Há um grande interesse no estudo de células-tronco em função de sua capacidade de auto-renovação e plasticidade. Estas características capacitam as células-tronco a produzirem células de diferentes linhagens que participam ativamente do processo de homeostase, da resposta à injúria e da regeneração e reparação tecidual. A polpa dental é o tecido mais estudado na Odontologia em relação a células-tronco, mas diversos estudos já mostraram a presença dessas células também na região periodontal. É importante salientar, que dependendo de sua origem, as células-tronco apresentam comportamentos diversos, especialmente no que tange ao transplante in vivo. Além disso, os microambientes onde as células-tronco residem (nichos), têm um papel fundamental no comportamento das mesmas, pois controlam aspectos essenciais como o estado de indiferenciação e a auto-renovação. Esse projeto de pesquisa teve como objetivos duas análises distintas. Na primeira, verificar se existem células-tronco mesenquimais derivadas da curetagem do alvéolo dental humano após extrações dentais. Na segunda, analisar o nicho de células-tronco nas polpas dentais de camundongos. Em comum, as duas análises se basearam no uso de marcadores previamente utilizados na literatura para o estudo de células-tronco. Como não existem marcadores únicos e específicos para a identificação dessas células, diferentes combinações desses marcadores entre si e de técnicas laboratoriais foram empregadas. No primeiro estudo, após o isolamento das células, deu-se especial atenção à sua caracterização, que foi realizada através de ensaios que avaliaram propriedades e comportamentos que sabidamente ocorrem em células-tronco. Já na segunda parte desse estudo, utilizamos a polpa dental de camundongos para a análise in vivo de nichos. Em camundongos, a localização do nicho responsável pelo crescimento continuo dos incisivos é conhecida. De uma maneira geral, nossos resultados demonstram que: 1) É possível isolar células-tronco/progenitoras a partir de tecidos curetados de alvéolo dental após extrações dentárias. Esse fato é inédito e abre novas perspectivas em termos de oportunidade de coleta e futura aplicação clínica. 2) É possível observar a diversidade populacional nas células que formam o nicho de células-tronco em polpa dental de camundongos, e através de uma organização hierárquica, propusemos um modelo para este nicho. Esse modelo servirá de base para estudos subsequentes que visem avaliar o comportamento das células que formam o nicho, quando isoladas das demais, e abrirá possibilidade para análises em outros tecidos dentais e não dentais. / There is great interest in the study of stem cells due to their ability to produce mature cells of different lineages that participate actively in the process of homeostasis, injury response, regeneration and tissue repair. The dental pulp is the most studied tissue in dentistry, but several studies have shown the presence of these cells in the periodontal tissue region. It is important to note that depending on their origin, these cells exhibit different behaviours, especially in regard to in vivo transplantation. Furthermore, the microenvironment in which these cells are found (niches) have an essential role in their behaviour as they control important aspects such as differentiation and self-renewal. This research project aimed for two distinct analyses. The first was to verify if there are mesenchymal stem cells derived from human dental socket curettage after dental extractions. The second, to analyse the stem cell niche in mouse dental pulp. In common, the two analyses were based on the use of markers previously used in the literature for the study of stem cells. As there are no specific and unique markers to identify these cells, an extensive combination of these markers among themselves, and laboratory techniques were performed. In the first study, after the isolation of the cells, special attention was given to their characterization by combining assays to evaluate stem cells properties and behaviours. In the second part of this study, we used the mouse dental pulp model for in vivo analysis of stem cell niches. In mice, the location of the niche responsible for the incisors continuous growth is known. In general our results showed that: 1) It is possible to isolate progenitor/stem cells from tissue curettage of the alveolus after tooth extractions. This fact is unprecedented and opens new perspectives for the obtention of stem cells for future clinical applications. 2) It is possible to observe the cells population diversity of the mouse dental pulp niche and through a hierarchical organization, we proposed a model for this niche. This model will provide basis for further studies aimed at evaluating the behavior of cells that form the niche, when isolated from the others, and opens the possibility for the analysis of the niche structure in other dental and non-dental tissues.

