La dysfonction diastolique du ventricule gauche (DDVG) réfère à une rigidité ainsi qu’à des troubles de relaxation au niveau de ce ventricule pendant la phase de la diastole. Nos connaissances sur les mécanismes moléculaires sous-jacents de cette pathologie demeurent limités. Les analyses géniques sont indispensables afin de bien identifier les voies par lesquelles cette maladie progresse. Plusieurs techniques de quantification de l’expression génique sont disponibles, par contre la RT-qPCR demeure la méthode la plus populaire vu sa haute sensibilité et de ses coûts modérés. Puisque la normalisation occupe un aspect très important dans les expériences de RT-qPCR, nous avons décidé de sélectionner des gènes montrant une haute stabilité d’expression dans un modèle de DDVG de lapin. Nous avons alors exposé 18 lapins blancs soit à une diète normale (n=7) ou bien à une diète hypercholestérolémiante additionnée de vitamine D2 (n=11). La DDVG a été évaluée par des mesures échocardiographiques. L’expression de l’ARNm de dix gènes communément utilisés dans la littérature comme normalisateur (Gapdh, Hprt1, Ppia, Sdha, Rpl5, Actb, Eef1e1, Ywhaz, Pgk1, et G6pd) a été mesurée par RT-qPCR. L’évaluation de leur stabilité a été vérifiée par les algorithmes de geNorm et Normfinder. Sdha et Gapdh ont obtenu les meilleurs scores de stabilité (M<0.2) et ont été suggérés par le geNorm, comme meilleure combinaison. Par contre, l’utilisation de Normfinder mène à la sélection d’Hprt1 et Rpl5 comme meilleure combinaison de gènes de normalisation (0.042). En normalisant par ces deux combinaisons de gènes, l’expression de l’ARNm des peptides natriurétiques de type A et B (Anp et Bnp), de la protéine chimiotactique des monocytes-1 (Mcp-1) et de la sous unité Nox-2 de la NADPH oxydase ont montré des augmentations similaires chez le groupe hypercholestérolémique comparé au groupe contrôle (p<0.05). Cette augmentation d’expressions a été corrélée avec plusieurs paramètres échocardiographiques de DDVG. À notre connaissance, c’est la première étude par laquelle une sélection de gènes de référence a été réalisée dans un modèle de lapin développant une DDVG. / Left ventricular diastolic dysfunction (LVDD) is characterized by the diminution of ventricle’s performance, its incapacity to relax normally and an increase of blood filling pressure. LVDD is considered as a main cause of heart failure in approximately 50% of patients suffering from this disease. However, the molecular mechanisms underlying LVDD remain unclear. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) is widely used in gene-expression studies. In this study we attempt to establish normalization genes for gene expression analysis in a rabbit model of LVDD. Eighteen New-Zealand white rabbits were exposed to normal (n=7) or 0.5% hypercholesterolemic (n=11) diet supplied by vitamin D2; an LVDD animal model previously characterized in our Laboratory. LVDD was assessed by echocardiography. RT-qPCR was performed using cDNA from left ventricle samples and measuring the stability of 10 candidate genes as normalisers (Gapdh, Hprt1, Ppia, Sdha, Rpl5, Actb, Eef1e1, Ywhaz, Pgk1, and G6pd). We found that Sdha and Gapdh are the most stable genes using geNorm analysis with very high stability average M <0.2. By contrast, Hprt1 and Rpl5 were found to be the best combination for normalization with a stability value of 0.042 when using Normfinder. Comparison of both normalization strategies highlighted an increase of Anp, Bnp, Mcp-1 and Nox-2 mRNA expression in the hypercholesterolemic rabbits (p<0.05) compared to normal controls. This increase correlates with different DD parameters and validates the development of the disease in our model. To our knowledge, this is the first study highlighting stable reference genes for RT-qPCR normalization in a validated rabbit model of LVDD.

