L'encéphalomyélite myalgique (EM), communément appelée syndrome de fatigue chronique (SFC), est une maladie chronique complexe, impliquant divers facteurs biochimiques, métaboliques, génétiques et épigénétiques dans sa pathogenèse. L'EM se caractérise par une fatigue persistante et débilitante, un malaise post-effort (PEM), des douleurs, des troubles du sommeil, des troubles cognitifs et d'autres symptômes. L'EM constitue un problème de santé important, compte tenu de sa prévalence dans la population générale. Cependant, notre compréhension des origines de l’EM reste limitée; son diagnostic est difficile et il n’existe aucun traitement curatif définitif ni de biomarqueur officiellement approuvé. Les approches de prise en charge actuelles visent principalement à soulager les symptômes, soulignant le besoin urgent de mieux comprendre ses causes sous-jacentes. Le développement de l’EM est reconnu comme une confluence de prédispositions génétiques et d’expositions environnementales, compte tenu de l’hétérogénéité clinique de cette pathologie. Ces dernières années, de nombreuses voies étiologiques ont été suggérées, notamment un développement post-infectieux de l’EM, qui reste l’une des principales hypothèses. L'implication de mécanismes épigénétiques, principalement la méthylation de l'ADN, un régulateur bien documenté de l'expression des gènes, est également apparu comme un acteur essentiel dans la pathogenèse de l'EM. Il est intéressant de noter, et avec une note d’inquiétude, que près de deux ans après la pandémie de SRAS-CoV-2 à l’origine du COVID-19, une cohorte croissante d’individus auparavant en bonne santé souffre du Long COVID (LC), une manifestation de symptômes persistants provenant de l’infection initiale. Il est remarquable de constater qu’il existe un chevauchement évident entre les présentations cliniques de l’EM et de la LC. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ce chevauchement restent encore à élucider. Dans le cadre de cette thèse, je me suis intéressée dans un premier temps à identifier les changements épigénétiques associés à l'EM à partir de la salive. Le choix d’utiliser la salive représente une approche non-invasive et découle également du fait que des études précédentes ont mis en évidence que les profils de méthylation de l’ADN obtenu des cellules buccales présentes dans la salive étaient assez similaires aux profiles observés au niveau du cerveau et des muscles (des tissus difficilement accessibles mais pourtant atteints dans l’EM) comparativement aux cellules mononuclées du sang périphériques (PBMCs). Cette approche pourrait aider à établir une signature épigénétique susceptible de combler le fossé conceptuel entre la génétique et l'influence environnementale dans la pathogenèse de l'EM. En effet, les sites CpG/gènes identifiés avec une méthylation différentielle pourraient être impliqués dans des mécanismes physiopathologiques associés au développement et/ou à la gravité de l'EM. Après correction de Bonferroni, mes travaux ont révélé un seul site CpG, "cg19803194", différentiellement méthylé chez les patients atteints d'EM par rapport aux sujets sains appariés pour l’âge. Ce site CpG est situé dans le corps du gène PTPRN2 codant pour la tyrosine phosphatase receptor type N2. De plus, le gène PTPRN2 contient un microARN intronique, le miR-153-3p (miR-153-2), qui est corégulé avec son gène hôte. En raison des défis éthiques et logistiques liés à l'accès aux tissus cérébraux ou musculaires, nous avons mesuré les niveaux circulants en miR-153-3p dans le plasma comme mesure de substitution pour évaluer les fluctuations de l'expression de PTPRN2. Nous avons donc analysé ce miARN comme un proxy prometteur pour mieux comprendre la dynamique d’expression de PTPRN2. Notre stratification des patients atteints d'EM basée sur les niveaux de méthylation de l'ADN cg19803194 (hypo vs hyper) a révélé qu'une réduction des niveaux circulants du miR-153-3p a été observée dans le groupe hypo-méthylé, ce qui concorde avec de précédentes études montrant que l'hypométhylation au niveau du corps des gènes, entraine habituellement une diminution de leur transcription. Cependant, l’intrigue a été amplifiée par un schéma contre-intuitif observé chez un sous-ensemble de patients. Cette découverte inattendue, nous a incité à découvrir un mécanisme alternatif régissant la régulation des niveaux de miR-153-3p en circulation, qui implique de manière complexe une interaction dynamique des niveaux nucléaires de PHB2 (Prohibitine 2) dans le contrôle de la maturation de certains miARN dont le miR-153-3p. La LC est un trouble complexe avec des symptômes prolongés et hétérogènes qui s’apparentent avec l’EM. Dans le cadre de ma seconde étude, nous avons utilisé une manoeuvre