Les génomes nucléaires eucaryotes sont empaquetés au sein d’une structure nucléoprotéique appelée chromatine et dont l’unité fondamentale est le nucléosome. Celui-ci est composé d’un octamère d’histones, contenant deux molécules de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4, autour duquel 147 pb d’ADN sont enroulées. Les modifications post-traductionnelles (PTMs) des histones et de l’ADN (méthylation des cytosines) constituent des marqueurs épigénomiques primaires qui participent à la régulation et au contrôle de l’accessibilité des différentes régions du génome. Ainsi, la chromatine forme une structure dynamique influencée par les changements environnementaux et développementaux et contribue à orchestrer diverses fonctions du génome. L’objectif principal de ma thèse était de caractériser l’organisation spatiale et la dynamique temporelle des états chromatiniens chez Arabidopsis par des approches à l’échelle du génome permettant l’étude des profils de méthylation de l’ADN et d’un ensemble de modifications post-traductionnelles des histones. La méthylation de l’ADN, une marque caractéristique de l’inactivation épigénétique et de l’hétérochromatine chez les plantes et les mammifères, est largement confinée aux séquences répétées, dont les éléments transposables (TEs). Par mon travail de thèse, j’ai montré que chez Arabidopsis les séquences de TEs faiblement méthylées ou non associées à des petits ARN interférents (siRNAs), donc potentiellement non régulées par la machinerie de RNA-directed DNA methylation (RdDM), peuvent acquérir une méthylation de l’ADN par diffusion à partir de séquences adjacentes ciblées par les siRNAs. Cette diffusion de la méthylation de l’ADN sur des régions promotrices pourrait expliquer, au moins en partie, l’impact négatif des TEs associés à des siRNAs sur l’expression des gènes à proximité immédiate. Dans une seconde partie de ma thèse, j’ai contribué à l’analyse intégrée de la méthylation de l’ADN et de onze modifications des histones. L’utilisation d’analyses combinatoires et en cluster m’a permis de montrer que l’épigénome d’Arabidopsis présente des principes simples d’organisation. En effet, ces analyses nous ont conduit à distinguer quatre états fondamentaux de la chromatine chez Arabidopsis, préférentiellement associés aux gènes actifs, aux gènes inactifs, aux TEs et aux régions intergéniques. Dans une troisième partie, j’ai intégré des données épigénomiques et transcriptomiques obtenues à différents temps afin d’étudier les dynamiques temporelles des états chromatiniens en réponse à un stimulus externe, la première exposition à la lumière des plantules suite à la germination. Ces travaux nous ont permis de montrer que la monoubiquitination de l’histone H2B participe à la modulation fine et sélective des changements rapides de l’expression de gènes. L’ensemble du travail présenté contribue à une meilleure compréhension de l’organisation de la chromatine le long du génome des plantes et de la dynamique des états chromatiniens en réponse aux changements de l’environnement. / Eukaryotic genomes are packed into the confines of the nucleus through a nucleoproteic structure called chromatin. Chromatin is a dynamic structure that can respond to developmental or environmental cues to regulate and orchestrate the functions of the genome. The fundamental unit of chromatin, the nucleosome, consists of a protein octamer, which contains two molecules of each of the core histone proteins (H2A, H2B, H3, H4), around which 147 bp of DNA is wrapped. The post-translational modifications (PTMs) of histones and methylation of the cytosine residues in DNA (DNA methylation) constitute primary epigenomic markers that dynamically alter the interaction of DNA with nucleosomes and participate in the regulation and control access to the underlying DNA. The main objective of my thesis was to understand the spatial and temporal dynamics of chromatin states in Arabidopsis by investigating on a genome-wide scale, patterns of DNA methylation and a set of well-characterized histone post-translational modifications. DNA methylation, a hallmark of epigenetic inactivation and heterochromatin in both plants and mammals, is largely confined to transposable elements and other repeat sequences. I show in this thesis that in Arabidopsis, methylated TE sequences having no or few matching siRNAs, and therefore unlikely to be targeted by the RNA-directed DNA methylation (RdDM) machinery, acquire DNA methylation through spreading from adjacent siRNA-targeted regions. Further, I propose that this spreading of DNA methylation through promoter regions can explain, at least in part, the negative impact of siRNA-targeted TE sequences on neighbouring gene expression. In a second part, I have contributed to integrative analysis of DNA methylation and eleven histone PTMs. I have shown through combinatorial and cluster analysis that the Arabidopsis epigenome shows simple principles of organisation and can be distinguished into four primary types of chromatin that preferentially index active genes, repressed genes, TEs, and intergenic regions. Finally, in a third part, I integrated epigenomics with transcriptome data at three different time points in a developmental window to investigate the temporal dynamics of chromatin states in response to an external stimulus. This used the light-induced transcriptional response as a paradigm to assess the impact of histone H2B monoubiquitination (H2Bub), and showed that this PTM is associated with active transcription and implicated in the selective fine-tuning of gene expression. Taken together, the work presented here contributes significantly to our understanding of the spatial organisation of chromatin states in plants, its dynamic nature and how it can contribute to allow plants to respond to a signal from the environment.