Effet de l’atorvastatine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à l’hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin Forcillo J, Aubin MC, Horn A, Shi YF, Carrier M, Tardif JC, Perrault LP Introduction: L’atorvastatine par ses effets pléiotropiques pourrait limiter la dysfonction endothéliale associée au développement de l’HVG. Méthodologie : Un cerclage de l’aorte ascendante pendant 2 mois entraîne le développement d’HVG et les groupes ont été traités avec atorvastatine 40 ou 80 mg de 60 à 90 jours. L’HVG est confirmée par échographie. La réactivité vasculaire est évaluée en chambres d’organe, la fonction endothéliale par la quantification de la GMPc et des nitrites/nitrates plasmatiques. Le stress oxydant est mesuré par les niveaux d’ANG II et de la carbonylation des protéines. Résultats : Après 60 et 90 j de cerclage, l’HVG est observée chez tous ces groupes. Les courbes concentrations-réponse des anneaux des artères coronaires épicardiques des groupes traités avec l’atorvastatine 40 et 80 mg pour 30 et 60 jours n’ont démontré aucune amélioration des relaxations dépendantes de l’endothélium. Une exacerbation significative de la dysfonction endothéliale a été observée. Les niveaux vasculaires de GMPc sont significativement diminués dans le groupe sans cerclage traité 60 d et ceux d’ANG II sont fortement augmentés chez ce dernier groupe ainsi que le groupe traité avec 80 mg pour 30 jours par rapport aux contrôles. L’expression de la carbonylation des protéines est augmentée dans le groupe témoin traité avec atorvastatine 80 mg, reflétant une augmentation du stress oxydant. Conclusion : L’administration d’atorvastatine ne prévient pas le développement de l’HVG ni la dysfonction endothéliale dans notre modèle. Au contraire l’atorvastatine à haute dose a un effet toxique sur les artères coronaires épicardiques en augmentant la dysfonction endothéliale. / Effect of atorvastatin on endothelial dysfunction of epicardial coronary arteries associated with left ventricular hypertrophy in a porcine model. Forcillo J, Aubin MC, Horn A, Shi YF, Carrier M, Tardif JC, Perrault LP Background: Atorvastatin, through pleiotropic effects, may prevent or reverse the endothelial dysfunction associated with LVH. Methods: After performing a banding of the ascending aorta for 2 months leading to the development of LVH, groups have been treated with atorvastatin 40 or 80 mg for 60 and 90 day periods. LVH was evaluated by echocardiographic studies. Vascular reactivity studies were performed in organ chambers. In vitro endothelial function was evaluated by plasmatic nitrites/nitrates, the degradations products of nitric oxide, and cGMP quantification. To quantify and qualify oxidative stress, protein carbonyl and angiotensin II levels were assessed. Results: Following 60 and 90 days of aortic banding, the development of LVH was observed in these groups. Concentration-response curves from rings of epicardial coronary arteries of groups treated with atorvastatin 40 and 80 mg for 30 and 60 days showed a significant decrease of endothelium-dependent relaxations with worsening of the endothelial dysfunction. Levels of cGMP were significantly decreased in the 60 days treated sham group and levels of ANG II were increased in the latter and also in the 90 days banded groups treated with 80 mg for 30 days compared to controls. The expression of protein carbonyl increased in the sham group treated with atorvastatin 80 mg compatible with an increase in oxidative stress. Conclusion: The administration of atorvastatin does not limit the development of LVH nor the endothelial dysfunction in our model. On the opposite, atorvastatin at a high dose has a toxic effect on epicardial coronary arteries by exacerbating the endothelial dysfunction.

Effet positif de la N-acétylcystéine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à une hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin A. A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT INSTITUT DE CARDIOLOGIE DE MONTRÉAL, MONTRÉAL, CANADA, Objectif : Il a été démontré dans le laboratoire que dans notre modèle d’hypertrophie ventriculaire gauche, la dysfonction endothéliale est secondaire à une diminution de la biodisponibilité du NO, celle-ci étant causée par une augmentation du stress oxydant tel que démontré par Malo et al. (2003) et Aubin et al. (2006). Le but de la présente étude est d’étudier l’effet d’un traitement chronique de la N-acétylcystéine (NAC) (un antioxydant) sur la dysfonction endothéliale associée à une hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Méthodologie: L’HVG a été induite par cerclage aortique (CA) chez vingt-et-un porcelets âgés de deux mois qui furent divisés aléatoirement en quatre groupes expérimentaux. Le groupe témoin (groupe 1) a été soumis à une thoracotomie antérolatérale gauche sans cerclage aortique (n=3). Le groupe 2 a été soumis à un cerclage aortique pour une période de 60 jours (n=6). Le groupe 3 a subi un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine de 1000 mg/jour per os pendant 60 jours commençant le jour de la chirurgie (n=6). Le groupe 4 a été soumis à un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine : 1000 mg/par jour pendant 30 jours commençant le jour 30 (post-chirurgie) (n=6). L’hypertrophie fut évaluée par échocardiographie. La réactivité vasculaire fut étudiée à l’aide de chambres d’organes par la construction des courbes concentration-réponse à la sérotonine (5-HT: relaxations induites