Câncer é a denominação para um grupo de doenças devastadoras caracterizadas pelo crescimento e multiplicação descontrolados de células anormais que são capazes de invadir estruturas próximas e se espalhar por diversas regiões do organismo.Trata-se de um grande problema de saúde pública mundial, fazendo milhares de novas vítimas a cada ano. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), são estimados cerca de 580 mil casos novos da doença no Brasil para 2014. A presente tese de doutorado teve como foco principal a identificação e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade anticâncer, através de triagens biológicas de compostos de origem natural e sintética, e do estudo das relações entre a estrutura e atividade (SAR). Triagens in vitro de derivados sintéticos do ácido gálico, ácido protocatecuico e guanidínicos, além de uma variedade de produtos naturais, possibilitaram a identificação de agentes inibidores da migração e proliferação de células tumorais metastáticas. Uma série de derivados sintéticos indólicos e espirocicloexadienonas, com potente efeito inibitório da migração celular, teve caracterizada a sua ação frente à proteína tubulina, alvo molecular de compostos importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. Ensaios de imunofluorescência revelaram a ação dos compostos associada a alterações do citoesqueleto celular. Também foram realizados o planejamento e a síntese de três cadeias peptídicas por meio da metodologia de síntese peptídica em fase sólida. Os resultados da avaliação biológica dos peptídeos indicaram o efeito de inibição na migração e proliferação de células tumorais de mama. Finalmente, estudos de metabolômica de duas linhagens tumorais de mama foram conduzidos através de análises de RMN do material celular cultivado. / Cancer is a group of devastating diseases characterized by the abnormal growth of defective cells which invade adjacent tissues and eventually disseminate to several locations of the body. It is a major public health problem, affecting thousands of people each year. According to the brazilian National Institute of Cancer (INCA), approximately 580,000 new cases of cancer are predicted for the year of 2014 in Brazil. The main goal of this PhD thesis was the identification and development of new molecules possessing anticancer activity, through biological screenings of compounds from natural and synthetic sources, as well as the investigation of structure-activity relationships (SAR). In vitro screening of synthetic derivatives of gallic acid, protocatechuic acid and guanidines, along with a diverse set of natural products, allowed the identification of inhibitors of cellular migration and metastatic cell proliferation. A series of synthetic indolic derivatives and cyclohexanediones, having potent inhibitory activity in cellular migration, was characterized upon tubulin, an important macromolecular target for compounds such as taxol, vinblastine and colchicine. Immunofluorescence assays revealed that the compounds act by altering the cellular cytoskeleton. The design and synthesis of three polypeptides were also performed through solid phase synthesis. The biological evaluation of the peptides demonstrated their inhibition effects on the migration and proliferation of breast cancer cells. Finally, metabolomic studies of two strains of breast cancer cells were conducted by NMR analyses of cellular cultures.

A ação metastática do BPV permanece não clara. Este estudo avaliou a ação do BPV na transição epitélio-mesênquima (TEM), empregando linhagens celulares de papiloma (P), fibropapiloma (FB) e carcinoma de esôfago (CE). Os resultados mostraram a presença de infecção produtiva e o aumento do potencial proliferativo nestas células. Porém, foi verificada a redução do potencial de membrana mitocondrial em relação à pele saudável (controle) e o aumento do estresse oxidativo, resultante da ação da oncoproteína E6, justificando a clastogenicidade e a aquisição do fenótipo-tronco descrito nas linhagens de P, FB e CE. Estas linhagens mostram capacidade migratória decorrente do sequestro citoplasmático de E-caderina, e o aumento dos níveis de expressão de vimentina, vinculina e N-caderina como consequência da ativação dos fatores STAT3 e SLUG, sugerindo a ação do vírus na indução da TEM. Tais resultados foram validados em amostras de tecido, reforçando a ação do vírus na TEM, bem como demostrando o potencial destas linhagens celulares como modelo de estudo da metástase. / BPV metastatic action remains unclear. This study evaluated the BPV action on epithelial-mesenchymal transmition (EMT), using cell lines form papilloma (P), fibropapilloma (FB) and esophageal carcinoma (EC). Results showed the productive infection presence and the proliferative potential increase in these cells. However, it was verified the mitochondrial membrane potential loss in relation to normal skin (control) and the oxidative stress increase as result of E6 oncoprotein, justifying the clastogenicity and stem-cell phenotype acquisition described in P, FB and EC cells. This cell lines showed a migratory capability as result of cytoplasmic sequester of E-cadherin, and the increase levels of vimentin, vinculin and N-cadherin as consequence of STAT3 and SLUG factors activation, suggest the virus action on EMT. These results were also verified in tissue samples, reinforcing the BPV action on EMT, as well as demonstrating the potential of these cell lines as model to study the metastasis.