La méthylation de l'ADN est l’une des marques épigénétiques les plus étudiées et est largement conservée. Mes travaux de thèse présentent le premier méthylome d'une diatomée marine P. tricornutum qui appartient à la famille des Stramenopiles. P. tricornutum présente une méthylation d’environ 6% qui est présente en mosaïque sur l’ensemble du génome. Une méthylation importante a été retrouvé chez les éléments transposables, en particulier les éléments amplifiés récemment de type Copia. L’analyse met en évidence plus de 320 gènes méthylés dans trois contextes génomiques différents : à proximité des éléments transposables, en grappes de gènes méthylés, et dans des gènes uniques. En outre, les gènes largement et complètement méthylés ont été trouvé fortement corrélés avec le silencing transcriptionnel et l'expression différentielle dans des conditions spécifiques. Enfin, il a été constaté que les gènes susceptibles d’avoir été acquis par transfert horizontal de gènes bactériens étaient préférentiellement insérés dans des régions riches en éléments transposables, ce qui suggère un mécanisme par lequel l'expression de gènes étrangers peut être tamponnée à la suite de leur insertion dans le génome. En résumé, P. tricornutum a une faible méthylation de l'ADN et une methylation relativement importante des éléments transposables et seulement quelques gènes méthylés. Ce premier méthylome d’une diatomée Stramenopile ajoute de manière significative à notre compréhension de l'évolution de la méthylation de l'ADN chez les eucaryotes. En ce qui concerne les modifications des histones, la distribution des marques H3K4me2, H3K9me2 et H3K27me3 a été examinée chez P. tricornutum. H3K4me2 est principalement associée à des gènes alors que les deux marques H3K9me2 et H3K27me3 ciblent principalement des éléments transposables. La répartition de H3K27me3 est inhabituelle et différente de ce qui a été observé chez les espèces modèles étudiées à ce jour. Les gènes marqués par H3K27me3 ont tendance à être faiblement exprimés et de façon différentielle. H3K27me3 et H3K9me2 ont tendance à co-marquer non seulement les éléments transposables méthylés, mais aussi des gènes fortement méthylés, ce qui semble être important pour le maintien du silencing des gènes différentiellement exprimés. L'analyse combinatoire de différentes marques d’histones et la méthylation de l'ADN nous a donné un aperçu du paysage de la chromatine chez les diatomées, et aidera à définir les caractéristiques structurales et fonctionnelles conservées. / DNA methylation is the most extensively studied and widely conserved epigenetic mark. Here the first whole genome methylome from a stramenopile, the marine model diatom P. tricornutum is reported. In P. tricornutum, around 6% of the genome was methylated in a mosaic landscape. Extensive methylation in transposable elements (TEs), especially in recently amplified Copia-like elements was found. Over 320 genes were found methylated occurring in three different genomic contexts: in the proximity of TEs, in clusters of methylated genes, and in single genes. Furthermore, genes extensively and completely methylated correlated strongly with transcriptional silencing and differential expression under specific conditions. Finally, it was found that genes likely acquired by horizontal gene transfer from bacteria were preferentially inserted within TE-rich regions, suggesting a mechanism whereby the expression of foreign genes can be buffered following their insertion in the genome. In general, P. tricornutum has low DNA methylation with relatively extensive DNA methylation on TEs and a few methylated genes. This first Stramenopile methylome adds significantly to our understanding of the evolution of DNA methylation in eukaryotes. As for the histone modifications, genome wide distribution of H3K4me2, H3K9me2 and H3K27me3 were examined in P. tricornutum. H3K4me2 is mainly associated with genes while both H3K9me2 and H3K27me3 marks target mainly transposable elements (TEs). The distribution of H3K27me3 is unusual and different from what have been profiled in model species so far. The genes marked by H3K27me3 tend to be lowly and differentially expressed. H3K27me3 and H3K9me2 tend to co-mark not only methylated TEs but also heavily methylated genes, which appears to be important for maintaining the silencing of differentially expressed genes. The combinatorial analysis of different histone marks and DNA methylation gave us an overview of diatom chromatin landscapes, and will help to define conserved structural and functional features.