par les récepteurs 5-HT1D, couplés aux protéines Gi) et à la bradykinine (BK: relaxations induites par les récepteurs B2, couplés aux protéines Gq). Les quantités de nitrites/nitrates et la production basale de GMPc ont été mesurées pour évaluer la fonction endothéliale. Le stress oxydant a été étudié en quantifiant les concentrations plasmatiques d’hydroperoxydes lipidiques et de glutathion réduit, ainsi que l’activité plasmatique des enzymes antioxydantes peroxydase du glutathion et dismutase du superoxyde. Résultats: Le rapport masse ventricule gauche/masse corporelle était significativement plus élevé pour le groupe 2 comparativement au groupe 1 (p<0,05) confirmant la présence d’une HVG. Le développement de l’HVG dans le groupe 3 a pu être prévenu par la NAC et sa progression fut atténuée dans le groupe 4 (p<0,05 versus groupe 2). La présence de la dysfonction endothéliale a été confirmée chez le groupe 2, tel qu’illustré par une diminution significative des relaxations maximales à la 5-HT et à la BK comparativement au groupe témoin. Le traitement à la NAC a significativement potentialisé les relaxations maximales (p<0,05) induites par la sérotonine et par la bradykinine, chez les deux groupes traités. Cette amélioration des relaxations dépendantes de l’endothélium peut être la conséquence d’une augmentation significative (p<0,05) de la biodisponibilité du monoxyde d’azote pour les cellules musculaires lisses, tel que suggéré par l’augmentation du ratio nitrites/nitrates et de la production basale de GMPc chez les groupes 3 et 4 comparativement au groupe 2. Cette augmentation du facteur relaxant peut résulter d’une augmentation de sa production par les cellules endothéliales ou d’une diminution de sa neutralisation par les espèces réactives oxygénées. De fait, les concentrations d’hydroperoxydes lipidiques étaient significativement inférieures (p<0,05) et associées à une augmentation des concentrations de l’antioxydant glutathion réduit et de l’activité de la peroxydase du glutathion chez les deux groupes traités par rapport au groupe 2. Conclusion: Le traitement à la NAC prévient le développement de la dysfonction endothéliale coronaire ainsi que l’HVG qui lui est associée. / Beneficial effect of N-acetylcysteine on endothelial dysfunction of epicardial coronary arteries associated with left ventricular hypertrophy in a porcine model A.A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT MONTREAL HEART INSTITUTE, MONTREAL, CANADA Objective : In our left ventricular hypertrophy (LVH) model, endothelial dysfunction is secondary to a reduced bioavailability of NO caused by increased oxidative stress demonstrated by Malo and al. (2003) and Aubin and al. (2006). The aim of this study was to investigate the potential effect of chronic administration of N-acetylcysteine (NAC), a thiol drug with antioxidant properties, on the coronary endothelial dysfunction associated with LVH. Design and method: LVH was induced by aortic banding (AB) on swine for a two-month period. Twenty-one 8-week-old Landrace male swine were randomly divided into 4 experimental groups. The sham group (group 1) was submitted to a thoracotomy without aortic banding (AB). The untreated aortic banded group (group 2) was kept for 60 days. The first AB treated group (group 3) received 1000mg/day of NAC per os for 60 days starting on the day of the surgery. The second AB treated group (group 4) received the same oral dose of NAC for 30 days starting on day 30. Hypertrophy was assessed by echocardiography. Coronary vascular reactivity was evaluated in organ chambers, by the construction of concentration-response curves to serotonin (5-HT: relaxations mediated by 5-HT1D receptors, coupled to Gi proteins) and bradykinin (BK: relaxations mediated by B2 receptors, coupled to Gq proteins). Levels of nitrite/nitrate and basal cGMP levels were measured to evaluate endothelial dysfunction. Finally, to assess oxidative stress, plasma lipid hydroperoxide levels (LPO), reduced glutathione as well as the activity of antioxidant enzymes glutathione peroxidase and superoxide dismutase were measured. Results: The LV mass/ body weight ratio was significantly higher in group 2 compared to group 1 confirming the development of LVH (p<0.05). The latter was found to be associated with a significant endothelial dysfunction. NAC did prevent LVH development in group 3 and attenuated its progression in group 4 (p<0.05). Concentration response curves to NAC showed improvement in endothelium-dependent relaxations to serotonin and to bradykinin (p<0.05). NAC treatment markedly improved maximal relaxations mediated by serotonin and bradykinin in both treated groups (p<0.05). The observed improvement in endothelium-dependent relaxations was supported by the increase of the bioavailability of NO for smooth muscle cells as suggested by the increase of the nitrite/nitrate ratio and the basal production of cGMP in groups 3 and 4 in comparison to group 2 (p<0.05). The increase of this relaxing factor could result from an increase of its production by endothelial cells or by a decrease of its neutralization by reactive oxygenated species. The lowering of LPO levels was accompanied by a higher glutathione concentration and glutathione peroxidase activity in both NAC treated groups compared to group 2 (p<0.05). Conclusions: NAC treatment demonstrated potent antioxidant properties in this porcine LVH model by slowing LVH development and restoring coronary endothelium-dependent relaxations.

