A linfadenite caseosa é uma doença infectocontagiosas, de ocorrência mundial, que acomete caprinos e ovinos, caracterizada pela formação de abscessos em gânglios linfáticos superficiais, e alguns casos órgãos e linfonodos internos. É uma enfermidade causada pelo Corynebacterium pseudotuberculosis, responsável por grandes perdas econômicas na caprinocultura e ovinocultura. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver um teste sorológico sensível e específico para detectar anticorpos anti-C. pseudotuberculosis em ovinos. Os animais foram classificados em dois grupos, com sintomatologia aparente para linfadenite caseosa (n=103) colhidos a campo, onde foram coletados amostras de soro e punção de linfonodos aumentados; e animais sem sintomatologia aparente (n=50) dos quais as amostras de soro e fragmentos de pulmão e linfonodo mediastínico foram colhidos em frigorífico. Em ambas as amostras a confirmação da presença e ausência da doença foi realizada através das provas de cultivo microbiológico e PCR, considerados nesse estudo como padrão para classificação dos animais. O resultado do cultivo microbiológico dos animais com sintomatologia aparente foi 53,5% (55/103) identificadas como C. pseudotuberculosis através de provas bioquímicas, e com a utilização da PCR, 46,5% (48/103) das amostras foram positivas para C. pseudotuberculosis. Com relação aos animais sem sintomatologia aparente, todas as amostras foram negativas no cultivo microbiológico e PCR (0/50). Na padronização do ELISA indireto foram utilizados 42 soros positivos e 43 soros negativos confirmados no cultivo microbiológico e PCR para linfadenite caseosa. A média de absorbância foi 1,88 com desvio padrão de 0,43, para as amostras positivas e, para as amostras negativas a média de 0,71 e desvio padrão 0,18. Dessa forma foram consideradas positivas, as amostras que apresentaram na reação de ELISA valor da DO> 1,1 e negativas de <1,1. A análise gráfica empregada no presente trabalho, curva ROC, permitiu encontrar o valor do ponto de corte associado à combinação dos parâmetros de sensibilidade e especificidade, assim, a acurácia do teste pôde descriminar indivíduos doentes de não doentes. A utilização de técnicas sorológicas no diagnóstico da linfadenite caseosa permitirá o controle epidemiológico da doença, porém não substitui o cultivo microbiológico, técnica considerada padrão ouro, e pode ser utilizada como teste de triagem ou mesmo na comercialização de animais, visto que a doença muitas vezes é de caráter inaparente, o que inviabiliza o diagnóstico clínico e microbiológico. / Caseous lymphadenitis is an infectious disease of worldwide occurrence that affects sheep and goats, characterized by the formation of abscesses in superficial lymph nodes, and sometimes internal organs and lymph nodes. It is caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, responsible for great economic losses in goat and sheepproduction. This study aimed to develop a sensitive and specific serological test to detect anti- C. pseudotuberculosis in sheep. The animals were divided into two groups, the first one encompassing the ones with apparent caseous lymphadenitis symptoms (n = 103), where serum samples and puncture of enlarged lymph nodes were collected, and the second one with animals with no apparent symptoms (n = 50) of which samples (lung fragments, serum and and mediastinal lymph nodes) were inspected and harvested in the slaughterhouse. In both groups the presence and absence of the disease was carried through the evidence of microbiological culture and PCR, considered as the standard for the groups classification. Microbiological culture results of animals with apparent symptoms was 53.5% (55/103) identified as C. pseudotuberculosis by biochemical tests, and allied to PCR, 46.5% (48/103) of the samples were positive for C. pseudotuberculosis. Regarding animals without apparent symptoms, all samples were negative in microbiological culture and PCR (0/50). For the standardization of indirect ELISA we used 42 positive sera and 43 negative sera confirmed by microbiological culture and PCR for caseous lymphadenitis. The mean absorbance was 1.88 with standard deviation of 0.43 for the positive samples, and for negative samples the average was 0.71 and standard deviation 0.18. Thus we considered as positive, the samples with DO value > 1.1 and negative <1.1. The graphical analysis employed in this study, ROC curve, allowed us to find the cutoff value allied to the association of sensitivity and specificity parameters, thus the test accuracy was able to discriminate sick from not sick individuals. The use of serological techniques for the diagnosis of caseous lymphadenitis will allow the epidemiological control of the disease, but does not replace the microbiological culture, considered as the gold standard technique, and can be used as a screening test or animals trade, since the disease condition often is unapparent, which derails the clinical diagnosis and microbiological.

