Adenine nucleotides hydrolysis is an important step of the neuromodulation of CNS and some of its breakdown products are able to protect the nervous tissue against brain injuries. The activity of NTPDase (EC 3.6.1.5, apyrase, CD39) was verified in cerebrospinal fluid (CSF) from patients without neural inflammatory process under different conditions and in the presence of several inhibitors. The samples were chose considering the low protein levels, normal glucose levels, low leukocyte count and CSF differential count. We chose use the supernatant 1 (S1) for enzyme assay due to the best enzymatic activities in this fraction. The best hydrolyze temperature was 37°C to ATP and ADP. This enzyme was cation-dependent, with a maximal rate for ATP and ADP hydrolysis in pH 8.0 in the presence of 5mM Ca+2. Sodum azide inhibited both nucleotide hydrolysis at concentrations higher than 10 mM. Sodium fluoride inhibited the ATP and ADP hydrolysis at concentrations of 15 mM and 20 mM. The Na+ K+ ATPase inhibitor ouabain, did not affect ATP or ADP hydrolysis. The inhibitor P-type ATPase lanthanum 5mM was ineffective on ATPDase hydrolysis. Suramin (30-300 μM) inhibited ATP and ADP hydrolysis and presented a maximal inhibitory effect of 50% at 300 μM. The results of the present study demonstrated that ATP and ADP hydrolysis from human CSF presented a similar response those obtained from rat synaptosomes. / A análise do líquor é de grande importância para a detecção de desordens neurológicas de diversas etiologias. O ATP junto a seus produtos de hidrólise (ADP, AMP e adenosina) desempenha importantes funções junto ao SNC, as quais envolvem ações neuroprotetoras em doenças de etiologias variadas. O presente estudo tem como objetivos verificar a ocorrência de hidrólise de nucleotídeos da adenina em líquor de pacientes sem doença inflamatória do sistema nervoso. A determinação da atividade enzimática da NTPDase foi feita em líquor humano em diferentes condições experimentais e na presença de inibidores. As amostras foram escolhidas de acordo com os baixos níveis protéicos, valores normais de glicose e contagem celular diminuída. Foi escolhido o sobrenadante 1 (S1) por apresentar melhores atividades enzimáticas. A melhor temperatura de hidrólise do ATP e ADP foi 37°C. Esta enzima é cátion dependente, sendo a atividade de hidrólise ótima do ATP em presença de 5 mM Ca+2 e o ADP 5-7 mM de Ca+2, ambos em pH 8.0. A azida sódica alterou a atividade enzimática do ATP e do ADP somente nas concentrações mais altas deste inibidor da ATPase mitocondrial. A ouabaína, um inibidor da Na+/K+ ATPase não afetou a hidrólise do ATP/ADP. O inibidor de ATPase tipo-P lantânio (5 mM) foi ineficaz na hidrólise dos nucleotídeos. O suramin (30-300 XM), inibidor específico de NTPDase, inibiu a hidrólise do ATP/ADP e apresentou máximo efeito inibitório na concentração de 300 XM. Os resultados deste estudo mostraram que a hidrólise de ATP/ADP em líquor humano apresentou uma resposta semelhante àquelas obtidas em sinaptossomas de ratos.

Trypanosoma evansi is a protozoan parasite which infects a wide variety of mammalian hosts leading to the development of trypanosomiasis. Several papers have investigated the enzymatic changes in lymphocytes, important cells involved in immune responses, which are important for understanding the pathological mechanism of trypanosomiasis in animals. Among them we highlight the ectoATPases, enzymes that hydrolyze extracellular nucleotides and nucleosides of adenine. The curcumin (cur) has been associated with several beneficial effects associated with its use in animals experimentally infected with T. evansi, since this compound exhibits its properties among inflammatory and anti-parasitic effects. This study aimed to evaluate the activity of enzymes of the purinergic system in lymphocytes of rats supplemented or not with curcumin 30 days before infection with Trypanosoma evansi. Thirty-two adult male Wistar rats were divided into four groups. The uninfected control group (C) received saline intraperitoneally (IP), the infected control group (CI) received by the same route 0.2 ml of blood with 1x106 parasites and treatment with corn oil. The group pre-infection 20 (PreI20) received 20mg/kg curcumin and pre-infection group 60 (PreI60) received 60mg/kg of curcumin for 30 days prior to inoculation with T. evansi. After inoculation, the 03 treated groups continued to receive daily curcumin within 15 days before euthanasia. The NTPDase activity for both the hydrolysis of ATP to ADP increased significantly in the infected control group compared to the control group (P <0.05). The ADA activity decreased significantly in the infected control group compared to the control (P <.05). The use of curcumin at doses of 20 and 60 mg / kg for 30 days prior to infection with T.evansi reduced significantly NTPDase activity and increased significantly ADA activity in the treated groups (P <0.05). The results of this study support the evidence that the use of curcumin prior infection with T. evansi induces immunomodulatory effects, since they maintain the NTPDase activity reduced in lymphocytes, and maintains high ADA activity, favoring the response against the parasite. Thus, it is suggested that curcumin can be used as a food supplement for animals in areas where trypanosomosis is endemic. / O Trypanosoma evansi é um protozoário o qual infecta uma grande diversidade de hospedeiros mamíferos levando ao desenvolvimento da tripanossomíase. Diversos trabalhos têm investigado as alterações enzimáticas em linfócitos, importantes células envolvidas com respostas imunológicas, as quais são importantes para a compreensão do mecanismo patológico da tripanossomíase em animais. Dentre elas se