Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

O estudo trata de infecções fúngicas por Histoplasma, Cryptococcus gattii e Paracoccidioides e por Actinomyces e Nocardia que simularam neoplasia a partir de achados radiológicos. O objetivo deste trabalho é demonstrar, através de casos do banco de dados do Laboratório de Micologia da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, a importância de um diagnóstico diferencial destas infecções com doenças neoplásicas. Identificamos os aspectos epidemiológicos e clínico-laboratoriais desses pacientes e revisamos criticamente a literatura. A casuística foi constituída por 83 casos, extraídos de uma população de 1.368 pacientes, de 1981 a 2012. As características clínicas e radiológicas de neoplasia foram observadas principalmente na histoplasmose, pela formação de histoplasmoma, na criptococose por C. gattii pela capacidade de formar criptococoma; na actinomicose e na nocardiose pela produção de massas. O que reforça o fato de que a síndrome clínica não é patognomônica da doença neoplásica e que as doenças infecciosas, especialmente granulomatosas devem ser consideradas no diagnóstico diferencial. / The study comes to infections by Histoplasma, Cryptococcus gattii, Paracoccidioides, and also Actinomyces and Nocardia simulating neoplasia from radiological findings. The objective of this study is to demonstrated, through case database of Mycology Laboratory of Irmandade Santa Casa de Misericordia de Porto Alegre, the importance of a differential diagnosis of these infections with neoplastic disease. We identified the epidemiological, clinical and laboratorial datas of these cases and review the literature critically. The casuistic consisted of 83 cases, drawn from a population of 1,368 patients, from 1981-2012. The clinical and radiological features of malignancy were observed mainly in histoplasmosis by manifestation as histoplasmoma, in cryptoccosis by C.gattii to the ability to form crytococcoma; actinomycosis and nocardiosis by the production of masses. This fact emphasizes that the clinical syndrome is not pathognomonic of neoplastic diseases and that infectious diseases, especially granulomatous, should be considered in the differential diagnosis.

Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies do gênero que causam infecção no homem, C. albidus e C. laurentii são espécies menos envolvidas. O presente trabalho teve por objetivos avaliar a patogenicidade in vivo, os fatores e os genes relacionados à virulência, e verificar o perfil de suscetibilidade ao fluconazol de 10 isolados ambientais de cada uma das espécies: C. neoformans, C. albidus e C. laurentii, antes e após a inoculação em camundongos BALB/c imunocompetentes; pesquisar os sorotipos, mating types e realizar a tipagem molecular. Proteinase, fosfolipase, urease, produção de melanina e crescimento à 37ºC foram pesquisados utilizando metodologias clássicas, e a pesquisa dos genes e determinação dos sorotipos e mating types foram feitas por PCR. A tipagem molecular foi realizada por PCR-fingerprinting, com os iniciadores (GACA)4 e M13. A determinação da CIM do fluconazol foi realizada pelo método da microdiluição em caldo. Todos os isolados de C. neoformans foram sorotipos A e MAT-alfa. A inoculação em animais mostrou que 9 isolados de C. neoformans mataram 100% deles em até 33 dias, e 1 levou os animais à morte num período entre 40 e 82 dias; 9 isolados foram recuperados dos pulmões e cérebro dos animais em 7 e 14 dias, e um deles levou todos os animais à morte em 12 dias, sendo possível recuperá-lo somente no 7º dia. Os animais inoculados com C. albidus e C. laurentii permaneceram vivos até negativação das culturas dos órgãos avaliados. C. albidus foi isolado principalmente do fígado e dos pulmões até 10 dias após a inoculação, C. laurentii dos pulmões e do cérebro até 120 dias. Todos os isolados das 3 espécies produziram cápsula antes e após a inoculação. Todos C. neoformans, 6 C. albidus e 6 C. laurentii cresceram à 37ºC antes e depois da inoculação. Melanina foi produzida por todos os isolados de C. neoformans e nenhum C. albidus nas duas ocasiões; e por 6 e 9 isolados de C. laurentii, antes e depois da inoculação, respectivamente. Seis isolados de C. neoformans e 1 de C. laurentii produziram proteinase nas duas ocasiões. Sete isolados de C. albidus produziram proteinase antes e todos depois da inoculação. Fosfolipase foi produzida por todos C. neoformans e C. albidus, e por 6 C. laurentii nas duas ocasiões. A avaliação da atividade da urease realizada em meio líquido foi