Der zeitnahe und möglichst sichere Nachweis bakterieller Krankheitserreger und deren Empfindlichkeit gegenüber verfügbaren antibakteriell wirksamen Chemotherapeutika (Antibiotika) stellt einen Hauptaufgabenbereich der medizinischen mikrobiologischen Routinediagnostik dar. Hierzu wurden im Laufe der Jahre unterschiedliche Methoden entwickelt, womit von der genauen Beschreibung der Kolonie- und mikroskopischen Morphologie, Anfärbbarkeit und Formation über die Charakterisierung der biochemischen Leistungsfähigkeit bis hin zur genauen Sequenzierung des gesamten Genoms ein enormer Fortschritt zu verzeichnen war. Seit Mitte der 1990er Jahre etablierte sich die Massenspektrometrie als phänotypisches Nachweisverfahren und gewann zunehmend an Bedeutung. Ebenso konnten Erfolge beim Nachweis Antibiotika resistenter Bakterien verzeichnet werden. Um das Potential dieser noch jungen Nachweismethode weiter zu erforschen, wurden in dieser Arbeit Spezies der Familie Enterobacteriaceae und der Nonfermenter in eine eigene massenspektrometrische Datenbank aufgenommen, um diese als Grundlage zur Validierung des Identifizierungspotentials der Methode mittels Blindstudie zu nutzen. Im selben Arbeitsschritt wurde der Versuch unternommen, Antibiotika resistente Stämme im Zuge der Speziesidentifizierung zu detektieren, um so Aussagen über eine mögliche Einschränkung der therapeutischen Möglichkeiten und gegebenenfalls notwendigen Hygienemaßnahmen treffen zu können.

O objetivo deste trabalho foi a construção de linhagens geneticamente modificadas de B. subtilis capazes de expressar porções de intimina, principal componente envolvido na capacidade de colonização de linhagens enteropatogênicas de Escherichia coli (EPEC), como estratégia vacinal de administração oral contra diarréias infecciosas. As vacinas desenvolvidas empregaram cinco regiões da intimina de EPEC e linhagens de B. subtilis capazes de expressar e acumular proteínas recombinantes no citoplasma. Além disso, avaliamos o uso de esporos e células vegetativas como veículos vacinais para a entrega de antígenos recombinantes a partir de sistema de expressão epissomal. A eficácia do modelo vacinal foi demonstrada pela: (i) produção de anticorpos sistêmicos (IgG) e secretados (sIgA) contra intimina, (ii) capacidade de neutralização das intiminas expressas por diferentes linhagens de EPEC pelos anticorpos específicos gerados nos animais imunizados; e (iii) proteção a desafio com linhagens de EPEC a partir de modelo experimental que emprega camundongos recém-nascidos. Os resultados representam uma etapa importante na validação de uma nova estratégia vacinal para o controle de patógenos entéricos. Além disto, propomos a utilização de um modelo animal como uma nova ferramenta para se avaliar o potencial protetor de vacinas contra EPEC. / The objective of this work was the construction of genetically modified strains of B. subtilis able to express portions of intimin, the main component involved in colonization by enteropathogenic Escherichia coli strains (EPEC) as a strategy of oral vaccination against infectious diarrhea. The vaccines employed five regions of EPEC intimin and B. subtilis strains expressing recombinant proteins in the cytoplasm. Furthermore, we evaluated the use of spores and vegetative cells as vaccine vehicles for the delivery of recombinant antigens based on an epissomal expression system. The efficacy of the vaccines was demonstrated by: (i) production of systemic (IgG) and mucosal (sIgA) antibody responses to intimin, (ii) neutralizing of intimin expressed by different strains of EPEC by the antibodies generated in immunized animals, and (iii) protection to lethal challenges carried out with EPEC strains using an experimental model based in newborn mice. The results represent an important step in the validation of a new vaccine strategy for the control of enteric pathogens. Moreover, we propose the use of an animal model as a new tool to evaluate the protective potential of vaccines against EPEC.