de provocation standardisée pour induire un malaise post-effort (PEM), ce qui nous a permis de stratifier les patients LC en deux groupes : LC1 (sévère) et LC2 (léger à modéré) en fonction de la gravité du PEM. Les patients LC1 présentaient des scores de gravité de la maladie significativement plus élevés et des scores neurocognitifs plus mauvais que les patients classés dans le groupe LC2. Ceci était étroitement lié aux scores PEM élevés chez les patients LC1 et aux scores PEM réduits chez les patients LC2. Nous avons également utilisé le profilage de la méthylation de l'ADN des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) pour étudier les changements dans la méthylation de l'ADN associés aux symptômes de la LC (n = 24) par rapport aux participants ayant eu la COVID-19, suivie d’une rémission complète (SC pour Short COVID en anglais) (n = 4). Il est intéressant de noter que nous avons identifié des altérations de plusieurs gènes impliqués dans le dysfonctionnement neurocognitif et le changement de la réponse immunitaire liés à la persistance des symptômes de la LC. En outre, dans le cadre de ma troisième étude, nous avons effectué une analyse complète de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome, à partir d'échantillons de salive provenant du même groupe de patients LC (n=24) LC, de 4 participants SC et de 13 témoins sains (HC) pré-pandémiques. Nous avons étudié les signatures épigénétiques associées à la LC. Nous avons constaté que les patients LC présentaient une hypométhylation significative de trois gènes communs, MEST, DDR1 et LRP1, par rapport aux participants SC et HC. Ces gènes sont impliqués dans la cascade de l’inflammation, l’altération de la réponse immunitaire et des maladies neurologiques. Nous avons également signalé des altérations de la méthylation de LGR6, ZFAND2A et TDG dans les PBMCs et la salive chez les mêmes individus associés à la sévérité de la LC. Plus précisément, nous avons constaté une hypométhylation au niveau des gènes LGR6 et ZFAND2A et une hyperméthylation au niveau du gène TDG dans les cas graves (groupe LC1) par rapport aux cas légers à modérés (groupe LC2). Cette convergence de profils entre la salive et les PBMCs souligne l'importance de LGR6, ZFAND2A et TDG dans la gravité des LC. L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre de cette thèse apporte un éclairage nouveau et pertinent sur les mécanismes épigénétiques qui sous-tendent l’EM et la COVID longue. Les nouvelles connaissances présentées dans les trois manuscrits ci-joints devraient nous permettre de mieux comprendre l’EM et la COVID longue, de développer de futures stratégies diagnostiques, thérapeutiques et préventives, mais également de mieux gérer les effets à long terme de ces conditions. En effet, les altération épigénétiques identifiées dans ces deux contextes pathologiques, plus précisément au niveau de la méthylation de l’ADN, pourraient être impliquées dans la sévérité et la persistance des symptômes de ces pathologies complexes, distinctes et présentant tout de même des similitudes. / Myalgic encephalomyelitis (ME), also known as chronic fatigue syndrome (CFS), is a complex chronic disease involving various biochemical, metabolic, genetic, and epigenetic factors. Patients with ME experience persistent and debilitating fatigue, post-exertional malaise (PEM), pain, sleep disturbances, cognitive impairment, and other symptoms. ME is a significant health problem, with an estimated prevalence of 0.2% to 0.5% in the general population. However, our understanding of the origins of ME remains limited; its diagnosis is complex, and there is no definitive cure or officially approved biomarker. Current management approaches focus primarily on relieving symptoms, highlighting the urgent need to understand its underlying causes better. The development of ME is thought to be a confluence of genetic predispositions and environmental exposures. In recent years, many etiological pathways have been suggested, including a post-infectious development of ME, which remains one of the main hypotheses. The involvement of epigenetic mechanisms, primarily DNA methylation, a well-documented regulator of gene expression, has also emerged as a critical player in the pathogenesis of ME. Interestingly, and with a note of concern, nearly two years after the SARS-CoV-2 pandemic that caused COVID-19, a growing cohort of previously healthy individuals suffer from Long COVID (LC), a manifestation of persistent symptoms from the initial infection. Remarkably, there is a clear overlap between the clinical presentations of ME and LC. However, the mechanisms underlying this overlap remain to be elucidated. This thesis investigated the epigenetic mechanisms underlying ME and