Le génome des bactéries vivantes n'est pas une entité statique mais au contraire c'est quelque chose très dynamique évoluant avec le temps. Les bactéries évoluent en acquérant par transfert horizontal des gènes du matériel génétique. C'est le cas des EPEC qui ont acquis l'îlot LEE via ce mécanisme. La protéine H-NS joue un rôle important dans la reconnaissance de cet ADN étranger, dans la liaison à cet ADN et dans la répression de son expression quand ce n'est pas en profit du " fitness " de la bactérie. Comme résultat H-NS régule la majorité des gènes associés à la virulence chez les entérobactéries Salmonella, Yersinia et les EPEC. Les EPEC possèdent une protéine paralogue à H-NS et codée dans le premier opéron de leur îlot LEE, il s'agit de la protéine Ler. Une fois exprimée Ler induit l'expression des 4 opérons restant de la région parmi lesquels LEE5. Ler partage une grande homologie avec H-NS surtout au niveau de leurs domaines de reconnaissance de l'ADN. Malgré cette homologie H-NS réprime LEE5 tandis que Ler l'active. De plus si H-NS est un régulateur global agissant sur plus de 500 gènes chez E. coli Ler est une protéine spécifique qui ne va agir que sur un petit nombre de promoteurs tous impliqués dans la virulence L'étude qualitative et quantitative de l'interaction de H-NS et de Ler avec la région promotrice de LEE5 montre qu'elles partagent globalement les mêmes sites de fixation sur des régions étendues en amont et en aval du +1 de la transcription. Ces sites de fixation sont bien définis d'une dizaine de paires de bases. L'affinité de ces sites pour H-NS est variable. Trois sites de haute affinité pour H-NS ont été identifiés. La séquence de ces sites est similaire à celle du site consensus élaboré en étudiant le promoteur proU(Bouffartigues et al - 2007). Des différences dans l'interaction de ces deux protéines avec le promoteur LEE5 résident surtout autour du +1 et des boîtes -10 et -35. Il s'agit de la première étude comparant la fixation de H-NS et de Ler sur des régions étendues de ce promoteur dans le but d'expliquer la régulation différentielle de ces deux protéines paralogues. L'étude de l'expression de LEE5 in vivo nous a permis de proposer que le mécanisme essentiel d'action de Ler est dirigé contre la répression induite par H-NS et que le taux maximum d'expression du promoteur LEE5 wtobservé dans la souche mutante pour hnsen présence de Ler (en comparaison avec la souche double mutante où Ler est absente) n'est pas dû à une activation directe par Ler mais plutôt à une répression par StpA, sensible à la mutation des sites de haute affinité de H-NS.

A DNA microarray capable of detecting 445 virulence factors (VFs) and antibiotic resistance genes was used to assess human and animal fecal E. coli isolates for pathogenic potential and host specificity. The only enteric pathotype detected was atypical EPEC, which was found in 3.7% of all isolates. 17% of human isolates were extraintestinal pathotypes, with the majority of these being uropathogenic. Isolates from humans and chickens were the most likely to have resistance to at least one class of antibiotic. VFs that were found almost exclusively in human isolates, when compared to one other group, included sat (10% of human isolates and no animal isolates), iucD and iut (24% of human, <1% mammal) and iha (16% human, <1% wild avian). Decision trees utilizing multiple probes to identify the source of an E. coli isolate were able to correctly identify the source of 79% of validation isolates in a human vs. animal comparison. / Environment Canada

Resumo: Pesquisou-se a ocorrência de E. coli (EPEC, EIEC, EHEC) em água e peixe (pele, trato gastrintestinal e músculo) de pesque-pagues da microbacia do Córrego Rico, Jaboticabal, SP. A amostragem foi realizada entre os meses de abril e junho de 2008 em cinco pesque-pagues. Em cada um, foram colhidos dez exemplares de peixes adultos, e para análise foram colhidas amostras do músculo, do trato gastrintestinal e da superfície corpórea. As amostras de água foram colhidas em cinco pontos distintos de todos os pesque-pague. As colônias com características morfológicas relativas à E. coli isoladas do ágar MacConkey foram submetidas a confirmação bioquímica. Posteriormente, os isolados foram identificados sorologicamente como EPEC, EIEC e EHEC e realizado os testes de susceptibilidade a antimicrobianos e atividade hemolítica. Assim, foram