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The quantization of endocrine disruptors was obtained through direct and competitive ELISA’s method, and all physical-chemical parameters were determined based on the APHA's Manual (2012). The effluent samples were collected at three distinct points: affluent (raw sewage), confluence of the effluent to the river (CER) and downstream of the release in STP’s Hélio Seixo de Brito (HSB), Samambaia (S) and Parque Atheneu (PA), while the samples of potable water were collected at two different points: in the capture of João Leite’s stream and after the water treatment in the WTP Jaime Câmara (JC). Through the physical-chemical parameters evaluated in the STP’s , the Turbidity , both DO and BOD, do not agree with the standards of CONAMA 357/05 and 430/11, which means that a lot of organic and inorganic matter are being dumped into the Meia Ponte River without treatment. In relation to the JC’s WTP, the same physical-chemical parameters are in accordance with the Decree No. 2,914 / 11 from the Ministry of Health, which deals with drinking water quality. The measured values for the E2 in the STP’s ranged in the rainy season around 53, 7 to 178, 24 ng/L and 45, 8 to 275, 0 ng/L in the dry season. In contrast with the progesterone in the same place where the values ranged from 69, 34 to 97, 54 ng / L in the rainy season from 60, 2 to 603, 8 ng / L in the dry season. While in the Meia Ponte River these values to the E2 ranged between 2,04 to 31,62 ng / L in the rainy season from 6,02 to 72,44 ng / L in the dry season and in relation to progesterone 4,35 to 52,48 ng / L in the rainy season 6,6 to 218,25 ng / L in the dry season. At João Leite’s stream, where is made the abstraction of the water for treatment, both in the rainy and drought seasons, E2 values were found 2,13 and 4,89 ng / L and progesterone 5,37 and 6,76 ng / L, however, the treated water that leaves the ETA, it was found in it values of E2 1,81 ng / L and 2,51 ng / L and progesterone 4,78 ng / L and 4,67 ng / L during the rainy and dry seasons, respectively. This search concludes that the biological method ELISA was efficient for the quantification of the studied hormones, and the values found for both the E2 and progesterone to the STP’s and ETA was xvii greater than 1.0 ng / L, and according to the literature these values are able to cause physiological damage in aquatic species. / A toxicologia dos desreguladores endócrinos (DE), conhecidos como micropoluentes, eliminados no meio ambiente através da urina ou fezes, causam alterações fisiológicas em seres vivos aquáticos. Assim, objetivou-se neste estudo avaliar os hormônios 17β-estradiol (E2) e progesterona, e medir a qualidade das águas residuais dos efluentes de algumas Estações de Tratamento de Esgotos (ETEs) e de água potável da Estação de Tratamento de água (ETA) localizados em Goiânia-GO, por meios dos parâmetros físico-químicos como: Potencial Hidrogeniônico (pH), Temperatura (T), Condutividade Elétrica (CE), Turbidez, Sólidos Totais Dissolvidos (TDS), Salinidade, Oxigênio Dissolvidos (OD), Nitrogênio Orgânico Total, Demanda Química de Oxigênio (DQO) e Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO). A quantificação dos desreguladores endócrinos foi realizada através do método de ELISA direto e competitivo e, todos os parâmetros físico químicos foram determinados com base no Manual da APHA (2012). As amostras dos efluentes foram coletadas em três pontos distintos: afluentes (esgoto bruto), confluência do efluente com o rio (CER) e jusante do lançamento nas ETEs Hélio Seixo de Britto (HSB), Samambaia (S) e Parque Ateneu (PA), enquanto que as amostras para avaliar a potabilidade da água em dois pontos diferentes: na captação do Ribeirão João Leite e após o tratamento da água na ETA Jaime Câmara (JC). Dos parâmetros físico químicos avaliados, nas ETEs, a Turbidez, o OD e a DBO, estão em desacordo com as normas do CONAMA 357/05 e 430/11, o que significa que estão sendo despejados no rio Meia Ponte grande quantidade de matéria orgânica e inorgânica sem tratamento. Em relação à ETA JC os parâmetros físico-químicos estão em conformidade com a portaria nº 2.914/11, do Ministério da Saúde, que trata da potabilidade da água. Os valores obtidos para o E2 nas ETEs variaram no período chuvoso entre 53,7 a 178,24 ng/L e no período de estiagem entre 45,8 a 275,0 ng/L. Em contrapartida, em relação a progesterona no mesmo local, esses valores variaram entre 69,34 a 97,54 ng/L no período chuvoso e 60,2 a 603,8 ng/L no período de estiagem. No rio Meia Ponte esses valores para o E2 estiveram entre 2,04 a 31,62 ng/L no período chuvoso e 6,02 a 72,44 ng/L no período de estiagem, e com relação à progesterona, os valores variaram de 4,35 a 52,48 ng/L no período chuvoso e 6,6 a 218,25 ng/L no período de estiagem. No ribeirão João Leite onde é feito a captação de água para tratamento, tanto no período de chuva como estiagem, foram encontrados valores de E2 de 2,13 a 4,89 ng/L, e progesterona de 5,37 e 6,76 ng/L. Na água tratada, que sai da ETA, verificaram-se valores de 1,81 ng/L e 2,51 ng/L, e da progesterona de 4,78 ng/L e 4,67 ng/L nos períodos de chuva e estiagem, respectivamente. Dessa pesquisa se conclui que o método biológico ELISA, foi eficiente para quantificação dos hormônios estudados, e os valores encontrados tanto para o E2 como para a progesterona nas ETEs e ETA foi maior que 1,0 ng/L e segunxv do a literatura esses valores são capazes de provocar danos fisiológicos em espécies aquáticas.

A cisticercose suína é uma doença causada pela larva de Taenia solium, Linneaus, 1758, denominada Cysticercus cellulosae (cisticerco). A doença está amplamente distribuída pelo mundo, sendo mais freqüente nos países onde o consumo de carne suína é elevado e as condições sanitárias são deficientes, como em grande parte dos países em desenvolvimento. A cisticercose causa prejuízo em criações de suínos, pois, a carne infectada torna-se imprópria para o consumo humano. Para o diagnóstico da cisticercose suína são realizados o exame da língua in vivo e o exame post-mortem (necropsia). O exame da língua é pouco sensível apesar da elevada especificidade, uma vez que a localização do parasita pode não ser disseminada. A análise post-mortem é baseada em sítios de predileção dos cisticercos. Por isso, são analisados em rotina de inspeção sanitária, o coração, a língua, o diafragma e músculos mastigadores (masseteres e pterigóide). No entanto, infecções brandas, com reduzido número de cisticercos instalados nos tecidos, podem não ser diagnosticadas na necrópsia, evidenciando uma sensibilidade baixa. Recentemente, tem sido sugerida a implementação de testes imunológicos, dentre eles o ELISA (Enzyme Linked Immunossorbent Assay), que tem por princípio a pesquisa de anticorpos no soro. Assim, o presente trabalho objetiva a avaliação de antígenos no método de ELISA para o imunodiagnóstico da cisticercose suína. Dessa forma, 7 suínos, desmamados, provenientes de criação tecnificada foram infectados com 200.000 ovos de T. solium. Foram coletadas amostras sangüíneas antes da infecção e a cada 7 dias até o 140º dia pós-infecção e os soros obtidos foram congelados a 20ºC negativos. Os soros foram avaliados através do ELISA utilizando antígeno total (T-Tso) e de escólex (Es-Tso) de C. cellulosae e de líquido vesicular de C. longicollis (LV-Tcra). O exame da língua in vivo apresentou sensibilidade baixa pois, não foi detectada a presença de cisticercos nos 7 animais durante o período da infecção. Mediante o exame post-mortem, constatou-se a cisticercose em todos os animais. Por outro lado, a quantidade de cisticercos por animal foi baixa tendo em vista a alta dose de ovos inoculados. Foram detectados ao todo 238 cisticercos, sendo todos viáveis. Quanto à distribuição, foi observado que a musculatura do membro anterior e do membro posterior apresentaram as maiores quantidades de parasitas com 24,38% (58) e 28,57% (68) respectivamente. Apenas 18,67% (43) dos cisticercos foram