positiva em 24 a 48 horas pelos isolados de C. neoformans e C. laurentii, e em 24 a 96 horas por C. albidus. A CIM de fluconazol variou de 2 a 8 ug/mL para C. neoformans, de 8 a >= 64 ug/mL para C. albidus, e de 1 a 64 ug/mL para C. laurentii, nas duas ocasiões. Todos os isolados de C. neoformans apresentaram os genes lacase (Lac1), fosfolipase (PLB1), proteinase (cnap1), calcineurina (CNA1), urease (URE1), e ERG11, com os oligonucleotídeos utilizados. A PCR com ERG11 mostrou uma banda no gel de agarose para todos C. albidus, porém nenhum dos outros genes pesquisados foram amplificados em C. albidus e C. laurentii. A tipagem molecular por PCR-fingerprinting dos isolados de C. neoformans revelou 2 tipos moleculares: VNI (7 isolados) e VNII (3 isolados). A maioria dos isolados de C. albidus apresentou homogeneidade nos padrões de bandas gerados, e C. laurentii foi a espécie que demonstrou maior diversidade genética por esta metodologia. Concluímos que a passagem dos isolados pelos animais não alterou os fenótipos estudados e nenhuma alteração foi detectada pela análise molecular. No entanto, verificamos a grande heterogeneidade molecular dos isolados de C. laurentii estudados. / Species of Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main ones in the genus causing infection in man while C. albidus and C. laurentii are less involved. This study evaluated the in vivo pathogenicity, factors and genes related to virulence and the susceptibility to fluconazole before and after inoculation in immunocompetent BALB/c mice of ten environmental isolates of C. neoformans, C. albidus and C. laurentii. Serotypes, mating types and molecular typing were also determined to complete the evaluation. Enzymes like proteinases, phospholipase, urease, production of melanin and growth at 37oC were investigated by classical methods, but gene characterization and determination of serotypes and mating types were investigated by PCR. Molecular typing was done by PCR-fingerprinting with primers (GACA)4 and M13. The microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of flucozanole. All C. neoformans isolates were serotype A and MAT-alfa and 9 of them when inoculated in animals killed 100% in up to 33 days. One isolate inoculated killed the animals in 40 to 82 days. Nine isolates were recovered from the animal lungs and brain in 7 and 14 days and the one which killed all animals in 12 days was only recovered on the 7th day. Animals inoculated with C. albidus and C. laurentii were alive until the tissue cultures of evaluated organs were negative. C. albidus was isolated mainly from the liver and lungs in up to 10 days after inoculation and strains of C. laurentii from the lungs and brain in up to 120 days. All isolates in the 3 species were capsule producers before and after inoculation. All strains of C. neoformans, 6 C. albidus and 6 C. laurentii grew at 37oC both before and after inoculation. All C. neoformans produced melanin and 6 C. laurentii produced it before inoculation and nine after. None was produced by C. albidus. Six isolates of C. neoformans and one of C. laurentii produced proteinases in both situations, before and after inoculation. Seven C. albidus isolates produced the protein hydrolyzing enzyme before inoculation and all after. Phospholipase enzyme was produced by all C. neoformans, and C. albidus and by 6 C. laurentii in both conditions, before and after inoculation. Urease activity was detected between 24 and 48 hours after incubation in a liquid medium for C. neoformans and C. laurentii cultures and after 24 to 96 hours for C. albidus. Fluconazole MICs ranged from 2 to 8 ug/ mL for C. neoformans isolates, from 8 to >= 64 ug/mL for C. albidus and from 1 to 64 ug/mL for C. laurentii in both conditions. Genes laccase (Lac1), phopholipase (PLB1) proteinase (cnap1), calcineurine (CNA1), urease (URE1) and ERG11, detected with the primers used were present in all C. neoformans. With exception of ERG11, which showed a band in agarose electrophoresis by all C. albidus, the other genes were not amplified in C. albidus and C. laurentii. Molecular typing by PCR-fingerprinting showed two molecular types in C. neoformans: VNI in 7 isolates and VNII in 3 isolates. Most C. albidus showed homogenous patterns in the bands generated and C. laurentii was the species with the higher genetic diversity by this methodology. It is concluded that isolate inoculations in animals does not alter phenotypes and no alteration is detected by molecular analysis. However, the high molecular heterogeneity of C. laurentii was detected.