EPECa tem sido identificada como o principal agente de diarreia aguda em crianças de países em desenvolvimento. Biofilmes são estruturas bacterianas envoltas por uma matriz de exopolissacarídeos. O objetivo deste estudo foi verificar a influência de diferentes condições de cultivo na formação de biofilme por EPECa isoladas de crianças com diarreia e pesquisar a presença de genes relacionados com a formação de biofilme. As sequências genéticas dos genes csgA, crl, fimH e bcsA foram pesquisadas através da PCR e verificadas em 6 (26%), 23 (100%), 22 (95,6%) e 23 (100%) das amostras respectivamente. A formação de biofilme em placas de MTP por EPECa foi melhor evidenciada em meio LB sem sal a 26 °C e em caldo E. coli a 37 °C, tanto em número de amostras quanto em intensidade da formação de biofilme. As microscopias confocal e de varredura propiciaram uma análise qualitativa de microcolônias e pilares, além de EPS respectivamente. As condições de cultivo devem ser usadas com precaução para realmente aferir a capacidade de formação de biofilme por amostras de EPECa. / aEPEC has been identified as the main agent of acute diarrhea in children in developing countries. Biofilms are bacterial structures which are surrounded by a matrix of exopolysaccharides. The aim of this study was investigate the influence of different culture conditions on biofilm formation by 23 aEPEC strains isolated from children with diarrhea and search for the presence of genes related to biofilm formation. The genetic sequences of the csgA, crl, fimH and bcsA genes were screened by PCR and were found in 6 (26%), 23 (100%) 22 (95.6%) and 23 (100%) of the strains respectively. Biofilm formation in MTP plates for aEPEC strains was better evidenced in LB medium without NaCl at 26 ° C and in E. coli broth at 37 ° C, both in number and intensity of biofilm formation. The confocal and scanning electron microscopy provided a qualitative analysis of structures such as microcolonies and pillars, and respectively EPS. The growing conditions should be used with caution to measure the real ability of biofilm formation by strains of aEPEC.

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 µg desse anticorpo reconheceu 0,6 µg de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 µg de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina α no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo. / Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 µg of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 µg of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and α intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.

Cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) estão entre os patógenos mais freqüentemente envolvidos em casos de diarréia. Este patotipo é subdividido em EPEC típicas e atípicas, sendo que as típicas possuem o gene eae (EPEC attaching and effacing) e o plasmídeo EAF (EPEC adherence fator), e as atípicas albergam somente o gene eae. A principal característica de sua patogênese é a formação de uma lesão histopatológica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E), que resulta da adesão íntima da bactéria ao enterócito. A adesão é uma etapa crítica na patogênese bacteriana, sendo o primeiro pré-requisito para que as E. coli colonizem com sucesso a mucosa do hospedeiro. A ligação da bactéria a um ou mais componentes teciduais da matriz extracelular como colágeno I e IV, laminina, fibronectinas celular e plasmática são indícios de que essas moléculas estão sendo usadas como substrato de adesão e colonização do hospedeiro pela bactéria patogênica. Adesinas com capacidade de interagir com componentes da matriz extracelular já foram identificadas em bactérias patogênicas, no entanto, ainda não foi caracterizada nenhuma proteína de EPEC atípica com essa capacidade de adesão. Essa propriedade foi evidenciada em um isolado de EPEC atípica durante pesquisas em nosso laboratório e neste trabalho visamos identificar e caracterizar a(s) proteína(s) envolvida(s) nesta habilidade adesiva. As proteínas possivelmente envolvidas apresentam massas moleculares relativas de 107, 44 e 35 kDa e a pré-incubação do isolado 2103 com componentes de matriz extracelular provoca uma variação no seu padrão de adesão e influencia o número de bactérias aderidas a células epiteliais. No entanto, como esse patotipo é muito heterogêneo essa característica não pode ser extrapolada para todos os isolados dessa categoria. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) has been a leading cause of childhood diarrhea in developing countries. The main mechanism of atypical EPEC pathogenesis is a lesion called attaching and effacing (A/E), which is characterized by intimate adherence of the bacteria to the intestinal epithelium and destruction of microvillus. Nevertheless, it represents a heterogeneous group and other virulence factors may be involved in atypical EPEC pathogenesis. Previously, we have identified one isolate of atypical EPEC, serotype O26:H11, which secretes proteins that interact with ECM macromolecules. The interactions between pathogenic bacteria and ECM molecules such as fibronectin, laminin and collagen may play an important role in the bacterium adherence to and invasion of host cells. Adhesion is critical for successful E. coli colonization of gastrointestinal tract and is mediated by adhesins. The aim of this study is to identify and characterize putative adhesins that may contribute to the binding of the isolate of atypical EPEC to extracellular matrix components. The supernatant of the atypical EPEC isolate was submitted to a solid phase binding assay with matrigel (a mouse basement membrane composed mainly of laminin, collagen IV and fibronectin), the adhered proteins were stripped from the wells, separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and submitted to immunoblotting assay. Three major proteins of apparent molecular weights of 107, 44 e 35 kDa were recognized by the anti-proteins polyclonal serum (produced in rabbit immunized with the isolate\'s supernatant) through immunoblotting assay. Besides, we observed that in the presence of ECM components the isolate clearly changes its adherence pattern of the isolate to HEp-2 cells, and the number of adhered bacteria to epithelial cells. The atypical EPEC do not share a unique pattern of virulence, suggesting that many virulence factors may contribute to the pathogenesis. The identification of proteins involved in the adhesion with extracellular matrix components in one isolate of this category of diarrheagenic E. coli confirms the heterogeneity among the atypical EPEC.