A la suite d’une lésion carieuse ou traumatique du complexe pulpo-dentinaire, une inflammation locale est initiée. Cette inflammation peut être délétère car la pulpe dentaire est localisée au sein de parois dentinaires rigides, elle doit donc être résolue pour initier la régénération.Lors de lésions juxta-pulpaires, le praticien réalise un coiffage pulpaire direct afin de conserver la vitalité de la dent. Un biomatériau est placé au contact des tissus pulpaires afin de maintenir l’intégrité de la pulpe, en promouvant les processus de guérison tout en la protégeant du milieu buccal hostile.Les silicates de calcium sont aujourd’hui les matériaux de choix pour ces actes thérapeutiques. Des modifications de leur formulation visant à réduire leur temps de prise ont conduit au développement de silicates tricalciques photo-polymérisables. Cependant, la présence importante de résines dont la toxicité pulpaire est connue, soulève des questions. Cette thèse a pour objectif d’évaluer l’effet de différents biomatériaux de coiffage pulpaire sur l’inflammation et la régénération, au niveau cellulaire et tissulaire et d'étudier les conséquences de l'ajout de résines. Nos résultats démontrent que les matériaux de coiffage pulpaire affectent les étapes précoces de l'inflammation et de la régénération pulpaire. Alors que les silicates tricalciques modifient l'équilibre vers le processus de régénération, les biomatériaux contenant de la résine déplacent cet équilibre vers une réaction inflammatoire. Ce travail met en évidence l'importance capitale du choix du biomatériau de coiffage et restreint l'utilisation de biomatériaux contenant de la résine pour le coiffage pulpaire indirect. / Deep carious or physical lesions may lead to dental pulp injuries. Subsequently, both infiltrating bacteria and injured tissues initiate an inflammatory reaction. This may be detrimental to the healing process within the pulp inextensible environment.Clinically, during juxta-pulpal lesions, the practitioner performs a direct pulp capping in order to preserve the tooth vitality. A biomaterial is placed directly in contact with the pulp tissues to maintain pulp integrity, promoting the healing processes and protecting it from the hostile oral environment. Tricalcium silicates are now considered as the biomaterials of choice for vital pulp therapy. Modifications of this type of biomaterials aiming at reducing their setting time led to the development of light-cured tricalcium silicates. However, the presence of a high percentage of resins in this material raises questions about its possible effects on the pulp inflammatory reaction due to its reported toxicity. This aim of this thesis was to determine the influence of tricalcium silicate-based capping biomaterials on the initial steps of pulp inflammation and healing and to investigate the consequences of adding resins.Our results demonstrate that pulp capping biomaterials affect the early steps of pulp inflammation and healing. While tricalcium silicates shift the balance towards the healing process, resin-containing biomaterials drive this balance towards an inflammatory reaction. Overall, this work highlights the fact that the choice of pulp capping biomaterial is of prime importance in direct pulp capping procedures and does not support using resin containing biomaterials for direct pulp capping.

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2002. / AH26 is a registered trademark. Title from document title page. Document formatted into pages; contains vii, 55 p. : ill. (some col.). Includes a video file in the AVI format. Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 48-53).

Darbo tikslas yra nustatyti galimus metabolinius pokyčius žmogaus danties pulpoje ortodontinio gydymo metu veikiant gramzdinimo jėgoms ir įvertinti šių jėgų įtaką pulpos gyvybingumui. Uždaviniai: 1. Nustatyti fermento aspartato aminotransferazės (toliau – AST) akty¬vumą sveikų dantų pulpos audinyje. 2. Nustatyti, kaip kinta danties pulpos AST aktyvumas veikiant dantis 7 ir 14 dienų nepertraukiama gramzdinimo jėga ir 7 dienų nepertrau¬kiama jėga su vėlesniu 7 dienų poilsiu bei palyginti šiuos aktyvumus su sveikų dantų pulpos AST fermento aktyvumu. 3. Įvertinti danties pulpos atsaką į dirginimą elektros srove, taikant elektroodontometrinio gyvybingumo testą (toliau – EPT) sveikiems ir dantims paveiktiems 7 ir 14 dienų nepertraukiama gramzdinimo jėga bei 7 dienų nepertraukiama jėga su vėlesniu 7 dienų poilsiu. 4. Atlikti jėgos, veikiančios ortodontinio krūvio metu, matematinę ana¬lizę. 5. Įvertinti galimą pulpos AST fermento aktyvumo bei pulpos EPT at¬sako ryšį su gramzdinimo jėgos dydžiu, dantų šaknų skaičiumi, žan¬dikaulio tipu, bei amžiumi. 6. Atlikti pacientų, kuriems radiografinis tyrimas taikytas odontolo¬ginio gydymo planavimui, skaitmeninių panoraminių radiogramų analizę, siekiant įvertinti pulpos akmenų pulpos kameroje ir šak¬ninėje pul¬poje paplitimą tarp jauno amžiaus pacientų. 7. Atlikti ortodontinių pacientų pirminių bei galutinių skaitmeninių pa¬no¬raminių radiogramų lyginamąją analizę, siekiant įvertinti pulpos akmenų paplitimą pulpos kameroje ir šakninėje... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of the study was to evaluate metabolic alterations of the human dental pulp in response to application of intrusive forces, and to investigate impact of such forces on the pulp vitality.Objectives of the study: 1) to determine activity of aspartate aminotransferase (hereinafter – AST) in the dental pulp of teeth unaffected by orthodontic loading; 2) to evaluate changes in the dental pulp AST activity after appli¬cation of continuous intrusive force for 7 and for 14 days, or, continuous force for 7 days with the following 7 days of rest, and to compare the obtained values with the pulp AST activity in teeth unaffected by orthodontic loading; 3) to compare dental pulp response to electrical stimulation by means of electric odontometric pulp test (hereinafter – EPT) in teeth unaffected by orthodontic loading, and in teeth subjected to continuous intrusive force for 7 and for 14 days, also for 7 days of continuous loading with the following 7 days of rest; 4) to perform mathematical analysis of the forces acting during the orthodontic loading; 5) to analyse relation of the pulp AST activity and the EPT measu¬rements with the intrusive force magnitude, tooth type (i.e. number of tooth roots; maxilar or, mandibular), and patient‘s age; 6) to analyse digital panoramic X-ray images of the patients, sub¬jected to radiography during routine dental treatment planning, in order to observe occurence of pulp stones in the dental pulp chamber; 7) to compare baseline and final... [to full text]