A expressão da conexina 32 e 43 nas células gigantes trofoblásticas foi analisada em condições de cultura celular com e sem influência de hormônios sexuais. Placentônios bovinos foram coletados de vacas prenhes em abatedouro nos diferentes períodos gestacionais e divididos em três grupos, primeiro terço (I), segundo terço (II), terceiro terço (III) e transportados ao laboratório em condições assépticas à temperatura de 4ºC em solução de PBS com antibiótico. No laboratório as células foram isoladas e cultivadas em meio D-MEM com 10% SFB por cinco dias. As detecções das conexinas 32 e 43 foram realizadas através de munofluorescencia, pelo método de amplificação da tiramida-fluoresceina, utilizando anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho, anti-conexina 32 e 43 de camundongo. Os resultados mostraram que as células gigantes trofoblásticas expressam conexinas 32 e 43 nos três períodos gestacionais com exceção da Cx32 no primeiro terço gestacional sem adição de hormônios, a qual passou a expressar fluorescência após a adição de hormônios. A distribuição da Cx43 evoluiu com a progressão da gestação, permanecendo limitada ao interior das células gigantes trofoblásticas, sem formar junções comunicantes. O terceiro terço gestacional mostra a Cx43 na CGTT localizada no interior do núcleo. A adição de hormônios ao meio de cultura vem confirmar que a progesterona e o estrógeno podem ter um papel no controle da Cx32. Para Cx43 onde se adicionou progesterona os níveis de expressão foram baixos no início aumentando no decorrer da gestação, o mesmo foi encontrado para o conjugado de progesterona/ estrógeno. Para o estrógeno no grupo I os níveis de expressão foram menores se comparados aos três grupos diminuindo no grupo II e voltando a aumentar no grupo III. / The trophoblast cells expression of connexins 32 and 43 was studied in cell culture conditions with or without influence of sexual hormones. Bovine placentomes were collected from pregnant cows in slaughterhouses in different gestational periods and so divided into three groups, first term (I), second term (II), and third term (III), and transported to the laboratory in aseptic conditions at a temperature of 40C in PBS solution with antibiotics. At the laboratory the cells were isolated and cultivated in D-MEM environment with 10% SFB for five days. The detections of connexins 32 and 43 were achieved through immunofluorescence, by the tyramide-fluorescein amplification method, using a rabbit polyclonal primary antibody anti-connexin 32 and 43 of mice. The results showed that the trophoblast cells expressed connexins 32 and 43 in the three gestational periods with an exception of the Cx32 at the first gestational period. However, after the addition of sexual hormones, they began to express the connexins in the cytoplasm in the first stage. The distribution of the Cx43 evolved with the progression of the gestation, remaining limited to the trophoblast`s cells interior, without formation of gap junctions. The third gestational term shows the Cx43 located inside the nuclei of the CGTT. Addition of hormones in the culture environment confirmed that estrogen and progesterone may have an important action controlling Cx32. For Cx43, the expression was low after prosterone was added to the culture medium, but increased as the gestation evolved, the same was found for a combined compost of estrogen\\ progesterone. For estrogen, in group I the expression levels were inferior when compared to the three groups decreasing in group II and increasing again in group III. We may conclude that the sexual hormes, specially estrogen, affect the expression of connexins in trophoblastic cells.