destacam as NTPDases, enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares de adenina. A curcumina (Cur) tem sido relacionada com diversos efeitos benéficos associados ao seu uso em animais experimentalmente infectados com o T. evansi, uma vez que este composto apresenta dentre suas propriedades efeitos antiinflamatórios e antiparasitários. Este estudo teve por objetivo avaliar a atividade das enzimas do sistema purinérgico nos linfócitos de ratos, suplementados ou não com curcumina 30 dias antes da infecção por Trypanosoma evansi. Trinta e dois ratos Wistar adultos foram distribuídos em grupos controle não infectado (C), recebeu solução fisiológica via intraperitoneal (IP), o grupo controle infectado (CI) recebeu pela mesma via 0,2ml de sangue com 1x106 parasitas e tratamento com óleo de milho. O grupo pré-infecção 20 (PreI20) recebeu 20mg/kg de curcumina e o grupo pré-infecção 60 (PreI60) recebeu 60mg/kg de curcumina por 30 dias prévios à inoculação com T. evansi.. Após a inoculação, os 3 grupos tratados continuaram a receber a curcumina diariamente no período de 15 dias até a eutanásia. A atividade da NTPDase tanto para a hidrólise do ATP quanto do ADP aumentou significativamente no grupo CI quando comparado ao grupo controle (P<0,05). A atividade da ADA diminuiu significativamente no grupo CI em relação ao controle (P<0,05). A utilização da Curcumina nas doses de 20 e 60mg/Kg por 30 dias prévios a infecção com o T. evansi reduziu significativamente a atividade da NTPDase e aumentou significativamente a atividade da ADA nos grupos tratados (P<0,05). Os resultados deste trabalho reforçam a evidencia que o uso da curcumina previamente a infecção por T. evansi induz efeitos imunomodulatórios, pois mantêm a atividade da NTPDase nos linfócitos reduzida, e mantém alta a atividade da ADA, favorecendo a resposta contra o parasita. Desta forma, sugere-se que a curcumina possa ser utilizada como suplemento alimentar para animais em áreas onde a tripanosomose é endêmica.

The thrombogenic process that affects the hypertensive patient is associated with regulatory mechanisms present in the vascular endothelium. These mechanisms involve the release of a endothelium-derived relaxing factor, ectonucleotidases and calcium ions. Considering that vasodilators act both on blood pressure and on homeostasis, we evaluated the interference of different vasodilators on platelet NTPDase activity in hypertensive and healthy patients, with the objective of verifying patient sensitivity to vasodilators. In addition, the kinetic behavior of NTPDase was determined in the presence of the vasodilator that showed the greatest inhibitory influence. The results showed a decrease in NTPDase activity in the presence of arginine (0.025 mM 3.0 mM), sodium nitroprusside (0.01 mM 2.0 mM) and hydralazine (20.0 μM 90.0 μM), when tested for ATP and ADP substrate. However, the hydrolysis of ATP and ADP substrates increased when tested in the presence of arginine in the control group. No effects on enzyme activities were observed when pharmacological doses of captopril were tested in vitro. Kinetic behavior studies were estimated in the presence of sodium nitroprusside, which caused a mixed inhibition. The Km values increased and Vmax decreased with increasing sodium nitroprusside concentrations. The IC50 values were 3.66 mM and 2.64 mM (control group) and 2.08 mM and 3.15 mM (hypertensive group) for ATP and ADP, respectively. The Ki values obtained were 0.345 mM and 2.00 mM for the control group and 0.167mM and 0.325 mM for the hypertensive group, using ATP and ADP as substrate, respectively. In conclusion, based on these results it is possible to speculate that there is an interaction between vasodilators, donors of nitric oxide, and the inhibition of adenine nucleotide hydrolysis on platelets of hipertensive patients. / O processo trombogênico que afeta os pacientes hipertensos está associado com mecanismos regulatórios presentes no endotélio vascular. Esses mecanismos envolvem o fator de relaxamento do endotélio, as ectonucleotidases e íons cálcio. Considerando que os vasodilatadores atuam em ambos, na pressão sangüínea e na homeostase, foi avaliada a interferência de diferentes vasodilatadores na atividade da NTPDase de plaquetas de hipertensos e pacientes saudáveis, com o objetivo de verificar a sensibilidade destes pacientes aos vasodilatadores. Além disso, foi determinado o comportamento cinético da NTPDase na presença do vasodilatador que apresentou maior influência inibitória. Os resultados mostraram uma diminuição na atividade da NTPDase na presença de arginina (0,025 mM 3.0 mM), nitroprussiato de sódio (0,01 2,0 mM) e hidralazina (20,0 μM 90,0 μM), quando testada para os substratos ATP e ADP em plaquetas do grupo hipertensos. Porém, a hidrólise dos substratos ATP e ADP aumentou quando testado na presença de arginina no grupo controle. Nenhum efeito foi observado sobre a atividade da enzima quando doses farmacológicas de captopril foram testadas in vitro. Estudos do comportamento cinético foram realizados na presença de nitroprussiato de sódio, o qual causou uma inibição mista. Os valores de Km aumentaram e os de Vmax diminuíram com o aumento da concentração de nitroprussiato de sódio. Os valores de IC50 foram 3,66 mM e 2,64 mM (grupo controle) e 2,08 mM e 3,15 mM (grupo hipertenso) para ATP e ADP, respectivamente. Os valores de Ki obtidos foram 0,167 mM e 0,325 mM para o grupo hipertensos, usando ATP e ADP como substrato, respectivamente. Contudo, baseado nos resultados encontrados, é possível sugerir que existe uma interação entre vasodilatadores, doadores de óxido nítrico e a inibição da hidrólise de nucleotídeos da adenina em plaquetas de pacientes hipertensos.