Orientador: Carlos Alberto de Souza Costa / Banca: Elisa Maria Aparecida Giro / Banca: Marcelo Ferrarezi de Andrade / Banca: Marcelo Giannini / Banca: André Luiz Fraga Briso / Resumo: O objetivo da presente pesquisa foi avaliar comparativamente, através de análise histopatológica, as respostas de polpas humanas após confecção de cavidades de classe I, utilizando-se turbina de alta velocidade ou sistema laser de Er:YAG. Pré-molares inferiores hígidos recomendados para extração devido ao tratamento ortodôntico foram selecionados, sendo que os pares de dentes pertencentes aos mesmos pacientes foram aleatoriamente divididos de acordo com os seguintes grupos experimentais (n=6): Grupo 1 - alta velocidade; e Grupo 2 - laser de Er:YAG. As cavidades com profundidade média de 2,5mm tiveram a parede pulpar forrada com material biocompatível, sendo então restauradas com resina composta e sistema adesivo. No Grupo 3 (controle), os dentes não receberam qualquer tipo de tratamento. Quinze dias após a confecção e restauração das cavidades, os dentes foram extraídos, fixados em formalina tamponada, descalcificados em solução de Morse e processados em laboratório para inclusão em parafina. Cortes histológicos com 6μm de espessura foram corados com H/E, Tricrômico de Masson e pela técnica de Brown & Brenn e então avaliados em microscopia de luz. Para o Grupo 1 (alta velocidade), 5 dentes não apresentavam reação inflamatória, porém 3 deles exibiam discreta ruptura da camada de odontoblastos com degeneração hidrópica destas células pulpares. Em apenas 1 espécime, cuja espessura de dentina remanescente (EDR) entre o assoalho da cavidade e a polpa coronária era de 214μm, foi observado significante degeneração de odontoblastos, associado à ampla área de hialinização da matriz extracelular. Neste Grupo 1, as cavidades profundas apresentavam, em média, EDR de 909,5μm. Para o Grupo 2 (laser), exposição acidental da polpa ocorreu em 1 espécime, o qual foi descartado do experimento. / Abstract: The aim of this in vivo study was to evaluate and to compare the histopathological response of human pulps after cavity preparation by using high speed or Er:YAG laser systems. Sound premolars were selected and randomly divided into two experimental groups (n = 6) as following: Group 1: High speed; and Group 2: Er:YAG Laser. Class I cavities, 2.5mm deep, were prepared and their pulpal walls were lined with a biocompatible dental material. The cavities were restored with adhesive system and composite resin. Intact premolars were used in Group 3 (control). Fifteen days after the clinical procedures of cavity preparation, the teeth were extracted, fixed in 10% formalin, decalcified in Morse solution, and processed for paraffin embedding. The histological sections, 6μm thick, were stained with H/E, Masson's trichrome and Brown & Brenn technique and evaluated in light microscope. In Group 1 (High Speed), 5 specimens did not present inflammatory reaction. However, 3 of them exhibited odontoblast layer disruption as well as hydropic degeneration of these pulp cells. In only 1 specimen, which presented remaining dentin thickness (RDT) between the cavity floor and the coronary pulp of 214μm, notable odontoblast degeneration associated with hyaline alteration of the extracellular matrix was observed. In this Group 1 the mean of the RDT was 909.5μm. In Group 2 (Er:YAG Laser), unexpected pulp exposure occurred in 1 specimen, which was took out of the experiment. Four specimens exhibited normal histological characteristics of the pulp tissue. Only 1 specimen (RDT = 413μm) showed moderate tissue disorganization characterized by odontoblast layer disruption. The odontoblast cells exhibited hydropic degeneration. In this Group 2 the mean of the RDT was 935.2μm. / Doutor

Submitted by JULIANA DE CARVALHO MACHADO null (jcmjulianacarvalho@yahoo.com.br) on 2016-05-19T15:21:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Juliana Carvalho (Maio de 2016).pdf: 1590692 bytes, checksum: e5232c5b91f0ba6b25657c023b2ddc84 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-23T16:56:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 machado_jc_me_araca.pdf: 1590692 bytes, checksum: e5232c5b91f0ba6b25657c023b2ddc84 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T16:56:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 machado_jc_me_araca.pdf: 1590692 bytes, checksum: e5232c5b91f0ba6b25657c023b2ddc84 (MD5) Previous issue date: 2016-05-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Terapias biológicas tem buscado novas substâncias/protocolos que promovam a eliminação microbiana e induzam ou estimulem a regeneração pulpar e o desenvolvimento completo radicular de dentes permanentes jovens com processos patológicos pulpares. Os objetivos do estudo foram avaliar a a tividade antimicrobiana/antibiofilme de algumas combinações de antibióticos sobre microrganismos de interesse endodôntico e analisar o efeito da combinação de antibióticos com melhor ação antimicrobiana associada à sinvastatina na expressão de marcadores odontoblásticos em células da polpa dental humana (CPDH). A atividade antimicrobiana dos