No presente estudo foi analisado o perfil eletroforético de 15 amostras de rotavírus, sendo 11 de bezerros, 02 de leitões e 02 de criança, que foram cultivadas até a sexta passagem em células da linhagem MA104, com o monitoramento realizado pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). O objetivo foi comparar o perfil eletroforético de amostras fecais e após o isolamento As amostras leitões não revelaram mudanças de migração aparente, mas uma amostra apresentou um segmento adicional entre os segmentos 5 e 6, tanto no material anterior ao cultivo, quanto na amostra isolada. Em relação as amostras de crianças, uma apresentou diferença na velocidade de migração eletroforética. Além disso, uma amostra de bezerro apresentou um segmento adicional entre os segmentos 5 e 6. Estes dados ressaltam a importância da PAGE como uma técnica de triagem de amostras, que podem, posteriormente serem analisadas por técnicas moleculares mais especificas. As mudanças de comportamento na migração eletroforética dos segmentos genômicos do RNA viral podem ser sugestivas de alteração nas propriedades antigênicas, além do fato de que mudanças que ocorreram in vitro poderão, também, ocorrer in vivo. / In the present work, we have analyzed the electrophoretic profile of 15 samples of rotavírus, 11 of calves, 02 of pigs and 02 of children, that have been cultivated on MA,104 cell up to the sixth passage. The polyacrilamide gel electrophoresis(PAGE) was used to confirm the viral isolation. The aim of the work was to compare the electropherotic profile of fecal samples before and after isolation in MA104 cells. The samples from pigs did not reveal apparent changes in bands migration. However, an additional segment, betweem segments 5 and 6 was detected, in one fecal sample and after isolation. Furthermore, one child sample showed differences in the electrophoretic mobility and also an additional segment was detected between segments 5 - 6 in one sample from a calf. The results emphasize the importance of PAGE as a technique to screen samples that could be analyzed posteriorly by more specific molecular techniques. The changes in the electrophoretic profiles of genomic segments of viral RNA might be suggestive of changes in the antigenic properties, besides the fact that changes that occurred in vitro may also happen in vivo.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-03-30T16:25:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO VERSÃO CAPA DURA (13-10-15).pdf: 2246251 bytes, checksum: fbcf11e37e0bbe5836c8e84eff1b1401 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T16:25:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO VERSÃO CAPA DURA (13-10-15).pdf: 2246251 bytes, checksum: fbcf11e37e0bbe5836c8e84eff1b1401 (MD5) Previous issue date: 2015-02-20 / CAPES / A kefirana, um exopolissacarídeo produzido por micro-organismos presentes nos grãos kefir e é constituído por uma glicogalactana que possui várias propriedades benéficas para a saúde. No presente trabalho foram desenvolvidos filmes poliméricos baseados em kefirana para constituir suportes para o cultivo celular. Inicialmente foram desenvolvidos vários métodos de extração da kefirana. Para o primeiro método foi utilizado uma solução de hidroxido de sódio 1 M como solvente de extração, denominado de T1. No segundo método, os grãos passaram por um processo de cozimento em água destilada onde foram separados os sobrenadante e precipitado, que foram analisados de forma independente, depois de serem cozidos em hidróxido de sódio. O sobrenadante foi denominado T2 e o precipitado, T3. Para obtenção de T4, os grãos foram submetidos a uma precipitação seriada, utilizando-se soluções de etanol, com concentrações diferentes. No quinto método utilizou-se água como solvente no processo de extração, chamado de T5. Foram selecionados os métodos T2 e T4 baseados na reprodutibilidade dos filmes formulados. Os filmes foram caracterizados através de análises morfológicas, físicas, espectroscópicas e de aderência celular. Os filmes foram analisados macroscopicamente e por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e apresentaram-se uniformes em sem rachaduras. Também foi avaliada a influência da irradiação gama para tanto foram irradiados kefiranas nas seguintes doses: 15, 25 e 50 kGy. Macroscopicamente, os filmes também se mostraram flexíveis. A técnica T4 obteve melhores resultados com menor espessura (0,03±0,015mm), maior teor de umidade (55,17 % ± 0,445), transparência (84,09 % ± 0,51), tensão de ruptura (4,89 MPa ± 0,06), alongamento de ruptura (111,99 % ± 0,35) e rendimento global (4,28 %), porém T2 obteve um maior teor de carboidrato (52,31 % ± 0,03) em relação a T4 (46,38 % ± 0,03). Através do ângulo de contato foi possível observar que a superfície dos filmes T2 e T4 era hidrofílica. Nas análises de Difração de Raios X (DRX) foi possível verificar o comportamento amorfo do polímero em ambos os métodos de extração. A natureza química do material foi confirmada por FTIR, sendo os dois filmes apresentando picos semelhantes como encontrado nos filmes de kefirana descritos na literatura. Nas analises viscosimétricas foi possível observar através do método de Huggins que a kefirana, assim como a maioria dos polímeros obedece a uma relação linear com KH ~ 3,8. A irradiação gama na kefirana, provocou os efeitos de reticulações e cisões na cadeia principal dependendo da dose irradiada, tendo a dose de 15 kGy um maior número de reticulação do que cisões. O teste de adesão celular em que células mesenquimais de cordão umbilical foram cultivadas sobre a superfície do polímero, observou-se que houve uma adesão parcial em ambos os filmes não indicando toxicidade nem decomposição do polímero. / The kefiran an exopolysaccharide produced by micro-organisms