La mucoviscidose (CF) est la maladie génétique récessive létale la plus fréquente dans la population caucasienne. Elle est caractérisée par une obstruction et des infections des voies respiratoires et une inflammation chronique. La morbidité et la mortalité sont principalement dues à l'atteinte pulmonaire, qui est variable chez les patients, même lorsqu’ils sont porteurs du même génotype. Les facteurs responsables sont multiples : les mutations dans CFTR (le gène responsable de la maladie), les gènes modificateurs, mais aussi les facteurs environnementaux et les modifications épigénétiques. L'objectif principal de ce projet était de déterminer s'il y avait une corrélation entre la méthylation de l'ADN et la sévérité de l'atteinte pulmonaire chez les patients CF. Nous avons obtenu la cohorte METHYLCF (49 patients CF p.Phe508del homozygotes et 24 témoins sains) ainsi qu’une biobanque d'ADN à partir de sang total et de cellules épithéliales nasales (NEC). Les patients CF ont été stratifiés en fonction de leur VEMS, ajusté à l’âge. D’une part, nous avons analysé la méthylation de l'ADN dans CFTR plus 13 gènes modificateurs en utilisant la méthode de conversion au bisulfite et séquençage de nouvelle génération (plateforme 454 Roche). D’autre part, nous avons réalisé une analyse pan-génomique de la méthylation de l'ADN avec la plateforme 450k BeadChip (Illumina). Les sites différentiellement méthylés (DMS) sélectionnés ont été validés par pyroséquençage (PyroMark Q24, Qiagen). Deux gènes modificateurs ont été identifiés comme différentiellement méthylés chez les patients CF par rapport aux témoins: EDNRA dans le sang et HMOX1 dans le sang et dans les NEC. De façon intéressante, dans les NEC, la méthylation de EDNRA, HMOX1 et GSTM3 a été corrélée avec la sévérité de l’atteinte pulmonaire. De plus, de faibles niveaux de méthylation d'ADN dans GSTM3 ont été associés à la présence de l'allèle GSTM3*B, un polymorphisme de séquence qui a un effet protecteur chez les patients CF. Grâce à l'analyse tout-génome, nous avons identifié 1267 DMS, associés à 638 gènes, chez les patients CF par rapport aux témoins, et 187 DMS, associés à 116 gènes, chez les patients CF sévères par rapport aux modérés. Parmi ces gènes, il y a de nombreux gènes importants pour l’adhésion cellulaire et les réponses immunitaire et inflammatoire. Les DMS identifiés sont enrichis dans des régions prédites comme enhancers, pouvant représenter des séquences régulatrices, mais également en régions intergéniques. De façon intéressante, 80 gènes différentiellement méthylés sur 638 étaient différentiellement exprimés (méta-analyse de données transcriptomiques disponibles). Six sur neuf DMS sélectionnés ont été validés et cinq DMS sur six ont été répliqués dans une population indépendante. De plus, 23 DMS, dont 10 intergéniques, étaient corrélés avec le VEMS. Notre étude a montré que la méthylation de l'ADN est profondément modifiée dans le sang et dans les NEC des patients CF. Des faibles changements de méthylation de l'ADN ont été observés dans des gènes modificateurs connus ; des changements de méthylation plus importants ont été observés dans d'autres gènes qui pourraient représenter de nouveaux modificateurs de la fonction pulmonaire. Ensemble, ces gènes pourraient moduler la sévérité de l’atteinte pulmonaire chez les patients CF. / Cystic fibrosis (CF) is the most common life-threatening recessive genetic disease in the Caucasian population. It is characterized by airway obstruction, respiratory infection and inflammation. Morbidity and mortality are mainly due to lung disease, which is variable among CF patients, even for those having the same genotype. Contributing factors are mutations in CFTR (the disease-causing gene), modifier genes, but also environmental factors and epigenetics. The main goal of this project was to determine whether there was a correlation between DNA methylation and the severity of CF lung disease. We built the METHYLCF cohort (49 p.Phe508del homozygous CF patients and 24 healthy controls) and a DNA biobank from whole blood and nasal epithelial cells (NEC). CF patients were stratified accordion to their FEV1% predicted, adjusted to age. We profiled DNA methylation at 14 modifier genes using bisulfite