seguintes antibióticos : Metronidazol (ME), Ciprofloxacina (CI), Minociclina (MI), Doxicilina (DO) e Fosfomicina (FO), isolados ou em combinação dupla (ME+CI, ME+MI, ME+DO, ME+FO, CI+MI, CI+DO, CI+FO, DO+FO, MI+FO) ou tripla (ME+CI+MI, ME+CI+FO, ME+MI+FO, ME+CI+DO, ME+DO+FO, CI+DO+FO, CI+MI+FO) foram testados contra Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Actinomyces israelii e Candida albicans em condições planctônicas. Biofilmes mono-espécie de E. faecalis e biofilmes em dual-espécies de E. faecalis and C. albicans foram preparados em blocos de dentina para testar a atividade antibiofilme das combinações de antibióticos com os melhores resultados microbiológicos. O efeito antibiofilme das combinações antibióticas sobre biofilme de E. faecalis dentro dos túbulos dentinários foi também avaliada por microscopia confocal. Culturas de CPDH foram expostas à combinação antibiótica com melhor resultado microbiológico e sinvastatina e determinada a viabilidade celular, atividade da fosfatase alcalina (ALP), deposição de nódulos de mineralização e expressão de DSPP (sialofosfoproteína dentinária), importante marcador odontoblástico de mineralização denti nária. Os dados foram 9 analisados estatisticamente, considerando p<0,05 . Todas as combinações de antibióticos reduziram o crescimento bacteriano, exceto por CI+DO e DO+FO para A. Israelii. ME+CI+MI e ME+MI+FO inibiram significantemente o crescimento de A. israelii e E. faecalis, e ME+MI+FO eliminou S. mutans. ME+MI+FO e ME+CI+FO tiveram o melhor efeito contra biofilme de E. faecalis, em mono ou dual-espécies e dentro dos túbulos dentinários. CI e ME+CI+FO afetaram a viabilidade das células pulpares, em 1 e 7 dias. A atividade de ALP aumentou com a presença de sinvastatina para todos os grupos, exceto para CI e ME+CI+FO. Grupos contendo sinvastatina mostram maior deposição de nódulos de mineralização e expressão de DSPP que os grupos sem sinvastatina. Pode-se concluir que a combinação de antibióticos tripla ME+CI+FO teve efeito marcante contra os microrganismos endodônticos, em condições planctônicas e em biofilme. A sinvastatina estimulou a expressão de marcadores odontoblásti cos de mineralização dentinária pelas HDPC; entretanto, seu efeito foi reduzido pela presença da CI. / Biological therapies have searching for substances/protocols, which promote microbial elimination and induce or stimulate pulp regeneration and completion of apical root development in young permanent teeth with pulp pathological processes . The objectives of this study were to evaluate the antimicrobial /anti-biofilm activity of some antibiotics combinations on endodontic microorganisms and the effect of the combination of antibiotics with the best antimicrobial action associated with simvastatin on expression of odontoblast markers by human dental pulp cells (HDPC). The antimicrobial activity of the following antibiotics : Metronidazole (ME), Ciprofloxacin (CI), Minocycline (MI), Doxycycline (DO) and Fosfomycin (FO), either alone or in double (ME+CI, ME+MI, ME+DO, ME+FO, CI+MI, CI+DO, CI+FO, DO+FO, MI+FO) or triple combinations (ME+CI+MI, ME+CI+FO, ME+MI+FO, ME+CI+DO, ME+DO+FO, CI+DO+FO, CI+MI+FO) were tested against Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Actinomyces israelii and Candida albicans in planktonic conditions. Mono-species biofilm of E. faecalis and dual-species biofilms of E. faecalis and C. albicans were prepared in dentin blocks to test the anti -biofilm activity of antibiotic combinations with the best microbiological results. Antibiofilm effect of antibiotic combination on E. faecalis biofilm inside dentin tubules was also evaluated by confocal microscopy. Cultures of HDPC were exposed to the antibiotic combination with the best antimicrobial effect and simvastatin and determined cell viability, alkaline phosphatase activity, deposition of mineralization nodules and expression of Dspp (dentin sialophosphoprotein), important odontoblast markers of dentin mineralization. Data were analyzed statistically, considering p<0.05. All antibiotic combinations reduced statistically the growth of bacteria tested, except by CI+DO and DO+FO for A. israelii. ME+CI+MI and ME+MI+FO inhibited significantly growth of A. 11 israelii and E. faecalis, and ME+MI+FO eliminated S. mutans. ME+MI+FO and ME+CI+FO had the best effect against E. faecalis biofilm, in mono and dual -species biofilms and inside dentin tubules, similar to CHX. CI and ME+CI+FO affected HDPC viability, 1 and 7 days. ALP activity increased with the presence of simvastatin for all groups, except by CI and ME+CI+FO. Groups containing simvastatin had higher mineralized nodule deposition and higher DSPP expression than groups without simvastatin. It can be concluded that triple antibiotic combination of ME+CI+FO ha d remarkable effect against endodontic microorganisms, in planktonic and biofilm conditions. Simvastatin stimulated the expression of odontoblast markers of dentin mineralization by HDPC; however, its effect was reduced i n the presence of CI. / FAPESP: 2014/00589-7