Grâce aux nombreuses études sur le sujet, nous savons qu’une stimulation inflammatoire vasculaire excessive entraîne un débalancement des fonctions homéostatiques de l’endothélium. Ce débalancement est à l’origine d’une dysfonction endothéliale définie comme étant l’étape clé contribuant au développement de l’athérosclérose. Le Toll-like receptor-2 (TLR2) est impliqué dans l’activation cellulaire via la transcription des gènes liés à l’inflammation. Il reconnaît des molécules microbiennes mais également des facteurs endogènes non-infectieux tels que sécrétés par les tissus endommagés provenant de la dysfonction endothéliale. Ainsi, l’activation et la signalisation du TLR2 sont en étroite relation avec le développement de l’athérosclérose. Les études épidémiologiques ont confirmé le rôle athéroprotecteur de l’œstrogène via de nombreux mécanismes d’action. Ainsi, nous avons cherché à identifier de nouvelles cibles moléculaires permettant de mieux interpréter les bénéfices potentiels de l’œstrogène sur le système cardiaque. Pour la première fois chez les cellules endothéliales (CE) vasculaires de souris, nos travaux ont confirmé l’effet anti-inflammatoire de l’œstrogène via la diminution de l’expression et de l’activité du TLR2. Nous avons également déterminé l’influence de l’œstrogène sur le profil de la réponse inflammatoire de ce récepteur en mesurant les potentiels endothéliaux de migration et d’adhésion. De plus, nous avons caractérisé les voies de signalisation impliquées en démontrant l’influence négative de l’œstrogène sur la phosphorylation des kinases activées par le TLR2; illustrant l’interaction entre l’œstrogène et la signalisation de ce récepteur. Nos travaux amènent ainsi de nouvelles connaissances sur la régulation endothéliale du TLR2 et mettent en lumière les effets anti-inflammatoires et vasculaires rapides de l’œstrogène. / Evidence supports the contribution of immune responses in atherosclerosis development in part by alterations in the endothelium activation status and by the recruitment of inflammatory cells triggered by cardiovascular risk factors. These alterations are the principal cause of endothelial dysfunction defined as the key step contributing to the development of atherosclerosis. Via the transcription of genes related to inflammation, the Toll-like receptor-2 (TLR2) is involved in endothelial cell activation. It generally recognizes microbial molecules but also non-infectious endogenous factors such as those secreted by damaged tissues from the endothelial dysfunction. Thus, activation and signalization of the TLR2 are closely linked with the development of atherosclerosis. Epidemiological studies have confirmed the atheroprotective role of estrogen through multiple mechanisms of action. Thus, to better interpret the potential benefits of estrogen on the cardiovascular system, we sought to identify new molecular targets such as TLR2 regulation. For the first time in mouse vascular endothelial cells (EC), our results have confirmed the anti-inflammatory effect of estrogen via the decreased expression and activity of TLR2. We also determined the influence of estrogen on the profile of the inflammatory response triggered through this receptor by measuring endothelial migration and adhesion potentials. Furthermore, we demonstrated the interaction between estrogen and TLR2 signalling pathways with a negative influence of estrogen on the phosphorylation level of kinases activated by this receptor. Thus, our study brings new insights into the endothelial regulation of TLR2 and highlights rapid anti-inflammatory and cardioprotective effects from estrogen.

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC. / Leigh syndrome French Canadian type (LSFC) is an orphan infantile disease caused by mutations in the LRPPRC gene. It is characterized by a tissue-specific cytochrome c oxidase deficiency (COX), mitochondrial dysfunction and fatal lactic acidosis crises which occur in more than 80% of cases. According to parents, these crises occur during stressful situations. The pathophysiology underlying this disease and the factors that precipitate these crises remain unknown. To better understand the regulation of energy metabolism in LSFC patients, we examined the activity of AMP activated protein kinase (AMPK), a key regulator of energy balance, and its downstream targets (SIRT1/PGC1α and Akt/mTOR) in LSFC and control fibroblasts under basal and stress conditions. Our results showed that AMPK activity was similar in LSFC and control cells under basal conditions. On the other hand, Akt/mTOR and SIRT1/PGC1α pathways were up regulated in LSFC cells compared to controls. We next examined AMPK activity in cells treated with 10 mM lactate and 1mM palmitate (LP) for 4h, thus mimicking the conditions of “crisis”. Following this treatment, AMPK phosphorylation levels increased significantly (90%, p<0.01) in control cells but not in LSFC cells. Nevertheless, AMPK seems functional in LSFC cells because the enzyme was activated in response to chemical hypoxia induced by 2,4 dinitrophenol. LP also increased the expression of SIRT1 (57%, p<0.05), LRPPRC (23%, p=0.045) and COXIV (19%, p<0.05), in controls cells. Furthermore, pretreatment with ZMP, a pharmacological activator of AMPK, had an additive effect with LP leading to a further increase in the activity of SIRT1 (120%, p<0.05), as well as the expression levels of SIRT1 (75%, p<0.01), LRPPRC (63%, p<0.001) and COXIV (38%, p<0.001). All these effects were abolished in LSFC cells and thus, our data highlight alterations in the regulation of key enzymes of energy metabolism, including the activation of AMPK, in LFSC fibroblasts.