conversion and next-generation sequencing (454 Roche). Genome-wide DNA methylation was analyzed with the 450K Beadchip (Illumina). Selected differentially methylated sites (DMS) were validated by pyrosequencing. Using the candidate modifier gene approach, we showed that two CF modifier genes were differentially methylated in CF patients compared to controls: EDNRA in blood and HMOX1 in blood and NEC. Methylation of EDNRA, HMOX1 and GSTM3 was associated with lung disease severity in NEC. Interestingly, low DNA methylation levels at GSTM3 were associated with the GSTM3*B allele, a polymorphic 3-bp deletion that has a protective effect on CF patients. In addition, through the genome-wide analysis, we identified 1267 DMS, associated with 638 genes, between CF patients and controls and 187 DMS, associated with 116 genes, between severe CF and mild CF patients. DMS were enriched at predicted enhancers, which may represent regulatory sequences, and also at intergenic regions. Gene ontology analyses highlighted cellular processes relevant to CF, i.e. cell adhesion and inflammatory and immune response. Interestingly, 80 out of 638 differentially methylated genes were differentially expressed in publicly available NEC transcriptomic data. Six out of 9 selected DMS were validated and five out of six DMS were replicated in an independent set of patients. Additionally, 23 DMS, 10 of which were intergenic, correlated with FEV1% predicted. Our study has shown that DNA methylation is altered in blood and NEC of CF patients. Small DNA methylation changes were observed at known CF modifier genes; more dramatic DNA methylation changes were found at other genes that may impact lung function. Collectively, these epigenomic variations may lead to different degrees of lung disease severity in CF patients.

DNA methylation is necessary for learning, memory consolidation and has been implicated in a number of neuropsychiatric disorders. Obtaining high quality and comprehensive data for the three common forms of methylation in brain is challenging for methylome-wide association studies (MWAS). To address this we optimized a panel of enrichment methods for screening the brain methylome. Results show that these enrichment techniques approach the coverage and fidelity of the current gold standard bisulfite based techniques. Our MBD-based method can also be used with low amounts of genomic material from limited human biomaterials. Psychiatric disorders have high prevalence and are often chronic making them a leading contributor to disability. Major depressive disorder (MDD) has a lifetime prevalence of ~15% and high recurrence leading to substantial morbidity and costs to society. The underlying biological processes that contribute to MDD are poorly understood. Noting the importance of DNA methylation in neurobiology, we conducted the largest MWAS in human post-mortem brain uncover novel candidate genes and biomarkers associated with MDD. The top result of this MDD MWAS was within the gene ANKS1B. This gene has been implicated in many past genetic studies of psychiatric disorders and has experimental support as a regulator of neurotransmission. Targeted epigenetic editing technologies allow for precise modification of DNA methylation in living cells. However, an appropriate model system is critical to properly interpreting such experiments. An accelerated protocol for differentiating Ntera2 cells into human neurons was developed for this purpose. Ntera2-derived neurons express key neuronal markers and are well suited to use in epigenetic editing experiments. Concurrently, the generation of the reagents necessary for recapitulating the aberrant methylation at ANKS1B linked to MDD was undertaken. Using a modified CRISPR/Cas9 approach demethylating enzyme was directed to target sites to attempt perform editing of DNA methylation. Results indicate that significant but biologically irrelevant changes to methylation at ANSK1B were achieved. The novelty of the technology employed presented challenges to the success of the current work. However, the field of epigenetic editing is advancing rapidly and will remain an attractive method for functional characterization of future MWAS findings and basic neuroscience research.