Cryptococcus neoformans species complex são fungos oportunistas que desencadeiam meningite, tanto em pacientes imunocompetentes como em indivíduos hígidos. Este trabalho teve como objetivo estudar as espécies circulantes de Cryptococcus neoformans species complex isolados no Estado de Sergipe tanto a partir do LCR (líquido céfalo raqueanao) de pacientes com meningite infecciosa como de diversos substratos ambientais. Foram utilizadas amostras do LCR que deram entrada no IPH/HEMOLACEN/SE no período de 2001 a 2007. Foram realizadas 104 coletas ambientais dentro do Estado de Sergipe, das quais 55 foram obtidas a partir de excretas de aves e quatro de amostras de fezes de morcegos coletadas em cavernas. As demais foram obtidas de materiais de origem vegetal, perfazendo 45 amostras: 21 de Eucalyptus spp., oito de material de troncos vegetais em decomposição, 10 de restos vegetais coletados em duas praças e seis de Anacardium occidentale L. (cajueiro). O líquor foi examinado por microscopia direta e cultivado a 25ºC e a 37ºC. No período de 2005 a 2007 foram obtidos 141 isolados ambientais e 35 isolados clínicos de Cryptococcus neoformans species complex. Foram determinadas inferências ecológicas e epidemiológicas dos isolados obtidos além de realização de provas para identificação presuntiva fenotípica em meioNíger e, das espécies em meio CGB, teste de sensibilidade frente aosantifúngicos, caracterização enzimática de interesse biotipar e/ou marcador de linhagens, determinação de mating type sexual utilizando PCR e PCR Fingerprintig com iniciador M13. Nas linhagens de Cryptococcus spp. isoladas de líquor de pacientes com meningite infecciosa no Estado de Sergipe prevaleceu a espécie C. neoformans. Em relação às linhagens ambientais, somente uma amostra, dentre 140, foi identifcada como C. gattii. Todas as amostras oriundas de excretas de aves foram positivas no isolamento da levedura. Os isolados clínicos de C. neoformans e C. gattii oriundos de pacientes com meningite criptocócica no Estado de Sergipe apresentaram valores altos de concentração inibitória mínima (CIM) para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza alta taxa de resistência, principalmente à Anfotericina B e ao Fluconazol. Em relação ao mating type sexual foi evidenciando que a maioria das linhagens clínicas foi identificada como MAT, confirmando o caráter de virulência que esta levedura desenvolve. Entretanto, no isolados ambientais o MATa foi mais prevalente, evidenciando o caráter menos virulento destas linhagens frente às de origem clínica. Cryptococcus neoformans foi a única espécie amplificada por PCR fingerprinting. Houve presença, dentre as amostras locais, de três perfis genéticos distintos epertencentes a uma mesma espécie. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT: Cryptococcus neoformans species complex are opportunistic fungi that cause meningitis in both immunocompetent patients and in healthy individuals. This work aimed to study the species of circulating Cryptococcus neoformans species complex isolated from northeastern Brazil from both the CSF (cerebrospinal fluid) of patients with infectious meningitis as various environmental substrates. Samples of CSF were received at IPH/HEMOLACEN/SE in the period 2001 to 2007. Were carried out 104 environmental samples within the state of Sergipe, of which 55 were obtained from the feces of birds and four stool samples collected from bat caves. The other samples were obtained from plant materials, totaling 45 samples: 21 from Eucalyptus spp., eight from material of decomposing trunks of plants, 10 from plant collected in two squares, six from Anacardium occidentale L. - (Cashew). CSF was examined by direct microscopy by staining with Indian ink and cultured in Sabouraud agar with chloramphenicol at 25 °C and 37 ºC. In the period from 2005 to 2007 were obtained from 141 environmental isolates and35 clinical isolates of Cryptococcus neoformans species complex. Ecological and epidemiological inferences were determined. In addition characteristics of isolates were carried out by tests for presumptive phenotypic identification, through Niger medium and species into