encontrados em tecidos indicados para inspeção da carne. Quanto ao ELISA, obteve-se a padronização do teste para os 3 antígenos, que detectou aumento significativo de anticorpos à partir do 21º dia p.i., para os 7 suínos. O maior índice de reatividade foi encontrado para o antígeno LV-Tcra. O teste com antígenos Es-Tso e LV-Tcra apresentaram os melhores resultados, detectando níveis de anticorpos acima do cut-off nos soros dos animais. Na análise dos soros dos animais suspeitos através do ELISA com Es-Tso, 64,3% (9) das amostras apresentaram absorbâncias acima do cut-off, sendo os animais considerados prováveis portadores de cisticercose. Ficou demonstrada a boa sensibilidade do ELISA com os 3 antígenos, sobretudo quando utilizados o Es-Tso, detectando a doença em animais com infecção leve. Ademais, o ELISA com o antígeno Es-Tso apresenta-se como uma importante ferramenta na pesquisa epidemiológica da cisticercose. / Swine cysticercosis is a disease caused by the Taenia solium’s metacestodes, called Cysticercys cellulosae (Cisticerci). This disease is largely spread around the world and is more frequent in countries where swine meat consumption is high and sanitary conditions are poor, as in developing countries. Cysticercosis is harmful to the raising of the swine because infected meat is not proper for human consumption. To diagnose swine cysticercosis one clinically examines the tonge in vivo and also examines post-mortem (necropsy). The tonge exam has little sensitivity in spite of its high specificity as the parasite location cannot be determined. Post-mortem analysis is based on metacestodes’s favorite sites. Therefore, the heart, the tonge, the diaphragm, and the chewing muscles (masseteres and pterigoidis) in the tissue are analyzed in the regular sanitary inspection. However, mild infections, with a minor number of metacestodes in the tissues may not be diagnosed in the necropsy, showing that evidently there is an low sensitivity. Recently there has been suggestions of immunological tests, including the ELISA (Enzyme Linked Immunossorbent Assay) which has as a principle the antibodies research in swine’s serum. Thus, this study’s aim is to evaluate the antigens in the ELISA method for immunodiagnosis of the swine cysticercosis. The experiment used 7 weaned swine for technological rising were orally infected with 200.000 T. solium eggs. At every 7 days, up to the 140º day of infection, 10 mL of blood was collected and the serum was frozen at minus 20ºC. The serum were analyzed through the ELISA and the analyses used 3 antigens: total (T-Tso) and scolex (Es-Tso) of C. cellulosae and C. longicollis’s vesicular fluid (LV-Tcra). The in vivo tongue exam showed low sensitivity because at no time during in the infection the presence of metacestodes could be detected. Through the post-mortem exam one could notice the cysticercosis in all animals. However, the amount of metacestodes per animal was very low, considering the high number of inoculated eggs. As a total 238 metacestodes were detected and all were viable. As for distribution, one observed that the muscles of front and hindquarters showed more parasites with 24,38 % (58) and 28,57% (68), respectively. Only 18,67% (43) of metacestodes were found in tissue appointed for meat inspection. As for the ELISA, the standardization was obtained for 3 antigens, that detected a significant rise of antibodies from the 21th day of infection. It was also observed that the test using the 3 antigens could detected antibodies anti-Cysticercus from the 21th day post-infection. The highest rate of reactivity was found for the antigen LV-Tcra. The immunoenzimatic tests with the Es-Tso and LV-Tcra showed best results, detecting antibodies level over the cut-off in the animals. In the analysis of the suspected animals with ELISA using Es-Tso, 64,3% (9) samples showed high absorbance to the cut-off and the animals considered probably cysticercosis carriers. In conclusion, it was proved that there is good sensitivity in the ELISA, particularly when the antigen Es-Tso is used, detecting cysticercosis in animals with mild infection. Moreover, the ELISA with the Es-Tso show as an important tool for the cysticercosis epidemiological research.

A infecção por Cryptosporidium serpentis é uma das enfermidades mais importantes em répteis e se caracteriza por infecção crônica, clínica ou subclínica, e presença de gastrite hipertrófica severa, regurgitação, perda de peso progressiva, mortalidade eventual e eliminação contínua e intermitente de oocistos em fezes. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste imunoenzimático (ELISA) indireto para detecção de anticorpos contra C. serpentis, e acompanhar a evolução clínica, parasitológica e da resposta imune humoral em serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis. Foram utilizadas 21 serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis e alojadas no Instituto Butantan, São Paulo, Brasil. As análises clínica e parasitológica foram realizadas em 21 serpentes por meio do registro diário dos sinais clínicos apresentados e pesquisa mensal da eliminação fecal de oocistos, em lâminas coradas pela técnica de Kinyoun. A avaliação sorológica foi realizada mensalmente utilizando o ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti-C. serpentis, pelo período de 12 meses em 8 animais, 8 meses em 3 animais e 6 meses em 1 animal. O ELISA indireto foi padronizado em bloco com utilização de antígeno produzido a partir de oocistos de C. serpentis, IgY de galinha anti-gamaglobulinas de serpentes e conjugado contendo IgG de coelho anti-IgY de galinha ligada à peroxidase. Os sintomas clínicos observados foram regurgitação, inapetência alimentar e perda de peso progressiva. A análise parasitológica revelou eliminação de quantidade variável de oocistos, de forma intermitente, em todas as serpentes, com positividade de 92% (116/126). O ELISA indireto apresentou positividade em 42,9% (54/126) das amostras. Foi observada resposta imune humoral na maioria dos animais, no entanto, com presença título flutuante de anticorpos e alternância de resultados positivos e negativos, em um mesmo animal. / Infection by Cryptosporidium serpentis is one of the most important diseases in reptiles, and is characterized by chronic infection, clinical or subclinical, and the presence of severe hypertrophic gastritis, food regurgitation, progressive weight loss, mortality, and intermittent and continuous shedding of oocysts in feces. The objective of this study was to standardize an indirect enzyme immunoassay (ELISA) to detect antibodies against C. serpentis, and evaluate the clinical, parasitological and humoral immune response in snakes naturally infected with C. serpentis. Twenty one snakes naturally infected with C. serpentis and housed at the Instituto Butantan, São Paulo, Brazil, were used for accomplish clinical and parasitological analyzes of C. serpentis infection, through the daily record of clinical signs and monthly survey of fecal shedding of oocysts using Kinyoun staining technique. The serological evaluation was performed monthly using the indirect ELISA for the detection of anti-C. serpentis antibodies, for a period of 12 months in eight animals, eight months in three animals, and six months in one animal. The indirect ELISA was standardized on the basis of block titration using antigen produced from oocysts of C. serpentis, chicken IgY anti-snake gamaglobulins and a conjugate containing rabbit IgG anti-chicken IgY linked to peroxidase. Clinical symptoms consisted in food regurgitation, inappetence, and progressive weight loss. The parasitological analysis revealed intermittent fecal shedding of variable number of oocysts in all snakes, with positivity in 92% (116/126) of the samples. The indirect ELISA was positive in 42.9% (54/126) of the samples. Humoral immune response was observed in most animals, however, fluctuating antibodies levels with rotation of positive and negative results were observed in some snakes.