L’origine de la variabilité phénotypique est un sujet très débattu depuis les théories de Lamarck et Darwin. Dans la vision contemporaine de l’évolution adaptative, il est communément admis que la seule source héritable de variabilité phénotypique soit d’origine génétique. Le phénotype est alors le produit du génotype sous l’influence de l’environnement. La mutation aléatoire des séquences d’ADN permet de générer de nouveaux variants phénotypiques qui sont alors soumis à la sélection naturelle. Traditionnellement, il est considéré que les caractères acquis par un individu durant sa vie, en réponse à l’environnement, ne sont pas héritables et ne jouent aucun rôle évolutif. Pourtant, il y a presque un siècle, un biologiste allemand du nom de Victor Jollos a mis en évidence que certains phénotypes peuvent être induits par des conditions environnementales particulières et persister durant quelques générations en l’absence du stimulus initial avant de disparaître progressivement. Il nomma ce phénomène Dauermodifikations, littéralement « modifications de longue durée ». Ses conclusions allaient à contre-courant des conceptions évolutives de son temps, et ont été considérées comme des artéfacts expérimentaux. Toutefois, nous sommes maintenant conscient qu’outre le code génétique, il existe également un autre mécanisme permettant une réponse héritable et pourtant flexible en réponse aux fluctuations environnementales : le code épigénétique. Au cours de cette thèse, j’ai essayé de mieux caractériser le rôle des mécanismes épigénétiques, plus précisément ceux impliques dans la structure chromatinienne, chez deux organismes présentant des Dauermodifikations : le corail tropical Pocillopora damicornis et le parasite humain Schistosoma mansoni. Les deux objectifs principaux de cette étude sont de déterminer (I) de quelle manière l’environnement influence la structure chromatinienne (ciblée ou aléatoire) et (II) dans quelle mesure ces changements sont-ils héritables (mitotiquement ou méïotiquement).Nos résultats ont permis de mieux caractériser les épigénomes des deux organismes étudiés. Nous avons décrit la structure chromatinienne de S. mansoni au travers de la distribution de six modifications d’histones, sur deux stades développementaux. Par ailleurs, nous avons montré chez S. mansoni trois types de changements de la structure chromatinienne : (I) ciblés en réponse à l’environnement, (II) associés au génotype et (III) aléatoires. Seuls les types II et III sont héritables d’un stade développemental du parasite à un autre. Nos travaux sur P. damicornis ont permis de remarquer une structure chromatinienne inhabituelle et d’offrir une première description d’un méthylome de corail. / The origin of phenotypic variability has been much debated since the establishment of Lamarck’s and Darwins theories of evolution. It is commonly accepted in the contemporary vision of adaptive evolution that the only source of heritable phenotypic variability is genetic. Here, phenotypes are the product of the genotypes under the influence of the environment. Random DNA mutations generate novel phenotypes, which are then subjected to natural selection. Traditionally, it is considered that acquired characters are not heritable and have no impact on evolution. Yet almost a century ago, a German biologist named Victor Jollos revealed that some phenotypes could be produced in particular environmental conditions and could persist for a few generations in the absence of the original stimulus, before disappearing gradually. He named this phenomenon Dauermodifikations, literally “long term changes”. His conclusions were going against evolutionary conceptions of his time, and were considered experimental artefacts. However, we are now aware that, in addition to the genetic code, there is also another heritable, and yet flexible, mechanism responding to environmental fluctuations: the epigenetic code. In this thesis, I attempted to characterize the role of epigenetic mechanisms, and more specifically modifications of the chromatin structure, in two organisms with Dauermodifikations: the tropical coral Pocillopora damicornis and the human parasite Schistosoma mansoni. The two main objectives of this study were (I) to determine how the environment influences the chromatin structure (in a targeted or random fashion) and (II) to what extent these changes are heritable (through mitosis or meiosis).My results provide a better knowledge of the epigenome of the two organisms we studied. We have described the chromatin structure of S. mansoni through the distribution of six histones modifications, in two developmental stages. Furthermore, we have shown three types of changes in chromatin structure of S. mansoni: (I) targeted in response to environmental changes, (II) genotype associated, and (III) random. Only types II and III are inherited to the next developmental stages of the parasite. Our work on P. damicornis delivers evidence for an unusual chromatin structure in this organism and to provide the first description of a coral methylome