LC. As part of this thesis, I was initially interested in identifying the epigenetic changes associated with ME from saliva. Saliva is a non-invasive sample that can be easily collected, and previous studies have shown that the DNA methylation profiles obtained from buccal cells present in saliva are similar to those observed in the brain and muscles. This suggests that saliva could be used as a proxy for these tissues, which are difficult to access but are thought to be involved in the pathogenesis of ME. I used Bonferroni's correction to identify a single CpG site, "cg19803194", differentially methylated in ME patients compared to age-matched healthy subjects. This CpG site is located in the body of the PTPRN2 gene, which encodes the tyrosine phosphatase receptor type N2. The PTPRN2 gene also contains an intronic microRNA, miR-153-3p (miR-153-2), which is co-regulated with its host gene. Due to ethical and logistical challenges, I measured circulating levels of miR-153-3p in plasma as a surrogate measure to assess fluctuations in PTPRN2 expression. This miRNA is a promising proxy for understanding the expression dynamics of PTPRN2 because it is located in the same gene and is co-regulated with it. My stratification of ME patients based on cg19803194 DNA methylation levels (hypo vs hyper) revealed that a reduction in circulating levels of miR-153-3p was observed in the hypo-methylated group. These findings agree with previous studies showing that hypomethylation in the body of genes usually decreases their transcription. However, a counterintuitive pattern was observed in a subset of patients. This unexpected finding prompted me to discover an alternative mechanism governing the regulation of circulating miR-153-3p levels. This mechanism involves a dynamic interaction of nuclear PHB2 (Prohibitin 2) levels in controlling the maturation of certain miRNAs, including miR-153-3p. LC is a complex disorder with prolonged and heterogeneous symptoms that resemble myalgic encephalomyelitis (ME). In my second study, we used a standardized provocative maneuver to induce post-exertional sickness (PEM), which allowed us to stratify LC patients into two groups: LC1 (severe) and LC2 (mild to moderate), depending on the severity of the PEM. LC1 patients had significantly higher disease severity scores and worse neurocognitive scores than patients classified in the LC2 group. This was closely related to high PEM scores in LC1 patients and reduced PEM scores in LC2 patients. We also used peripheral blood mononuclear cell (PBMC) DNA methylation profiling to investigate changes in DNA methylation associated with LC symptoms (n=24) compared to participants who had COVID followed by complete remission Short COVID (SC) (n = 4). Interestingly, we identified alterations in several genes implicated in neurocognitive dysfunction and changes in immune response related to the persistence of LC symptoms. In my third study, we also performed a comprehensive genome-wide DNA methylation analysis of saliva samples from the same group of LC patients (n=24), 4 SC participants, and 13 pre-pandemic healthy controls (HC). We studied the epigenetic signatures associated with LC. We found that LC patients showed significant hypomethylation of three common genes, MEST, DDR1, and LRP1, compared to SC and HC participants. These genes are involved in the cascade of inflammation, impaired immune response, and neurological disease. We also reported LGR6, ZFAND2A, and TDG methylation alterations in PBMCs and saliva in the same individuals associated with CL severity. Specifically, we found hypomethylation at the LGR6 and ZFAND2A genes and hypermethylation at the TDG gene in severe cases (LC1 group) compared to mild to moderate cases (LC2 group). This convergence of profiles between saliva and PBMCs highlights the importance of LGR6, ZFAND2A, and TDG in the severity of CL. All the results obtained in this thesis shed new and relevant light on the epigenetic mechanisms underlying ME and LC. The new knowledge in the three attached manuscripts allowed us to understand ME and LC better, develop future diagnostic, therapeutic, and preventive strategies, and better manage these conditions' long-term effects. Epigenetic alterations, more precisely at the level of DNA methylation, have been identified in both ME and long-term COVID. These alterations could be involved in the severity and persistence of the symptoms of these complex pathologies, which are distinct but share some similarities. The findings of this thesis suggest that epigenetics could be a promising target for developing new treatments for ME and long-term COVID. Further research is needed to confirm these findings and to develop effective therapeutic interventions.