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) présents au niveau des tumeurs reconnaissent des antigènes présentés par les cellules cancéreuses, mais ne parviennent pas à induire le rejet de ces tumeurs chez les patients cancéreux. Cette observation a amené les immunologistes à étudier les différents mécanismes d'immunosuppression induits par les tumeurs qui permettent aux cellules cancéreuses d'échapper à la reconnaissance et à la destruction immunitaires. L'un des mécanismes contribuant à la résistance des tumeurs aux réponses immunitaires est le recrutement de lymphocytes T CD4+ régulateurs (Tregs). Les Tregs s'accumulent au niveau des sites tumoraux et jouent un rôle important dans la suppression des réponses immunitaires dirigées contre les cellules tumorales. Dans ce travail de thèse, nous rapportons que des épitopes tumoraux dérivés des protéines NY-ESO-1 et TRAG-3 stimulent à la fois des lymphocytes T CD4+ auxiliaires (Th) et des Tregs chez des patients porteurs de mélanome. Grâce à une analyse clonotypique, nous démontrons que, contrairement aux cellules CD4+ Th, les TCR des Tregs dirigés contre NY-ESO-1 et TRAG-3 sont retrouvés à la fois dans le répertoire des Tregs naturels (CD4+CD25high) et dans celui des cellules T CD4+ classiques/Th (CD4+CD25-), au niveau des PBMCs des patients. Cette observation suggère que le recrutement des Tregs spécifiques d'antigènes tumoraux se fait en partie par la conversion des cellules T CD4+ classiques suite à leur stimulation chronique par des antigènes de tumeurs. / Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) present in tumors recognize tumor antigens presented by cancer cells but fail to induce tumor rejection in patients. This observation has led immunologists to study the different mechanisms of tumor-induced immunosuppression that allow cancer cells to escape from recognition and destruction by the immune system. One of the mechanisms contributing to tumor resistance to immune responses is the recruitment of CD4+ regulatory T cells (Tregs). Tregs accumulate at tumor sites and play an important role in suppressing immune responses against tumor cells. In this thesis, we report that tumor epitopes derived from the proteins NY-ESO-1 and TRAG-3 stimulate both CD4+ T helper cells (Th) and Tregs in patients with metastatic melanoma. Through clonotypic analysis, we show that, within PBMCs of melanoma patients, tumor antigen-specific Tregs, but not Th cells, share a common TCR usage with naturally-occuring Tregs (CD4+CD25high) and Th cells (CD4+CD25-), suggesting that their recruitment occurs through the peripheral conversion of CD4+CD25- T cells upon chronic antigen exposure. The second part of this thesis consists of the study of inhibitory receptors expressed by CTLs directed against tumor antigens which, upon engagement by their ligands presented on the surface of tumor cells, activate negative regulatory pathways. Here, we report that tumor-induced CTLs directed against a peptide derived from NY-ESO-1 in melanoma patients upregulate the expression of the inhibitory receptors PD-1, Tim-3 and BTLA. Additionaly, the co-expression of PD-1 with Tim-3 and/or BTLA defines populations of dysfunctional tumor antigen-specific CTLs.

On estime qu'approximativement 20 millions de personnes dans le monde souffrent d'insuffisance cardiaque et la prévalence de cette pathologie ne cesse d'augmenter avec le vieillissement croissant de la population. L'évaluation de la fonction ventriculaire gauche par la mesure de la fraction d'éjection permet en fait de distinguer deux populations distinctes de patients insuffisants cardiaques : l'une avec et l'autre sans altération de la fraction d'éjection, encore dénommées respectivement Heart Failure with Reduced Ejection Fraction (IC-FEr) et Heart Failure with Preserved Ejection Fraction (IC-FEp). On ne sait pas aujourd'hui si ces deux entités représentent deux pathologies distinctes ou, au contraire, deux entités intimement liées. L'IC-FEp est actuellement observée chez environ 40 à 50% des patients présentant une insuffisance cardiaque et son évolution est semblable à celle des patients IC-FEr.Le concept d'IC-FEp soulève toutefois des difficultés conceptuelles : d'une part car la notion d'une fraction d'éjection préservée implique la connaissance de sa valeur de base et d'autre part, les valeurs dites "normales" de la fraction d'éjection sont encore à établir. Par ailleurs, la vision mécanique du cœur comme une pompe hémodynamique ou musculaire conditionne la compréhension de la physiopathologie de la IF-FEp.Dans ce contexte, nous avons mis au point un modèle porcin de dysfonction diastolique avec éjection préservée secondaire à une hypertension artérielle induite par une perfusion continue d'angiotensine II pendant 28 jours. Dans ces conditions, nous avons démontré une altération de la fonction ventriculaire gauche alors même que l'éjection était préservée. Ceci était objectivé par 1) une augmentation paradoxale des durées relatives de contraction et de relaxation isovolumiques, 2) des réponses inappropriées des phases isovolumiques du cycle cardiaque à des augmentations de la fréquence et de l'inotropisme cardiaques et 3) une étroite relation entre ces deux phases isovolumiques (couplage contraction-relaxation). L'inadéquation entre les niveaux de fréquence cardiaque et des phases isovolumiques nous a amené à évaluer les effets de la modulation pharmacologique de la fréquence