Dans certains cancers, le ligand nétrine-1 (NTN1) est surexprimé, induisant alors une inhibition de l'apoptose induite par ses récepteurs à dépendance DCC et UNC5H, et promouvant ainsi la progression tumorale. Néanmoins, dans d'autres cancers, l'inhibition sélective de l'apoptose induite par cette voie de signalisation est liée à la perte d'expression de protéines pro apoptotiques effectrices. Dans cette étude, nous avons montré chez l'homme qu'une forte proportion de cancers mammaires et pulmonaires subit des pertes d'expression de DAPK1 et NTN1 liées à l'hyperméthylation de leur promoteur. DAPK1 est une protéine kinase notamment responsable de la transmission du signal proapoptotique des récepteurs à dépendance en absence de leur ligand nétrine-1. L'inhibition de la méthylation de l'ADN à l'aide d'épidrogues telles que la décitabine dans les cancers exprimant faiblement NTN1 restaure l'expression à la fois de DAPK1 et NTN1. Ainsi, la combinaison de traitements décitabine avec des stratégies induisant le silence transcriptionnel de NTN1, ou des anticorps bloquant l'interaction entre le ligand (NTN1) et son récepteur (UNC5B dans le cas présent), induit la potentialisation de la mort cellulaire des tumeurs, et bloque efficacement la croissance tumorale dans différents modèles animaux. Ainsi, combiner l'utilisation d'inhibiteurs de la méthylation de l'ADN avec des agents neutralisant la nétrine-1 pourrait représenter une stratégie pertinente pour combattre ces cancers / In a substantial part of human cancers, netrin-1 (NTN1) is up-regulated and this upregulation is inhibiting apoptosis induced by its so-called dependence receptors DCC and UNC5H and thus promotes tumor progression. However, in other cancers, the selective inhibition of this dependence receptor death pathway relies on the silencing of pro-apoptotic effector proteins. We show here that a large fraction of human breast and lung tumors exhibits simultaneous DNA methylation-dependent loss of expression of NTN1 and of DAPK1, a serine threonine kinase known to transduce the netrin-1 dependence receptor pro-apoptotic pathway. The inhibition of DNA methylation by drugs such as decitabine in netrin- 1-low cancer cells restores the expression of both NTN1 and DAPK1. Consequently, the combination of decitabine with NTN1 silencing strategies or with an anti-netrin-1 neutralizing antibody potentiates tumor cell death and efficiently blocks tumor growth in different animal models. Thus, combining DNA methylation inhibitors with netrin-1 neutralizing agents may be a valuable strategy for combating cancer

La méthylation de l'ADN est une des marques épigénétiques majeures qui intervient dans la régulation de processus physiologiques importants. Par ailleurs, elle a été reconnue comme une cible majeure pour lutter contre le cancer car son dysfonctionnement est impliqué dans le développement de pathologies comme les cancers. Une meilleure compréhension de ce mécanisme permettrait aux chimistes médicinaux de développer de nouveaux inhibiteurs plus spécifiques. Actuellement, un grand nombre d'hypothèse ont été avancées concernant la méthylation de l'ADN et méritent d'être confirmées ou clarifiées. Dans ce contexte, nous avons décidé de développer de nouveaux analogues nucléosidiques fluorescents et ratiométriques présentant un motif 3-hydroxychromones, afin d'étudier la dynamique et le mécanisme de méthylation de la cytosine impliquant UHRF1 et DNMT1. Nous avons tout d'abord décidé de nous focaliser sur la première étape du mécanisme, la reconnaissance du duplexe hémi-méthylé par le domaine SRA de UHRF1. Deux stratégies de marquage de l'ADN ont ainsi été explorées. La première a consisté à remplacer une base azotée naturelle par le fluorophore, afin de sonder l'intérieur du duplexe. Ce biocapteur a ainsi pu être utilisé afin de détecter l'approche du domaine SRA de UHRF1 ainsi que le basculement de la cytosine méthylée dans son site de reconnaissance. La deuxième approche repose sur la modification d'une nucléobase naturelle sur laquelle la sonde ratiométrique est attachée à l'aide d'un bras espaceur insaturé rigide, lui permettant ainsi de sonder les interactions au niveau du grand sillon de l'ADN. / DNA methylation is one the major epigenetic modification and plays an important role in the regulation of major processes. DNA methylation was recently recognized as one of the major target to inhibit and to fight cancer. A deeper insight of the DNA methylation mechanism should help medicinal chemists in the design and research of more specific inhibitors of DNA methylation. Currently, miscellaneous hypotheses are advanced about DNA methylation mechanism and deserve to be confirmed or clarified. In this context, we decided to develop new ratiometric fluorescent