isoladas 115 cepas de E. coli, entre as quais 81 (70%) foram sorogrupadas como EPEC, 5 (4%) como EHEC e 8 (7%) como EIEC. Os sorogrupos mais frenquentes foram O125 (13,9%), O126 (11,3%) e O158 (10,4%). Dentre as amostras testadas, 60 (52%) apresentaram resistência simultânea a dois antimicrobianos. A Análise de Correspondência foi realizada com intuito de verificar as possíveis correspondências envolvendo o local de isolamento, sorogrupos e multirresistência e com isso pode-se observar que o músculo foi o local de isolamento com menor correlação aos demais fatores. Enquanto água, trato e pele apresentaram maior correspondência entre si. Assim, a presença de um alto número de isolados EPEC nesse estudo indica contaminação por enteropatógenos possivelmente advindos de fezes de animais, humanas e/ou águas contaminadas, representando risco à saúde dos frequentadores destes pesque-pagues e consumidores do pescado. / Abstract: The occurrence of Escherichia coli (EPEC, EIEC, EHEC) in water and fish (skin, gastrointestinal tract and muscle) was surveyed in fee fishing from the stream Rico micro-basin, Jaboticabal, São Paulo/Brazil. Samples were collected between april and june 2008 in five fee fishing. In each fee fishing, ten copies were collected from adult fish and for analysis were sampled muscle, gastrointestinal tract and body surface. Water samples were collected from five different points of all fee fishing. Thus, we isolated colonies from the MacConkey agar with morphological characteristics related to E. coli for biochemical confirmation. Subsequently, the isolates were identified serologically as EPEC, EIEC and EHEC and performed tests of antimicrobial susceptibility and hemolytic activity. It was found that among 115 strains of E. coli isolated, 81 (70%) were serologically classified as EPEC, 5 (4%) as EHEC and 8 (7%) as EIEC. The most common serogroups were O125 (13.9%), O126 (11.3%) e O158 (10.4%). From the 115 bacterial isolates, 60 (52%) were resistant to two antimicrobials. The Correspondence Analysis was performed to verify possible matches involving the location of isolation, serogroup and antimicrobial resistance and that can be observed that the muscle had lower correlation to other factors. While water and tract and skin had correlation with each other. Probably, the isolation of EPEC serogroups in this study indicates contamination by pathogens coming from animals, human and/or contaminated water, constituting a potential risk to the consumer health of these fee fishing. / Orientador: Fernando Antonio de Ávila / Coorientador: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Luiz Florencio Franco Margatho / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:56:20Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_mmc_me_jabo.pdf: 650496 bytes, checksum: d36cf123ceb16765bef9266b5c12dc6e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Pesquisou-se a ocorrência de E. coli (EPEC, EIEC, EHEC) em água e peixe (pele, trato gastrintestinal e músculo) de pesque-pagues da microbacia do Córrego Rico, Jaboticabal, SP. A amostragem foi realizada entre os meses de abril e junho de 2008 em cinco pesque-pagues. Em cada um, foram colhidos dez exemplares de peixes adultos, e para análise foram colhidas amostras do músculo, do trato gastrintestinal e da superfície corpórea. As amostras de água foram colhidas em cinco pontos distintos de todos os pesque-pague. As colônias com características morfológicas relativas à E. coli isoladas do ágar MacConkey foram submetidas a confirmação bioquímica. Posteriormente, os isolados foram identificados sorologicamente como EPEC, EIEC e EHEC e realizado os testes de susceptibilidade a antimicrobianos e atividade hemolítica. Assim, foram isoladas 115 cepas de E. coli, entre as quais 81 (70%) foram sorogrupadas como EPEC, 5 (4%) como EHEC e 8 (7%) como EIEC. Os sorogrupos mais frenquentes foram O125 (13,9%), O126 (11,3%) e O158 (10,4%). Dentre as amostras testadas, 60 (52%) apresentaram resistência simultânea a dois antimicrobianos. A Análise de Correspondência foi realizada com intuito de verificar as possíveis correspondências envolvendo o local de isolamento, sorogrupos e multirresistência e com isso pode-se observar que o músculo foi o local de isolamento com menor correlação aos demais fatores. Enquanto água, trato e pele apresentaram maior correspondência entre si. Assim, a presença de