Made available in DSpace on 2018-06-27T18:56:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Liliani Mathias Brum.pdf: 1503888 bytes, checksum: ad2eacb7dc98b3e5fbf2604c9ae82084 (MD5) Liliani Mathias Brum.pdf.jpg: 3065 bytes, checksum: 9adf1c37fd40ed3180ec5d7ac9fc8754 (MD5) Previous issue date: 2008-09-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Since the extracellular nucleotides represent an important means of modulating the activity of lymphocytes, it is essential the presence of an enzymatic mechanism to keep constant the concentration of those in the extracellular space. The activity of NTPDase has been recognized as a marker of activation necessary for the function of effector lymphocytes, participate in the processes of recognition of antigen. Contact dermatitis occurs in a delayed hypersensitivity reaction of type IV, mediated by cells through a mechanism that sensitizes the immune T lymphocyte to an antigen protein or a hapten linked to a protein. Among the mediators able to modulate the actions of lymphocytes stand out from the nucleoside and nucleotide adenine, in particular the extracellular ATP that is able to regulate the cell-cell interactions are important processes of activation, differentiation, development, proliferation, cell death and responses of effector lymphocytes. This study sought to determine first of the hydrolysis of adenine nucleotides, the NTPDase (EC 3.6.1.5, nucleoside triphosphate difosfoidrolase, CD39) in lymphocytes from mice with dermatitis induced by nickel sulphate to 5%, before and after treatment with dexamethasone and dexamethasone nanostructured free to try to check the possible changes in the activity of this enzyme front of an inflammatory reaction of type IV hypersensitivity and immunosuppressive therapy. Moreover, it was possible to verify the relationship of submission of the drug in the formulation free and nanostructures with the hydrolysis of adenine nucleotides. The average enzymatic activity of the group with contact dermatitis was significantly higher in the control group by the test of hypotheses to averages T. The results are in line with work done earlier that showed an increase of enzyme activity by the activation of lymphocytes. The hydrolysis of ATP and ADP in the group treated with dexamethasone free and in the group treated with dexamethasone nanostructured was significantly higher in the control group by analysis of variance for a way (ANOVA) followed by Kruskal-Wallis test (P < 0001). The results are in line with work done earlier that showed an increase of enzyme activity by the activation of lymphocytes. Was observed greater hydrolysis of ATP and ADP in the group treated with dexamethasone nanostructures in relation to the group treated with dexamethasone free. However, this difference was not statistically significant. Work previously shown an increase of enzyme activity during treatment with dexamethasone as a possible compensatory effect of the decrease in the number of lymphocytes. The results of this study suggest that dexamethasone nanostructures possess a immunosuppressive effects greatest, which may be the beginning of the evaluation of a more effective and safe treatment for contact dermatitis. From these results we can conclude that the determination of the activity of NTPDase in lymphocytes could be used as an indicator of the efficiency of the treatment of contact dermatitis / Uma vez que os nucleotídeos extracelulares representam uma importante via de modulação da atividade dos linfócitos, é indispensável a presença de um mecanismo enzimático capaz de manter constante a concentração desses no espaço extracelular. A atividade da NTPDase tem sido reconhecida como um marcador de ativação necessário para a função efetora dos linfócitos, participando também dos processos de reconhecimento do antígeno. Na dermatite de contato ocorre uma reação de hipersensibilidade retardada tipo IV, mediada por células, através de um mecanismo imunológico que sensibiliza os linfócitos T frente a um antígeno protéico ou a um hapteno ligado a uma proteína. Dentre os mediadores capazes de modular as ações dos linfócitos destacam-se os nucleosídeos e nucleotídeos da adenina, em especial o ATP extracelular que é capaz de regular as interações célula-célula sendo importante nos processos de ativação, diferenciação, desenvolvimento, proliferação, morte celular e respostas efetoras dos linfócitos. Este estudo procurou determinar primeiramente a hidrólise de nucleotídeos da adenina, pela NTPDase (EC 3.6.1.5, nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase, CD39) em linfócitos de ratos com dermatite induzida por sulfato de níquel, antes e após tratamento com dexametasona livre e dexametasona nanoestruturada, para tentar verificar as possíveis alterações na atividade desta enzima frente a uma reação inflamatória de hipersensibilidade tipo IV e na terapia imunossupressora. Além disso, procurou-se verificar a possível relação da apresentação do fármaco na formulação livre e nanoestruturada com a hidrólise de nucleotídeos da adenina. A atividade enzimática média do grupo com dermatite de contato foi significativamente maior em relação ao grupo controle pelo teste de hipóteses para médias T. Os resultados encontrados estão de acordo com trabalhos realizados anteriormente que demonstram um aumento da atividade enzimática pela ativação dos linfócitos. A hidrólise do ATP e do ADP no grupo tratado com dexametasona livre e no grupo tratado com dexametasona nanoestruturada foi significativamente maior em relação ao grupo controle pelo teste de análise de variância de uma via (ANOVA) seguido pelo teste de Kruskal-Wallis (P< 0,001). Observou-se uma maior hidrólise de ADP e ATP, no grupo tratado com dexametasona nanoestruturada em relação ao grupo tratado com dexametasona livre. No entanto, esta diferença não foi estatisticamente significativa. Trabalhos anteriores já demonstraram um aumento de atividade enzimática durante tratamento com dexametasona como um possível efeito compensatório à diminuição do número de linfócitos. Os resultados deste estudo sugerem que a dexametasona nanoestruturada possui um efeito imunossupressor maior, o que pode ser o início da avaliação de um tratamento mais eficaz e seguro para a dermatite de contato. A partir destes resultados podemos concluir que a determinação da atividade da NTPDase em linfócitos poderia ser utilizada como um indicador da eficiência da terapêutica da dermatite de contato.