nucleoside analogs, incorporating 3-hydroxychromone moiety, to study the dynamics and mechanism of cytosine methylation involving UHRF1 and DNMT1. We firts decided to focus on the first step of the mechanism, the recognition of the hemi-methylated duplex by the SRA domain of UHRF1. Two diferent strategies of labeling DNA were explored. In the firts one, a natural nucleobase was substituted by the fluorescent dye in order to probe inside the duplex. This biosensor allows to detect and monitor the binding of the SRA domain and flipping of the 5-methylcytosine from the duplex into its recognizing site. The second approach is based on a modification of a natural nucleobase on which, through a rigid unsaturated linker, the ratiometric probe was incorporated in order to sense the interaction in the major groove.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie à transmission autosomale dominante causée par une répétition trinucléotidique CTG située dans la région 3’ non-traduite du gène dystrophia myotonica protein kinase (DMPK). La prévalence mondiale de la DM1 est de 8,26 personnes atteintes par 100 000 habitants : celle-ci est presque 20 fois plus importante au Saguenay-Lac-St-Jean en raison d’un effet fondateur. La présentation clinique de la DM1 peut comprendre divers symptômes dont de la faiblesse musculaire, de la myotonie, des cataractes, de l’insuffisance respiratoire, de l’arythmie cardiaque, de l’hypersomnolence et des troubles cognitifs et endocriniens. Par ailleurs, une grande variation dans la présence et la sévérité de ces symptômes est observée chez les patients et celle-ci n’est qu’en partie expliquée par la longueur des répétitions CTG. Plusieurs mécanismes pourraient expliquer la variabilité inexpliquée dont les défauts d’épissage, la mauvaise régulation des facteurs de transcription, la traduction non-ATG associée aux répétitions et les modifications épigénétiques, en particulier la méthylation de l’ADN. L’objectif de ce projet était donc d’évaluer l’impact de la méthylation de l’ADN au locus DMPK sur la variabilité phénotypique des patients atteints de DM1. Nous rapportons que la méthylation de l’ADN mesurée en amont et en aval de la répétition CTG est respectivement corrélée négativement et positivement avec la longueur de la répétition CTG. La présence d’une interruption de la répétition est associée à un niveau plus élevé de méthylation de l’ADN. À l’aide de modèles de régression linéaire multiple, nous démontrons que la méthylation de l’ADN contribue significativement et indépendamment de la longueur des répétitions CTG, à expliquer la variabilité́ de la force des dorsifléchisseurs de la cheville, de la force de préhension, de la force des pinces, de la capacité́ vitale forcée, du débit expiratoire de pointe, de la pression expiratoire et inspiratoire maximale. La méthylation de l’ADN explique une fraction de la variabilité phénotypique en DM1 et en association avec la longueur de la répétition CTG pourrait aider à améliorer la prédiction de la progression de la maladie chez ces patients. / Abstract : Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an autosomal dominant disorder caused by a CTG repeat extension in the 3’ untranslated region of the dystrophia myotonica protein kinase (DMPK) gene. Worldwide, the prevalence of DM1 is 8.26 affected persons per 100 000 persons, but it goes up to 158 affected persons per 100 000 in the Saguenay-Lac-St-Jean region of the province of Quebec (Canada) due to a founder effect. Clinical presentation includes muscular weakness, myotonia, cataracts, respiratory insufficiency, cardiac arrhythmia, hypersomnolence and endocrine and cognitive problems. There is a large variability in the presence and severity of these symptoms that is only partially explained by the CTG repeat length. Many mechanisms such as splicing defects, impaired regulation of transcription factors, repeat-associated non-ATG translation and epigenetic modifications, including DNA methylation, may explain this variability. The objective of this study was to assess the impacts of DNA methylation measured at the DMPK gene locus on phenotypic variability in DM1. We report that DNA methylation upstream of the repeat was negatively correlated with CTG repeat length whereas downstream DNA methylation was positively correlated. The presence of a variant repeat within the CTG repeat was associated with a higher level of DNA methylation. Linear multiple regression models support that DNA methylation contributes significantly and independently of the CTG repeat length to the variability of the ankle dorsiflexor, grip and pinch strengths, as well as forced vital capacity, peak expiratory flow and maximal inspiratory and expiratory pressures. DNA methylation could thus explain part of the phenotypic variability in DM1 and, together with CTG repeat length, could help improve the prediction of the progression of the disease.