um alto número de isolados EPEC nesse estudo indica contaminação por enteropatógenos possivelmente advindos de fezes de animais, humanas e/ou águas contaminadas, representando risco à saúde dos frequentadores destes pesque-pagues e consumidores do pescado. / The occurrence of Escherichia coli (EPEC, EIEC, EHEC) in water and fish (skin, gastrointestinal tract and muscle) was surveyed in fee fishing from the stream Rico micro-basin, Jaboticabal, São Paulo/Brazil. Samples were collected between april and june 2008 in five fee fishing. In each fee fishing, ten copies were collected from adult fish and for analysis were sampled muscle, gastrointestinal tract and body surface. Water samples were collected from five different points of all fee fishing. Thus, we isolated colonies from the MacConkey agar with morphological characteristics related to E. coli for biochemical confirmation. Subsequently, the isolates were identified serologically as EPEC, EIEC and EHEC and performed tests of antimicrobial susceptibility and hemolytic activity. It was found that among 115 strains of E. coli isolated, 81 (70%) were serologically classified as EPEC, 5 (4%) as EHEC and 8 (7%) as EIEC. The most common serogroups were O125 (13.9%), O126 (11.3%) e O158 (10.4%). From the 115 bacterial isolates, 60 (52%) were resistant to two antimicrobials. The Correspondence Analysis was performed to verify possible matches involving the location of isolation, serogroup and antimicrobial resistance and that can be observed that the muscle had lower correlation to other factors. While water and tract and skin had correlation with each other. Probably, the isolation of EPEC serogroups in this study indicates contamination by pathogens coming from animals, human and/or contaminated water, constituting a potential risk to the consumer health of these fee fishing.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-09-27T20:18:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Parcial - Andréia F. Silva.pdf: 1665108 bytes, checksum: 8a2eda0da827e922952dbcfec94773cd (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-09-27T20:18:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Parcial - Andréia F. Silva.pdf: 1665108 bytes, checksum: 8a2eda0da827e922952dbcfec94773cd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T20:18:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Parcial - Andréia F. Silva.pdf: 1665108 bytes, checksum: 8a2eda0da827e922952dbcfec94773cd (MD5) Previous issue date: 2016-11-21 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Escherichia coli (EPEC) was frequent cause of many cases of diarrhea in Brazil and around the world, and one of the main agents responsible for high mortality rates among children aged 0-5 years. EPEC is known to cause histological damage to the microvilli of enterocytes, characterized by the formation of a shaped support ultrastructure. One of the factors responsible for pathogenicity is complex BFP (bundle forming pili). The presence of genes BfpA promotes adhesion and consequently the injury of EPEC strains characterized as typical. Differently, some EPEC strains lack EAF (EPECBfpA-) causing lesions shaped as pedestal, but more slowly, called atypical EPEC. BfpA is known as immunogenic and recently the incidence of atypical (EPECBfpA-) is increasing, it is believed that these bacteria injury occurs through other means making it important to develop strategies for identifying. In this study several predicted peptide sequences were synthesized, to produce polyclonal antibodies and anti-EPEC -BfpA in BALB / c antibodies that are used to target specific identification of typical and atypical EPEC. To achieve the objectives of bioinformatics tools and prediction of protein epitopes immuneepitope B were used for antigenic regions specific mapping for the EPEC two phenotypes. Synthetic peptides were purchased to immunize Balb / C mice, so the antisera are evaluated for specificity EPEC. As results, it was possible to construct and synthetize six linear BfpA peptides (P1-P6). P6 peptide was selected as the product of this study due to its ability to induce the antibodies production against this protein and this serum recognize the native protein in typical EPEC strains. We believe that the functional characterization of these antibodies by developing new tools will help in the diagnosis of these two specific strains of EPEC and