Foi investigado o valor diagnóstico da resposta alérgica cutânea à tuberculina e do ELISA indireto, com antígeno recombinante MPB 70, em leitões experimentalmente sensibilizados, pela via intramuscular, com suspensões oleosas de M. bovis ou M. avium inativados. Foram utilizados 91 animais divididos em quatro grupos. Os grupos A e B, cada um com 25 indivíduos, grupos C e D com 21 e 20 indivíduos respectivamente, balanceando-se as características de raça, linhagem, faixa etária e sexo. Aos 21 dias de idade, todos os animais foram submetidos a uma triagem com a aplicação de tuberculina PPD de M. bovis, pela via intradérmica na base da orelha e não houve qualquer tipo de reação. Decorridos 60 dias do teste tuberculínico de triagem, o grupo A, recebeu injeção intramuscular de 0,5 mL de uma suspensão oleosa de M. avium estirpe D4; o grupo B, recebeu 0,5 mL de uma suspensão oleosa de M. bovis estirpe AN5; o grupo C (controle I), recebeu 0,5 mL do adjuvante oleoso e o grupo D (controle II), recebeu 0,5 mL de solução fisiológica. Foi realizado o exame histopatológico de biopsias das reações cutâneas e a colheita de sangue para o teste de ELISA de captura. Após 30 dias da sensibilização, foi efetuada a prova de tuberculinização comparativa com reação medida pela variação da espessura da pele com paquímetro às 0h, 24h, 48h e 72h, após a aplicação das tuberculinas. No teste comparativo, lido às 72 horas, a reação foi considerada negativa quando a diferença das reações entre o PPD bovino e o PPD aviário foi menor que 6,7 mm; suspeito ou inconclusivo quando a diferença se situou na faixa de 6,7 a 7,5 mm; e positiva para o tipo de PPD, considerando-se tuberculose para PPD M. bovis e micobacteriose para PPD M. avium, quando a diferença da reação foi superior a 7,5 mm. Nos exames histopatológicos, foi observado intenso infiltrado inflamatório linfocitário no local das reações intradérmicas dos animais testados com o PPD homologo ao tipo de micobactéria utilizada na suspensão oleosa sensibilizante. O ensaio de ELISA com antígeno, MPB 70 recombinante, foi capaz de revelar a presença de anticorpos contra o M. bovis, porém não revelou anticorpos para M. avium. / The diagnostic value of the cutaneous allergic response to tuberculin and Indirect ELISA test was investigated using MPB 70 recombinant antigen, in piglets experimentally sensitized intramuscularly with the oily suspensions of inactivated M. bovis or M. avium. The ninety-one animals used were divided into four groups. The groups A and B were formed each with 25 individuals, and groups C and D, with 21 and 20 individuals, respectively, balancing the characteristics of race, ancestry, age and sex. At the age of 21 days, all the animals were submitted to the screening test with the use of M. bovis PPD, by the intradermal route at the base of the ear and no reaction was detected. Sixty days after the screening tuberculin test, animals of the group A were injected intramuscularly with 0.5 mL of oily suspension of M. avium D4 strain; animals of group B received 0.5 mL of an oily suspension of M. bovis, AN5 strain; and the members of group C (control I) received 0.5 mL of an oily adjuvant and the individuals of group D (control II) received 0.5 mL of saline solution. Histological examinations of biopsies of skin reactions were carried out and blood collections made for capture ELISA. Following 30 days of sensitization, comparative skin reactions were measured by the variation in skin thickness with a caliper at 0h, 24h, 48h an 72h after applications of tuberculins. In the comparative test measured at 72h, the reaction was considered negative when the difference of the reactions between bovine PPD and avian PPD was less than 6.7 mm; suspected or inconclusive, when the difference stood in the range of 6.7 to 7.5 mm; and positive according to the type of PPD, considering tuberculosis the M. bovis PPD and mycobacteriosis the M. avium PPD, when the difference of the reaction was greater than 7.5 mm. In histopathological examinations, intense lymphocytic inflammatory infiltrate were observed at the site of intradermal reactions of the animals tested with PPD homologous to the type of mycobacteria used in sensitizing oil suspension. The ELISA assay with MPB 70 recombinant antigen was able to reveal the presence of antibodies against M. bovis, but did not reveal antibodies to M. avium.