Made available in DSpace on 2018-06-27T18:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Luciana dos Santos Lopes.pdf: 903442 bytes, checksum: 9241c2c46a0d205e6d9e1b049687e5f7 (MD5) Luciana dos Santos Lopes.pdf.jpg: 3030 bytes, checksum: 0c80e97bb571acad00dbccdd7ce7c921 (MD5) Previous issue date: 2009-01-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The NTPDase (apirase-ect, ect-difosfoidrolase, CD39, EC 3.6.1.5) hydrolyses tri nucleotides and/or diphosphate. It is an ectonucleotidase, identified as the antigen surface of lymphoid cells, whose greatest expression leads to an increase in activity of ATPase and ADPase and these cells through the hydrolysis of ATP and ADP. The inhibitor of ecto-nucleotidases may represent valuable therapeutic tools to amplify the biological effects of extracellular nucleotides, since they induce apoptosis in lymphocytes, causing a state of immunosuppression. It is known through the literature that sodium azide produces a significant inhibition in the hydrolysis of ATP and ADP, caused this enzyme when it is used in concentrations around 20mM. The azides are chemical components widely used in organic synthesis, and remarkably stable in biological environment. The aim of this study was to determine the inhibitory effects of an organic azide derived from acetic acid in the hydrolysis of ATP and ADP, which is the activity of NTPDase of human lymphocytes. Since changes in distribution and activity of this enzyme have been reported in various pathological conditions, demonstrating its participation in the activation of lymphocyte, it is believed that the identification of new compounds inhibiting NTPDase will contribute to treatment of diseases where there is a need for immunosuppression, as allergies and autoimmune diseases. After incubation of lymphocytes in medium containing different concentrations of azide organic, there was a significant inhibition of ADP in the hydrolysis when used concentrations of 10 and 20 mM, and this of 50 and 77% respectively. Unverified inhibitory effects on the ATP hydrolysis with organic azide. A changed the hydrolysis of nucleotide adenine diphosphate, indicating that the substance could be used as an inhibitor of mixed NTPDase. / A NTPDase (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase, CD39, EC 3.6.1.5) hidrolisa nucleotídeos tri e/ou difosfatados. É uma ectonucleotidase, identificada como antígeno de superfície de células linfóides, cuja maior expressão leva a um aumento das atividades de ATPase e ADPase nestas células. Os inibidores de ecto-nucleotidases podem representar valiosas ferramentas terapêuticas para amplificar os efeitos biológicos dos nucleotídeos liberados no meio extracelular, uma vez que estes induzem apoptose nos linfócitos, causando um estado de imunodepressão. Sabe-se através da literatura que azida sódica, quando utilizada em concentrações em torno de 20mM, produz uma significativa inibição na hidrólise de ATP e ADP causada por esta enzima. As azidas são componentes químicos muito usados em sínteses orgânicas, sendo notavelmente estáveis em ambiente biológico. Este trabalho, procurou determinar os efeitos inibitórios de uma azida orgânica derivada do ácido acético na hidrólise de ATP e ADP, ou seja, na atividade da NTPDase de linfócitos humanos. Uma vez que alterações na atividade e distribuição desta enzima têm sido relatadas em várias condições patológicas, demonstrando sua participação na ativação do linfócito, acredita-se que a identificação de novos compostos inibidores da enzima NTPDase venha a contribuir em patologias onde há necessidade de uma imunossupressão, como em alergias e doenças autoimunes. Após incubação dos linfócitos em meio contendo diferentes concentrações de azida orgânica, verificou-se uma inibição significativa na hidrólise do ADP quando utilizadas as concentrações de 10 e 20 mM, sendo esta de 50 e 77%, respectivamente. Não foram verificados efeitos inibitórios sobre a hidrólise do ATP. A azida orgânica alterou a hidrólise dos nucleotídeos da adenina difosfatados, indicando que esta substância poderia ser utilizada como um inibidor da NTPDase, cujo tipo de inibição causada seria mista.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-06-21T15:37:43Z No. of bitstreams: 1 daniellegomesmarconato.pdf: 2747967 bytes, checksum: 9b5932356e36c2997fb2e0f9fb1227b9 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:11:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 daniellegomesmarconato.pdf: 2747967 bytes, checksum: 9b5932356e36c2997fb2e0f9fb1227b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniellegomesmarconato.pdf: 2747967 bytes, checksum: 9b5932356e36c2997fb2e0f9fb1227b9 (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares podem funcionar como moléculas de sinalização dos processos inflamatórios e da resposta imune. Nesse contexto, as NTPDases representam uma importante família de enzimas capazes de hidrolisar nucleosídeos di e tri-fosfatados, responsáveis por regular a sinalização purinérgica na maioria dos seres vivos. A homologia entre diferentes enzimas dessa família estimula investigações das interações dos anticorpos direcionados contra as isoformas destas enzimas presentes em parasitos e sua conexão com as isoformas expressas em seus hospedeiros mamíferos. As isoformas de NTPDases do helminto Schistosoma mansoni, denominadas SmATPDases 1 e 2 são antigênicas e exibem uma homologia significativa com as isoformas de NTPDases presentes em células de mamíferos. O objetivo do trabalho foi verificar se anticorpos anti-SmATPDase 1 presentes no soro de animal infectado com S. mansoni podem ter imunorreatividade cruzada com isoforma