A regeneração óssea alveolar tem sido um dos principais alvos de estudo na odontologia, tanto humana como veterinária, principalmente na implantodontia e nas cirurgias periodontais e buco-maxilo-faciais. Em função disto, este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a regeneração óssea alveolar, utilizando como enxerto osso liofilizado e células-tronco mesenquimais (MSCs), oriundas da polpa dentária de um doador macho para enxerto alogênico. Foram utilizados 57 coelhas, Nova Zelândia, sendo um coelho doador das MSCs, distribuídos em sete grupos: controle (G1), osso liofilizado (G2), Matrigel (G3), Matrigel e MSC (G4), osso liofilizado e Matrigel (G5), Osso liofilizado, Matrigel e MSC (G6) e somente MSC (G7). Após a exodontia do incisivo inferior esquerdo, o alvéolo recebia o implante de acordo com cada grupo e avaliados em sete dias. As amostras foram coletadas para análise microscópica, desmineralizadas e não desmineralizadas, PCR, além de terem sido submetidas à análise radiográfica, a qual também era realizada no pré e no pós-operatório imediato. Macroscopicamente, foi observado espessamento do ramo mandibular dos animais dos grupos que receberam Matrigel e aceleração do crescimento dos dentes incisivos remanescentes nos animais que receberam terapia celular. Na análise microscópica, constatou-se que, todos os grupos que receberam como enxerto o osso liofilizado, o tempo de regeneração foi menor, embora o grupo controle tenha apresentado melhor organização na regeneração óssea, sendo que o tratamento com Matrigel resultou ainda em uma reação inflamatória exacerbada, dado este confirmado também nas amostras não desmineralizadas. As radiografias periapicais também apontaram que os grupos que foram tratados com osso liofilizado apresentavam maior área de radiopacidade, sugerindo aceleração do processo de regeneração. Porém, o teste de PCR não detectou a presença do cromossomo Y do doador nas fêmeas receptoras das MSCs. Os resultados sugerem que o uso da terapia celular diminui o tempo de regeneração óssea alveolar e, quando aliada ao osso liofilizado, acelera este processo. Entretanto, decorridos sete dias da aplicação do Matrigel, houve aumento da espessura do ramo mandibular no alvéolo onde foi aplicado, necessitando maior tempo de avaliação para melhor elucidar seu uso clínico. / The alveolar bone regeneration has been a major focus of study in dentistry, both human and veterinary medicine, especially in implant and periodontal surgery and in the bucco-maxillo facial. Because of this, this study was to evaluate alveolar bone regeneration, using lyophilized bone and implant as mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the dental pulp of a male donor for allogeneic graft. We used 57 female New Zealand rabbits, one rabbit MSCs from donor, divided into seven groups: control (G1), lyophilized bone (G2), Matrigel (G3), Matrigel and MSC (G4), lyophilized bone and Matrigel(G5), lyophilized bone, MSC and Matrigel (G6) and MSC only (G7). After extraction of the left lower incisor, the socket receiving the implant according to each group and evaluated in seven days. The samples were collected for microscopic analysis, demineralized and non-demineralized, PCR, and they have been subjected to X-ray analysis, which was also held in pre-and postoperatively. Grossly, there was thickening of the mandibular branch of animals that received and accelerate growth of the incisor teeth remaining in the Matrigel animals that received cell therapy. Under microscopic analysis, we found that all groups that received the bone graft as lyophilized, regeneration time was lower, although the control group had a better organization in bone regeneration, and treatment with still resulted in a Matrigel exaggerated inflammatory response, since this is also confirmed in samples not demineralized. The periapical radiographs also showed that the groups were treated with lyophilized bone had a greater area of radiopacity, suggesting acceleration of the regeneration process. However, the PCR test failed to detect the presence of Y chromosome in female recipients of the donor of MSCs. The results suggest that the use of cell therapy reduces the duration and alveolar bone regeneration when combined with lyophilized bone, accelerates this process. However, Matrigel, there was increased thickness after seven days of applying of the mandibular alveolus in which it was applied, requiring longer evaluation to elucidate its clinical use.

O objetivo do presente estudo clínico foi compreender o efeito do uso prévio de agentes antimicrobianos na diversidade e a estrutura do microbioma procariótico de saliva, biofilme supragengival e canal radicular de dentes com infecção endodôntica aguda. Realizaram-se coletas microbiológicas de saliva (S), biofilme supragengival (BS) e canal radicular (CR) de pacientes que não utilizaram antibióticos (G1: n=6) e de pacientes que utilizaram antibióticos (G2: n=6). Para a caracterização das comunidades de procariotos por meio de sequenciamento de alto rendimento, foram produzidos pools de seis amostras para cada um dos sítios. A região hipervariável V3-V4 do gene 16S rRNA foi amplificada e a plataforma Illumina MiSeq foi empregada para análise das sequências geradas. Foram determinadas a presença e abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (OTUs) em cada amostra. Procedeu-se a análise de alfa-diversidade para cada amostra, considerando-se as métricas de Simpson, dominância, estimativa de riqueza de Chao-I e o Índice de Shannon. Os valores obtidos foram comparados por meio de testes estatísticos. Para a análise dos índices de beta-diversidade, empregou-se o método de agrupamento UPGMA, com jackknifing e método de comparação UniFrac com peso. A representação gráfica tridimensional da beta-diversidade foi realizada por meio de análise de coordenadas principais. A técnica de PCR gene específico foi empregada para determinar a presença de genes relacionados à resistência bacteriana para agentes beta-lactâmicos (blaTEM, blaZ, ampC, mecA), macrolídeos (ermB, ermC, mefA), tetraciclinas (tetM, tetQ, tetW), lincosamidas (lnuB, lsaB) e vancomicina (vanA, vanD, vanE). A similaridade para a presença/ausência de genes de resistência nas amostras de S, BS e CR em G1 e G2 foi determinada por meio de coeficiente de agrupamento, utilizando-se o método UPGMA com distância Euclidiana. Todos os pacientes apresentavam infecção endodôntica aguda, caracterizada pela presença de dor espontânea, necrose pulpar e dor à percussão vertical. Aumento de volume foi observado em 8/12 pacientes. Os pacientes do Grupo 2 utilizaram beta-lactâmicos previamente à consulta (amoxicilina = 5; cefalexina = 1). Há predomínio de integrantes do domínio Bactéria em todas S, BS e CR. Archaea pertencentes