Este estudo representa a primeira avaliação ovariana, imunológica e hormonal realizada em duas espécies de felinos brasileiros ameaçados: L. pardalis (n=5) e L. tigrinus (n=4), antes e após 4 a 6 tratamentos alternados com as gonadotrofinas exógenas eCG/hCG e pFSH/pLH. Os animais foram submetidos a superovulação alternada com eCG-hCG e pFSH-pLH a cada quatro meses pelo período de dois anos, perfazendo um total de 6 intervenções. Os oócitos foram recuperados por vídeo laparoscopia, caracterizados quanto à morfologia e utilizados para determinação dos estágios do ciclo meiótico por análise citogenética e maturação pela caracterização de metáfase II. Avaliação ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão e varredura foi realizada para caracterização da morfologia dos oócitos. Antes e após cada intervenção sangue foi colhido e utilizado em análises hormonais séricas (progesterona e estradiol) por RIE e pesquisa de anticorpos para gonadotrofinas exógenas por ELISA. Comparando os tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) no número total de estruturas ovarianas observadas em superovulações alternadas sucessivas, nas duas espécies estudadas. Também não houve diferença significativa em relação ao total de estruturas ovarianas encontradas em cada tratamento (5,7±1,2 eCG/hCG; 7,9±0,9 pFSH/pLH) para L. pardalis e (eCG/hCG 2,6±0,7; pFSH/pLH 2,0±0,5) para L. tigrinus. Embora L. pardalis tenham apresentado maior número de estruturas ovarianas por estimulação que L. tigrinus (p<0,05), a porcentagem de oócitos maduros em relação aos oócitos totais não diferiu, indicando que a metodologia utilizada foi eficiente. L. pardalis apresentaram maior número de oócitos totais e maduros nos tratamentos com pFSH/pLH (p<0,05), sendo que em L. tigrinus ambos tratamentos se comportaram de maneira semelhante (p>0,05). Não foi possível a caracterização dos estágios do ciclo meiótico pela avaliação da configuração cromossômica nos oócitos, sendo que nenhum oócito apresentou-se em metáfase II. Ultraestruturalmente os oócitos apresentaram características semelhantes aos observados em mamíferos de maneira geral. Dosagens hormonais séricas demonstraram um aumento de estradiol após as superovulações. Elevações de progesterona foram observadas em alguns momentos pré e pós superovulações. Embora alguns animais tenham demonstrado desenvolvimento de títulos para imunoglobulinas anti-gonadotrofinas exógenas, essa resposta imune humoral não parece interferir com a indução da atividade ovariana produzida pela superovulação, já que os animais responderam bem aos tratamentos alternados. Com estes resultados podemos concluir que essas espécies podem ser manejadas intensivamente usando tratamentos alternados com gonadotrofinas exógenas para procedimentos de reprodução assistida sem comprometer a resposta ovariana a esses hormônios. / This study represents the first assessment of ovarian, immunological and hormonal responses of two endangered Brazilian felids: L. pardalis (n=5) and L. tigrinus (n=4), treated with two exogenous gonadotropin regimens eCG/hCG and pFSH/pLH. Females were treated with four to six times alternating eCG/hCG and pFSH/pLH protocols using an interval of four months between each treatment. Ovarian follicular development and oocytes recovery were performed through laparoscopy. Recovered oocytes were submitted to the cytogenetical analysis and to the electron microscopy in order to evaluate the maturation (metaphase II) and the morphological and ultrastructural status, respectively. Blood samples were collected before each treatment and during the laparoscopy in order to measure progesterone and estradiol by RIA and to evaluate the immunological response to the exogenous gonadotropins by ELISA. Our results suggest that L. pardalis and L. tigrinus do not show a decrease (p>0.05) in ovarian response after repeated and alternate exposure to different gonadotropin treatments. In both L. pardalis and L. tigrinus, no differences were found regarding to the number of total ovarian structures (p>0.05) during successive gonadotropin treatments. When comparing the eCG/hCG and the pFSH/pLH treatments, there were no differences (p>0.05) regarding to the total number of ovarian structures in L. pardalis (5.7 ± 1.2 and 7.9 ± 0.9, respectively) or L. tigrinus (2.6 ± 0.7 and 2.0 ± 0.5, respectively). Despite the fact that the L. pardalis showed a higher number of follicles and CLs per stimulation (p<0.05) when compared to the L. tigrinus, no differences were found when analyzing the percentage of mature oocytes (p>0.05). Within species, both gonadotropin regimens were equally effective (p>0.05) to induce the follicular growth. No decreases (p>0.05) on the total number of ovarian structures and on the oocyte maturation percentages were observed between the sequential stimulations, but. L. pardalis showed a higher number of mature and total oocytes when treated with pFSH/pLH (p<0.05). L. Tigrinus didn’t show any differences regarding to the number of total and mature oocytes (p>0.05) when comparing both gonadotropin regimens. No oocytes in metaphase II were observed in the cytogenetic analyses. Oocytes histological evaluation showed that morphological characteristics were the same observed in others mammals. Hormonal analyses showed increased estradiol levels after superovulations. Higher levels of progesterone were observed before and after superovulations. Although some of these cats do demonstrate the development of anti-gonadotropin immunoglobulin titers, these humoral immune responses do not appear to interfere with gonadotropininduced ovarian stimulation. In this study, animals treated repeatedly with alternating regimens of eCG/hCG and pFSH/pLH showed no decrease in total ovarian structures after four to six successive treatments. These findings are potentially valuable for the ongoing efforts to develop and apply assisted reproductive technologies to the management and conservation of endangered felid populations.

Nos últimos anos a incidência da clorose letal, causada pelo Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) vem aumentando em plantios de cucurbitáceas e preocupando produtores pelos danos causados na produção. Devido às poucas informações sobre esta virose em cucurbitáceas, somente algumas medidas profiláticas de controle têm sido recomendadas para minimizar a incidência da doença. A resistência genética, seja da forma tradicional ou por meio da transgenia, é considerada a melhor e mais eficiente forma de controle de viroses em geral. Sendo assim essa proposta de pesquisa visou caracterizar a resistência da moranga Exposição ao ZLCV, para gerar informações que auxiliem programas de melhoramento vegetal e também estudar a possível interferência do Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) e do Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) na resistência das plantas ao ZLCV. A infecção pelo ZLCV e sua movimentação na planta foram avaliadas por PTA-ELISA, RT-PCR, impressão de tecido (Tissue printing) e teste de recuperação biológica. Os resultados mostraram que o vírus pôde ser detectado no local da infecção, mas não foi detectado além do ponto de inoculação. Estes resultados sugerem que a moranga Exposição apresenta uma resistência à invasão sistêmica de longa distância ao ZLCV. Para verificar a possível interferência dos potyvirus na resistência da moranga Exposição ao ZLCV foram conduzidos experimentos em casa de vegetação, onde os vírus foram inoculados em mistura nas plantas teste e experimentos em campo onde os potyvirus foram pré-inoculados e a infecção pelo ZLCV ocorreu naturalmente pelo vetor. Em nenhum dos casos foi verificada interferência dos potyvirus na resistência das plantas de moranga ao ZLCV. / The occurrence of lethal chlorosis in the past years, caused by Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), has become common in cucurbit crops, which concerns producers in terms of yield losses. Due to the lack of information about this virus disease, only few prophylactic precautions have been recommended in order to minimize the occurrence of the disease. The genetic resistance, either via conventional means or via transgenesis, is considered the most efficient way so far to control virus diseases. With that in mind, the present work aimed to characterize the genetic resistance of winter squash Exposição against ZLCV in order to generate important information for cucurbit breeding programs, as well as to investigate the potential effect of Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) in winter squash Exposição resistance against ZLCV. The ZLCV infection and its systemic mobility inside the plant were evaluated by PTA-ELISA, RT-PCR, tissue printing and biological recovery test. The results have shown that ZLCV can be detected at the infection spot, but was not detected beyond the inoculation point. These results suggest that winter squah Exposição is resistant to long-distance systemic invasion of ZLCV. In order to verify the potential interference of the potyviruses on the winter squash Exposição resistance against ZLCV, experiments were carried out into greenhouse, where the viruses were inoculated together into testing plants, and also in field trials, where the potyviruses were pre-inoculated and the infection by ZLCV naturally occurred by the vector. Interference of potyviruses on the winter squash resistance was not observed via the investigation methods presented.