<p>DNA methylation is an epigenetic modification that is nearly ubiquitous. Eukaryotic DNA methylation contributes to the regulation of gene expression and maintaining genome integrity. In mammals, DNA methylation occurs primarily on the C5 carbon of cytosine in a CpG dinucleotide context and is catalyzed by the DNA methyltransferases, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. While <i>dnmt3a</i> and <i>dnmt3b</i> genes are highly homologous, the enzymes have distinct functions. Some previous reports suggested differences in the enzymatic behavior of DNMT3A and 3B, which could affect their biological roles. The goal of my thesis work was to characterize kinetics mechanisms of DNMT3A and 3B, and to identify the similarities and differences in their catalytic properties that contribute to their distinct biological functions. Given the sequence similarity between the enzymes, we asked whether DNMT3B was kinetically similar to DNMT3A. In a series of experiments designed to distinguish between various kinetics mechanisms, we reported that unlike DNMT3A, DNMT3B methylated tandem CpG on DNA in a processive manner. We also reported that the disruption of the R-D interface, critical for the cooperativity of DNMT3A, had no effect on DNMT3B activity, supporting the non-cooperative mechanism of this enzyme. </p> <p>DNMT3A is frequently mutated in numerous cancers. Acute Myeloid Leukemia (AML) is a malignancy of hematopoietic stem cells in which numerous patients exhibit a high frequency of the heterozygous somatic mutation Arg882His in DNMT3A. Through thorough consensus motif building, we discovered a strong similarity in CpG flanking sequence preference between DNMT3A Arg882His variant and DNMT3B enzyme. Moreover, we found that the variant enzyme has the same kinetics mechanism as DNMT3B, indicating a gain-of-function effect caused by the mutation. This change is significant because the variant enzyme can aberrantly methylate DNMT3B targets in AML cells and effect global gene expression. In particular, given that DNMT3B has been shown to have oncogenic properties, this suggests that the Arg882His variant can acquire similar oncogenic properties and drive AML development.</p> <p>Taken together, my thesis work provides novel insights into the relationship between the biochemical properties and the biological functions of DNMT3A and 3B. </p>

La méthylation de l'ADN est une marque épigénétique importante chez les mammifères. Malgré le fait que la méthylation de la cytosine en 5' (5mC) soit reconnue comme une modification épigénétique stable, il devient de plus en plus reconnu qu'elle soit un processus plus dynamique impliquant des voies de méthylation et de déméthylation actives. La dynamique de la méthylation de l'ADN est désormais bien caractérisée dans le développement et dans le fonctionnement cellulaire des mammifères. Très peu est cependant connu concernant les implications régulatrices dans les réponses immunitaires. Pour se faire, nous avons effectué des analyses du niveau de transcription des gènes ainsi que du profilage épigénétique de cellules dendritiques (DCs) humaines. Ceux-ci ont été faits avant et après infection par le pathogène Mycobacterium tuberculosis (MTB). Nos résultats fournissent le premier portrait génomique du remodelage épigénétique survenant dans les DCs en réponse à une infection bactérienne. Nous avons constaté que les changements dans la méthylation de l'ADN sont omniprésents, identifiant 3,926 régions différentiellement méthylées lors des infections par MTB (MTB-RDMs). Les MTB-RDMs montrent un chevauchement frappant avec les régions génomiques marquées par les histones associées avec des régions amplificatrices. De plus, nos analyses ont révélées que les MTB-RDMs sont activement liées par des facteurs de transcription associés à l'immunité avant même d'être infecté par MTB, suggérant ces domaines comme étant des éléments d'activation dans un état de dormance. Nos données suggèrent que les changements actifs dans la méthylation jouent un rôle essentiel pour contrôler la réponse cellulaire des DCs à l'infection bactérienne. / DNA methylation is an important epigenetic mark in mammals. Although methylation at the 5’ position of cytosine (5mC) is recognized as a stable epigenetic modification, it is becoming increasingly viewed as a more dynamic process that involves both active methylation and demethylation pathways. While the dynamics of DNA methylation has been well characterized in mammalian development and normal cellular function, little is known about its regulatory implications in immune responses. To that end, we performed comprehensive transcriptional and epigenetic profiling of primary dendritic cell (DC) samples from humans, before and after infection with Mycobacterium tuberculosis (MTB). Our results provide the first complete genomic portrait of the extensive epigenetic remodeling occurring in primary DCs in response to a bacterial infection. We found that active changes in DNA methylation are pervasive, identifying 3,926 MTB-induced differentially methylated regions (MTB-DMRs). MTB-DMRs show a striking overlap with genomic regions marked by histones associated with enhancer activity. ATAC-seq footprinting analysis revealed that regions that change methylation were actively bound by immune-related TFs prior to MTB-infection suggesting that these domains are likely to represent enhancer elements in a poised state. Our data suggests that active changes in DNA methylation play an essential and previously unappreciated role at controlling of the regulatory programs engaged by DCs in response to a bacterial infection.