cardiaque sur le couplage contraction-relaxation. Ainsi la réduction sélective de la fréquence cardiaque par l'administration d'ivabradine, un inhibiteur des canaux If, a réduit significativement la durée de ces deux phases et favorisé le remplissage. Cependant, cette normalisation n'était qu'apparente puisque le ratio entre la contraction et la relaxation isovolumiques restait augmenté à J28, en défaveur de la contraction isovolumique.En conclusion, le développement d'une dysfonction diastolique avec une éjection préservée s'accompagne d'une dysfonction systolique qui entrave une réponse adéquate du myocarde à un stress dans un contexte d'hypertension chronique. / Approximately 20 millions individuals in the world experience heart failure symptoms; heart failure prevalence is continuously rising with population aging. Left ventricular function evaluation by the ejection fraction allows distinguishing two different patient sets: one with and one other without ejection fraction alteration, respectively named Heart Failure with Reduced Ejection Fraction (HF-rEF) and Heart Failure with Preserved Ejection Fraction (HF-pEF). It is unknown if these two clinical presentations represent two different pathologies or two manifestations of the same clinical entity. HF-pEF is found in about 40-50% of patients with heart failure and its evolution is similar to that of patients with HF-rEF.However, several conceptual difficulties deal with the HFpEF: on one hand, talking about preserved ejection fraction implies the knowledge of its basal value; on the other, the normality needs to be established. Moreover, considering the heart either as a hemodynamic pump or as a muscular pump may modify the understanding of HFpEF physiopathology.We therefore set up a swine model of diastolic dysfunction with preserved ejection induced by chronic hypertension, which was obtained by continuous perfusion of angiotensin II during 28 days. In these conditions, we clearly demonstrated a LV function impairment, while the ejection phase parameters remained preserved. The LV impairment is demonstrated by: 1) the paradox increase of the relative durations of isovolumic contraction and relaxation; 2) the blunted responses of the isovolumic phases of cardiac cycle to heart rate augmentation and cardiac inotropisme; 3) a straight relationship between these two isovolumic phases (contraction-relaxation relationship).The mismatch between the heart rate and the isovolumic phases behaviour led us to investigate the possible effects of the heart rate pharmacological modulation on the contraction-relaxation coupling. The selective reduction of the heart rate by ivabradine administration (a selective If channel inhibitor) was able to significantly reduce the isovolumic contraction and relaxation phases' durations, thus improving filling phase dynamics. Anyway, this “normalisation” was only apparent, because the contraction to relaxation ratio was increased at day 28, to the detriment of the isovolumic contraction.In conclusion, chronic hypertension induces a diastolic dysfunction with a preserved ejection fraction paralleled by a systolic dysfunction which is responsible of a blunted myocardial response to stress.

L'administration chronique de rHuEPO peut engendrer de graves effets secondaires. Une augmentation de l’hématocrite provoquée par la rHuEPO, en augmentant l'érythrocytose, la viscosité sanguine et les forces de cisaillement à la surface vasculaire, peut être responsable d'hypertension artérielle (HTA) et de thromboses artérielles. La présence d'une fonction endothéliale normale et de monoxyde d'azote (NO) peut contrer les effets délétères thrombogène et hypertenseur de l'EPO. Sur ces bases, nous avons étudié les effets cardiovasculaires d'une administration chronique de rHuEPO dans différentes situations : dans le cadre du dopage, chezdes rats "sportifs" présentant une dysfonction endothéliale NO-dépendante induite par l'administration chronique de L-NAME et dans le cadre d'un traitement chez des rats urémiques développant une dysfonction endothéliale NO-dépendante résultante d'une néphrectomie de 5/6de la masse rénale. Chez nos rats entrainés, dopés et traités au L-NAME, nous avons observé une altération de la performance physique avec une mortalité importante (51%). Une HTA sévères'est développée chez ces rats, avec des valeurs de pression artérielle (> 220 mmHg) bien plusélevées que celles des rats recevant le L-NAME seul, associée à une altération de la vasorelaxation NO-dépendante aortique (< 60%). Les rats insuffisants rénaux (IRC) ont eux aussi montré une augmentation de la pression artérielle et une dysfonction endothéliale en réponse àl'acétylcholine au niveau de l'aorte et en réponse à une élévation du flux au niveau de l'artère mésentérique perfusée. Ces différents paramètres ont été améliorés par l'exercice. Les coupes de rein colorées au rouge Sirius ont montré une fibrose accentuée chez les rats CKD. La fibrose, la créatinémie et l'albuminurie ont été diminuées par l'exercice seul mais ont été aggravées chez les rats du groupe CKD+EPO+Ex. L'activité NADPH oxydase et l'expression des Nox4, p67phox etMAPK erk1/2 ont été augmentées chez les les rats CKD. L'exercice ou la rHuEPO ont prévenuces augmentations. Cependant, l'activité de la NAD(P)H oxydase et l’expression des MAPKerk1/2 sont restées élevées dans le rein des rats CKD+EPO+Ex. Nos données suggèrent que l'exercice seul a un effet