No experimento 1, avaliou-se os efeitos da leptina exógena na concentração sérica de leptina e na expressão do gene LEP no tecido adiposo de novilhas zebuínas pré-púberes. Amostras de tecido adiposo (mesentérico, perirenal e subcutâneo) e de sangue foram obtidas de 36 novilhas, distribuídas nos tratamentos: A) dieta de alta energia; B) dieta de baixa energia; BL) dieta de baixa energia + 4,8 g/kg PV de oLeptin subcutânea, duas vezes ao dia, por 56 dias. A concentração de leptina foi determinada com kit comercial ELISA (Cusabio) específico. Amostras de sangue de quatro novilhas por grupo foram coletadas em seis pontos no tempo, sendo um antes e um após o tratamento hormonal. Dois dias após a obtenção da puberdade, oito novilhas por grupo foram abatidas para coleta de tecido. A expressão gênica foi quantificada nos depósitos de gordura por PCR em tempo real. A oLeptina aumentou transitoriamente a concentração de leptina do grupo BL, com pico (11,1 ± 1,4 ng/mL) após 7 dias do início do tratamento. A leptina sérica do grupo A aumentou linearmente no tempo, enquanto no grupo B, manteve-se constante (4,0 ± 2,0 ng/mL). A dieta A aumentou a expressão de leptina no tecido adiposo em 2,4 vezes; e a administração de oLeptina diminuiu a expressão do gene LEP em cerca de 2,5 vezes, comparando com o grupo controle. A redução na expressão do gene LEP explica a redução na leptina sérica do grupo BL após 30 dias de tratamento hormonal. O objetivo do experimento 2 foi clonar a região codificadora da leptina bovina, transformar leveduras Pichia pastoris KM71H e expressar a proteína no meio de cultura. O gene da leptina foi amplificado em reação de PCR, a partir de amostra de tecido adiposo subcutâneo de novilha do grupo A. Os primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (senso) e 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT - 3\' (antisenso), contendo sítios EcoRI e SalI, foram desenhados com base na sequência do mRNA da leptina bovina (NM 173928.2), substituindo a sequência sinal de secreção nativa pela sequência do Fator do Saccharomyces cereviasiae. O inserto foi clonado nos vetores de expressão pPICZ&alpha;A e pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), sendo as leveduras transformadas por eletroporação. Clones com múltiplas cópias do gene foram selecionados em meio YPD + 500 &#956;g/mL de zeocina, e 22 colônias recombinantes foram selecionadas para análise de expressão em pequena escala. Colônias pPICbLep foram inicialmente cultivadas em meio de crescimento (BMGY), sendo transferidas para meio de indução (BMMY), contendo metanol. A indução durou 144 horas. Alíquotas de 200 &#956;l de sobrenadante foram coletadas diariamente, para análise da presença da bLeptina por SDS-PAGE. As colônias pGAPbLep foram cultivadas em meio YPD por 96 h, com coleta de sobrenadante a cada 24 h. As leveduras foram transformadas com sucesso, com os plasmídeos pPICbLep e pGAPbLep, entretanto, apenas as colônias pGAPbLep expressaram uma proteína de 35 kDa, o dobro do tamanho esperado para a bLeptina (17 kDa), provavelmente por ocorrência de dimerização. Mais estudos são necessários sobre os processos de produção de leptina recombinante bovina em Pichia pastoris. / In experiment 1, the effects of exogenous leptin were evaluated on serum leptin levels and on LEP gene expression in the adipose tissue of prepubertal zebu heifers. Adipose tissue (mesenteric, perirenal and subcutaneous) and blood samples were collected from 36 heifers, distributed among treatments: A) high energy diet; B) low energy diet; BL) low energy diet + 4,8 g/kg BW subcutaneous oLeptin, twice daily, for 56 days. Leptin concentration was determined with specific commercial ELISA kit (Cusabio). Blood from four heifer per group was sampled in six time points, one before and one after the hormonal treatment. Two days after puberty attainment , eight heifers per group were slaughter for tissue sampling. Gene expression was quantified in fat depots by real time PCR. The oLeptin increased transiently leptin concentration in group BL, with a peak (11,1 ± 1,4 ng/mL) after 7 days of treatment. Serum leptin in group A increased linearly in time, while in group B it remained constant (4,0 ± 2,0 ng/mL). Diet A enhanced leptin expression in the adipose tissue 2.4-fold, and oLeptin administration decreased de expression 2.5-fold, comparing to the control group. The decrease in LEP gene expression explains the reduction in serum leptin from group BL after 30 d of hormonal treatment. The objective with experiment 2 was to clone de codifying region of bovine leptin, transform KM71H Pichia pastoris yeasts, and express the protein in culture media. The leptin gene was amplified by PCR, from subcutaneous adipose tissue sample from a heifer in group A. Primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (forward) and 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT 3 (reverse), containing EcoRI and SalI restriction sites, were designed based in the mRNA sequence from bovine leptin (NM 173928.2), replacing the native secretion signal sequence by the -factor sequence from Saccharomyces cereviasiae. The insert was cloned in the expression vectors pPICZ&alpha;A and pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), and yeasts were transformed by electroporation. Clones with multiple copies of the gene were selected in YPD + 500 &#956;g/mL zeocina, and 22 recombinant colonies were selected for a small-scale expression analysis. pPICbLep colonies were initially cultivated in growth media (BMGY), and then transferred to the induction media (BMMY), containing methanol. The colonies were inducted for 144 h. Supernatant aliquots (200 &#956;l) were collected daily, for bLeptin analysis in SDS-PAGE. pGAPbLep colonies were cultivated in YPD media for 96 h, collecting supernatant samples each 24 h. Yeasts were successfully transformed with the plasmids pPICbLep and pGAPbLep, however, only pGAPbLep colonies expressed a protein with 35 kDa, twice the size expected for the bovine leptin (17 kDa), probably because of dimerization. More studies are necessary about the recombinant bovine leptin production processes in Pichia pastoris.