NTPDase 1 das células do sistema imune de mamíferos. Essa imunorreatividade pode afetar a proliferação e sinalização celular, justificando uma modulação direta da sinalização purinérgica desenvolvida durante a progressão da esquistossomose. Na primeira etapa, foi detectado que os anticorpos contra a isoforma de SmATPDase 1 presente no “pool” de soros de animais infectados foram capazes de reconhecer a isoforma NTPDase 1 em preparações de macrófagos e esplenócitos, resultando na visualização de bandas nítidas com peso molecular de aproximadamente 53 e 58 kDa. A isoforma NTPDase 1 também foi identificada na superfície destas células por imunofluorescência. A reatividade entre preparações de células e anticorpos anti-IgG presentes no soro de animais com esquistossomosse (diluições 1:50 e 1:100) também sugeriu a existência de proteínas homólogas entre o parasito e as células imunes, podendo estar relacionadas às NTPDases. Estes anticorpos utilizados foram capazes de reduzir a atividade fosfohidrolítica nas preparações de macrófagos (22%) e esplenócitos (58%), assim como os anticorpos anti-CD39 promoveram decréscimo nessa atividade em 40% e 83%, respectivamente. Em ensaios de proliferação celular, houve redução na proliferação de macrófagos em 24 h (14%), 48 h (14%) e 72 h (11%) em células incubadas com “pool” soros de animais infectados e com anti-CD39 29%, 12% e 90%, respectivamente. A atividade proliferativa de esplenócitos incubadas com anti-CD39 aumentou nos tempos de 48h (45%) e 72h (70%) e nas células mantidas com soro imune de animal infectado não foi observada nenhuma diferença significativa. Em ensaio de proliferação de linfócitos por citometria de fluxo houve um aumento significativo do número de linfócitos T nos grupos incubados com soro imune (36%) e anti-CD39 (>100%). Por sua vez, houve um decréscimo de 44% na proliferação de linfócitos B tratados previamente com soro de animal infectado e de 34% no grupo tratado com anti-CD39. Com esses resultados sugerimos que a inibição da NTPDase 1 de células imunes por anticorpos produzidos contra a isoforma da enzima do S. mansoni pode ser responsável pela modulação da resposta imune que ocorre na esquistossomose, contribuindo para um perfil Th2. Porém, outros testes são necessários para corroborar essa hipótese. A inibição das NTPDases pode contribuir para o estudo dos mecanismos envolvidos em diversas disfunções relacionadas a defeitos na sinalização purinérgica. / Extracellular nucleotides and nucleosides may act as signaling molecules that control inflammation and immune response. In this context, NTPDases represent an important family of enzymes capable of hydrolyzing di- and tri-phosphate nucleosides which regulate purinergic signaling in most living beings. The homology between different enzymes from the NTPDase family supports new investigations about the interactions of antibodies directed against isoforms of these enzymes in parasites and the connection to their isoforms expressed in mammalian hosts. The NTPDase isoforms in Schistosoma mansoni, called SmATPDases 1 and 2 are antigenic and display a significant homology with the NTPDases isoforms found in mammalian cells. The aim of this work was to verify if anti-SmATPDase 1 antibodies from serum of animals infected with S. mansoni show cross-immunoreactivity with the NTPDase 1 isoform from immune system cells of mammalians. This cross-immunoreactivity could affect cell proliferation and cell signalization, justifying a direct modulation of the purinergic signaling developed during the progression of schistosomiasis. Through western blotting technique we verified that antibodies against SmATPDase isoforms from serum of infected animals were able to recognize NTPDase isoform 1 from homogenized splenocytes and macrophages, resulting in clear display of bands with molecular weights of approximately 53 and 58 kDa. Additionally, NTPDase 1 was identified and localized in these cells by immunofluorescence. The reactivity between preparations of cells and anti-IgG antibodies present in the serum of animals with schistosomiasis (dilutions 1:50 and 1: 100) also suggested the existence of homologous proteins between the parasite and the immune cells that could be related to NTPDases. Antibodies were also able to reduce activity enzyme in preparations of macrophages (22%) and splenocytes (58%). Anti-CD39 promoted decrease in this activity by 40% and 83%, respectively. In cell proliferation assays, there was a reduction in the proliferation of macrophages in 24 h (14%), 48 h (14%) and 72 h (11%) in cells incubated with pool infected animal sera and with anti-CD39 29%, 12% and 90%, respectively. When the splenocytes culture was incubated with anti-CD39, proliferative activity increased in 48h (45%) and 72 h (70%) and in cells maintained with immune serum of the infected animal, it observed no significant difference. The lymphocyte proliferation assay by flow cytometry there is a significant increase in the number of T lymphocytes incubated with immune serum (36%) and anti-CD39 (> 100%). In turn, there was a 44% decrease in proliferation of B cells previously treated with infected animal serum and 34% in the group treated with anti-CD39. These results suggest that inhibition of NTPDase 1 of immune cells by antibodies produced against the isoforms of the S. mansoni could be responsible for modulation of the immune response during the schistosomiasis, conducting to a Th2 response. However, more tests should be carried out to confirm this hypothesis. The NTPDases inhibition may contribute for studies of the mechanisms involved in various disorders related to defects in purinergic signaling.

