FC ) and amphotericin B ( A MB ) alone and in combination with 5FC and AMB with voriconazole ( VRZ ) 2 – The minimum inhibitory concentration ( MIC ) by flow cytometry ( FCM ) comparing MIC of FLZ , ITZ and AMB with CLSI; 3 - The minimum lethal concentration ( MLC ) of AMB and 5FC, a lone and in combination; 4 - The action of melanin against 5FC and AMB alone and combined 5FC, 5 – The induced resistance in vitro to FLZ and standardize the fluorochromes: acetoximetil - calceína (calceina - AM), acetoximetil - 2’, 7’ - bis - (2 - carboxietil) - 5 - (e - 6) - carboxifluoresceína (BCECF - AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3’ – dipentiloxacarbocianina (DiOC5) in FCM to verify expression of efflux pumps; 6 - The compare the expression of efflux pumps. These results permitted the identification of dif ferent susceptibility phenotypes which were analyzed and compared between the two species and molecular types, allowing the production of four articles . T hus, we concluded that: 1 - The analysis of the molecular type VGII MICs presented less susceptibility against VGI and VNI, whereas in the combination of AMB and VRZ in vitro 100% indifference was observed, in the combination of AMB and 5FC we observed the need for standardization of the concentration of glucose for future tests which can be related to cli nical cases; 2 - the FCM method proved to be an alternative automated reproducible reading for antifungal susceptibility testing with use of Acridine Orange and FUN - 1, 3 - The importance of carrying out the MLC test to verify the protective action of mela nin when exposed to the combination of AMB and 5FC. 4 - Was also verified that expression of melanin, in combination AMB and 5FC reduces the detection of synergism and additive effect in vitro . 5 - The strains induced to resistance to fluconazole made it p ossible to obtain statistically significant results in the verification of acriviry of efflux pumps in vitro using FCM with fluorochrome Dioc5 and protonophores blocker CCCP, 6 - It was found that 65% isolates no inducted to resistance and 90% isolates ind ucted to resistance of the molecular ty pe VGII expels the FLZ with a certain advantage in relation to the molecular types VNI and VGI. The results of these studies contribute to the understanding of the behavior in vitro of C. neoformans and C. gattii agai nst antifungal drugs and can be applied in clinical correlation studies in vitro and in vivo to better understand the antifungal therapy of cryptococcosis and validation of susceptibility testing for these two species.