Os programas de melhoramento de figueira (Ficus carica L.) por métodos convencionais tais como cruzamentos dirigidos, para a obtenção de novos cultivares, são inviáveis em muitos países, como no Brasil, principalmente pela pequena variabilidade genética encontrada, e pela dificuldade de obtenção de plantas originadas pela fusão de gametas, uma vez que a vespa Blastophaga psenes, responsável pela polinização natural, não existe no país. Desse modo, o melhoramento genético, com o uso de mutagênicos, se torna uma linha de pesquisa importante para a melhoria da cultura, sendo necessário reunir informações sobre essa espécie, principalmente, em relação à sua variabilidade genética, para que projetos de propagação e manejo adequados sejam realizados. Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi verificar a existência de variabilidade epigenética devido à metilação do DNA em seleções irradiadas de figueiras, entre si e quando comparadas ao principal cultivar comercial, Roxo-de-Valinhos, utilizando as técnicas de MSAP e ELISA, e posterior sequenciamento do DNA, tratado com bissulfito de sódio, para detecção do posicionamento das regiões polimórficas, analisado por ferramentas de bioinformática. Amostras do DNA genômico foram duplamente digeridas com a enzima HpaII (sensível à metilação) ou com o seu isoesquizomero MspI (não sensível à metilação), juntamente com a enzima EcoRI. Foram testadas 14 combinações de primers e obteve-se 87.9%, 10.1% e 2.0%, respectivamente, de regiões não metiladas CCGG, regiões metiladas CmCGG e regiões hemimetiladas hmCCGG, de um total de 553 produtos de amplificação, demostrando que a técnica MSAP é eficiente para detecção de sítios diferencialmente metilados no material genômico estudado, evidenciando sua divergência epigenética. Com o sequenciamento do DNA isolado desses sítios diferencialmente metilados, foi possível verificar diferentes padrões de metilação nos mesmos pelo sequenciamento dos DNAs tratados com bissulfito de sódio, em regiões codificadoras de genes regulatórios do desenvolvimento e amadurecimento dos frutos, além de terem sido encontrados no DNA mitocondrial dos tratamentos, o qual regula o fornecimento de energia em forma de ATP para as plantas, estando intimamente relacionado com o desenvolvimento das mesmas, justificando os diferentes fenótipos encontrados, tanto nos frutos, quanto no crescimento das plantas que sofreram estresse devido à exposição à radiação gama. Pela técnica de imunoquímica (ELISA), utilizando anticorpos anti 5-mC, foram observadas diferenças significativas pelo teste de Tukey, a 95 % de confiabilidade, no conteúdo global de metilação dos DNAs dos tratamentos, indicando que este fator abiótico foi responsável pelas alterações no epigenoma das plantas. Como o material utilizado como controle se encontrou também metilado, uma possível desmetilação dos materiais genômicos pode ser a responsável pela variação fenotípica entre os tratamentos. Diante disso, o estudo futuro da expressão gênica entre os tratamentos torna-se uma estratégia de extrema importância para o entendimento dos complexos sistemas regulatórios, levando à identificação de genes de interesse agronômico para a cultura da figueira, possibilitando a sua manipulação subsequente e propagação de cultivares melhorados para fins comerciais. / The fig tree (Ficus carica L.) breeding programs by conventional methods such as directed crosses, in order to obtain new cultivars, are unworkable in many countries, as in Brazil, mainly by small genetic variability found, and by the difficulty for obtaining plants originated from the fusion of gametes, since the wasp Blastophaga psenes, responsible for natural pollination, doesn`t exist in the country. In this way, the genetic breeding, with the use of mutagenic, becomes an important research line for the improvement of culture, being necessary to gather information about this species, mainly in relation to its genetic variability, for perform propagation projects and appropriate management. Given the above, The objective of this study was to verify the existence of epigenetic variability due to DNA methylation in irradiated fig selections, with each other and when compared to the main commercial cultivar, Roxo-de-Valinhos, using MSAP and ELISA techniques, and subsequent DNA sequencing, treated with sodium bisulfite, for detection of the position of the polymorphic regions, analyzed by bioinformatics tools. Samples of genomic DNA were double-digested with the HpaII enzyme (sensitive to methylation) with its isoschizomer MspI (insensitive to methylation), together with the EcoRI enzyme. Fourteen primer combinations were tested and it was obtained 87.9%, 10.1% e 2.0%, respectively, unmethylated CCGG, methylated CmCGG and hemimethylated regions hmCCGG, from a total of 553 amplification products, displaying, the MSAP technique, efficient for detection of differentially methylated sites in the genomic material studied, demonstrating their epigenetic divergence. With the sequencing of DNA isolated of these differentially methylated sites, it was possible to verify different patterns of methylation in them by sequencing the DNA treated with sodium bisulfite, in coding regions of regulatory genes of the development and fruits ripening, besides they have been found in the mitochondrial DNA of treatments, which regulates the supply of energy in ATP form for the plants, being closely related to their development, justifying the different phenotypes found in both fruits and plant growth that suffered stress due to exposure to gamma radiation. By the technique of immunochemistry (ELISA), using 5-mC antibodies, significant differences were observed by Tukey test, at 95% of trustworthiness, in the global content methylation of the treatments DNA, indicating that this abiotic factor was responsible for the changes in the epigenome of the plants. Since the material used as control was found also methylated, a supposed demethylation of the genomic material may be responsible for phenotypic variation among treatments. Considering this, future study of gene expression between treatments becomes an extreme important strategy for understanding the complex regulatory systems, leading to the identification of genes with agronomic interest for the fig culture, allowing its subsequent manipulation and propagation of improved cultivars for commercial purposes.