The meningitis is a serious inflammatory illness of meninges, the membranes that recover and protect encephalo and the spinal cord. The main causing agents of the meningitis are the viruses and the bacteria. Some works affirm that the adenosine, the final product of ATP hydrolysis (when degraded by ectonucleotidases), have an important protective role in brain disorders. Breakdown of extracellular ATP to adenosine is catalyzes by ecto-nucleotidases family, the NTPDase hydrolyze extracellular nucleotide tri and diphosphates (ATP and ADP) to nucleotide monophosphate (AMP) and the 5'-nucleotidase catalyzes the hydrolysis of AMP to adenosine. In this work we verified adenine nucleotides hydrolysis in the CSF of aseptic and bacterial meningitis patients, in order to compare with adenine nucleotides hydrolysis in controls patient (absence of neural inflammatory process). Were used patients with age between 18 and 59 years of both the sex in a sampling of 15 patient controls, 15 patients with aseptic meningitis and 15 patients with bacterial meningitis. For the criteria of inclusion and exclusion had been analyzed parameters like, aspect of the CSF, total counting of leukocytes, distinguishing counting of leukocytes, values of protein, glucose and lactate. We got as resulted a significant reduction of hydrolysis of the ATP in the patients with aseptic and bacterial meningitis when compared with patient controls. In contrast we got a significant increase of hydrolysis of the ADP and the AMP in the two groups of meningitis when compared with the controls. The increase in ADP and AMP hydrolysis maybe means the attempt of increase the adenosine production, that have a recognized neuroprotective actions in brain insults. / A meningite é uma grave doença inflamatória das meninges, as membranas que recobrem e protegem o encéfalo e a medula espinhal. Os principais agentes causadores da meningite são os vírus e as bactérias. Vários trabalhos afirmam que a adenosina, produto final da degradação do ATP (quando degradado pelas ectonucleotidases), possui um importante papel protetor nas desordens cerebrais. A degradação do ATP até adenosina é catalisada pela família das ecto-nucleotidases, a NTPDase hidrolisa nucleotídeos extracelulares tri e di-fosfatados (ATP e ADP) até nucleotídeos mono-fosfatados (AMP), e a 5'-nucleotidase catalisa a hidrolise do AMP até adenosina. Neste trabalho verificou-se a hidrólise dos nucleotídeos de adenina no líquor de pacientes com meningite asséptica e bacteriana, a fim de comparar a hidrólise destes nucleotídeos com pacientes controles (ausência de processo inflamatório neural). Foram utilizados pacientes com idade entre 18 e 59 anos de ambos os sexos em uma amostragem de 15 pacientes controles, 15 pacientes com meningite asséptica e 15 paciente com meningite bacteriana. Para os critérios de inclusão e exclusão foram analisados parâmetros tais como: aspecto do líquor, contagem total de leucócitos, contagem diferencial de leucócitos, valores de proteína, glicose e lactato. Obtivemos como resultado uma diminuição significativa da hidrólise do ATP nos pacientes com meningite asséptica e bacteriana quando comparados com pacientes controles. Ao contrário obtivemos um aumento significativo da hidrólise do ADP e do AMP nos dois grupos de meningites quando comparados com os controles. A hidrólise aumentada do ADP e do AMP refere-se talvez a tentativa de aumentar a produção de adenosina, que por sua vez possui um conhecido papel neuroprotetor frente a insultos cerebrais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The exposure to the cigarette smoke xenobiotics is related with a compromised immune system and the development of many diseases such as Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and lung cancer. The NTPDase and acetylcholinesterase (AChE) are important enzymes involved in the regulation of immune system and alterations in their activities have been showed in many diseases including the related with cigarette smoke-exposure. The curcumin (Cur), polyphenol isolated from the rhizomes of Curcuma longa and widely employed in the culinary and oriental traditional medicine, has many biological activities such as antioxidant, anticarcinogenic and antiinflammatory. Considering the relevance of lymphocytes in the establishment and progression of immune responses, the purpose of this study was to evaluate the effect of curcumin in the NTPDase and AChE activities in peripheral lymphocytes (PL) and lung lymphocytes (LL) from rats exposed to cigarette smoke. The establishment of a protocol to lung lymphocytes separation using the lung tissue was performed with the objective of optimize the cellular viability and the purity of separation, using as references the protocols for separation of human peripheral and lung lymphocytes. The experimental procedure to evaluate the effect of curcumin on the NTPDase and AChE in lymphocytes from rats exposed to the cigarette smoke was divided in two sets of experiments. In the first set, the animals were randomly divided into four groups: Vehicle; Cur 12.5 mg/kg; Cur 25 mg/kg; Cur 50 mg/kg. In the second experimental set, the animals were divided into 5 groups: Vehicle; smoke exposed; smoke and Cur 12.5 mg/kg; smoke and Cur 25 mg/kg; smoke and Cur 50 mg/kg. Curcumin was diluted with corn oil, administered by oral gavage, not exceeding 1 ml/kg body weight. The treatment with curcumin and cigarette smoke was carried out once a day, 5 days each week, during 30 days. It was administered the curcumin or corn oil, and approximately 10 minutes later, the smoking groups were exposed to the sidestream smoke of four commercial cigarettes (nicotine 0.9 mg, tar 10 mg each) inside a whole-body smoke exposure chamber. Control animals were placed in an equal chamber for the same amount of time. After thirty days, the animals were euthanized, the lung was removed and the peripheral blood collected for separation of lymphocytes. With the standardization of the protocol to the separation of lung lymphocytes it was achieved a percentage of lymphocytes higher than 82% and it was observed a strong correlation between the enzyme activity using ATP and ADP as substrates, which indicates that the results can be expressed in