the CGB test, sensitivity to the antifungal, enzymatic characterization of biotypes of interest and/or marker lines, determining sexual mating type using PCR and PCR Fingerprintig with primer M13. Among the strains of Cryptococcus spp. isolated from CSF of patients with infectious meningitis in the state of Sergipe, in the period from 2001 to 2009, prevaled the species C. neoformans. Among the environmental strains, only one sample of 140, was identified as C. gattii. All samples from thefeces of birds were positive in the isolation of yeast. Clinical isolates ofCryptococcus neoformans and C. gattii originating from patients withcryptococcal meningitis in the state of Sergipe exhibited higher values ofminimum inhibitory concentration (MIC) to the antifungal agents tested, which symbolizes high rate of resistance, especially to amphotericin B and fluconazole. In relation to sexual mating type was evident that most of the clinics were MAT strains, confirming the character of virulence of this yeast. However, among the environmental isolates the MATa was more prevalent, showing the character of these less virulent strains. Cryptococcus neoformans was the only species amplified by PCR fingerprinting. There was a presence among the local samples of three different genetic profiles belonging to the same species.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-11T19:43:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T09:34:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T09:34:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maysa Paula da Costa - 2012.pdf: 1943875 bytes, checksum: b80f4f02efcb888e3b6b59c7d58f6bc8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-03-08 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Secondary metabolites that have been discovered from the plant kingdom are major sources of innovative therapeutic agents for infectious diseases. Plants have been demonstrated to present important biological activities and are considered as potential clinical application when show compatibility with the human organism. Hymenaea courbaril Linnaeus var. stilbocarpa a tree known as jatoba, presents chemicals products obtained from their leaves, stem, fruit and seeds that are used in folk medicine. Antimicrobial and cytotoxic activity of this plant is little known. An initial screening was performed to evaluate the in vitro susceptibility to sap and compounds of H. courbaril against dermatophytes and Cryptococcus isolates. The sap and the compound fisetin were more active and thus they were used to determine the in vitro susceptibility against eighteen dermatophytes and twenty-six Cryptococcus isolates. The results of in vitro susceptibility assay showed antifungal activity of H. courbaril against all fungi studied. The sap of H. courbaril showed minimal inhibitory concentrations (MIC) ranging between 32-128 μg/mL for dermatophytes and 8-256 μg/mL for complex C. neoformans yeast. The compound of H. courbaril fisetin inhibited the growth of dermatophytes and of Cryptococcus in concentration of 4-128 μg/ml, and of 8 a 128 μg/ml, respectively. In vitro cytotoxicity assays of sap and compound were performed with fibroblast 3T3-A31 by using the technique of absorption of the dye neutral red. Cytotoxicity assays showed that sap and compound have an low toxicity on these cells. The sap and the compound showed IC50 values of 109 μg/mL of 158μg/mL, respectively. The results of this study are relevant and promising because they show that the “fisetin” present a good biological activity for fungi, and is a compound biocompatible with basal cells of mammals. Products with such concentrations of MIC and IC50 can be considered of great value for further pharmacological studies. / As plantas e seus metabólitos secundários são uma grande fonte de inovação de agentes terapêuticos para inúmeras enfermidades, incluindo doenças infecciosas. Plantas de uso popular apresentam atividade biológica em potencial, sendo que devem ser consideradas a importância da aplicação clínica e a compatibilidade com o organismo humano. Hymenaea courbaril Linnaeus var. stilbocarpa uma árvore conhecida como