O número crescente de descobertas de substâncias bioativas produzidas pelo metabolismo secundário de cianobactérias tem despertado o interesse de grupos de pesquisa no mundo todo com o objetivo comum de descrever e explorar estas moléculas e entender a sua biossíntese. No Brasil, as pesquisas sobre moléculas bioativas produzidas por linhagens de cianobactérias nativas são escassas. Neste trabalho, utilizando iniciadores específicos da PCR e sequenciamento, a presença de genes envolvidos na biossíntese da neurotoxina saxitoxina (STX) foi confirmada em representantes dos gêneros Dolichospermum, Sphaerospermopsis, Cuspidothrix e Cylindrospermopsis, enquanto que genes da citotoxina cilindrospermopsina (CYN) foram detectados somente em representantes de Cylindrospermopsis. Genes envolvidos com a produção dos inibidores enzimáticos, microviridina (MDN) e a cianobactina microciclamida (MCA) foram sequenciados em isolados do gênero Microcystis. Os genomas das linhagens de Cylindrospermopsis raciborskii CENA302 e CENA303 foram sequenciados usando a plataforma HiScan SQ (Ilumina) com biblioteca pareada 2 x 100 pb. O genoma da Sphaerospermopsis torques-reginae ITEP-024 foi sequenciado utilizando a plataforma Ion Torrent (Life Technologies) com tamanhos de fragmentos de até 200 pb. As tentativas de montagem ab initio dos genomas foram realizadas e o agrupamento gênico da saxitoxina (28 kb) da linhagem C. raciborskii CENA302 foi identificado e caracterizado. As análises filogenéticas das sequências de aminoácidos envolvidos com a biossíntese das moléculas bioativas avaliadas demonstraram que os isolados brasileiros de cianobactérias formam clados com elevado valor de reamostragem com sequências homólogas de cianobactérias conhecidas como produtoras dessas moléculas. Neste estudo é relatada pela primeira vez a presença de genes cyr em linhagens da América do Sul de C. raciborskii e a presença simultânea de genes cyr e sxt em uma única linhagem de C. raciborskii. Além disso, este é o primeiro estudo que relata a presença de genes envolvidos na biossíntese de MDN e MCA nas espécies de cianobactérias M. protocystis, M. panniformis e M. wesenbergii. Análises por espectrometria de massas acoplada a cromatografia líquida (LC-MS) e imunoensaio enzimático (ELISA) foram utilizadas a fim de detectar e identificar variantes estruturais das moléculas bioativas das cianobactérias que tiveram os genes biossintéticos sequenciados. A análise de LC-MS mostrou a produção das variantes GTX2, GTX3, STX e dc-STX pela linhagem C. raciborskii CENA302, enquanto que a linhagem C. raciborskii CENA305 apresentou as variantes NEO, C1 e dcGTX3. As quatro novas variantes de MCY, [D-Val1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-YR e [D-Phe1]MC-LR, foram encontradas nas espécies M. panniformis SPC702 e M. protocystis SPC697. Este é o primeiro relato da produção de MCY por essas duas espécies de Microcystis. Dezesseis linhagens que ainda não possuíam as sequências do gene de RNAr 16S foram sequenciadas. O resultado da análise filogenética das sequências do gene de RNAr 16S foi coerente com as descrições morfológicas, sendo que todas as linhagens foram caracterizadas em nível de espécie. As informações geradas neste estudo contribuem para o aumento do conhecimento da diversidade metabólica dos isolados brasileiros de cianobactérias e trazem nova visão sobre a evolução dessas moléculas produzidas pelo metabolismo secundário / The growing numbers of discoveries of bioactive substances produced by cyanobacterial secondary metabolism has attracted the interest of research groups around the world with the common goal of describing and exploring these molecules and understanding their biosynthesis. In Brazil, researches on bioactive molecules produced by native cyanobacterial strains are scarce. In this work, using specific PCR primers and sequencing, the presence of genes involved in the biosynthesis of the neurotoxin saxitoxin (STX) was confirmed in representatives of the genera Dolichospermum, Sphaerospermopsis, Cuspidothrix and Cylindrospermopsis, while genes of the cytotoxin cylindrospermopsin (CYN) were detected only in representatives of Cylindrospermopsis. Genes involved in the production of protease inhibitors, microviridin (MDN) and the cianobactin microciclamide (MCA), were sequenced in isolates of the genus Microcystis. The genomes of Cylindrospermopsis raciborskii strains CENA302 and CENA303 were sequenced using the high-throughput platform HiScan SQ (Illumina) as paired-ends 2 x 100 bp. The Sphaerospermopsis torques-reginae ITEP-024 genome was sequenced using the high-throughput platform Ion Torrent (Life Technologies) with fragment sizes up to 200 bp. Attempts of ab initio genomes assembly were performed and the 28 kb saxitoxin gene cluster of C. raciborskii strains CENA302 was identified and characterized. Phylogenetic analyses of amino acid sequences involved in the biosynthesis of the bioactive molecules evaluated showed that the Brazilian cyanobacterial isolates formed clades with high bootstrap values with homologous sequences of known cyanobacterial producers of these molecules. In this study is reported for the first time the presence of cyr genes in South America strains of C. raciborskii and the simultaneous presence of cyr and sxt genes in a single C. raciborskii strain. Furthermore, this is the first study reporting the presence of genes involved in the biosynthesis of MDN and MCA in the cyanobacterial species M. protocystis, M. panniformis e M. wesenbergii. Analyses by mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC-MS) and enzyme immunoassay (ELISA) were used to detect and identify structural variants of bioactive molecules of the cyanobacteria that had the biosynthetic genes sequenced. Analysis of LC-MS showed the production of the variants GTX2, GTX3, STX and dc-STX by the C. raciborskii strain CENA302, whereas the strain C. raciborskii CENA305 presented the variants NEO, C1 and dcGTX3. The new four MCY variants [D-Val1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-YR and [D-Phe1]MC-LR were found in the species M. panniformis SPC702 and M. protocystis SPC697. This is the first report of the MCY production by these two species of Microcystis. Sixteen strains that still lacked the 16S rRNA gene sequences were sequenced. The result of the phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences was consistent with the morphological descriptions, and all strains were characterized to species level. The informations generated in this study contribute to the increase of knowledge on metabolic diversity of Brazilian cyanobacterial strains and bring new insight into the evolution of these molecules produced by secondary metabolism