milligram of protein, millions of cells and millions of viable cells. The results from the experiments with the cigarette smoke exposure demonstrated that the treatment with curcumin prevented the alterations observed in the cigarette smoke-exposed animals such as the decrease of ATP and ADP hydrolysis in PL and LL, and the increase of AChE activity in PL. We suggest that the treatment with curcumin was protective, since the high concentrations of ATP are positively related with inflammation and tissue damage, and the emphysematous damages observed in cigarette smoke-exposed was not observed in the groups treated with curcumin. / A exposição aos xenobióticos da fumaça do cigarro está relacionada com o comprometimento do sistema imune e o desenvolvimento de diversas doenças como a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e câncer de pulmão. A NTPDase e a acetilcolinesterase (AChE) são importantes enzimas envolvidas na regulação do sistema imune e alterações nas suas atividades tem sido descritas em várias doenças incluindo as relacionadas à exposição à fumaça do cigarro. A curcumina (Cur), polifenol obtido a partir de rizomas de Curcuma longa e amplamente utilizado na culinária e na medicina tradicional oriental, possui muitas atividades biológicas como antioxidante, anticarcinogênica e antiinflamatória. Tendo em vista a relevância dos linfócitos no estabelecimento e progressão de respostas imunes, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da curcumina na atividade das enzimas NTPDase e AChE em linfócitos periféricos (PL) e linfócitos pulmonares (LL) de ratos expostos à fumaça do cigarro. A padronização da separação dos linfócitos a partir de tecido pulmonar foi realizada com o objetivo de otimizar a viabilidade celular e a pureza da separação, utilizando-se como base os protocolos de separação de linfócitos periféricos e pulmonares de seres humanos. Os procedimentos experimentais para a avaliação do efeito da curcumina sob a atividade das enzimas NTPDase e AChE em linfócitos de ratos expostos à fumaça do cigarro foram divididos em duas etapas. Primeiramente, os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: veículo; Cur 12.5 mg/kg, Cur 25 mg/kg; Cur 50 mg/kg. Na segunda etapa experimental os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: veículo; cigarro; cigarro e Cur 12.5 mg/kg; cigarro e Cur 25 mg/kg; cigarro e Cur 50 mg/kg. A curcumina foi diluída em óleo de milho, administrada por gavagem oral, não excedendo 1 ml/kg de massa corpórea. O tratamento com a curcumina e com a fumaça do cigarro foi realizada uma vez por dia, cinco dias por semana, durante trinta dias. A curcumina foi administrada e, após aproximadamente dez minutos, os grupos fumantes eram expostos à fumaça de quatro cigarros comerciais (0,9 mg nicotina, 10 mg alcatrão cada) dentro de uma câmara de exposição. Os animais não expostos à fumaça do cigarro foram colocados em uma câmara equivalente, pelo mesmo período. Após trinta dias, os animais foram eutanasiados, os pulmões removidos e o sangue periférico coletado para a separação dos linfócitos. Com a padronização da técnica para a separação de linfócitos pulmonares foi obtido um percentual de linfócitos superior a 82% e ainda observou-se uma forte correlação entre a atividade da enzima usando ATP e ADP como substrato o que indica que os resultados podem ser expressos tanto em miligramas de proteína, quanto em milhões de células quanto em milhões de células viáveis. Os resultados dos experimentos com a fumaça do cigarro demonstraram que o tratamento com a curcumina preveniu as alterações observadas nos animais expostos à fumaça do cigarro como a diminuição na hidrólise de ATP e ADP em PL e LL, e o aumento da atividade da AChE em PL. Analisando os resultados obtidos, sugere-se que o tratamento com a curcumina foi protetor, uma vez que as altas concentrações de ATP estão positivamente relacionadas com inflamação e dano tecidual, e as lesões enfisematosas observadas no grupo exposto à fumaça do cigarro não foram observadas com os tratamentos com a curcumina.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-25T12:58:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177092 bytes, checksum: 246c209ae17c914f543ab3f722afaf0d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-25T12:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177092 bytes, checksum: 246c209ae17c914f543ab3f722afaf0d (MD5) Previous issue date: 2018-02-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A doença de Chagas é causada pelo protozoário intracelular obrigatório Trypanosoma cruzi, e transmitido a humanos e animais vertebrados através do contato de uma solução de continuidade da pele com fezes de insetos triatomíneos infectados. Atualmente, a doença afeta aproximadamente 16 milhões de pessoas em todo o mundo. Somente duas drogas estão disponíveis no mercado para o tratamento de doentes: Benzonidazol e Nifurtimox, no entanto estas apresentam diversos efeitos colaterais, são contra-indicadas a pacientes imunossuprimidos e são eficientes apenas na fase aguda da doença. Levando-se em consideração a eficácia limitada e toxicidade das drogas disponíveis, o desenvolvimento de uma estratégia de vacinação representa uma alternativa para o controle desta doença. Neste sentido, nosso objetivo foi avaliar a resposta imune induzida pela vacinação utilizando a estratégia vacinal “prime-boost” heterólogo DNA/NTPDase-1 de T. cruzi, em camundongos BALB/c. Os resultados indicaram que a imunização com o “prime-boost”, induziu produção de níveis semelhantes tanto de IgG1 quanto de IgG2a, e embora o grupo imunizado com três doses da rNTPDase-1 tenha produzido níveis mais elevados de anticorpos precocemente, quando a avaliação foi feita 15 dias após a última imunização, verificamos que esses níveis eram semelhantes para ambos os grupos imunizados, sendo observada produção mista desses isótipos. Também foi observado, para o grupo ”prime-boost ”, aumento significativo na produção de citocina Th1 (TNF-α) e da quimiocina MCP-1. Avaliando o perfil de células T, verificamos que os animais vacinados seguindo esse mesmo protocolo apresentaram um aumento significativo na frequência de linfócitos T CD8 (CD3 + CD8 + ), além de aumentar de forma significativa o