jatobá, possui produtos químicos obtidos de suas folhas, tronco, frutos e sementes que são usadas na medicina popular, no entanto atividade antifúngica e a citotoxicidade desta planta ainda é pouco conhecida. Uma triagem inicial foi realizada para avaliação da suscetibilidade in vitro com a seiva e compostos de H. courbaril sobre isolados de dermatófitos e Cryptococcus. A seiva e o composto fisetina apresentaram-se mais ativos e desta forma foram usados para determinar a suscetibilidade de dezoito isolados de dermatófitos e vinte e seis de Cryptococcus. A seiva de H. courbaril apresentou concentrações inibitórias mínima (CIMs) que variaram de 32 a 128 μg/mL para os dermatófitos e de 8 a 256 μg/mL para as leveduras do complexo C. neoformans. O composto fisetina foi capaz de inibir os dermatófitos em CIMs que variaram de 4 a 128μg/mL e as leveduras do complexo C. neoformans em CIMs que variaram de 8 a 128 μg/mL. A avaliação da citotoxicidade in vitro com fibroblastos 3T3-A31 foi realizada para a seiva e o composto fisetina usando a técnica de absorção do corante vermelho neutro. Por este método foi possível verificar que a seiva de H. courbaril apresentou um IC50 de 109 μg/mL e o composto de 158μg/mL Os resultados encontrados neste estudo são relevantes e promissores, pois mostram que esta planta apresenta uma boa atividade biológica para fungos, além de possuir um composto isolado biocompatível com celulas basais de mamíferos. Produtos com tais concentrações de CIM e IC50 podem ser considerados de grande valor para posteriores estudos farmacológicos.

Realizamos o isolamento de leveduras do complexo Cryptococcus a partir da cloaca e do inglúvio de papagaios do gênero Amazona aestiva. Para a realização das coletas, as aves foram anestesiadas, e em seguida foi realizado lavado do inglúvio e coleta de material da cloaca. As amostras coletadas foram inoculadas em ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol, de onde foram isoladas colônias leveduriformes. Por meio de análises macro e micromorfológicas, os isolados condizentes com as características do gênero Cryptococcus foram submetidos à provas bioquímicas, testes de suscetibilidade aos antifúngicos e pesquisa de exoenzimas. Todos os isolados foram provenientes da cloaca. Dos isolamentos, 90% das cepas corresponderam à espécie C. albidus, e 10% à espécie C. laurentii; 80% foram produtores de fosfolipase e 100% de proteinase. Estes resultados sugerem que não só o ambiente, como também as aves podem ser carreadoras de Cryptococcus albidus. / We performed the isolation of yeasts of Cryptococcus complex from the cloaca and the crop of parrots of the genus Amazona aestiva. To carry out the sampling, the birds were anesthetized to perform a lavage of the crop and the collection of material from the cloaca. The samples were inoculated on Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol, which were isolated from yeast colonies. Through macro and micromorphological analysis, isolates consistent with the characteristics of the genus Cryptococcus were subjected to biochemical tests, antifungal susceptibility testing and research exoenzymes. All isolates were from the cloaca. Of the isolates, 90% of the strains corresponded to the species C. albidus, and 10% of the species C. laurentii; 80% of the isolates were producing phospholipase and 100% were producing proteinase. These results suggest that not only environmental but also birds can be Cryptococcus albidus carrier. These results suggest that there is not only an environmental source but also birds can be Cryptococcus albidus carriers