La maintenance de la méthylation ADN sur les sites CG joue un rôle crucial dans le silencing des éléments transposables (TE) et l’expression correcte des gènes. Chez Arabidopsis thaliana, on observe, dans le mutant met1-3 déficient en méthylation CG, une apparition ectopique de méthylation CHG sur de nombreux gènes, ainsi qu’une relocalisation de la diméthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me2) de l’hétérochromatine vers l’euchromatine. Nous avons démontré que ceci est lié à un défaut de transcription au niveau du grand intron du gène codant la déméthylase H3K9me2 IBM1. Nous avons également constaté que dans les épihybrides F1 issus du croisement de plantes met1-3 avec une plante sauvage la méthylation CHG présente dans l’intron de l’allèle IBM1 hérité du parent mutant était perdue. Afin de définir si la perte de méthylation affecte également d’autres loci génomiques, et plus globalement à l’échelle du génome entier l’impact de la rencontre de deux épigénomes différents, nous avons analysé les profils de méthylation, de siRNAs et de transcription des épihybrides F1. Nos données révèlent que l’union de deux méthylomes distincts au sein d’un même génome provoque une restructuration considérable des profils épigénétiques et transcriptionnels. La méthylation CHG apparaissant sur de nombreux gènes dans met1 tend à persister, créant ainsi de nouveaux épiallèles pouvant être hérités. Du côté des TE, nombre d’entre eux sont déméthylés et réactivés, tandis que d’autres sont immédiatement reméthylés et resilencés. Ainsi, ces résultats contribuent à la compréhension de la stabilité de la méthylation ADN et de son rôle dans le contrôle différentiel des gènes et des TE. / Maintenance of DNA methylation at CG sites is crucial for silencing of transposable element (TE) and proper expression of genes. In Arabidopsis thaliana, met1-3 mutant, deficient in CG methylation, shows ectopic appearance of CHG methylation at numerous genes, as well as relocation of H3K9me2, from heterochromatin towards euchromatin. We have shown that this is due to a defect of the transcription of the large intron of the gene encoding the IBM1 H3K9me2 demethylase. We also found that, in the F1 epihybrids from the cross between met1 and WT plants, CHG methylation at the intron of the met1-derived IBM1 allele is lost. In order to define whether the loss of methylation at IBM1 also affects other genomic loci, and the impact of the union of two different epigenomes on methylation and transcription genome-wide, we analyzed the methylation, siRNA and transcription patterns of F1 epihybrids. Our data reveal that the union of two distinct methylomes within the same genome triggers considerable restructuring of epigenetic and transcriptional patterns. CHG methylation appearing in the mutant parent tends to persist in F1, creating new epialleles that can be inherited. On the TE side, lots of them are demethylated and reactivated while others are immediately remethylated and resilenced. Thus, our results provide new insights to the understanding of DNA methylation stability and its role in the differential control of genes and TEs.

Malgré le succès de l’Aide Médicale à la Procréation (AMP), des données récentes suggèrent un lien entre le recours à l’AMP et des pathologies liées à des erreurs épigénétiques. Afin d’évaluer l’impact des procédés in vitro de l’AMP sur la méthylation de l’ADN, nous avons analysé : 1) le profil de méthylation de 2 locus soumis à empreinte, H19DMR et KvDMR1, dans des ovocytes recueillis immatures, vitrifiés, puis mûris in vitro après réchauffement. Nous avons montré pour la première fois que le procédé vitrification/MIV pouvait constituer une alternative prometteuse pour préserver le potentiel procréatif des femmes avant un traitement anticancéreux, puisqu’il n’altérait pas l’empreinte parentale. 2) le profil de méthylation de H19DMR dans des embryons humains en retard de développement ainsi que dans les gamètes des géniteurs. Nous avons mis en évidence des anomalies de l’empreinte dans ces embryons, sans lien apparent avec les indications d’ICSI mais liées à des altérations survenues soit au cours de l’ovogenèse, soit au cours du développement précoce. 3) le profil de méthylation des promoteurs d’OCT4 et NANOG, gènes essentiels à l’expression de la pluripotence, dans des embryons bloqués après culture prolongée. Nous avons montré que le promoteur d’OCT4 était significativement hyperméthylé dans les embryons bloqués, en particulier dans la population de couples présentant uniquement une infertilité masculine, alors que le promoteur de NANOG était hypométhylé / Despite the success of Assisted Reproductive Technologies (ART), recent data suggest a link between the use of ART and diseases related to epigenetic errors. To evaluate the impact of ART on DNA methylation, we analyzed: 1) the methylation profile of 2 imprinted loci, H19DMR and KvDMR1, in immature oocytes which were vitrified and matured in vitro after warming. We have shown for the first time that vitrification/IVM process did not alter the imprinting. Then, this new technology could be a promising alternative to preserve the procreative potential of women before cancer treatment. 2) the methylation profile of H19DMR in human embryos with developmental anomalies and in the gametes of the parents. We have shown that imprinting errors in these embryos have no apparent link with ICSI indications, but were related to alterations in H19DMR occurring either during oogenesis or early development. 3) the methylation profile of the promoters of OCT4 and NANOG, essential genes for the expression of pluripotency in arrested embryos after prolonged culture. We have shown that the promoter of OCT4 was highly methylated in arrested embryos particularly in the population of couples with male infertility only, whereas the NANOG promoter was hypomethylated