percentual de células T CD4 e CD8 com fenótipo de memória (CD44 high CD62L), quando comparado ao grupo que recebeu três doses da rNTPDase-1 e também o grupo inoculado somente com PBS (controle). Após o desafio, observamos que a imunização tanto com a rNTPDase-1 quando com o “prime- boost” foram eficazes em reduzir a carga parasitária presente no tecido cardíaco dos animais vacinados em comparação ao grupo controle, no entanto a carga parasitária presente no grupo “prime-boost” era inferior quando comparada ao grupo imunizado somente com a rNTPDase-1. A imunização utilizando esses dois protocolos, também resultou em 100% da sobrevivência quando comparados ao grupo controle, onde 50% dos animais haviam morrido durante o período experimental. Diante dos dados observados, sugerimos que a imunização seguindo a estratégia vacinal “prime-boost” heterólogo DNA/NTPDase-1 de T. cruzi, além de induzir polarização da resposta imune para o tipo Th1, também resultou em melhora na proteção. Sendo assim, imunização seguindo a estratégia vacinal “prime-boost” heterólogo DNA/NTPDase-1 de T. cruzi pode ser vista como promissora no controle da doença de Chagas. / Chagas disease is caused by the required intracellular protozoan Trypanosoma cruzi, transmitted to humans and vertebrates animals through of contacto of a continuity solution skin with feces of infected triatomine insects. The disease currently affects approximately 16 million people worldwide. Only two drugs are commercially available for the treatment of patients, such as Benzonidazole and Nifurtimox, however, they have several side effects, are not indicated in immunosuppressed patients and are efficient only in the acute phase of the disease. Due to the limited efficacy and toxicity of the available drugs, the development of a vaccination strategy represents an alternative for the control of this disease. In this regard, our objective was to study the immune response induced by the vaccination using “prime-boost” heterólogo DNA/NTPDase-1 de T. cruzi, in mice BALB/c. Our results indicated that immunization with prime-boost induced production of similar levels of IgG1 and IgG2a, and although the group immunized with rNTPDase-1 produced higher levels of antibodies at the immunization intervals when the evaluation was done 15 days later the last immunization, we check that these levels were similar for both immunized, being observed mixed production of these isotypes. We also observed a significant increase in the production of Th1 cytokine (TNF-α) and chemokine MCP-1 in the prime-boost group, and the T-cell profile showed that the animals vaccinated following the same protocol had a significant increase in the frequency of CD8 T lymphocytes (CD3 + CD8 + ), in addition to significantly increasing the percentage of CD4 and CD8 T cells with memory phenotype (CD44 high CD62L) when compared to the rNTPDase-1 group and also the group inoculated only with PBS (control). After the challenge, we observed that immunization with NTPDase-1 was effective in reducing the level of parasite present in the cardiac tissue of the vaccinated animals compared to the control group, however the parasite level present in the prime-boost group was lower when compared to the group immunized only with rNTPDase-1. Immunization using these two protocols also resulted in 100% survival when compared to the control group, where 50% of the animals died during the experimental period. The observed data, suggest that immunization following “prime-boost” heterólogo DNA/NTPDase-1 of T. cruzi strategy, induced polarization of the Th1-type immune response, also resulted in improved protection. Thus, immunization following the this strategy can be seen as promising in the control of Chagas' disease.

O papel dos nucleotídeos da adenina na função vascular e plaquetária já está bem estabelecido. Apirase (CD39) faz parte de uma família de ecto-enzimas capazes de hidrolisar nucleosídeos di- e trifosfatados da adenosina e sua participação no sistema tromborregulador tem sido estudada. Nós utilizamos um modelo experimental in vivo de trombose arterial aguda para testar a hipótese de que a administração de apirase solúvel pode prevenir a formação de trombos. Vinte e cinco coelhos brancos Nova Zelândia foram submetidos à lesão arterial com cateter balão e, após 15 dias, a um protocolo indutor de trombose. Treze animais receberam duas administrações intravenosas de apirase solúvel (com 90 minutos de intervalo) e 12 animais foram utilizados como controle. Após 3 horas do protocolo indutor de trombose, os animais foram mortos e a taxa e área de trombose foram avaliadas. A taxa de trombose no grupo apirase foi significativamente menor que no grupo controle (69% vs. 16,7%, respectivamente, P=0,015) assim como a área de trombose (1,7 mm2 ± 4,3 vs. 21,7 mm2 ± 37,4, respectivamente, P=0,008). Nossos resultados confirmam a participação da apirase na homeostasia através de um potente efeito antitrombótico. / The role of adenine nucleotides on vascular and platelet functions has long been established. Apyrase (CD39) takes part of a family of ecto-enzymes that hydrolyze adenosine di and triphosphate and its participation on thromboregulatory system is under study. We used an in vivo experimental model of acute arterial thrombosis to test the hypothesis that administering soluble form of potato apyrase could prevent thrombus formation. Twenty five white New Zealand male rabbits suffer balloon aortic endothelium denudation and fifteen days after were submitted to a thrombosis triggering protocol with a procoagulant (Russel’s viper venom) and epinephrine. After the thrombosis triggering protocol 13 animals received two soluble apyrase administration (with 90 minutes interval) and 12 animals that received no treatment were used as controls. Three hours after the triggering protocol, the animals were killed and the rate and area of arterial thrombosis were analyzed. The rate of thrombosis in the apyrase group was significantly lower than the control group (69% vs. 16,7%, respectively, P= 0,015) as well as the area of thrombosis (1,7 mm2 ± 4,3 vs. 21,7 mm2 ± 37,4, respectively, P=0,008). Our results confirm that apyrase do participate in homeostasis through a potent antithrombotic effect.