present in the kefir grains and consists of a glicogalactan which has various properties beneficial to health. In this work were developed polymeric films based on kefirana to constitute supports for cell culture. Initially they were developed several methods of extraction kefirana. For the first method used was a sodium hydroxide solution 1 M as the extraction solvent, called T1. In the second method, the grains have undergone a baking process in which the distilled water supernatant and precipitate were separated, they were analyzed independently, after being boiled in sodium hydroxide. The supernatant was and the precipitate called T2, T3. To obtain T4, the grains were subjected to a serial precipitation using ethanol solutions with different concentrations. In the fifth method we have used water as the solvent in the extraction process, called T5. T2 and T4 methods based on reproducible formulated films were selected. The films were characterized by morphological, physical, spectroscopic analysis and cell adhesion. The films were analyzed macroscopically and by scanning electron microscopy (SEM) and showed up in uniform without cracks. It also evaluated the influence of gamma irradiation for both were irradiated kefiran in the following doses: 15, 25 and 50 kGy. Macroscopically, the films also proved flexible. The T4 technique achieved better results with less thickness (0.03 ± 0,015mm), higher moisture content (55.17% ± 0.445), transparency (84.09% ± 0.51), breakdown voltage (4.89 ± 0.06 MPa), breaking elongation (111.99% ± 0.35) and comprehensive income (4.28%), although T2 obtained a higher carbohydrate content (52.31% ± 0.03) compared T4 (46.38 ± 0.03%). Through the contact angle was observed that the surface of the films T2 and T4 was hydrophilic. In the analysis of X-Ray Diffraction (XRD) it observed the behavior of amorphous polymer in both extraction methods. The chemical nature of the material was confirmed by FTIR, and the two films having similar peaks as found in others kefiran films. In viscosimetric analysis was observed by Huggins method that kefiran, as most polymers obeys a linear relationship with KH ~ 3.8. Gamma irradiation at kefiran caused the effects of crosslinking and divisions in the main chain depending on the irradiated dose, and a dose of 15 kGy a greater number of crosslinking than divisions. The cell adhesion assay in which umbilical mesenchymal cells were cultured on the polymer surface, it was observed that there was a partial membership in both films indicates no toxicity and no decomposition of the polymer.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-04T13:11:29Z No. of bitstreams: 1 Rosana Leo de Santana.pdf: 693786 bytes, checksum: b9d2b7d60669ce82e4b87ed63463daad (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-04T13:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosana Leo de Santana.pdf: 693786 bytes, checksum: b9d2b7d60669ce82e4b87ed63463daad (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / Contagious ectima is a severe and proliferartive virus among ovine and caprine caused by the contagious ectima virus (ECV) of the Parapoxvirus genus. The control of the infection in endemic regions is done with vaccines, however there are limitations in the vaccine production due to the difficulties in replicating the virus in cell cultures. The purpose of this paper is to evaluate the behavior of ECV samples in primary cultures of fetal caprine cornea cells, a system of cultures yet untested for the replication of ECV. Crust samples from nine sheep and two goats from the states of Bahia, Sergipe and Paraiba and presenting the clinical symptoms of EC were inoculated in monolayers of the cells, during seven consecutive passages at weekly intervals. During all the occasions we observed, after 24 hours of infection, the cytopathic effect (CE) characterized by cell rounding, fusion with the formation of small sincicia, cytoplasmatic inclusion and vacuolation. The intensity of detachment from the cell layers ranged from 25% to 100% which varied according to the sample. We concluded that the primary cell cultures of the fetal caprine cornea appeared highly permissible to replication of ECV and the isolated samples of ECV appeared to adapt to the utilized culture with slight variation among samples. / Ectima contagioso (EC) é uma virose aguda e proliferativa de ovinos e caprinos, causada pelo vírus do ectima contagioso (ECV), do gênero Parapoxvirus. O controle da infecção em regiões endêmicas é realizado através de vacinação, porém existem limitações nas técnicas de produção de vacinas, que é a dificuldade de replicação do vírus em cultivo celular. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de isolar e avaliar o comportamento das amostras de ECV em cultivo primário de células de córnea fetal caprina (CFC), sistema de cultivo ainda não testado para replicação de ECV. Amostras de crostas de nove ovinos e de dois caprinos que apresentavam sintomatologia clínica de EC, originários dos Estados da Bahia, Sergipe e Paraíba, foram inoculadas em monocamadas de células epiteliais de córnea de feto caprino, durante sete passagens consecutivas, a intervalos semanais. Observou-se em todas passagens, a partir de 24 horas pós infecção, efeito citopático (ECP) caracterizado pelo arredondamento celular, fusão com formação de pequenos sincícios, vacuolização e corpúsculos de inclusão citoplasmático, com intensidade de 25% a 100% de desprendimento da camada celular, que variou de acordo com a amostra. Conclui-se que as culturas de células primárias de córnea fetal caprina mostraram-se altamente permissíveis à replicação do ECV e que as amostras de ECV isoladas mostraram-seadaptadas ao cultivo utilizado, com pequena variação entre as amostras.