Objetivando estudar o perfil fenotípico de leveduras mantidas em banco de microrganismos de Cryptococcus neoformans, 40 cepas de origem clínica e 44 de origem ambiental foram escolhidas aleatoriamente. As cepas passaram por tipagem bioquímica para diferenciação em C. neoformans e C. gattii, e dentre as cepas clínicas 90% foram tipadas como C. neoformans e 10% como C. gattii, já dentre as cepas ambientais 95,5% foram C. neoformans e 4,5% C. gattii. As cepas cepas que foram positivas no teste bioquímico para C. gattii passaram por tipagem molecular (PCR-RFLP) e verificou-se que apenas quatro cepas eram realmente C. gattii (VGII), e duas outras C. neoformans (VNI e VNIII). Quando estudado os fatores relacionados a virulência, todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras de fosfolipase, sendo que cepas de origem clínica produziram essa enzima em maior quantidade. Todas as cepas tanto clínicas quanto ambientais foram produtoras da enzima protease e todas também apresentaram intensidade de cor da colônia ( melanização). Quando avaliado a espessura capsular in vitro todas apresentaram cápsula, das cepas clínicas, 67% apresentaram cápsula média e das ambientais 70%. Quando avaliado a sensibilidade aos antifúngicos pelo métodos E-test todas as cepas clínicas e ambientais foram sensíveis aos antifúngicos anfotericina B, cetoconazol, fluconazol, voriconazol e posoconazol. O itraconazol também foi testado e apresentou cepas sensíveis à droga, porém uma cepa clínica e duas ambientais tiveram classificação dose dependente. Destacamos que a fosfolipase poderia ser usada como um marcador fenotípico para o complexo Cryptococcus neoformans e uma correta identificação das culturas mantidas em banco de microrganismos é necessário. / Aiming to study the phenotypic profile of yeasts maintened in stock culture identified as Cryptococcus neoformans, 40 clinical and 44 environmental strains, were chosen ran domly. The strains had undergone biochemical typing for differentiation as C. neoformans and C. gattii. Among the clinical strains 90% were typed as C. neoformans and 10% as C. gattii, already among the environmental strains were 95,5% C. neoformans and 4,5% C. gattii. The strains thah were positive in biochemical test for C. gattii underwent molecular typing (PCR-RFLP) and found that only four strain were actually C. gattii (VGII) and two other C. neoformans (VNI and VNII). When the factors related to virulence were studied, both the clinical and environmental strains were phospholipase positive but the clinical strains produced a greater amount of this enzyme. All strains were both clinical and environmental production of protease and also showed an intensity colony color (melanization). When the thickness of the capsule was evaluated, all of it showed a capsule, from the clinical strains 67% had an average capsule and from environmental strains 70% had an average capsule. When assessed by sensitivity to antifungal by E-test method all clinical and environmental strains were sensitive to the anphotericine B, ketoconazole, fluconazole, voriconazole and posoconazole. Itraconazole was tested and the samples showed drug sensitive-strains. We point out that phospholipase production would be used as marked to C. neoformans complex and a correct identification of strains maintened in stock culture is necessary.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-06-12T14:29:57Z No. of bitstreams: 1 marianylopesdacostafolly.pdf: 3168369 bytes, checksum: de896015afed496005f9be77af62d0e0 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: ver departamento on 2018-06-14T11:42:19Z (GMT) / Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-06-14T11:47:12Z No. of bitstreams: 1 marianylopesdacostafolly.pdf: 3168369 bytes, checksum: de896015afed496005f9be77af62d0e0 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-06-14T11:47:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marianylopesdacostafolly.pdf: 3168369 bytes, checksum: de896015afed496005f9be77af62d0e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-14T11:47:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marianylopesdacostafolly.pdf: 3168369 bytes, checksum: de896015afed496005f9be77af62d0e0 (MD5) Previous issue date: 2018-03-01 / O constante aumento da incidência de doenças fúngicas oportunistas tem se tornado um importante problema de saúde pública, principalmente após o advento da SIDA quando o número de indivíduos imunocomprometidos aumentou drasticamente. A criptococose é uma importante micose sistêmica causada por fungos do gênero Cryptococcus, com estimativa global de um milhão de novos casos e aproximadamente 600.000 mortes por ano. As opções terapêuticas atuais de criptococose são restritas, tanto