will contribute to studies involving these bacteria. / A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) tem sido causa frequente de muitos casos de diarreia no Brasil e no mundo, além de ser um dos principais agentes responsáveis pelas taxas de mortalidade entre as crianças de 0 a 5 anos de idade. A EPEC causa uma lesão histológica nas microvilosidades dos enterócitos caracterizada pela formação de uma ultraestrutura em forma de pedestal. Um dos fatores de patogenicidade responsável é o complexo BfpA (bundle forming pili). A BfpA promove a adesão das cepas de EPEC denominadas como típicas. Diferentemente, algumas cepas de EPEC são desprovidas do Fator de Aderência de Escherichia coli -EAF (EPECBfpA-) e tendem a provocar as lesões típicas de pedestal com mais lentidão e por isso são denominadas EPEC atípicas. Como a BfpA é uma proteína imunogênica e recentemente a incidência de EPECBfpA- atípicas vem aumentando, acredita-se que a lesão por estas bactérias ocorra por outras vias tornando importante o desenvolvimento de estratégias para sua identificação. Neste estudo várias sequências antigenicamente preditas foram usadas para sintetizar peptídeos a fim de produzir anticorpos policlonais anti-BfpA em camundongos BALB/c visando a identificação específica da EPEC típica. Para alcançar os objetivos, inicialmente ferramentas de bioinformática de proteínas e de predição de epítopos B foram utilizadas para mapeamento de regiões antigênicas específicas para EPEC. Peptídeos sintéticos foram adquiridos para a imunização de camundongos Balb/c, afim de que antissoros fossem avaliados quanto a especificidade à EPEC. Como resultados foi possível a construção e síntese de seis peptídeos lineares de BfpA (P1-P6). O peptídeo P6 foi selecionado como produto deste estudo devido a habilidade de induzir a produção de anticorpos contra esta proteína e este soro reconhecer a proteína nativa em cepas de EPEC típica. Acredita-se que a caracterização funcional destes anticorpos permita o desenvolvimento de ferramentas para o diagnóstico específico das duas linhagens de EPEC visando a contribuição para estudos futuros sobre o controle do processo fisiopatológico no intestino.

Diarrheal disease caused by attaching and effacing pathogens, such as enteropathogenic E. coli (EPEC), is a worldwide health concern. As the second leading cause of diarrheal-related death in young children, new investigations into host defense against EPEC, as well as future therapeutics, is greatly needed. To elucidate the host immune responses to these enteric pathogens, the attaching and effacing (A/E) murine pathogen, Citrobacter rodentium, has been widely used. It is well understood that C. rodentium infection induces a robust Th1 response within the host. Yet how these pleiotropic IFNγ immune responses are initiated, propagated, and the accessory immune cell types involved remains poorly understood. In this thesis, I investigated how innate immune cell types such as natural killer cells, which are significant producers of IFNγ, mediate these Th1 directed responses. This work identified that both NK and NK-like innate lymphoid type 1 cells (ILC1s) are capable of producing IFNγ in response to C. rodentium, and NK cells rapidly increase in numbers within the colon during the early stages of infection. Depletion of these cell types causes a delayed Th1 CD4+ T cell response within the colon, resulting in increased bacterial load, and greater degree of colonic pathology at later time points. Additionally, depletion of these cells results in decreased CXCL9 chemokine expression in mice. I later determined that CXCL9 exhibited direct antimicrobial action against Citrobacter in vitro. Depletion of this chemokine in vivo, in the absence of adaptive immune responses, or its receptor CXCR3, results in increased mortality rates, elevated bacterial loads, greater degree of pathology, and deeper penetration of bacteria within the colonic crypts. These data indicate a potential direct antimicrobial role for this IFNγ-induced chemokine, independent of its known properties for the homing of T cells to the site of infection. These findings demonstrate the importance of accessory IFNγ-producing immune cells in not only mediating Th1 CD4+ T cells responses, but also other innate host defense mechanisms against A/E pathogens. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