As amostras foram obtidas de éguas adultas, totalizando 42 animais, sendo 30 destinados à descrição e caracterização da placenta e anexos embrionários/fetais. Os outros 12 animais foram destinados ao cultivo celular das membranas vitelinas e amnióticas. Os embriões foram mensurados obtendo Crow-Rump e fixados para descrição morfológica. Os fragmentos vitelínicos e amnióticos foram cultivados em meio α-MEM, suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de glutamina e 1% de antibiótico, incubados a 37º C e 5% de CO2. Quanto ao material obtido, o córion é a membrana mais externa ao embrião, morfologicamente constituído por epitélio colunar e mesênquima ricamente vascularizado e rico em fibras colágenas. O alantóide é bem desenvolvido e vascularizado, constituído por epitélio simples pavimentoso e por microvilosidades. O âmnio é uma membrana avascular e delgada constituída por uma única camada de células pavimentosas, membrana basal e mesênquima. O saco vitelino exibe um aspecto amarelado com vasos na superfície, constituído por duas camadas celulares entremeadas por mesênquima vascularizado. A cinta coriônica aparece como um halo ao redor do concepto no ponto onde as membranas do alantóide e saco vitelino se encontram. Em relação aos embriões em geral, notamos a presença do prosencéfalo em formação, arcos branquiais, vesícula óptica pigmentada, neuróporo cranial aberto expondo o chamado 4º ventrículo encefálico, e uma flexura cervical acentuada. Notamos a impressão cardíaca; os membros torácicos e pélvicos apresentam formato de "remo". Nos fetos em geral observamos as cavidades orais e nasais delimitadas externamente; o crescimento do pavilhão auricular e início do crescimento da orelha externa; formação do aparelho ungueal nos membros torácicos e pélvicos. As costelas tornam-se mais proeminentes e algumas estruturas já apresentam ossificações Morfologicamente às células vitelinas e amnióticas exibem morfologia fibroblastóide e epitelióide. As células progenitoras isoladas do saco vitelino e do âmnio, na quinta passagem, demonstraram cariótipo normal (2n=64). A população de células do saco vitelino apresentou um crescimento progressivo, não constante até a quinta passagem, e em P10 um declínio acentuado. Para a membrana amniótica, a população celular apresentou um crescimento constante, não linear, até a oitava passagem, e em P10 um declínio acentuado. À imunocitoquímica, as células do saco vitelino e da membrana amniótica, apresentaram-se imunopositivas para: Oct-4, Nanog, SSEA-3, vimentina, citoqueratina 18 (ck18) e PCNA. Tanto as células do saco vitelino como as da membrana amniótica expressaram os seguintes marcadores: CD 45, CD 105, Oct3/4, Nanog, CD 34 e Stro-1. As duas linhagens celulares demonstraram capacidade de diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos e não apresentaram potencial carcinogênico em camundongos NUDE. / The samples were obtained from adult mares, totalizing 42 animals, being 30 for the description and characterization of the placenta and embryonic annexes / fetus. The other 12 animals were used for the cell culture of amniotic membranes and yolk sac. The embryos were measured obtaining Crow-Rump and fixed for morphological description. The vitelline and amniotic fragments were cultured in α-MEM, supplemented with 20% fetal bovine serum, 1% nonessential amino acids, 1% glutamine and 1% antibiotic, incubated at 37 º C and 5% CO2. As for the material obtained, the chorion is the outer embryo membrane, consisting of morphologically columnar epithelium and mesenchyme richly vascularized and rich in collagen fibers. The allantois is well vascularized and developed, consisting of a simple squamous epithelium and with the presence of microvilli. The amnion is an avascular membrane consisting of a single thin layer of squamous cells, basal membrane and mesenchyme. The yolk sac exhibits a yellowish appearance with surface vessels, consisting of two cell layers interspersed with a vascularized mesenchyme. The chorionic girdle appears as a halo around the fetus at the point where the allantoid membranes and the yolk sack meet. Regarding embryos in general, the presence of the forebrain in formation, branchial arches, pigmented optic vesicle, open cranial neuropore exposing the so called 