ao gênero Methanobrevibacter foram encontradas apenas em amostras de CR, constituindo menos de 1% do total de OTUs (G1-CR = 0,319%; G2-CR = 0,014%). Há predomínio de bactérias dos filos Firmicutes e Bacteroidetes em amostras de S, BS e CR. Há redução intensa no percentual de OTUs pertencentes ao Filo Firmicutes em amostras de saliva, quando antibiótico foi utilizado (G1-S = 75,371; G2-S = 35,242). Comportamento oposto ocorreu neste ecossistema para integrantes do Filo Bacteroidetes (G1-S = 12,657; G2-S = 33,947). Tanto em G1 quanto em G2, bactérias do gênero Streptococcus predominam em amostras de S e BS. Em canais radiculares, maiores percentuais de OTUs foram observados para os gêneros Porphyromonas e Prevotella. As métricas de alfadiversidade indicam que o uso prévio de antimicrobiano parece oportunizar o estabelecimento de espécies antes menos abundantes, especialmente em saliva (dominância: G1-S>G2-S; índice de Shanon: G1-S<G2-S; índice de Simpson: G1- S<G2-S; índice de Chao-1: G1-S<G2-S). A análise de beta-diversidade mostra proximidade entre G1-BS e G2-BS; há distanciamento entre G1-S e G2-S. As amostras G1-CR e G2-CR estão mais distantes de S e BS, sugerindo maior seleção imposta pelo ecossistema do CR aos procariotos. Os genes de resistência mais frequentemente detectados foram tetM, tetQ, tetM, ermB e mefA. Não foram detectados genes vanA, vanD, vanE, blaZ, mecA, lnuB e ermC. O gene ermB foi frequentemente detectado em amostras de S, BS e CR em ambos os grupos. Em pacientes que não utilizaram antibiótico, o gene tetM e o gene tetQ foram detectados simultaneamente em S, BS e CR (tetM = 4/6; tetQ = 3/6). A análise multivariada não demonstrou nível de agrupamento alto entre amostras de um mesmo paciente, de um mesmo ecossistema, ou de um mesmo grupo. A partir dos resultados do presente estudo, observou-se que a utilização de agente antimicrobiano betalactâmico parece alterar parâmetros composicionais de comunidades de procariotos na cavidade bucal. Entretanto, particularidades relativas a cada ecossistema podem modular a extensão deste efeito, parecendo ser mais intensos em amostras de S do que em BS e CR. / The present clinical study aimed to assess the effect of antibiotics over the diversity and structure in prokaryotic communities of saliva, supragengival biofilm and root canal of teeth with acute primary infections. Samples of saliva (S), supragengival biofilm (BS) and root canal of teeth with acute primary infections (CR) were collected from patients, and were grouped according with the previous use of antibiotic (G1 = no antibiotics; G2 = antibiotics). Pooled samples for each community were evaluated. DNA sequencing was performed with MiSeq (Illumina). The V3-V4 hypervariable region from the 16S rRNA gene was amplified. The presence and relative abundance of the operational taxonomic units (OTUs) was determined for each sample. Alpha-diversity analysis was performed with the Simpson’s index, dominance, Chao-1 richness index and Shannon’s index. Statistical analysis was carried out to compare their values for each community.Beta-diversity was computed through UPGMA clustering and jackknifing. The principal coordinate analysis employed weighted UniFrac. Gene-specific PCR was employed to detect resistance genes to lactamics (blaTEM, blaZ, ampC, mecA), macrolides (ermB, ermC, mefA), tetracyclines (tetM, tetQ, tetW), lincosamides (lnuB, lsaB) e vancomycin (vanA, vanD, vanE). The UPGA clustering analysis with Euclidean distance was applied to investigate the existence of similar groups of samples. A dendrogram was constructed to show the arrangement of the sample groups produced by clustering. All the patients had primary acute endodontic infections, with spontaneous pain, pulp necrosis and tenderness on percussion. Swelling was observed for 8 out of 12 patients. Patients from G2 had lactamics before the urgency appointment (amoxicillin = 5; cephalexin = 1). Bacteria were predominant in S, BS and CR samples. Archaea belonging to the genus Methanobrevibacter were only detected in RC samples and comprised less than 1% of all the OTUs G1-CR = 0.319%; G2-CR = 0.014%). The great majority of the detected OTUs in S, BS, and CR belonged to the phyla Firmicutes and Bacteroidetes. Reduction in the percentage of Firmicutes was observed in G2-S (G1-S = 75.371%; G2-S = 35.242%). A distinct behavior was demonstrated by the Bacteroidetes (G1- S = 12.657%; G2-S = 33.947%). Components belonging to the genus Streptococcus were predominant in S and BS, for both G1 and G2. CR harbored high percentage of species belonging to the genus Porphyromonas and Prevotella. The alpha-diversity indexes demonstrated that the G2-S had an increase in low abundant species (dominance: G1- S>G2-S; Shanon index: G1-S<G2-S; Simpson index: G1-S<G2-S; Chao-1 index: G1-S<G2- S). Beta-diversity showed that G1-BS and G2-BS had close spatial distribution. G1-CR and G2-CR were more distant from S and BS samples. The RC may promote a most intense species selection, due to environmental conditions. The most frequently detected genes associated with resistance to antibiotics were tetM, tetQ, tetM, ermB, and mefA. The genes vanA, vanD, vanE, blaZ, mecA, lnuB, and ermC were not detected in the samples. The gene ermB was frequently detected in S, BS and CR samples. In patients from G1, tetM and tetQ were detected simultaneously in all the three environments (tetM = 4/6; tetQ = 3/6). There was no clustering behavior for samples belonging to different environments in the same patients and between the same environment samples from different groups. An overall analysis from the data allows for suggesting that the use of lactamic agents may alter compositional parameters from prokaryotic communities in the oral cavity to different extents. Specific environmental characteristics from each site may modulate the effect that seemed to be more intense for S than for BS and CR.