Globalmente ocorrem cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos associadas à diarreia, principalmente na África subsaariana, sul da Ásia e América Latina. Dentre os patógenos causadores de diarreia, Escherichia coli diarreiogênica (DEC) é o agente etiológico bacteriano mais comum, incluindo E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli produtora da toxina de Shiga e seu subgrupo enterohemorrágica (STEC/EHEC). Os dados epidemiológicos indicam a importância do diagnóstico precoce e sua realização em locais com pouca infraestrutura. Desta forma o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um teste rápido, sensível e específico para o diagnóstico de EPEC e STEC/EHEC. Primeiramente, foram definidas diferentes condições do cultivo bacteriano: Dulbecco\'s modified Eagle\'s (DMEM), DMEM contendo 1% de triptona e DMEM pré-condicionado para o cultivo dos isolados de EPEC/EHEC e avaliação da produção/secreção das proteínas secretadas EspA e EspB, utilizando anticorpos monoclonais (MAb) e policlonais (PAb) anti-EspA ou anti-EspB por ELISA indireto. Para a avaliação da liberação das toxinas de Shiga para o sobrenadante do cultivo bacteriano de STEC/EHEC, foram testados diferentes condições de tratamento, o cultivo bacteriano foi tratado com Triton X-100 e o sedimento foi tratado com tampão de lise B-PER utilizando MAb e PAb anti-Stx1 ou anti-Stx2 por ELISA de captura. Subsequentemente, foi desenvolvido e avaliado o teste de aglutinação em látex para a detecção de EspB em isolados de EPEC/EHEC, e Stx1 e Stx2 em isolados de STEC/EHEC. EspB foi definida como biomarcador, o MAb anti-EspB como ferramenta para o diagnóstico de EPEC/EHEC, e a condição ideal para a produção/secreção de EspB foi o cultivo em DMEM. Para o diagnóstico de STEC/EHEC a condição ideal para liberação das toxinas Stx foi o tratamento do cultivo com Triton X-100. Tanto o ELISA, como a aglutinação em látex apresentaram sensibilidades e especificidades exigidas para testes diagnósticos de doenças negligenciadas em países em desenvolvimento e os testes de aglutinação em látex para a detecção destes patógenos foram precisos, rápidos e fáceis de executar, sendo portanto promissores para a utilização em laboratórios com mínima infraestrutura. / There are 800,000 deaths associated with diarrhea worldwide in children under five, and these are mainly in sub-Saharan Africa, Southeast Asia and Latin America. Among the causative pathogens of diarrhea, diarrheagenic Escherichia coli (DEC) is the most common bacterial etiological agent, including enteropathogenic E. coli (EPEC) and Shiga toxin-producing E. coli and its subgroup enterohemorrhagic E. coli (STEC/EHEC). Epidemiological data indicate the importance of early diagnosis and its realization in places with limited resources. Therefore, the objective of this work was to develop a rapid, sensitive and specific test for the diagnosis of EPEC and STEC/EHEC. First, different bacterial growth conditions were evaluated: Dulbecco\'s modified Eagle\'s medium (DMEM) or DMEM containing 1% tryptone, and DMEM pre-conditioned with EPEC/EHEC isolates. The production/secretion of the secreted proteins EspA and EspB was determined by indirect ELISA utilizing anti-EspA or anti-EspB monoclonal (MAb) and polyclonal (PAb) antibodies. Different treatments were tested for their effect on the release of Shiga toxins into the medium of STEC/EHEC bacterial cultures. The bacterial culture supernatant was treated with Triton X-100, and the sediment was treated with B-PER lysis buffer. The toxins release was determined by capture ELISA using anti-Stx1 or anti-Stx2 MAb and PAb. Subsequently, a latex agglutination test was developed and evaluated for the detection of EspB in EPEC/EHEC isolates and of Stx1 and Stx2 in STEC/EHEC isolates. EspB was defined as the biomarker and anti-EspB MAb as the tool for the diagnosis of EPEC/EHEC. The ideal conditions for the production/secretion of EspB were cultivation in DMEM. For the diagnosis of STEC/EHEC, the ideal conditions for the release of Stx were Triton X-100 treatment. ELISA as well as latex agglutination showed the sensitivities and specificities required for diagnostic tests of neglected diseases in developing countries. The latex agglutination test for the detection of these pathogens was precise, rapid and easy to perform, thereby being promising for their utilization in laboratories with limited resources.