4th encephalic ventricle, and pronounced cervical flexure were noticed. The cardiac impression was observed and the fore and hindlimbs had a \"paddle\" shape. Fetuses in general had the nasal and oral cavities externally defined; presented the growth of the auricular pavilion and early growth of the external ear; and formation of the nail apparatus in fore and hindlimbs. The ribs become more prominent and some structures already presented ossification. Morphologically the yolk and amniotic cells was presented as fibroblastoid and epithelioid. The progenitor cells isolated from the yolk sac and the amnion, in the fifth passage, showed normal karyotype (2n = 64). The cells population in the yolk sac showed a progressive growth, not constant until the fifth passage, and a marked decline in P10. For the amniotic membrane, the cell population showed a constant growth, not linear, until the eighth passage, and a marked decline in P10. In immunocytochemistry, the yolk sac cells and amniotic membranes presented themselves as immunopositive for: Oct-4, Nanog, SSEA-3, vimentin, cytokeratin 18 (CK18) and PCNA. Either the yolk sack as the aminiotic membranes expressed the markers CD 45, CD 105, Oct3 / 4, Nanog, CD 34 and Stro-1. Both cell lines demonstrated the capacity to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes and had no carcinogenic potential in NUDE mice.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-07-21T12:10:16Z No. of bitstreams: 1 2010 - Rafaella Camara Teixeira.pdf: 2127524 bytes, checksum: 2f2281ce314ac38db40bc03d628e7447 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T12:10:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Rafaella Camara Teixeira.pdf: 2127524 bytes, checksum: 2f2281ce314ac38db40bc03d628e7447 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico, CNPq, Brasil. / Cell cultures provide a simplified system of observation that can be particularly useful for studies of intracellular and epicellular microorganisms. The aim of this study was to establish in vitro embryonic cells primary culture of the tick Rhipicephalus sanguineus to cultivate the spirochete Borrelia burgdorferi american strain G39/40. The culture was established from embryonated eggs of engorged females of R. sanguineus to 12 days after the beginning of the oviposition, using the culture medium Leibovitz's L-15B supplemented with 20% of inactivated fetal calf serum, 10% of tryptose phosphate broth, 0.1% fraction V bovine albumin, 1% of glutamine and 0.1% of gentamicin antibiotic, pH 6.8. After the formation of a monolayer, the initial culture medium L-15B was removed from the tubes and replaced by Barbour-Stoenner-Kelly medium (BSK) or BSK with L-15B without antibiotics. Spirochetes previously grown in BSK were counted and inoculated into tubes, with final concentration of approximately 6.2 x 105 spirochetes/mL. B. burgdorferi from the inoculated tubes were countered when the means showed yellow color, indicative of high acidity due to the multiplication of spirochetes. On the third day after the start of primary culture of R. sanguineus embryonic cells, we observed the fixation of cell aggregates on the surface of the bottles. From these clusters, there were several cell types, such as large fibroblast-type cells and structures like vesicles and tubes. In the second week, we observed the appearance of round or flattened epithelial-type cells, and after 21 days of culture, we realized the formation of a monolayer due to the appearance of confluent cells. The L-15B medium proved to be efficient for the development of primary culture of R. sanguineus embryonic cells. There was a great multiplication of spirochetes cultivated with cultured embryonic cells when compared to the initial concentration, as well as the spirochetes grown in the absence of the tick cells, observing an increase of 100 times the number of B. burgdorferi. Seven days after inoculation, the tubes in which we used only the BSK medium, higher concentrations of B. burgdorferi were recovered when compared to the tubes where the medium BSK and Leibovitz's L-15B were used. Regardless of the culture media tested, the final concentration of B. burgdorferi of the tubes with embryonic tick cells was lower than that of seamless embryonic cells. In