Uma potencial alternativa para o transplante de tecidos é a engenharia de tecidos. Células-tronco mesenquimais e scaffolds eletrofiados são comumente utilizados nesta área devido à capacidade multipotente de diferenciação destas células e à rede de poros interconectados destas estruturas fibrosas. Além disso, bioreatores de perfusão podem ser utilizados para melhorar o transporte de nutrientes e reduzir o acúmulo de metabolitos tóxicos. Neste contexto, uma maneira de estudar e otimizar o sistema de cultivo é utilizar técnicas de modelagem para descrever interações ou processos individuais envolvidos no crescimento celular. Deste modo, o objetivo geral deste estudo é realizar o cultivo de células-tronco mesenquimais da polpa de dente decíduo (DPSCs) utilizando scaffolds tridimensionais eletrofiados de policaprolactona (PCL), biorreatores e técnicas de modelagem. Inicialmente foram testadas diferentes misturas de solventes (clorofórmio e metanol), a fim de produzir scaffolds com poros adequados ao cultivo tridimensional. Os diâmetros de fibra e de poro foram determinados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O crescimento e o metabolismo das células foram avaliados através da determinação da atividade metabólica e das concentrações de glicose e lactato do meio de cultivo, e a infiltração celular foi observada com a marcação do núcleo celular. Depois de estabelecidos os parâmetros de eletrofiação, o efeito da perfusão direta no desprendimento de DPSCs de scaffolds eletrofiados de PCL foi estudado. A atividade metabólica das células foi determinada para diferentes tempos de adesão, vazões e densidades de semeadura, e a tensão de cisalhamento na parede do poro foi calculada para cada vazão. A morfologia das células foi avaliada através de imagens de microscopia confocal e MEV. Paralelamente, foram realizadas simulações utilizando o software OpenFOAM para estudar como os parâmetros e variáveis de entrada (concentração inicial de glicose, porosidade e espessura do scaffold) afetam as saídas (fração volumétrica de células e concentração de substrato) de um modelo de proliferação celular que considera a difusão e o consumo de glicose. As contribuições do teor de oxigêno na cinética de crescimento de Contois e da variação da porosidade com o tempo devido à degradação do polímero também foram avaliadas. Inicialmente, foi observado que apenas um tamanho de poro maior que o diâmetro da célula permitiu a infiltração das células no scaffold. Então, observou-se que o aumento do tempo de adesão acarretou em maior espalhamento das células e, assim como a diminuição da densidade de semeadura e da tensão de cisalhamento, resultou em uma redução do desprendimento das células sob perfusão. Quanto ao modelo fenomenológico, observou-se maior sensibilidade à concentração inicial de glicose e à porosidade do scaffold, e aos parâmetros adimensionais relacionados à proliferação e morte celular e ao consumo de nutrientes. Além disso, o número inicial de células apresentou maior impacto no transporte de massa do que no crescimento celular. Neste estudo, foi possível obter scaffolds eletrofiados e conduções de cultivo dinâmico adequadas ao cultivo tridimensional de DPSCs, e elucidar os efeitos da limitação do transporte de massa e do oxigênio no crescimento celular, e da degradação do polímero no transporte de massa. / A potential alternative to tissue transplant is tissue engineering. Mesenchymal stem cells and electrospun scaffolds are commonly used in this field due to the multipotent differentiation capacity of these cells and the interconnected pore network of these fibrous structures. In addition, perfusion bioreactors can be used to enhance nutrient transport and reduce the accumulation of toxic metabolites. In this context, one way to study and optimize the culture system is to use modeling techniques to describe interactions or individual processes involved in cell growth. Thus, the objective of this study is to perform the three-dimensional culture of mesenchymal stem cells of dental pulp (DPSCs) using electrospun polycaprolactone (PCL) scaffolds, bioreactors and modeling techniques. Initially, different solvent mixtures (chloroform and methanol) were tested to produce scaffolds with pores suitable to three-dimensional culture. Fiber and pore diameter was determined using a scanning electron microscope. Cell growth and metabolism were evaluated through the metabolic activity and the culture medium concentration of glucose and lactate, and the cell infiltration was observed with cell nuclei staining. After the establishment of the elesctrospinning parameters, the effect of direct perfusion on DPSCs detachment from PCL electrospun scaffolds was investigated. The metabolic activity of the cells was determined for different adhesion times, flow rates and seeding densities and the pore wall shear stress was calculated for each flow rate. The cell morphology was evaluated through scanning electron and confocal microscopy imaging. In parallel, simulations with the software OpenFOAM were performed to study how parameters and inputs (initial glucose concentration, porosity