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. / Following exposure to risk factors including malnutrition, dyslipidemia, physical inactivity and metabolic disorders, cardiovascular diseases (CVD) are characterized by a pro-oxidative and pro-inflammatory state, and a dysregulation in the expression of various factors responsible for the redox and inflammatory environment homeostasis. The implication of antioxidant enzymes, such as superoxide dismutases (SOD) and glutathione peroxidases (Gpx), as well as the contribution of pro-inflammatory mediators such as angiopoietin-like 2 (Angptl2) are well characterized in the context of CVD. However, little is known about the molecular mechanisms sensitive to environmental cues leading to the development of CVD. Epigenetics are mechanisms regulating gene expression that are sensitive to extracellular stimuli and could therefore contribute to the pathogenesis of CVD. DNA methylation is an epigenetic mechanism that can vary both at gene and genomic levels; the consequence of these epigenetic changes on the expression of targeted genes is dependent on the methylation site. Since it has been reported that DNA methylation variations can be associated with diverse pathological conditions including CVD, the goal of our work was to study the link between the methylation of antioxidant and pro-inflammatory genes, and their consequences on biological functions in the context of risk factors associated with CVD, such as aging, dyslipidemia and physical inactivity. In the first study, we observed that in the femoral artery of aging mice, the methylation at the promoter of the Sod2 gene, which codes for the antioxidant enzyme superoxide dismutase, type 2 (SOD2 or MnSOD), decreases with age. This suggests an induction of MnSOD expression and thus a strengthening of the endogenous antioxidant defense. Since aging is associated with an accumulation of free radicals, we studied the endothelium-dependant vasodilation, known to be sensitive to oxidative stress. We observed that, overall, vasodilatory capacity was preserved in aging mice, due to a concomitant decrease in endothelium-derived hyperpolarizing factors (EDHF) and an increased contribution of the nitric oxide (NO) pathway. We then used two in vivo oxidative stress-reducing approaches, namely the supplementation with the antioxidant catechin and chronic exposure to voluntary physical exercise. These interventions prevented the changes in endothelial function and the Sod2 hypomethylation-dependent induction of MnSOD expression. Hence, this first study demonstrates the sensitivity of DNA methylation to the redox environment. In the second study, we demonstrated that the antioxidant enzyme glutathione peroxidase 1 (Gpx1) expression was regulated through the methylation of its coding gene, Gpx1, in the context of severe dyslipidemia. Our results show that in the skeletal muscle of severely dyslipidemic transgenic mice (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 is hypermethylated, which in turn decreased Gpx1 expression and weakened the endogenous antioxidant defense. In these mice, chronic physical exercise managed to increase Gpx1 expression, an effect linked with a transient gene hypomethylation. This study demonstrates that oxidative stress associated with severe dyslipidemia alters antioxidant defense mechanisms, partially through an epigenetic mechanism. Moreover, we also observed that physical exercise can revert these changes and can induce epigenetic changes, at least transiently. The goal of the third project was to study Angptl2 regulation, a circulating pro-inflammatory protein, in the context of CVD. We observed that, in coronary patients, circulating Angptl2 concentration is significantly increased in conjunction with hypomethylation of its gene, ANGPTL2, measured in circulating leukocytes. We are the first to show that in response to the pro-inflammatory environment associated with a CVD, Angptl2 expression is stimulated by an epigenetic mechanism. In conclusion, our studies allowed the identification of novel regulatory differentially methylated regions located in genes involved in antioxidant defense, namely Sod2, in the context of aging, and Gpx1 in the context of dyslipidemia and exercise. We also revealed, for the first time, an Angptl2 regulating mechanism dependent on ANGPTL2 methylation in a context of CVD. These observations illustrate the dynamic nature of epigenetic regulation through DNA methylation in response to environmental cues. Our studies therefore contribute to the understanding and identification of molecular mechanisms involved in the development of pathological phenotypes following exposure to risk factors, which opens the way to novel therapeutic strategies.

Leukemia is the most common malignant disease in children patients. In our laboratory (CLIP) a novel subtype of B-cell precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (BCP-ALL) with lineage switch during early phase of treatment towards myeloid lineage (swALL) was recently documented. SwALL incidence is almost 4 % of all BCP-ALLs (Slámová et al., 2014). DNA methylation (presence of 5-methylcytosine) is together with post-translational histone modifications and non- coding RNAs an epigenetic mechanism which regulates gene expression without changes of genetic code. DNA methylation is easily detected by bisulphite conversion and subsequent sequencing. The aim of this work was to compare genome-wide DNA methylation patterns between patients with swALL and control BCP-ALLs. The first step in achieving that was revision and improvement of bioinformatic processing protocol for eRRBS data from massive parallel sequencing. To improve the sequence adapter trimming I tested four bioinformatic tools - FAR, cutadapt, Trimmomatic and fastx_clipper. I implemented the fastest and most effective - Trimmomatic into the processing protocol. As a next step I analysed the data with improved protocol and extended the analysis in R programming environment where the comparison of studied groups was performed. The comparison of...