pelo aumento da resistência dessas leveduras frente aos fármacos utilizados quanto pela elevada toxicidade dos antifúngicos para o organismo humano sendo necessária a busca contínua por novas entidades químicas para o tratamento de infecções. Nesse contexto, os produtos naturais e derivados constituem uma fonte inestimável de substâncias com potencial biológico. Xylosma ciliatifolia, popularmente conhecida como sucará, é uma árvore semidecídua, nativa do Brasil, podendo também ser encontrada em outros países. O presente trabalho avaliou a atividade antifúngica das folhas de X. ciliatifolia, in vitro, frente à C. gattii e C. neoformans. Foi determinada a CIM do extrato etanólico e das frações hexano, diclorometano, acetato de etila, butanol e resíduo aquoso. A fração acetato de etila (FAXC) apresentou atividade promissora e foi selecionada para os ensaios subsequentes. Através do ensaio de atividade fungicida/fungistática observou-se que FAXC possui ação fungicida. No ensaio de interação com fluconazol e anfotericina B, in vitro, não foi observada interferência na ação dos fármacos e o ensaio de curva de morte demonstrou que FAXC apresenta um comportamento dose dependente. FAXC não alterou o valor de CIM na presença de sorbitol, indicando que sua ação possivelmente não se dá diretamente através de parede celular. Através da quantificação de ergosterol foi possível observar que FAXC interfere na biossíntese do esteroide, podendo esse ser um dos mecanismos de ação. Foi avaliada a produção de EROs e PRNs nas células fúngicas pela emissão de fluorescência e após tratamento com FAXC houve um aumento da produção de peroxinitrito, que causa danos celulares. Foram medidos os produtos da peroxidação lipídica como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), onde evidenciou-se a peroxidação lipídica nas membranas celulares fúngicas em uma maior concentração. O tamanho do diâmetro celular e cápsula de Cryptococcus foi avaliado através da comparação da contagem de células tratadas e não tratadas coradas com a tinta da índia. Após exposição à concentração equivalente à metade da CIM o diâmetro celular diminuiu sugerindo uma tentativa de defesa, mas não houve alteração no tamanho da cápsula. A carga da superfície celular foi avaliada por potencial zeta que também não demonstrou alteração. A interação entre FAXC e os fungos, avaliada por ITC, é provavelmente fraca como as interações não polares. Por fim, verificou-se pelo ensaio colorimétrico de MTT, que FAXC não apresenta citotoxicidade nas concentrações ativas, sendo esta dose dependente. / The steady increase in the incidence of opportunistic fungal diseases has become a major public health problem, especially after the advent of AIDS when the number of immunocompromised individuals increased dramatically. Cryptococcosis is an important systemic mycosis caused by fungi of the genus Cryptococcus, with a global estimate of one million new cases and approximately 600,000 deaths per year. The current therapeutic options of cryptococcosis are restricted, both by the increase of the resistance of these yeasts to the drugs used and by the high toxicity of the antifungal to the human organism being necessary the continuous search for new chemical entities for the treatment of infections. In this context, natural products and derivatives are an invaluable source of substances with biological potential. Xylosma ciliatifolia, popularly known as Sucará, is a semi-deciduous tree, native to Brazil, and can also be found in other countries. The present work evaluated the antifungal activity of X. ciliatifolia leaves, in vitro, against C. gattii and C. neoformans. The MIC of the ethanolic extract and the fractions hexane, dichloromethane, ethyl acetate, butanol and aqueous residue were determined. The ethyl acetate fraction (FAXC) showed promising activity and was selected for subsequent trials. Through the fungistatic / fungistatic activity assay it was observed that FAXC has fungicidal action. In the interaction test with fluconazole and amphotericin B, in vitro, no interference was observed in the action of the drugs and the death curve assay demonstrated