protecteur contre les dysfonctions vasculaire et rénale et la fibrose rénale. Ces effets protecteurs sont associés à une inhibition de l'activité de la NADPH oxydase et des voies de signalisation MAPK erk1/2. Par contre, l'exercice combiné avec le traitement rHuEPO, a des effets délétères sur la structure et la fonction rénale des rats CKD. Ces effets nocifs semblent liés à la stimulation de la NADPH oxydase et des voies de signalisation MAPKerk1/2. Malgré les effets protecteurs cardiovasculaire et rénal de l'entraînement physique, ces résultats mettent en évidence que la fonction rénale peut être potentiellement endommagée ainsique la structure du rein en combinant l'exercice avec le traitement rHuEPO dans l'insuffisance rénale. En conclusion, nous pouvons dire que la rHuEPO affecte gravement la fonction cardiovasculaire du rat entraîné présentant une dysfonction endothéliale. Ce risque étant fatal,beaucoup de sportifs, voulant augmenter leur performance, mettent leur vie en danger. Par ailleurs, ayant remarqué les effets délétères au niveau rénal, en associant exercice et traitement rHuEPO dans des conditions expérimentales sur un modèle d'insuffisance rénale, nous suggérons une investigation clinique afin de vérifier la transposition de nos résultats aux patients insuffisants rénaux. / The chronic administration of rHuEPO can engender side effects. An increase of the hematocritinduced by rHuEPO, by increasing the erythrocytosis, the blood viscosity and the shear stress onvascular surface, can be responsible of arterial high blood pressure and arterial thrombosis. Thepresence of a normal endothelial function and nitric oxide (NO) can counter the noxious effectsof rHuEPO. On these bases, we studied the cardiovascular effects of a chronic administration ofrHuEPO in various frames: within doping field, to trained rats with L-NAME-induced NOdependentendothelial dysfunction and within the framework of a treatment, to chronic kidneydisease (CKD) rats developing endothelial dysfunction caused by the "5/6 nephrectomy". In ourdoped rats, we observed an important mortality (51%). A severe arterial high blood pressuredeveloped in these rats (> 220 mmHg) associated with an impairment of the NO-dependentvasorelaxation (< 60 %). CKD rats also showed an increase in blood pressure and an endothelialdysfunction, in response to acetylcholine in the aorta and in response to a rise in flow in perfusedmesenteric artery. These parameters were improved by exercise. Kidney sections stained withSirius red showed marked fibrosis in CKD rats. Fibrosis, creatinine and albumin were decreasedby exercise alone but were increased in rats from the CKD + EPO + Ex group. NAD(P)H oxidaseactivity and the expression of Nox4, p67phox, and MAPK erk1/2 were increased in CKDrats. Exercise or rHuEPO prevented these increases. However, the NAD(P)H oxidase activityand the expression of MAPK erk1/2 remained high in the kidney of rats from the CKD+EPO+Exgroup. Our data suggest that exercise alone has a protective effect against vascular and renaldysfunction and renal fibrosis. These protective effects are linked to the downregulation of theNADPH oxidase activity and MAPK erk1/2 signaling pathways. However, exercise combinedwith rHuEPO treatment has deleterious effects on kidney structure and function in CKDrats. These adverse effects appear to be related to the stimulation of NADPH oxidase and MAPKerk1/2 signaling pathways. Despite the cardiovascular and renal protective effects of physicaltraining, these results highlight the potentially damaging renal function and structure bycombining exercise with rHuEPO therapy in renal failure. In conclusion, we can say that therHuEPO affects seriously cardiovascular function in trained rat with endothelial dysfunction. Thisrisk being fatal, many sportsmen, looking to increase their performance, put their life in danger.Moreover, having noticed the deleterious effects in the kidney by combining exercise andrHuEPO therapy under experimental conditions on a model of renal failure, we suggest a clinicalinvestigation to verify the transposition of our results to patients with renal failure

Afin d’identifier de nouveaux composés prévenant la dysfonction et l’immunogénicité des cellules endothéliales qui sont impliquées dans la survenue des rejets de greffe,nous nous sommes intéressés aux métabolites secondaires de différentes espèces de Clusiaceae et de Calophyllaceae. Tout d’abord, 4 extraits DCM de Calophyllaceae malaisiennes ont été sélectionnés sur la base d’une étude déréplicative et d’un criblage biologique anti-inflammatoire. Puis, l’étude phytochimique de l’extrait de fruits de Mesua lepidota a permis d’isoler 9 coumarines de type mammea, dont 7 constituent 2 nouvelles séries : Les lépidotols et les lépidotines. L’étude des extraits de 2 lots de feuilles de Calophyllumtetrapterum a quant à elle conduit à l’isolement de dérivés polyphénoliques distincts : Desacylphloroglucinols polyprénylés dans le lot A, dont le composé majoritaire, la tétraptérone, est un dérivé acide original, et des pyranochromanones acides dans le lot B, dont un nouveau dérivé appelé acide tétraptérique. Le même protocole appliqué à l’extrait de feuilles de Mesuaassamica a montré que les fractions cytotoxiques sont riches en xanthones, tandis que les fractions anti inflammatoires renferment des coumarines de type mammea. Parallèlement à ces études phytochimiques, un panel de polyphénols représentatifs