Au vu de l’impact croissant du changement climatique global et en particulier de la sécheresse sur les forêts, il est nécessaire de comprendre les mécanismes de réponse des arbres face à des variations de disponibilité en eau. Ces dernières années, des études ont montré un contrôle épigénétique et notamment par la méthylation de l’ADN de la plasticité phénotypique des plantes en réponse aux variations environnementales. Dans ce contexte, cette thèse visait à évaluer le rôle de la méthylation de l’ADN des cellules du méristème apical caulinaire dans la plasticité développementale de la tige feuillée en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier, un arbre modèle. A cette fin, le méthylome de la chromatine non condensée dans le méristème apical caulinaire de Populus trichocarpa a été caractérisé. Ensuite, l’impact de variations de disponibilité en eau sur la méthylation de l’ADN a été étudié dans l’apex caulinaire de différents hybrides (P. × euramericana). Les loci et les réseaux de gènes affectés pour leur expression et leur méthylation ont ainsi été identifiés. Ces travaux ont montré que dans le méristème apical caulinaire, la majorité des gènes étaient dans un état non condensé de la chromatine et méthylés dans leur corps. Ils ont également mis en évidence une forte variation de la méthylation globale de l’ADN selon les génotypes et en réponse à des variations de disponibilité en eau. De plus, des corrélations ont été établies entre les niveaux de croissance des arbres et de méthylation globale de l’ADN dans l’apex caulinaire. Enfin, les variations de la méthylation de l’ADN en réponse aux variations de la disponibilité en eau s’accompagnent de variations d’expression et ont ciblé particulièrement des gènes impliqués dans la signalisation par les phytohormones ou la morphogenèse. Ainsi, les travaux effectués lors de cette thèse suggèrent un rôle de la méthylation de l’ADN dans la plasticité phénotypique en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier via le contrôle de l’expression de réseaux de gènes dans le méristème apical caulinaire. / Predicted climate changes and particularly drought represent a major threat to forest health. Therefore, understanding mechanisms that control trees response to variations in water availability is of great interest. These last years, epigenetic marks such as DNA methylation have been involved in plant phenotypic plasticity in response to environmental stresses. In this context, this work aimed at assessing the role of shoot apical meristem cells DNA methylation in the shoot developmental plasticity towards variations in water availability in poplar, a model tree. For this purpose, the methylome of non condensed chromatin in Populus trichocarpa shoot apical meristem was characterized. Then, the impact of variations in water availability on shoot apex DNA methylation in different hybrids (P. × euramericana) was studied. Loci and gene networks affected by DNA methylation and expression changes were thus identified. This work showed that in shoot apical meristem, most of the genes was in non condensed chromatin state with DNA methylation in their body. A strong variation in DNA methylation depending on genotypes and water availability was highlighted. Moreover, correlations between trees growth and shoot apex DNA methylation levels were established. Lastly, DNA methylation changes in response to variations in water availability correlated to expression variations were identified for genomic loci and gene networks. Thus, the work performed during this thesis suggests a role for DNA methylation in poplar phenotypic plasticity in response to variations in water availability through the control of gene networks transcription in the shoot apical meristem.