and thickness of the scaffold) affect the outputs (cell volume fraction and substrate concentration) of a model of cell proliferation and glucose diffusion and consumption. The contribution of the oxygen in the Contois growth kinetics and the porosity variation with time due to polymer degradation was also evaluated. Initially, it was observed that only a pore size higher than the cell diameter allowed the infiltration of the cells through the scaffold. Then, it was observed that a higher adhesion time leaded to higher cell spreading in static conditions and, similar to smaller seeding densities and shear stresses, reduced cell detachment under perfusion. Regarding the phenomenological model, it was observed that the model is more responsive to the initial glucose concentration and scaffold porosity, and to the dimensionless parameters related to cell proliferation, death and nutrient uptake. Furthermore, the initial cell number had a more significant impact on mass transport than on cell growth. In this study, it was possible to obtain an electrospun scaffold and dynamic culture conditions suitable for the three-dimensional culture of DPSCs, and to elucidate the effects of transport limitations and of oxygen on cell growth, and of polymer degradation on mass transport were elucidated.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-28Bitstream added on 2014-06-13T19:01:40Z : No. of bitstreams: 1 kina_jf_dr_arafo.pdf: 2110836 bytes, checksum: 08ad560b8fcc1aedd6d562d28b44eb82 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo da presente pesquisa foi avaliar comparativamente, através de análise histopatológica, as respostas de polpas humanas após confecção de cavidades de classe I, utilizando-se turbina de alta velocidade ou sistema laser de Er:YAG. Pré-molares inferiores hígidos recomendados para extração devido ao tratamento ortodôntico foram selecionados, sendo que os pares de dentes pertencentes aos mesmos pacientes foram aleatoriamente divididos de acordo com os seguintes grupos experimentais (n=6): Grupo 1 – alta velocidade; e Grupo 2 – laser de Er:YAG. As cavidades com profundidade média de 2,5mm tiveram a parede pulpar forrada com material biocompatível, sendo então restauradas com resina composta e sistema adesivo. No Grupo 3 (controle), os dentes não receberam qualquer tipo de tratamento. Quinze dias após a confecção e restauração das cavidades, os dentes foram extraídos, fixados em formalina tamponada, descalcificados em solução de Morse e processados em laboratório para inclusão em parafina. Cortes histológicos com 6μm de espessura foram corados com H/E, Tricrômico de Masson e pela técnica de Brown & Brenn e então avaliados em microscopia de luz. Para o Grupo 1 (alta velocidade), 5 dentes não apresentavam reação inflamatória, porém 3 deles exibiam discreta ruptura da camada de odontoblastos com degeneração hidrópica destas células pulpares. Em apenas 1 espécime, cuja espessura de dentina remanescente (EDR) entre o assoalho da cavidade e a polpa coronária era de 214μm, foi observado significante degeneração de odontoblastos, associado à ampla área de hialinização da matriz extracelular. Neste Grupo 1, as cavidades profundas apresentavam, em média, EDR de 909,5μm. Para o Grupo 2 (laser), exposição acidental da polpa ocorreu em 1 espécime, o qual foi descartado do experimento. / The aim of this in vivo study was to evaluate and to compare the histopathological response of human pulps after cavity preparation by using high speed or Er:YAG laser systems. Sound premolars were selected and randomly divided into two experimental groups (n = 6) as following: Group 1: High speed; and Group 2: Er:YAG Laser. Class I cavities, 2.5mm deep, were prepared and their pulpal walls were lined with a biocompatible dental material. The cavities were restored with adhesive system and composite resin. Intact premolars were used in Group 3 (control). Fifteen days after the clinical procedures of cavity preparation, the teeth were extracted, fixed in 10% formalin, decalcified in Morse solution, and processed for paraffin embedding. The histological sections, 6μm thick, were stained with H/E, Masson´s trichrome and Brown & Brenn technique and evaluated in light microscope. In Group 1 (High Speed), 5 specimens did not present inflammatory reaction. However, 3 of them exhibited odontoblast layer disruption as well as hydropic degeneration of these pulp cells. In only 1 specimen, which presented remaining dentin thickness (RDT) between the cavity floor and the coronary pulp of 214μm, notable odontoblast degeneration associated with hyaline alteration of the extracellular matrix was observed. In this Group 1 the mean of the RDT was 909.5μm. In Group 2 (Er:YAG Laser), unexpected pulp exposure occurred in 1 specimen, which was took out of the experiment. Four specimens exhibited normal histological characteristics of the pulp tissue. Only 1 specimen (RDT = 413μm) showed moderate tissue disorganization characterized by odontoblast layer disruption. The odontoblast cells exhibited hydropic degeneration. In this Group 2 the mean of the RDT was 935.2μm.