observation of the culture tubes on microscopy phase contrast, spirochetes were presented adhered to epithelial-type and fibroblast-type tick cells in an epicelular way and with great motility. R. sanguineus embryonic cells grown in BSK medium, with or without B. burgdorferi inoculation, stopped its propagation, showed membrane degeneration and many of them broke away from the surface of the bottle. The cells grown in BSK and L- 15B continued to multiply, many were still intact and attached to the bottle, with the presence of tissues in development, with fewer degenerated and floating cells than those cultivated in BSK. The spirochete B. burgdorferi strain G39/40, adhered, grew, multiplied and showed great motility in cultures of embryonic cells of R. sanguineus tick, using BSK and Leibovitz?s L-15B media. / As culturas celulares oferecem um simplificado sistema de observa??o que pode ser particularmente ?til para estudos de microrganismos intracelulares e epicelulares. O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura prim?ria in vitro de c?lulas embrion?rias do carrapato Rhipicephalus sanguineus para cultivo da espiroqueta Borrelia burgdorferi, cepa americana G39/40. A cultura foi estabelecida a partir de ovos embrionados de f?meas ingurgitadas de R. sanguineus com 12 dias ap?s o ?nicio da postura, utilizando o meio de cultivo Leibovitz?s L- 15B, suplementado com 20% de soro fetal bovino inativado, 10% de caldo triptose fosfato, 0,1% fra??o V de albumina bovina, 1% de glutamina e 0,1% de antibi?tico gentamicina, pH 6,8. Com a forma??o de uma monocamada celular, o meio de cultura inicial L-15B foi retirado dos tubos e trocado por meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) ou BSK com L-15B sem antibi?tico. As espiroquetas previamente cultivadas em BSK foram contadas e inoculadas nos tubos, apresentando concentra??o final de aproximadamente 6,2 x 105 espiroquetas/mL. A contagem de B. burgdorferi dos tubos inoculados foi realizada quando o meio apresentou colora??o amarela, indicativa de elevada acidez devido ? multiplica??o das espiroquetas. No terceiro dia ap?s o in?cio da cultura prim?ria de c?lulas embrion?rias de R. sanguineus, foi poss?vel observar a fixa??o de agregados celulares na superf?cie dos frascos. A partir destes agregados, surgiram diversos tipos celulares, como grandes c?lulas fibroblast?ides e estruturas semelhantes a ves?culas e tubos. Na segunda semana, foi observado o aparecimento das c?lulas epiteli?ides ou redondas e, com 21 dias de cultivo, visualizou-se a forma??o de uma monocamada celular devido ao aspecto confluente das c?lulas. O meio de cultivo L-15B demonstrou ser eficiente para o desenvolvimento da cultura prim?ria de c?lulas embrion?rias de R. sanguineus. Houve grande multiplica??o das espiroquetas cultivadas com c?lulas embrion?rias quando comparada ? concentra??o inicial, assim como das espiroquetas cultivadas na aus?ncia das c?lulas de carrapato, observando-se um aumento em 100 vezes do n?mero de B. burgdorferi. Sete dias ap?s a inocula??o, foram recuperadas maiores concentra??es de B. burgdorferi nos tubos onde se utilizou somente o meio BSK, do que nos tubos onde foi utilizado BSK juntamente com Leibovitz?s L-15B. Independente dos meios de cultivo testados, a concentra??o final de B. burgdorferi dos tubos com c?lulas embrion?rias de carrapato foi menor do que a dos tubos sem c?lulas embrion?rias. Na observa??o dos tubos de cultivo ? microscopia de contraste de fase, as espiroquetas apresentaram-se aderidas ?s c?lulas de carrapato epiteli?ides e fibroblast?ides de maneira epicelular e com grande motilidade. As c?lulas embrion?rias de R. sanguineus cultivadas em meio BSK, com ou sem in?culo de B. burgdorferi, pararam sua multiplica??o, apresentaram degenera??o na membrana e muitas desprenderam-se da superf?cie do frasco. As c?lulas cultivadas em meio BSK e L-15B continuaram a se multiplicar, muitas ainda estavam ?ntegras e aderidas ao frasco, com presen?a de tecidos em desenvolvimento, com menos c?lulas degeneradas e flutuantes que as cultivadas somente em BSK. A espiroqueta B. burgdorferi, cepa G39/40, aderiu, cresceu, multiplicou e apresentou grande motilidade nos cultivos com c?lulas embrion?rias do carrapato R. sanguineus, utilizando meios BSK e Leibovitz?s L-15B.