Cette thèse a pour l’objet l’étude des pressions de sélection qui s’appliquent sur les îlots CpG, courtes séquences génomiques qui échappent à la méthylation chez les mammifères. Nous avons tout d’abord étudié les caractéristiques génomiques des îlots CpG, notamment leurs liens avec l’initiation de transcription des gènes et les origines de réplication de l’ADN, en utilisant des jeux de données récemment publiés. Nous avons ensuite déterminé si les caractéristiques de séquence des îlots CpG (richesse en dinucléotides CpG et richesse en GC) étaient sous pression de sélection et pouvaient jouer un rôle dans les fonctions des îlots CpG. Nous avons montré que la richesse relative en dinucléotides CpG des îlots CpG résulte uniquement de la faible méthylation de ces séquences. De plus, la richesse en bases GC des îlots CpG n’est pas soumise à pression de sélection mais semble résulter d’un mécanisme neutre, la conversion génique biaisée vers GC. Nous discutons également du devenir des îlots CpG chez les primates, qui et avons montré que si le taux de GC de ces séquences est en train de diminuer, la richesse relative en CpG quant à elle reste stable / This thesis analyses selective pressures applying on CpG islands, short sequences which escape methylation in mammalian genomes. We first studied genomic characteristics of CpG islands. We namely studied their relationships with gene transcription start, and with DNA replication origins, using recently published data. We then determined wether base peculiar composition of CpG islands (high number of CpG dinucleotides, high GC content) may be under (negative or positive) selective pressures, and thus play a role in their function, or not. We showed that the relative CpG-richness of CpG islands is the mere consequence of the low methylation of these genomic regions. Moreover, we showed that the high GC content of CpG islands is not under selective pressures, and seem to result from a neutral mechanism, biased gene conversion toward GC. We also discussed the future of CpG islands and primates. We showed that the GC content of CpG islands is decreasing, while the relative CpG content remains constant

La méthylation de l’ADN et les modifications post-traductionnelles des histones sont desmodifications épigénétiques qui interviennent dans la régulation des éléments transposables(ET) chez de nombreuses espèces. La proportion des ET dans les génomes varie selon lesespèces considérées et pose la question des mécanismes de régulation de ces ET. Au sein del’espèce Drosophila simulans, les populations naturelles présentent un polymorphisme uniquedans le nombre de copies des ET, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier cettequestion. L’étude de la méthylation d’ADN et des modifications post-traductionnelles deshistones associées au rétrotransposon à LTR tirant dans la lignée germinale des populationsnaturelles a permis de montrer l’influence d’une copie d’ET sur la structure de la chromatineau site d’insertion. Dans un second volet, nous avons cherché à caractériser la méthylation del’ADN chez la drosophile, chez laquelle la fonction est encore mal connue. Nous avons, pardes approches spécifiques et globales, mesuré l’abondance de cette marque épigénétique chezla drosophile. Nous concluons que les taux de méthylation de l’ADN sont très faibles maisvariables entre espèces. Notre travail n’a pas permis de mettre en évidence un rôle de laméthylation de l’ADN dans le contrôle des ET, toutefois, nous ne pouvons pas exclure cesystème de régulation. / Epigenetic modifications such as DNA methylation and post-translational histonemodifications are involved in transposable elements (TE) silencing in many species. Theirrelative abundance in genomes ask the question of differences in regulation mecanismbetween species. Within the Drosophila simulans species, natural populations exibits a uniquepolymorphism in TE copy number, providing a powerfull tool for the analysis of TEregulation in population from the same specie. We analyzed DNA methylation and posttranslationalhistone modifications associated with the LTR retrotransposon tirant in thegermline of natural populations and report the influence of this element on chromatinestructure. DNA methylation is a wide-conserved epigenetic modification involved in generegulation and TE silencing but its function in drosophila remains missunderstood. Usingdifferent methods, we determined the abundance of methylated cytosines in drosophila, andshowed that methylation level are low and variable between species. Our results show lowevidence for a TE regulation system involving DNA methylation but this cannot be so farexcluded.

A esquizofrenia é uma desordem altamente incapacitante que atinge cerca de 1% da população, envolvendo desequilíbrio da neurotransmissão dopaminérgica e uma hipofunção glutamatérgica. Portadores dessa doença apresentam deficiência do processamento de informações caracterizada por prejuízo no teste de inibição pré-pulso (prepulse inhibition - PPI). Essa condição pode ser reproduzida em modelos experimentais, pelo tratamento com psicoestimulantes, como a anfetamina (ANF) e atenuado/revertido pelo tratamento com antipsicóticos. O canabidiol (CBD) é o principal componente não psicotomimético da Cannabis sativa. Estudos clínicos e pré-clínicos sugerem que o CBD apresenta perfil antipsicótico, com baixa indução de efeitos adversos. Contudo, até o momento poucos estudos foram realizados com o objetivo de investigar os mecanismos farmacológicos e/ou moleculares envolvidos nesse perfil. Os prováveis