Globalmente ocorrem cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos associadas à diarreia, principalmente na África subsaariana, sul da Ásia e América Latina. Dentre os patógenos causadores de diarreia, Escherichia coli diarreiogênica (DEC) é o agente etiológico bacteriano mais comum, incluindo E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli produtora da toxina de Shiga e seu subgrupo enterohemorrágica (STEC/EHEC). Os dados epidemiológicos indicam a importância do diagnóstico precoce e sua realização em locais com pouca infraestrutura. Desta forma o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um teste rápido, sensível e específico para o diagnóstico de EPEC e STEC/EHEC. Primeiramente, foram definidas diferentes condições do cultivo bacteriano: Dulbecco\'s modified Eagle\'s (DMEM), DMEM contendo 1% de triptona e DMEM pré-condicionado para o cultivo dos isolados de EPEC/EHEC e avaliação da produção/secreção das proteínas secretadas EspA e EspB, utilizando anticorpos monoclonais (MAb) e policlonais (PAb) anti-EspA ou anti-EspB por ELISA indireto. Para a avaliação da liberação das toxinas de Shiga para o sobrenadante do cultivo bacteriano de STEC/EHEC, foram testados diferentes condições de tratamento, o cultivo bacteriano foi tratado com Triton X-100 e o sedimento foi tratado com tampão de lise B-PER utilizando MAb e PAb anti-Stx1 ou anti-Stx2 por ELISA de captura. Subsequentemente, foi desenvolvido e avaliado o teste de aglutinação em látex para a detecção de EspB em isolados de EPEC/EHEC, e Stx1 e Stx2 em isolados de STEC/EHEC. EspB foi definida como biomarcador, o MAb anti-EspB como ferramenta para o diagnóstico de EPEC/EHEC, e a condição ideal para a produção/secreção de EspB foi o cultivo em DMEM. Para o diagnóstico de STEC/EHEC a condição ideal para liberação das toxinas Stx foi o tratamento do cultivo com Triton X-100. Tanto o ELISA, como a aglutinação em látex apresentaram sensibilidades e especificidades exigidas para testes diagnósticos de doenças negligenciadas em países em desenvolvimento e os testes de aglutinação em látex para a detecção destes patógenos foram precisos, rápidos e fáceis de executar, sendo portanto promissores para a utilização em laboratórios com mínima infraestrutura. / There are 800,000 deaths associated with diarrhea worldwide in children under five, and these are mainly in sub-Saharan Africa, Southeast Asia and Latin America. Among the causative pathogens of diarrhea, diarrheagenic Escherichia coli (DEC) is the most common bacterial etiological agent, including enteropathogenic E. coli (EPEC) and Shiga toxin-producing E. coli and its subgroup enterohemorrhagic E. coli (STEC/EHEC). Epidemiological data indicate the importance of early diagnosis and its realization in places with limited resources. Therefore, the objective of this work was to develop a rapid, sensitive and specific test for the diagnosis of EPEC and STEC/EHEC. First, different bacterial growth conditions were evaluated: Dulbecco\'s modified Eagle\'s medium (DMEM) or DMEM containing 1% tryptone, and DMEM pre-conditioned with EPEC/EHEC isolates. The production/secretion of the secreted proteins EspA and EspB was determined by indirect ELISA utilizing anti-EspA or anti-EspB monoclonal (MAb) and polyclonal (PAb) antibodies. Different treatments were tested for their effect on the release of Shiga toxins into the medium of STEC/EHEC bacterial cultures. The bacterial culture supernatant was treated with Triton X-100, and the sediment was treated with B-PER lysis buffer. The toxins release was determined by capture ELISA using anti-Stx1 or anti-Stx2 MAb and PAb. Subsequently, a latex agglutination test was developed and evaluated for the detection of EspB in EPEC/EHEC isolates and of Stx1 and Stx2 in STEC/EHEC isolates. EspB was defined as the biomarker and anti-EspB MAb as the tool for the diagnosis of EPEC/EHEC. The ideal conditions for the production/secretion of EspB were cultivation in DMEM. For the diagnosis of STEC/EHEC, the ideal conditions for the release of Stx were Triton X-100 treatment. ELISA as well as latex agglutination showed the sensitivities and specificities required for diagnostic tests of neglected diseases in developing countries. The latex agglutination test for the detection of these pathogens was precise, rapid and easy to perform, thereby being promising for their utilization in laboratories with limited resources.