des classes chimiques retrouvées dans les Clusiaceae et les Calophyllaceae ont été évalués pour leurs effets sur divers marqueurs endothéliaux de l’inflammation et de l’immunité. Il apparaît ainsi que les coumarines de type mammea et la guttiférone J, une benzophénone polyprénylée, inhibent significativement l’expression de VCAM-1 ainsi que des molécules HLA de classe II, HLAE et MICA. / In order to identify new compounds preventing endothelial cells dysfunction and immunogenicity which are involved in the emergence of graft rejection, the secondary metabolites of different Clusiaceae and Calophyllaceae specious were investigated. Firstly 4DCM extracts originating from Malaysian Calophyllaceae specious were selected through a dereplication analysis combined with an anti-inflammatory screening. Then, the phytochemical study of the fruits extract of Mesualepidota allowed us to isolate 9 mammea coumarins, among which 7 represent 2 novel series, i.e. lepidotols and lepidotins. The phytochemical study of 2 different batches of Calophyllum tetrapterum leaves led to the isolation of distinct polyphenolic derivatives : polyprenylated acylphloroglucinols were identified in batch A, with the major compound, tetrapterone, as a new acid derivative, whilst chromanone acids were identified in batch B, including a new derivative named as tetrapteric acid. The same protocol applied to Mesuaassamica leave extract showed that cytotoxic fractions were rich in xanthones whereas anti-inflammatory fractions contained numerous mammea coumarins. Along with these phytochemical studies, a panel of polyphenols representative of the chemical classes generally identified in Clusiaceae and Calophyllaceae specious were evaluated for their effects on various endothelial markersof inflammation and immunity. Mammea coumarins and guttiferone J, a polyprenylated benzophenone, appeared to significantly inhibit the expression of VCAM-1 as well as that of HLA class II molecules, HLA-E and MICA.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie grave caractérisée par une obstruction progressive des artères pulmonaires de petit calibre, conduisant à une augmentation des résistances vasculaires pulmonaires et, à terme, à une défaillance cardiaque droite et au décès du patient. La vasoconstriction, le remodelage vasculaire et la dysfonction endothéliale pulmonaire sont autant de facteurs qui contribuent au développement et à la progression de la maladie. Plusieurs arguments sont également en faveur d’une hypothèse de désordres immunologiques, voire autoimmuns, dans la physiopathologie de l’HTAP. Malgré ces données, le lien entre endothélium pulmonaire et système immunitaire dans cette maladie restent peu connus. Ce travail de thèse a donc eu pour objectif d’étudier et mieux comprendre la nature et les conséquences d’une communication aberrante entre cellules endothéliales pulmonaires et système immunitaire dans la pathogénèse de l‘HTAP, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, nous avons analysé le rôle de la dysfonction endothéliale dans la régulation de deux processus de la dysfonction immunitaire : l’autoimmunité pour la réponse adaptative d’une part, et la sécrétion de cytokines en ce qui concerne la réponse innée d’autre part. A travers ce travail de thèse, nous avons mis en évidence l’existence d’une communication aberrante entre endothélium pulmonaire et système immunitaire dans l’HTAP et montré que l‘endothélium pulmonaire jouait un rôle primordial dans le contrôle des réponses adaptatives, en régulant la fonction des lymphocytes T régulateurs via la leptine, et dans la participation active à la réponse innée, en acquérant un phénotype pro-inflammatoire. Cette meilleure compréhension du rôle de la dysfonction endothéliale dans la dérégulation du système immunitaire présente dans l’HTAP pourrait aider au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a severe disease characterized by a progressive obstruction of small pulmonary arteries, leading to an increase in pulmonary vascular resistance and ultimately right heart failure and death. Vasoconstriction, vascular remodeling and pulmonary endothelial dysfunction contribute to the disease development and progression. Increasing evidence are also suggesting the importance of immune disorders, such as autoimmunity, in PAH pathophysiology. Despite these data, the link between pulmonary endothelium and immune system is still unclear. The objective of this work was to investigate and elucidate the nature and the consequences of an aberrant communication between pulmonary endothelial cells and immune system in PAH pathogenesis, in order to identify new therapeutical targets. Therefore, we analyzed the role of endothelial dysfunction in the control of two types of altered immune responses: autoimmunity for the adaptive response and cytokine secretion for the innate response. In this work, we highlighted the existence of an aberrant communication between pulmonary endothelium and immune system in PAH and showed that pulmonary endothelium played a key role in the control of adaptive responses, by regulating regulatory T lymphocyte function in a leptin-dependent manner, and by actively participating to the innate responses through a pro-inflammatory phenotype. A better understanding of the role of endothelial dysfunction in PAH immune system dysregulation may help to the development of new therapeutical strategies for this disease.