mecanismos envolvidos com as propriedades antipsicóticas do CBD parecem envolver a ativação de receptores TRPV1 e o aumento da sinalização do endocanabinoide anandamida. No presente estudo, demonstramos que os receptores TRPV1 e o aumento da disponibilidade de anandamida parecem participar do perfil antipsicótico do CBD. Nessas investigações, não observamos participação dos receptores 5-HT1A. A microinjeção de CBD no córtex pré-frontal (CPF), estrutura envolvida com a fisiopatologia da esquizofrenia e um provável sítio para ação de antipsicóticos, não atenuou o prejuízo induzido por ANF no PPI. Recentemente, mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA, têm sido associados à fisiopatologia da esquizofrenia. Nesse sentido, avaliamos o envolvimento da metilação do DNA em estruturas envolvidas com a neurobiologia da esquizofrenia regulada por CBD, sobre as respostas comportamentais induzidas por drogas psicotomiméticas. Verificamos que a ANF causa um aumento da metilação global no estriado ventral, efeito bloqueado pelo pré-tratamento com CBD e de forma semelhante com o antipsicótico clozapina (CLZ). Não observamos alterações na metilação global no CPF. O tratamento com MK-801 não alterou a metilação global nas duas estruturas anteriormente citadas. Protocolo experimental semelhante foi utilizado em mais duas abordagens: (i) a expressão do fator neurotrófico do cérebro (BDNF), relacionado com a manutenção, crescimento e diferenciação dos neurônios está aumentada no hipocampo dos animais tratados com a associação CBD e ANF, padrão semelhante foi observado com a associação CLZ e ANF. (ii) a expressão de fosfo-histona acetilada, um marcador que indica alterações na cromatina, intimamente ligada com as alterações da expressão gênica está aumentada no núcleo acumbens e CPF dos animais tratados com a associação CBD e ANF. Os dados aqui apresentados sugerem que os receptores TRPV1 e o endocanabinoide anandamida parecem estar envolvidos com o perfil antipsicótico do CBD. Pela primeira vez foi demonstrado que tanto o pré-tratamento com CBD ou CLZ podem alterar o aumento da metilação global de DNA induzido por ANF. Além disso, a expressão de BDNF no hipocampo e a expressão de fosfo-histona acetilada podem ser outros mecanismos que merecem atenção em relação ao perfil antipsicótico do CBD. / Schizophrenia is a highly disabling disorder that affects about 1% of the population and involves impaired dopaminergic neurotransmission and glutamatergic hypofunction. Patients with this disorder have a deficiency in information processing characterized by disruption in the prepulse inhibition (PPI) test. This condition can be reproduced in experimental models by treatment with psychostimulants such as amphetamine and attenuated / reversed by treatment with antipsychotics. Cannabidiol (CBD) is the main non-psychotomimetic component of Cannabis sativa. Clinical and preclinical studies suggest that CBD has an antipsychotic profile, with low induction of adverse effects. However, to date, few studies have been carried out to investigate the pharmacological and / or molecular mechanisms involved in this outcome. The likely mechanisms involved with the antipsychotic properties of CBD appear to involve activation of TRPV1 receptors and increased endocannabinoid anandamide signaling. In the present study, we demonstrated that TRPV1 receptors and the increased availability of anandamide appear to participate in the CBD antipsychotic profile. In these investigations, we did not observe participation of 5-HT1A receptors. Microinjection of CBD in the prefrontal cortex, structure involved in the pathophysiology of schizophrenia and a probable site of antipsychotic action, did not attenuate the amphetamine-induced disruption in PPI. Recently, epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, have been associated with the pathophysiology of schizophrenia. In this sense, we also evaluated the involvement of DNA methylation in structures involved with the neurobiology of CBD-regulated schizophrenia on behavioral responses induced by psychotomimetic drugs. We found that amphetamine causes increased global methylation in the ventral striatum, an effect blocked by pre-treatment with CBD and similarly with the antipsychotic clozapine. We did not observe changes in the global methylation in prefrontal cortex. Treatment with MK-801 did not alter the global methylation in the two aforementioned structures. Similar experimental protocol was used in two other approaches: (i) brain neurotrophic factor (BDNF) expression, related to the maintenance, growth and differentiation of neurons is increased in the hippocampus of animals treated with CBD and amphetamine; a similar pattern was observed with the association clozapine and amphetamine. (ii) the expression of acetylated phospho-histone, a marker indicating changes in chromatin, closely linked to changes in gene expression is increased in the nucleus acumbens and CPF in animals treated with the CBD and amphetamine combination. The data presented here suggest TRPV1 receptors and the endocannabinoid anandamide seem to be involved with the antipsychotic profile of CBD. For the first time it has been shown that both pre-treatment with CBD or clozapine may alter the increase in overall DNA methylation induced by amphetamine. In addition, the expression of BDNF in the hippocampus and the expression of acetylated phospho-histone may be different mechanisms that deserve attention in relation to the antipsychotic profile of CBD.

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