that FAXC shows a dose-dependent behavior. FAXC didn't change the MIC value in the presence of sorbitol, indicating that its action possibly don´t occur directly through the cell wall. Through the quantification of ergosterol it was possible to observe that FAXC interferes in the biosynthesis of the steroid, being this one of the mechanisms of action. The production of ROS and RNS in fungal cells was evaluated by the emission of fluorescence and after treatment with FAXC there was an increase in peroxynitrite production, which causes cell damage. Lipid peroxidation products were measured as thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), where lipid peroxidation was evidenced in fungal cell membranes in a higher concentration. Cell size and capsule size of Cryptococcus was evaluated by comparing the count of treated and untreated cells stained with the India ink. After exposure to the concentration equivalent to half of the MIC, the cell diameter decreased suggesting a defense attempt, but there wasn't change in capsule size. Cell surface loading was evaluated by zeta potential, which also showed no change. The interaction between FAXC and fungi, as assessed by ITC, is probably weak as non-polar interactions. Finally, it was verified by the MTT colorimetric assay that FAXC didn't present cytotoxicity in the active concentrations, being this dose dependent.

Criptococose é uma doença causada pelo fungo C. neoformans que têm grande importância atualmente, devido ao aumento da população imunocomprometida,. Além disso, existem poucas opções terapêuticas contra micoses profundas. Neste trabalho foi avaliado se a via de biossíntese do triptofano seria um bom alvo para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Com o uso da tecnologia de RNA de interferência, concluiu-se que esta via de síntese é essencial para a sobrevivência desta levedura, sendo, portanto, um ótimo alvo. Ainda neste estudo, demonstrou-se que a letalidade decorre da baixa captação de triptofano pelas permeases de aminoácidos, as quais sofrem repressão catabólica pela fonte de nitrogênio e efeito negativo da temperatura. Foram testados dois inibidores específicos que atuam sobre a antranilato sintase e a triptofano sintase, duas enzimas cruciais para a conversão do corismato em triptofano. Ambos compostos causaram inibição do crescimento de C. neoformans e C. gattii. / Cryptococcosis is a disease caused by C. neoformans, currently of great importance due to the increase in immunocompromised population. Furthermore, there are few therapeutic options for treating this disease. This study evaluated the tryptophan biosynthetic pathway as a possible target for the antifungal development. By using RNA interference technology we concluded that this metabolic pathway is essential for the survival of this yeast, and, therefore, it is a good target. In the same study, it was demonstrated that lethality results from the low uptake of the tryptophan amino acid by permeases, which undergo nitrogen catabolite repression and negative effect of temperature. Two specific inhibitors acting on the anthranilate synthase and tryptophan synthase, two key enzymes for the conversion of chorismate into tryptophan were tested. Both compounds caused growth inhibition of C. neoformans and C. gattii.

Thesis (MSc (Microbiology))--University of Stellenbosch, 2005. / Intraspecific diversity among yeasts, including basidiomycetous yeasts has mostly been studied from a taxonomic point of view. The heterobasidiomycetous genus Cryptococcus is no exception and it was found to contain species that display heterogeneity both on a genetic and physiological level, i.e. diversity among strains originating from different geographical areas. It was stated that this diversity within yeast species is possibly caused by intrinsic attributes of the different habitats the strains of a particular species originate from. However, little is known about the diversity of a species within a specific habitat. Thus, in this study intraspecific diversity among selected cryptoccoci isolated from a single soil sample originating from pristine Fynbos vegetation , was investigated.