Um dos grandes problemas da saúde pública no país esta diretamente ligada à dengue, uma vez que aproximadamente 550 mil pessoas são infectadas anualmente, e cerca de 20 mil vêm a óbito. Esta doença é causada pelo vírus da família Flaviviridae, transmitido pela fêmea ao hospedeiro durante o repasto sanguíneo. Este projeto teve como objetivo isolar e caracterizar células indiferenciadas de ovos embrionados e do tubo digestivo de larvas em quarto instar de Aedes aegypti, como fonte de pesquisa na área de biologia celular e estrutural destes vetores. Mediante cultura celular, as células foram isoladas e recultivadas em meio de cultura DMEM-High, e temperatura de 28 ºC. As seguintes análises foram feitas: morfologia celular, ciclo celular, testes de imunofenotipagem pelo método de citometria de fluxo e analise de imunohistoquimica. As células de Aedes aegypti analisadas pela morfologia celular, apresentaram formato globóide, tamanho pequeno e população heterogênica. A análise das fases do ciclo Sub-G1, G0-G1, S e G2-M após cultura primaria de ovos embrionados atingiram (27,5%; 68%; 30,2% e 1,9%, respectivamente). Após 24 horas atingiram (10%; 92,4%; 6,2% e 0,6%, respectivamente). A análise de imunofenotipagem realizada pelo método de citometria de fluxo demonstrou em ovos embrionados, marcações positivas para pluripotencia, assim como baixa expressão para Oct 3/4, e alta expressão para o (Sox2). As células mesenquimais tiveram alta expressão para os marcadores (Stro-1, Vimentina e Nestin). O marcador de morte celular por apoptose (Caspase3), teve alta expressão nas células cultivadas, enquanto que os marcadores endossomicos específicos para células de insetos (Anti GM130 e Anti RAB-5) também foram altamente expressos. Na cultura celular derivada do tubo digestivo de larvas de Aedes aegypti, as analises dos marcadores para pluripotencia tais como Oct 3/4 não demonstrou expressão, entretanto, o marcador Sox2 foi altamente expresso na cultura. Para as células mesenquimais não houve expressão de nenhum marcador utilizado, ou seja, (Stro-1, Vimentina e Nestin). No entanto para o marcador de morte celular por apoptose (Caspase 3) as células em cultura demonstraram alta expressão, enquanto que para os marcadores endossomicos específicos de insetos os mesmos foram altamente marcados. O teste de imunohistoquímica realizado em ovos embrionados no final do período embrionário demonstrou que as células tinham potencial ploriferativo mediante marcação positiva para PCNA. As células pluripotentes foram pouco expressas pelos marcadores Nanog, Oct 3/4, e muito expressas pelo marcador Sox2. As células de origem mesenquimais foram altamente expressas pelos marcadores SSEA-4, Stro-1, Vimentina e Nestin assim como para os marcadores endossomicos específicos para células de insetos, os quais demonstraram alta expressão nas células de embriões de Aedes. Sendo assim, conclui-se que tanto ovos embrionados quanto larvas de quarto instar de Aedes aegypti possuem células indiferenciadas, com grande potencial para estudos com biologia molecular, visando o controle biológico deste vetor / A major problem of public health in the country is directly linked to dengue, as approximately 550 million people are infected annually, and about 20,000 have died. This disease is caused by the virus of the Flaviviridae family, transmitted by the female to the host during blood feeding. This project aimed to isolate and characterize stem cells from fertilized eggs and larvae gut fourth instar Aedes aegypti, as a source of research in cell biology and structural area of these vectors. Upon cell culture, the cells were isolated and recultured in DMEM-high culture temperature and 28 º C. The following analyzes were performed: cell morphology, cell cycle tests immunophenotyping by flow cytometry and immunohistochemistry analysis. The Aedes aegypti cells analyzed by cell morphology showed globular shape, small size and heterogenic population. The analysis of sub-G1 phase of the cycle, G0, G1, S and G2-M after primary culture reached embryonated eggs (27.5%, 68%, 30.2% and 1.9%, respectively). Achieved after 24 hours (10%, 92.4%, 6.2% and 0.6%, respectively). Immunophenotyping analysis by flow cytometry demonstrated in embryonated eggs, positive for pluripotency markers, as well as low expression of Oct 3/4 and high expression for the (Sox2). The mesenchymal cells had high expression for markers (Stro-1, vimentin and Nestin). The marker of cell death by apoptosis (Caspase3) had high expression in cultured cells, whereas the endosomal markers specific for insect cells (GM130 and Anti-Anti RAB 5) were also highly expressed. In cell culture derived from the gut of larvae of Aedes aegypti, the analysis of pluripotency markers such as Oct for 3/4 showed no expression, however, the marker Sox2 was highly expressed in the culture. For mesenchymal cells no expression of any label used, ie (Stro-1, Nestin and vimentin). However marker for cell death by apoptosis (caspase 3) cells in culture showed high expression, whereas for the specific endosomal markers insects they were highly labeled. The immunohistochemistry test on embryonated eggs at the end of the incubation period the cells have demonstrated potential ploriferativo by positive staining for PCNA. Pluripotent cells were slightly expressed by markers Nanog, Oct 3/4, Sox2, and expressed by the marker. The cells of mesenchymal origin were highly expressed by SSEA-4 markers, Stro-1, Nestin and vimentin as well as the specific endosomal markers for insect cells, which showed high expression in cells of Aedes embryos. Therefore, it is concluded that both embryonated eggs as room instar larvae of Aedes aegypti have undifferentiated cells, with great potential for studies of molecular biology, targeting the biological control of this vector

No description available.