O consumo crescente de carne de aves requer uma contínua atenção na provisão de alimentos seguros para o consumidor. Entre os agentes emergentes de relevância para a Saúde Pública destaca-se a Escherichia coli produtora de Shiga toxina (STEC), causadora de severa colite hemorrágica e síndrome urêmica hemolítica. Apesar da importância deste microrganismo na carne de ruminantes, sua presença em carne de aves tem sido pouco investigada. O presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de STEC em carcaças de aves congeladas comercializadas na cidade de Xanxerê/SC. Um total de 246 carcaças adquiridas em oito supermercados da cidade, de acordo com a disponibilidade na gôndola, foi submetido à rinsagem individual com água peptonada tamponada 1% e submetida à enumeração de coliformes totais e Escherichia coli e pesquisa de STEC pelo protocolo descrito na ISO/TS 13136:2012(E). Após 24 horas de incubação de uma alíquota da rinsagem a 36°C, foi realizada a pesquisa de genes de virulência (stx1, stx2 e eae) por PCR multiplex. Das carcaças amostradas, a maioria era frango “in natura” (57%), seguidos de galinha (16%), galeto (15%), frango temperado (11%) e frango caipira (2%). A enumeração de coliformes totais no líquido de rinsagem resultou em mediana de 5,2 UFC.g-1 (variando de 1 a 2.836,1 UFC.g-1) e de Escherichia coli foi 0,6 UFC.g-1 (variando de 1 242 UFC.g-1), demonstrando uma qualidade higiênico-sanitária satisfatória do produto. Todos os líquidos de rinsagem originados das 246 carcaças avaliadas foram negativos para os genes stx1 e stx2, indicando ausência de STEC nas amostras. Em 12 carcaças (4,88%) foi confirmada a presença de E.coli eae+, indicando a presença do patotipo enteropatogênico (EPEC). Conclui-se que as carcaças de aves comercializadas em Xanxerê apresentam um padrão higiênico sanitário adequado e ausência de STEC considerando uma prevalência detectável de 1,5% na amostra analisada. Por outro lado, detectou-se a presença de EPEC, a qual deve ser investigada para caracterizar as cepas encontradas em termos de potencial importância para a saúde do consumidor. / The increasing consumption of poultry meat requires continued attention in the provision of safe food for the consumer. Emerging agents of relevance to Public Health include Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), which causes severe hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. Despite the importance of this microorganism in beef, its presence in poultry meat has been few investigated. The present study aimed to evaluate the occurrence of STEC in frozen poultry carcasses marketed in the city of Xanxerê/SC. A total of 246 carcasses purchased from eight city supermarkets, according to on-shelf availability, was submitted to individual rinsing with 1% buffered peptone water and submitted to enumeration of total coliforms and Escherichia coli and STEC detection by the protocol described in ISO / TS 13136: 2012 (E). After 24 hours of incubation at 36 ° C an aliquot of the rinsing, virulence gene (stx1, stx2 and eae) were investigated by multiplex PCR. Of the carcasses sampled, the majority were fresh poultry meat (57%), followed by chicken (16%), young chicken (15%), seasoned poultry meat (11%) and “caipira”type chicken (2%). The enumeration of total coliforms in the rinsing liquid resulted in a median of 5.2 CFU.g-1 (ranging from 1 to 2836.1 CFU.g-1). The median of Escherichia coli was 0.6 CFU.g-1 (ranging from 1 to 242 CFU.g-1), demonstrating a good sanitary and hygienic quality of the product. All rinse liquids from the 246 carcasses tested were negative for the stx1 and stx2 genes, indicating absence of STEC in the samples. In 12 carcasses (4.88%) the presence of E.coli eae + was confirmed, indicating the presence of the enteropathogenic pathotype (EPEC). It is concluded that the poultry carcasses marketed in Xanxerê have an good hygienic sanitary standard and absence of STEC considering a detectable prevalence of 1.5% in the sample analyzed. On the other hand, we detected the presence of EPEC, which should be further investigated to characterize the strains in terms of potential importance for consumer health.