Die vorliegende Arbeit beschaeftigt sich mit Gleichgewichtsproblemen unter Gleichgewichtsrestriktionen, sogenannten EPECs (Englisch: Equilibrium Problems with Equilibrium Constraints). Konkret handelt es sich um gekoppelte Zwei-Ebenen-Optimierungsprobleme, bei denen Nash- Gleichgewichte fuer die Entscheidungen der oberen Ebene gesucht sind. Ein Ziel der Arbeit besteht in der Formulierung dualer Stationaritaetsbedingungen zu solchen Problemen. Als Anwendung wird ein oligopolistisches Wettbewerbsmodell fuer Strommaerkte betrachtet. Zur Gewinnung qualitativer Hypothesen ueber die Struktur der betrachteten Modelle (z.B. Inaktivitaet bestimmter Marktteilnehmer) aber auch fuer moegliche numerische Zugaenge ist es wesentlich, EPEC-Loesungen explizit bezueglich der Eingangsdaten des Problems zu formulieren. Der Weg dorthin erfordert eine Strukturanalyse der involvierten Optimierungsprobleme (constraint qualifications, Regularitaet), die Herleitung von Stabilitaetsresultaten bestimmter mengenwertiger Abbildungen und die Nutzung von Transformationsformeln fuer die sogenannte Ko-Ableitung. Weitere Schwerpunkte befassen sich mit der Beziehung zwischen verschiedenen dualen Stationaritaetstypen (S- und M-Stationaritaet) sowie mit stochastischen Erweiterungen der betrachteten Problemklasse, sogenannten SEPECs. / This thesis is concerned with equilibrium problems with equilibrium constraints or EPECs. Concretely, we consider models composed by coupling together two-level optimization problems, the upper-level solutions to which are non-cooperative (Nash-Cournot) equilibria. One of the main goals of the thesis involves the formulation of dual stationarity conditions to EPECs. A model of oligopolistic competition for electricity markets is considered as an application. In order to profit from qualitative hypotheses concerning the structure of the considered models, e.g., inactivity of certain market participants at equilibrium, as well as to provide conditions useful for numerical procedures, the ablilty to formulate EPEC solutions in relation to the input data of the problem is of considerable importance. The way to do this requires a structural analysis of the involved optimization problems, e.g., constraints qualifications, regularity; the derivation of stability results for certain multivalued mappings, and the usage of transformation formulae for so-called coderivatives. Further important topics address the relationship between various dual stationarity types, e.g., S- and M-stationarity, as well as the extension of the considered problem classes to a stochastic setting, i.e., stochastic EPECs or SEPECs.

Cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) estão entre os patógenos mais freqüentemente envolvidos em casos de diarréia. Este patotipo é subdividido em EPEC típicas e atípicas, sendo que as típicas possuem o gene eae (EPEC attaching and effacing) e o plasmídeo EAF (EPEC adherence fator), e as atípicas albergam somente o gene eae. A principal característica de sua patogênese é a formação de uma lesão histopatológica no epitélio intestinal denominada attaching and effacing (A/E), que resulta da adesão íntima da bactéria ao enterócito. A adesão é uma etapa crítica na patogênese bacteriana, sendo o primeiro pré-requisito para que as E. coli colonizem com sucesso a mucosa do hospedeiro. A ligação da bactéria a um ou mais componentes teciduais da matriz extracelular como colágeno I e IV, laminina, fibronectinas celular e plasmática são indícios de que essas moléculas estão sendo usadas como substrato de adesão e colonização do hospedeiro pela bactéria patogênica. Adesinas com capacidade de interagir com componentes da matriz extracelular já foram identificadas em bactérias patogênicas, no entanto, ainda não foi caracterizada nenhuma proteína de EPEC atípica com essa capacidade de adesão. Essa propriedade foi evidenciada em um isolado de EPEC atípica durante pesquisas em nosso laboratório e neste trabalho visamos identificar e caracterizar a(s) proteína(s) envolvida(s) nesta habilidade adesiva. As proteínas possivelmente envolvidas apresentam massas moleculares relativas de 107, 44 e 35 kDa e a pré-incubação do isolado 2103 com componentes de matriz extracelular provoca uma variação no seu padrão de adesão e influencia o número de bactérias aderidas a células epiteliais. No entanto, como esse patotipo é muito heterogêneo essa característica não pode ser extrapolada para todos os isolados dessa categoria. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) has been a leading cause of childhood diarrhea in developing countries. The main mechanism of atypical EPEC pathogenesis is a lesion called attaching and effacing (A/E), which is characterized by intimate adherence of the bacteria to the intestinal epithelium and destruction of microvillus. Nevertheless, it represents a heterogeneous group and other virulence factors may be involved in atypical EPEC pathogenesis. Previously, we have identified one isolate of atypical EPEC, serotype O26:H11, which secretes proteins that interact with ECM macromolecules. The interactions between pathogenic bacteria and ECM molecules such as fibronectin, laminin and collagen may play an important role in the bacterium adherence to and invasion of host cells. Adhesion is critical for successful E. coli colonization of gastrointestinal tract and is mediated by adhesins. The aim of this study is to identify and characterize putative adhesins that may contribute to the binding of the isolate of atypical EPEC to extracellular matrix components. The supernatant of the atypical EPEC isolate was submitted to a solid phase binding assay with matrigel (a mouse basement membrane composed mainly of laminin, collagen IV and fibronectin), the adhered proteins were stripped from the wells, separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and submitted to immunoblotting assay. Three major proteins of apparent molecular weights of 107, 44 e 35 kDa were recognized by the anti-proteins polyclonal serum (produced in rabbit immunized with the isolate\'s supernatant) through immunoblotting assay. Besides, we observed that in the presence of ECM components the isolate clearly changes its adherence pattern of the isolate to HEp-2 cells, and the number of adhered bacteria to epithelial cells. The atypical EPEC do not share a unique pattern of virulence, suggesting that many virulence factors may contribute to the pathogenesis. The identification of proteins involved in the adhesion with extracellular matrix components in one isolate of this category of diarrheagenic E. coli confirms the heterogeneity among the atypical EPEC.

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 µg desse anticorpo reconheceu 0,6 µg de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x 10-8 M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 µg de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina (Int388-667) na forma purificada e a intimina α no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo. / Intimin is the major virulence factor involved in the pathogenesis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The detection of EHEC and typical or atypical EPEC has fundamental importance in defining the therapeutic management of infections caused by E. coli, which are still the leading cause of acute diarrhea in children and adults in many developed and developing countries. Antibodies are important tools in the detection of several pathogens. In this study it was evaluated the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies against intimin in the detection of EPEC and EHEC by immunoblotting. All employed antibodies showed 100% specificity and the sensitivity was 97%, 92% and 78% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, rat antisera and monoclonal antibody, respectively. This anti-intimin monoclonal was characterized as IgG2b and 1 mg recognized 0.6 µg of purified intimin with a dissociation constant of 1.3 x 10-8 M. The less extent reactivity of monoclonal led us to clone and express the single chain fragment variable of this antibody (scFv). Thus, the anti-intimin hybridoma mRNA was extracted, reverse transcribed to cDNA and the light and heavy chains of variable fragment of the antibody were amplified using commercial random primers. The chains were amplified, ligated to the pGEM-T Easy vector and the insert was sequenced. Specific primers were designed and used in a strategy to amplify and link the chains, obtaining the scFv, which was cloned into the pAE expression vector. E. coli BL21(DE3)plys was transformed with the pAE-scFv anti-intimin plasmid and subjected to induction of protein expression. The scFv anti-intimin, expressed in the insoluble fraction, was purified and submitted to refolding. The yield was 1 mg of protein per 100 mL of bacterial culture. To test the functionality of the scFv, ELISA and immunofluorescence assays were performed. The results showed that 275 ng of scFv reacted with 2 µg of purified intimin resulting in an absorbance of 0.75. By immunofluorescence it was observed a strong reactivity to the typical EPEC isolate E2348/69. This study demonstrated that the recombinant anti-intimin antibody obtained was able to recognize the conserved region of intimin (Int388-667) in its purified form and α intimin in a typical EPEC isolate, and was more efficient than the native monoclonal antibody.

A Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) é um dos principais agentes causadores de diarreia infantil e às vezes é necessário o tratamento com antimicrobianos. O objetivo do presente trabalho foi verificar o perfil de resistência aos antimicrobianos de 72 amostras de aEPEC, correlacionando com o perfil genético de resistência e a produção de β-lactamases de espectro extendido (ESBL). As aEPEC apresentaram resistência aos β-lactamâmicos, sulfonamidas, tetraciclinas, aminoglicosídeos e ansamicina, verificadas através de disco difusão. Multirresistência foi identificada em 27,8%. Treze amostras (18,1%) produziram ESBL. Os genes de resistência encontrados através de PCR foram: sul1 - 50%, sul2 - 86,4%, tetA - 42,1%, tetB - 68,4%, tetC- 5,3%, blaCTX-M - 26,1%, blaTEM -78,3%, blaSHV - 4,4% e intl - 35,7%. O conhecimento sobre o perfil de resistência e produção de ESBLs é muito importante na orientação do tratamento adequado quando se fizer necessário, além de conhecer o potencial de resistência que poderiam vir a ser transferidos para outras bactérias. / The atypical Enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is one of the most common childhood diarrhea`s agent, and sometimes the antimicrobials treatment may be necessary. The aim of this study was verify the antimicrobial resistance profile of 72 aEPEC strains, correlating with the resistance genetic profile, and the extended-spectrum β-lactamases (ESBL) production. The aEPEC strains presented resistance to β-lactams, Sulfonamides, Tetracycline, Aminoglycoside, and Ansamycin, verified through disc diffusion. Multiresistance was identified in 27.8%. Thirteen strains (18.1%) produced ESBL. The resistance genes found through PCR were: sul1 - 50%, sul2 86.4%, tetA 42.1%, tetB 68.4%, tetC- 5.3%, blaCTX-M 26.1%, blaTEM -78.3%, blaSHV 4.4%, and intl 35.7%. The knowledge about resistance profile´s and ESBL production is very important in guiding the most appropriate treatment when it is necessary, in addition to knowing the resistance potential that could be transferred to other bacteria.

Der zeitnahe und möglichst sichere Nachweis bakterieller Krankheitserreger und deren Empfindlichkeit gegenüber verfügbaren antibakteriell wirksamen Chemotherapeutika (Antibiotika) stellt einen Hauptaufgabenbereich der medizinischen mikrobiologischen Routinediagnostik dar. Hierzu wurden im Laufe der Jahre unterschiedliche Methoden entwickelt, womit von der genauen Beschreibung der Kolonie- und mikroskopischen Morphologie, Anfärbbarkeit und Formation über die Charakterisierung der biochemischen Leistungsfähigkeit bis hin zur genauen Sequenzierung des gesamten Genoms ein enormer Fortschritt zu verzeichnen war. Seit Mitte der 1990er Jahre etablierte sich die Massenspektrometrie als phänotypisches Nachweisverfahren und gewann zunehmend an Bedeutung. Ebenso konnten Erfolge beim Nachweis Antibiotika resistenter Bakterien verzeichnet werden. Um das Potential dieser noch jungen Nachweismethode weiter zu erforschen, wurden in dieser Arbeit Spezies der Familie Enterobacteriaceae und der Nonfermenter in eine eigene massenspektrometrische Datenbank aufgenommen, um diese als Grundlage zur Validierung des Identifizierungspotentials der Methode mittels Blindstudie zu nutzen. Im selben Arbeitsschritt wurde der Versuch unternommen, Antibiotika resistente Stämme im Zuge der Speziesidentifizierung zu detektieren, um so Aussagen über eine mögliche Einschränkung der therapeutischen Möglichkeiten und gegebenenfalls notwendigen Hygienemaßnahmen treffen zu können.