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:54Z : No. of bitstreams: 1 Publico-115.pdf: 983090 bytes, checksum: 7f674d882f7cc66c5e1e6fe6b081c85c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e Programa Brasil Alemanha / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC) produz lesão attaching/effacing (A/E) em células eucarióticas mediada pela adesina de membrana externa intimina. EPEC são sub-agrupadas em típica (tEPEC) e atípica (aEPEC). Recentemente demonstramos que a amostra de aEPEC 1551-2 (sorotipo O não-tipável, não-móvel) invade células HeLa por um processo dependente da expressão de intimina do subtipo omicron. Neste estudo, avaliamos se amostras de aEPEC expressando diferentes subtipos de intimina também são invasoras utilizando ensaios quantitativos de proteção com gentamicina. Também avaliamos se aEPECs invadem células intestinais diferenciadas T84 e Caco-2. Cinco das seis amostras testadas invadiram células HeLa e T84 numa faixa de 13.3%-20.9% e 5.8%-17.8%, respectivamente, do total de bactérias associadas às células. As amostras estudadas foram significantemente mais invasoras que a amostra protótipo de tEPEC E2348/69 (1.4% e 0.5% em células HeLa e T84, respectivamente). A amostra 1551-2 foi ainda testada em células Caco-2 diferenciadas, o que resultou num índice de invasão semelhante àqueles obtidos em células T84 (7,5%±1,7) e também significantemente maior que a tEPEC E2348/69 (1,8%±0,6). A invasão de células T84 foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos ainda que a invasão de células HeLa por aEPEC 1551-2 depende de filamentos de actina, mas não de microtúbulos. Além disso, a infecção de monocamadas não diferenciadas e o rompimento das tight junctions aumentaram a eficiência da invasão de células T84, sugerindo uma via de invasão preferencial pela superfície não diferenciada. Em resumo, amostras de aEPEC podem invadir cultura de células in vitro com eficiência variável e independentemente de subtipo de intimina. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) produce attaching/effacing (A/E) lesions on eukaryotic cells mediated by the outer membrane adhesin Intimin. EPEC are subgrouped into typical (tEPEC) and atypical (aEPEC). We have recently demonstrated that aEPEC strain 1551-2 (serotype O non-typable, non-motile) invades HeLa cells by a process dependent on the expression of intimin subtype omicron. In this study, we evaluated whether aEPEC strains expressing other intimin subtypes are also invasive using the quantitative gentamicin protection assay. We also evaluated whether aEPEC invade intestinal differentiated T84 cells. Five of six strains invaded HeLa and T84 cells in a range of 13.3%-20.9% and 5.8%-17.8%, respectively, of the total cellassociated bacteria. The strains studied were significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.4% and 0.5% in HeLa and T84 cells, respectively). aEPEC strain 1551-2 was also tested in differentiated Caco-2 cells, resulting in an invasion index similar to that obtained in T84 cells (7.5%±1.7%). This strain was also significantly more invasive than prototype tEPEC strain E2348/69 (1.8%±0.6%). Invasiveness of T84 cells was confirmed by transmission electron microscopy. We also showed that invasion of HeLa cells by aEPEC 1551-2 depended on actin filaments, but not on microtubules. In addition, infection of non-differentiated monolayers and disruption of tight junctions enhanced its invasion efficiency in T84 cells, suggesting preferential invasion via a non-differentiated surface. In summary, aEPEC strains may invade intestinal cells in vitro with varying efficiencies and independently of the intimin subtype. / CAPES - Probral: 281/07 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações