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Caracterización de gelatinas de uso enológico presentes en el mercado mediante análisis químicos y electroforéticosZamorano Carbonell, Matías Alonso January 2010 (has links)
Memoria para optar al Título
Profesional de Ingeniero Agrónomo
Mención Enología / Esta memoria tuvo por objetivos la caracterización química y física de 14 gelatinas de
uso enológico presentes en el mercado nacional y el estudio del comportamiento de la
composición fenólica global de una solución hidroalcóholica de concentración conocida
y de un vino tinto del cv. Cabernet Sauvignon frente a la clarificación con tres dosis
diferentes de cada gelatina.
Inicialmente, las gelatinas fueron caracterizadas mediante parámetros físicos y químicos
como pH, contenido de proteína total, densidad y detección de proteínas en matrices de
celulosa. Todas las muestras presentaron densidades similares, mientras que sus pH
fueron consecuentes con sus procesos de elaboración. Las gelatinas que presentaron
mayores concentraciones proteicas además de una mayor difusión y reactividad al
colorante sobre la matriz de celulosa, fueron las muestras de formulación sólida.
Luego de comprobar la presencia de proteínas en las muestras analizadas, se realizaron
electroforesis SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes, para determinar la
composición proteica de cada gelatina. Como estándar de peso molecular se utilizaron
las proteínas presentes en la saliva humana. Para las gelatinas líquidas se utilizaron
geles con una concentración de 12% de acrilamida, presentando una dispersión no
uniforme del material con la presencia de una única banda proteica a los 55 kDa en tres
de las seis gelatinas. En el caso de las muestras de formulación sólida, se utilizaron
geles con una concentración de 10% de acrilamida. A diferencia del caso anterior, éstas
sí presentaron bandas proteicas, sin embargo debido a su gran tamaño, migraron sólo en
una fracción del gel, impidiendo determinar sus pesos moleculares exactos.
A continuación, se realizaron pruebas de clarificación estableciendo como unidades
experimentales de cada ensayo una solución hidroalcóholica de composición conocida y
un vino tinto del cv. Cabernet Sauvignon. Se utilizaron dosis de gelatina de 5, 10 y 15
g/hL correspondientes a cada tratamiento. Luego de 48 horas de clarificación, se
determinaron parámetros espectofotométricos para conocer el comportamiento de la
fracción polifenólica global frente a la acción clarificadora de cada gelatina. Los
resultados obtenidos en ambos ensayos, mostraron una mayor extracción y remoción de
compuestos por parte de las gelatinas sólidas, especialmente de taninos totales. / The objective of this research was the chemical and physical characterization of 14
oenological gelatins that are available in the national market and the study of the
behavior of the phenolic compounds of a hydroalcoholic solution of known
concentration and a red wine from the cv. Cabernet Sauvignon after clarification by
means of three different doses of each gelatin under study.
Initially, the gelatins were characterized through several physical and chemical
parameters, such as pH, total protein content, density and protein detection on cellulose
matrices. All samples showed similar densities, while their pHs were consistent with
their manufacture. With respect to protein concentration and detection in matrices of
cellulose, the solid gelatins in solution had higher concentrations and a higher dye
diffusion and reactivity on the cellulose matrix compared with the liquid gelatins.
After verifying the presence of proteins in samples, was carried out a SDS-PAGE
electrophoresis performed in denaturing conditions in order to determine the protein
composition of each gelatin. As standard of molecular weight were used the proteins
present in the human saliva. For liquid gelatins, were used gels with a concentration of
12% acrylamide, showing an irregular dispersity of the material with the presence of the
only protein band of 55 kDa only in three of the six gelatins. In the case of samples of
solid formulation, were used gels with a concentration of 10% acrylamide. Unlike the
previous case, the solid samples showed bands corresponding to proteins, but they
couldn’t be separated correctly, which didn´t allow us to know their exact molecular
weights.
Next, were carried out clarification tests, establishing as experimental units for each
trial, a hydroalcoholic solution of known composition and a red wine of cv. Cabernet
Sauvignon. For each gelatin were used three doses of 5, 10 and 15 g / hL corresponding
to each treatment. After 48 hours of clarification, were determined spectrophotometric
parameters in order to know the global polyphenolic fraction behavior versus the
clarifying action of the various gelatins. The results of both trials showed a higher
extraction and removal of phenolic compounds using solid gelatins, the total tannins
being the most affected compounds.
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Determinación de especies de glutatión por electroforesis capilar en plantas bajo estrés por cobreGonzález Roa, Cecilia Catalina January 2005 (has links)
El objetivo de éste estudio fue optimizar un método por Electroforesis Capilar de Zona para la determinación rápida de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en la matriz de tejido vegetal de hojas y raíces de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L.). Se compararon dos tratamientos de muestra diferentes para el aislamiento de los analitos de la matriz vegetal, se determinó los niveles de GSH y GSSG en plantas sometidas a estrés por cobre en dos periodos de tiempo (48 horas y 28 días) y se evaluó el efecto de cobre sobre la biomasa y los niveles de macronutrientes presentes en la planta.
De los resultados obtenidos se concluye que: La optimización de los parámetros instrumentales, tales como largo de capilar, voltaje aplicado y polaridad de la fuente de poder, así como la optimización de los parámetros relacionados con el electrolito de corrida, tales como composición, concentración, pH y fuerza iónica permiten la separación de ambos analitos en un tiempo inferior a los tres minutos. Las condiciones óptimas fueron: polaridad de la fuente positiva, capilar de 40 cm de largo, voltaje de 20 kV, electrolito borato 300 mM, pH 7,6 y 30 segundos de inyección hidrostática de la muestra.
El método optimizado para la matriz vegetal presenta una muy buena correlación entre área bajo la curva y concentración de GSH y GSSG, con coeficientes de correlación de 0,9995 y 0,9994, respectivamente. Los límites de detección fueron 2,75 y 1,68 µmol/L para GSH y GSSG y la recuperación del analito en el proceso fue de 105 y 87 %, respectivamente.
En la etapa de tratamiento de la muestra, el uso de un método químico (ácido metafosfórico) es más efectivo que el uso de un método físico (copas de ultrafiltración) para el aislamiento de los analitos desde la matriz proteica. Esta efectividad se reflejo en un menor consumo de tiempo, mayor volumen de muestra obtenido y obtención de una matriz mas limpia.
El tratamiento prolongado de las plantas con cobre se manifiesta en síntomas de toxicidad con una drástica disminución de la biomasa de la parte aérea y raíz, en asociación con un descenso de la concentración de potasio en ambos órganos. Este efecto no se observa en plantas tratadas por un periodo corto de tiempo con el metal.
Los niveles de cobre alcanzados en la parte aérea y raíz correlacionan positivamente con la concentración de cobre aplicada en ambos tratamientos, siendo las concentraciones más altas observadas en la raíz El cobre aplicado a la planta modifica los niveles de glutatión reducido y oxidado tanto en el tratamiento crónico como en el agudo. El efecto más notorio se manifestó sobre el glutatión reducido contenido en la raíz. Este péptido decrece su concentración a medida que incrementa la concentración de cobre, siendo este efecto independiente de los cambios morfológicos que presenta la raíz y del lapso de tiempo en que el cobre fue aplicado.
Los cambios producidos en los niveles de glutatión reducido y oxidado constituyen un buen indicador de la respuesta temprana al estrés por metal en plantas desarrolladas, expuestas a cobre por un periodo de tiempo corto (horas)
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Estudio de la diversidad genética de individuos de poblaciones silvestres de Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze "Tara" mediante análisis de patrones electroforéticos de proteínas seminalesLinares Gonzáles, José Ricardo January 2014 (has links)
Se realizó el estudio electroforético de proteínas seminales totales de 18 individuos de poblaciones silvestres de Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze, procedentes de Tarma, Ayacucho y Cajamarca, en geles de poliacrilamida con Sodio Dodecil Sulfato SDS-PAGE. Las proteínas fueron extraídas a partir de la harina de la semilla mediante el uso de un buffer de extracción que contenía 0.5M Tris-HCl (pH 8.0), 0.2% SDS, 5M úrea y 1% 2-mercaptoetanol, glicerol al 10 % (v/v). La cantidad de proteínas se determinó mediante el método de Biuret. Asimismo mediante el análisis densitométrico se logró identificar 22 bandas proteicas las cuales mostraron diferencias en sus movilidades. De esta manera se obtuvieron modelos electroforéticos diferentes para algunos de los individuos y mediante un análisis de conglomerados (método UPGMA) se obtuvo un dendrograma que mostró la distinción entre individuos en dicho carácter, permitiendo expresar las diferencias entre ellos. Se identificó que existen bandas únicas las cuales solamente se encuentran en individuos de Cajamarca (banda de 94-91 kDa y de 49-46 kDa) y bandas que son excluyentes pues solamente se encuentran en individuos de Tarma y Ayacucho (64-61 kDa). Por lo que se concluye se concluye que la cantidad de proteínas no guarda relación con la zona de procedencia, que los individuos analizados comparten un mismo acervo genético y que el patrón electroforético de la semillas de “tara” analizadas permite identificar su procedencia geográfica.
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Desarrollo de sistemas de preconcentración "on-line" para análisis de muestras de interés biológico mediante electroforesis capilarTascón, Marcos January 2015 (has links)
Los analitos de interés biológico utilizados fueron una familia de alcaloides b-carbolínicos denominados Harmanos, entre ellos podemos destacar al Harmano, Norharmano, Harmol, Harmalol, Harmina y Harmalina. Todos estos alcaloides son estructuralmente muy similares y de pesos moleculares muy cercanos (en algunos casos de 1 Da) con lo cual la separación de los mismos constituye un interesante desafío. El interés de su análisis radica en que estos alcaloides están presentes en cantidades variables en varias especies vegetales y que, a su vez, a ciertas concentraciones poseen efectos psicotrópicos y alucinógenos en seres humanos, así como se presume que son cancerígenos según estudios recientes. Los mismos en concentraciones elevadas en alimentos los harían no aptos para el consumo humano.
Por otra parte se estudiaron péptidos opiáceos que están relacionados con enfermedades como el dolor crónico, alzheimer, entre otras. Su determinación a concentraciones extremadamente bajas en plasma humano sería de mucha utilidad al momento de realizar diagnósticos precoces.
Mediante técnicas electroforéticas de preconcentración en línea y mediante el uso de distintos sistemas de detección se intenta alcanzar los límites de detección deseados para cada muestra en particular. Además se desarrollan nuevos métodos de concentración utilizando a la temperatura como variable.
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Caracterización de la microbiota intestinal de Seriola lalandi (Valenciennes, 1833) de medio silvestre comparación de métodos tradicionales versus métodos moleculares de identificaciónRubio Valladares, Laura Elizabeth January 2016 (has links)
Tesis presentada para optar al Grado de Magister en Ciencias de la Acuicultura / El jurel cola amarilla (Seriola lalandi) se viene cultivando en chile, durante los últimos años, y su expansión se debe a la gran demanda en el mercado internacional. El mayor conocimiento científico - técnico ha sustentado su incremento en producción, convirtiéndose en una prominente especie para el desarrollo acuícola.
Dentro de las áreas de estudio en acuicultura para el aumento en producción, la nutrición ha tenido un rol relevante, que debido a los tipos de dietas, uso de antibióticos, cambia el status sanitario del pez y la composición microbiana intestinal. Estos últimos son microorganismos asociados a la microbiota normal, que otorgan beneficios como proteger al pez de ataque de patógenos y ayudar en la digestión de los ingredientes incorporados en la dieta. Sin embargo, el conocimiento de la microbiota de esta especie es muy limitada, es por eso que el objetivo de este estudio fue caracterizar la microbiota intestinal de Seriola lalandi de medio silvestre.
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Nuevas estrategias para la simplificación y miniaturización de sistemas analíticos : empleo de nanoestructuras de carbonoSpringer, Valeria 12 March 2014 (has links)
En el presente trabajo de Tesis se desarrollan, evalúan y proponen métodos analíticos simples, con el mayor grado de simplificación y miniaturización posible, para la determinación de residuos de antibióticos y pesticidas en muestras de alimentos y ambientales.
El interés en este tipo de analitos radica en que en los últimos años se ha incrementado el empleo de fármacos, tanto en medicina humana como veterinaria, y la aplicación de pesticidas en prácticas agrícolas. Esto ha generado cierta preocupación puesto que sus residuos pueden ocasionar daños a la salud humana. Además, su uso y control está regulado por organismos nacionales e internacionales.
Los métodos propuestos se basan en el uso de la técnica de electroforesis capilar (CE), evaluando además, diferentes estrategias para el pretratamiento de las muestras analizadas; en lo que respecta al “clean up” de las mismas y a la preconcentración de los analitos a determinar.
Se ha estudiado el empleo de nanotubos de carbono tanto en el paso de preconcentración (como material adsorbente) y en la separación electroforética (fase pseudoestacionaria).
Así, se han propuesto los siguientes métodos:
-Separación y determinación de sulfonilureas en muestras de agua de distinta procedencia, que incluye un paso de preconcentración en continuo, fuera de línea, utilizando una minicolumna empaquetada con nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs). - Análisis de muestras de leche bovina, determinando antibióticos de dos familias diferentes, empleando como solución de separación una fase pseudoestacionaria que contiene nanotubos de carbono para mejorar la eficiencia de separación. Este método incluye una preconcentración en línea (“stacking”) combinada con una fuera de línea, que también se realiza en un sistema de flujo continuo.
- Se desarrolla un método empleando líquido iónico como medio de separación y nanotubos de carbono de pared simple (SWCNTs) como fase pseudoestacionaria, para mejorar la resolución en separaciones electroforéticas. Este nuevo método se emplea para la determinación de sulfonilureas en muestras de granos.
- Se establece un método electroforético muy sencillo para la determinación de FQs en leche que incluye un paso de preconcentración, empleando un microdispositivo con MWCNTs.
- Con el objetivo de mejorar la resolución electroforética, se evaluó el uso de capilares con recubrimientos poliméricos para la determinación anterior. Se propone el acoplamiento de esta separación con la espectrometría de masas, lo cual se realiza aplicando MALDI-TOF-MS para hacer el análisis confirmatorio.
- Se implementa el acoplamiento de este último método de electroforesis capilar con espectrometría de masa, aplicando la técnica MALDI para llevar a cabo el análisis confirmatorio.
En todos los casos, se han desarrollado nuevas estrategias para llevar a cabo análisis simples y rápidos, con el mayor grado de miniaturización posible. Los resultados obtenidos han sido muy satisfactorios. / In this thesis, several straightforward analytical methods are developed, evaluated and proposed with the major grade of simplification and miniaturization as possible for determining antibiotics and pesticides residues in food and environmental samples.
During the last years, the increased use of pharmaceutical compounds in human and veterinary medicine and the massive application of pesticides in agricultural practices have generated special attention due to their residues can be harmful for the human health. Moreover, the use of these analytes is regulated by national and international organizations.
The proposed methods are based on capillary electrophoresis (CE). Different strategies are developed to perform the pretreatment of analyzed samples, including both, the clean-up of samples and analytes preconcentration. Moreover, carbon nanotubes are included as sorbent material for the preconcentration step and as pseudostationary phases in the CE analysis.
Thus, the following methods have been proposed:
- Separation and determination of sulfonylurea herbicides in water samples, including a continuous preconcentration step in off-line mode. A minicolumn packed with multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) was used.
- Determination of antibiotics (belonging to different families) in bovine milk samples. Carbon nanotubes were employed as pseudostationary phases in the electrophoretic system with the aim to improve the separation. This method includes an ‘in-line’ preconcentration step (stacking) and an ‘off-line’ preconcentration step using a continuous flow system.
- A CE method with ionic liquid and single wall carbon nanotubes (SWCNTs) was developed. SWCNTs were proposed as pseudostationary phases in order to improve the electrophoretic resolution. This novel method was used for determination of sulfonylureas in grain samples. A simple electrophoretic method to determine FQs in milk samples is developed. A μ-SPE step employing MWCNTs is included for analytes preconcentration.
-With the aim to improve the electrophoretic resolution and a further MALDI-TOF-MS analysis of analytes, the use of polymer-coated capillaries was considered for fluoroquinolones determination in milk samples.
-Besides, an off-line coupling between CE and MS was included by using the ionization technique MALDI with the aim to perform the accurate identification of analytes after CE-UV determination. In all experiences, new strategies for simple and fast analyses have been proposed, aiming to develop miniaturized methodologies with satisfactory analytical performance.
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Proteínas de arroz: propiedades estructurales y funcionalesPinciroli, María January 2011 (has links)
Objetivo general: Estudiar las proteínas de arroz de la variedad Nutriar desde el punto de vista estructural y funcional provenientes de grano pulido e integral. Compararlas con las de una variedad de amplio uso local, de calidad tropical.
Objetivos específicos: Determinar la composición proteica, cuali y cuantitativamente de la variedad Nutriar en comparación con la variedad de referencia.
Explorar distintos métodos de preparación de aislados proteicos mediante la variación del pH de extracción de proteínas. Elección del método más adecuado.
Caracterización estructural, nutricional y funcional de los aislados obtenidos con la metodología de elección.
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Ferramentas de bioinformática para proteômica / Bioinformatics tools for proteomicsBrum, Itaraju Junior Baracuhy 18 August 2018 (has links)
Orientador: Eduardo Galembeck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Brum_ItarajuJuniorBaracuhy_M.pdf: 1893501 bytes, checksum: 59afb345a47fb8e963452a41b2327f1c (MD5)
Previous issue date: 2007 / Resumo: A área de proteômica visa estudar um conjunto completo de proteínas expressas por um organismo ou tecido numa dada situação, através da identificação e quantificação. Apesar de limitações nas técnicas disponíveis, vem se aumentando o volume de informações oriundos desta área, situação que exige o emprego de ferramentas computacionais para permitir o uso eficiente de dados disponíveis, além de buscar-se novas formas de análise destes. Este projeto visa o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática para aplicação em proteômica. Estas ferramentas abrangem as seguintes aplicações: Cálculo Teórico de Ponto Isoelétrico e Peso Molecular de seqüências de aminoácidos, eletroforese-bidimensional teórica, digestão teórica e simulação de eletroforese e identificação de peptídeos, ferramenta para análise de Vias Metabólicas a partir de dados de proteômica / Abstract: The proteomics field aims to study sets of proteins expressed in a cell or tissue, according to a specific situation, through protein identification and quantification. Though technical limitations do exist, the amount of information derived from this field increases each day. And so, there is a need for employing computational tools that enable efficient analysis of data. This project aims developing bioinformatics tools for application in proteomics. The tools here presented comprehend the following tasks: theoretical computation of isoeletric point and molecular weight of aminoacid sequences, theoretical two-dimensional electrophoresis, theoretical triptic digestion and electrophoresis simulation for peptide identification, and analysis of metabolic pathways with proteomics data / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular
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Study of substrate modulation and bioreceptor anchoring for the development of high performance microarraysJiménez Meneses, Pilar 28 February 2020 (has links)
[EN] The present PhD thesis is focused on the study of new approaches able to improve the performance of microarrays. Aspects such as the nature of the surfaces and the probes, functionalization of the substrates, probe printing, immobilization and target detection were considered in the fabrication process. Within all these features, modulation of the surface behavior and probe anchoring were the most challenging aspects, as the interface is key for the immobilization of the receptors and the later detection, which will determine the performance of the final device.
In this work, two microarray types have been developed, one for oligonucleotides and another one for antibodies. Then, a characterization of the reached achievements is done. All the routes have in common the use of light to catalyze the attachment of bioreceptors on the surface substrates, employing click-chemistry reactions.
In the first chapter, the state of the art of microarray technology is overviewed, with special focus in the main aspects of microarray design.
In the second chapter, the goals for this PhD thesis are settled. These general objectives are addressed in the following experimental chapters.
In the third chapter, the effect of hydrophobicity and probe multi-point attachment on the microarray performance are studied. Thus, modulation of glass slide surfaces with alkenyl and alkynyl motifs for the anchoring of mono and multithiolated oligonucleotide probes by thiol-ene and thiol-yne photocoupling reactions, respectively, was accomplished. Surfaces modified with the most hydrophobic silane (alkynyl), or anchoring polythiolated probes, revealed better performances. These microarray systems were applied to the discrimination of SNPs and to detect bacterial genome PCR products.
In the fourth chapter, a rational design for the preparation of microarrays of antibodies, is done. The immobilization approach displays the oriented anchoring of thiol-bearing antibody fragments to alkenylated glass slides by thiol-ene photocoupling reaction. Multiplexed detection of cardiac biomarkers is demonstrated. The designed microarray shows higher recognition capacity in comparison to whole antibody microarrays.
In the fifth chapter, improvement of a novel methodology for the anchoring of thiolated oligonucleotides has been developed. Due to the interest on modifying highly hydrophobic surfaces, a new photoinduced reaction is set up. Thanks to the features of the named "fluor-thiol photocoupling reaction", immobilization of thiolated probes to surfaces containing C-F bonds in a fast, easy and biocompatible with aqueous media way, was achieved. Hydrophobicity of the surfaces was controlled to get successful hybridizations. Because of the high hydrophobicity of the surfaces, a huge confinement of the probes is accomplished, which allows the approximation of the analytes only where the probe is linked, keeping a high repulsion in the remaining surface. The perfluorinated glass slides improved the immobilization densities and detection capacity, regarding to the alkenylated and alkynylated surfaces, and allowed the discrimination of SNPs and detection of bacterial PCR products, as well.
In the sixth chapter, other surfaces different than glass are explored. Thus, polyvinylidene fluoride membranes were employed as substrates for the development of oligonucleotide microarrays. Therefore, a fast, easy and mild functionalization process by UV irradiation and organosilane chemistry, was developed. Then, alkenyl functionalized and non-functionalized membranes were applied to microarray technology by covalent anchoring through thiol-ene and fluor-thiol photocoupling reactions, respectively. Promising results were obtained with both surfaces. / [ES] La presente tesis tesis doctoral se centra en el estudio de nuevas aproximaciones capaces de mejorar el rendimiento de los microarrays. Aspectos como la naturaleza de las superficies y las sondas, la funcionalización de los sustratos, la impresión, la inmovilización y la detección de las sondas se consideraron en el proceso de fabricación. Dentro de todas estas características, la modulación de la superficie y el anclaje de la sonda fueron los aspectos más desafiantes, ya que la interfaz es clave para la inmovilización de los receptores y la posterior detección, lo que determinará el rendimiento del dispositivo final.
En este trabajo, se han desarrollado dos tipos de microarrays, uno para oligonucleótidos y otro para anticuerpos. Luego, se ha realizado una caracterización de los logros alcanzados. Todas las rutas tienen en común el uso de la luz para catalizar la unión de los biorreceptores en los sustratos de la superficie, empleando reacciones de la química clic.
En el primer capítulo, se facilita una visión general del estado del arte de la tecnología de microarrays con un enfoque especial en los aspectos principales del diseño de microarrays.
En el segundo capítulo, se establecen los objetivos de esta tesis doctoral. Estos objetivos generales se abordan en los siguientes capítulos experimentales.
En el tercer capítulo, se estudia el efecto de la hidrofobia y el uso de sondas con múltiples puntos de unión, en el rendimiento del microarray. De este modo, se llevó a cabo la modulación de superficies vidrio con grupos alquenilo y alquinilo para el anclaje de sondas de oligonucleótidos mono y multitioladas mediante las reacciones de foto anclaje del tiol-eno y tiol-ino, respectivamente. Las superficies modificadas con el silano más hidrofóbico (alquinilo) y las sondas politioladas ancladas, revelaron mejores rendimientos. Estos sistemas de microarrays se aplicaron a la discriminación de SNPs y a la detección de productos de PCR de bacterias.
En el cuarto capítulo, se realiza un diseño racional para la preparación de microarrays de anticuerpos. El enfoque de inmovilización muestra el anclaje orientado de los fragmentos de anticuerpos que contienen tiol sobre superficies de vidrio alqueniladas mediante reacción de foto anclaje del tiol-eno. De esta forma, se demuestra la detección multiplexada de biomarcadores cardíacos. El microarray diseñado muestra una mayor capacidad de reconocimiento en comparación con los microarrays de anticuerpos completos.
En el quinto capítulo, se ha desarrollado una nueva metodología para mejorar el anclaje de oligonucleótidos tiolados. Dado el interés en modificar superficies altamente hidrófobas, se establece una nueva reacción fotoinducida. Gracias a las características de la llamada "reacción de fotoacoplamiento de fluor-tiol", se logró la inmovilización de sondas tioladas a superficies que contienen enlaces C-F de una manera rápida, fácil y biocompatible con medios acuosos. La hidrofobicidad de las superficies se controló para obtener hibridaciones exitosas. Debido a la alta hidrofobicidad de las superficies, se logra un gran confinamiento de las sondas, lo que permite la aproximación de los analitos solo donde está unida la sonda, manteniendo una alta repulsión en la superficie restante. Las superficies de vidrio perfluoradas mejoraron las densidades de inmovilización y la capacidad de detección, con respecto a las superficies alqueniladas y alquiniladas, y también, permitieron la discriminación de SNPs y la detección de productos de PCR bacterianos.
En el sexto capítulo, se exploran otras superficies diferentes al vidrio. Por lo tanto, membranas de fluoruro de polivinilideno se emplearon como sustratos para el desarrollo de microarrays de oligonucleótidos. Para ello, se desarrolló un proceso de funcionalización rápido, fácil y suave, mediante el empleo de irradiación UV y la química de los organosilanos. / [CAT] La present tesi doctoral es centra en l'estudi de noves aproximacions capaces de millorar el rendiment dels microarrays. Aspectes com ara la naturalesa de les superfícies i les sondes, la funcionalització dels substrats, la impressió, la immobilització i la detecció de les sondes es van considerar en el procés de fabricació. Dins de totes aquestes característiques, la modulació de la superfície i l'ancoratge de la sonda van ser els aspectes més desafiadors, ja que la interfície és clau per a la immobilització dels receptors i la posterior detecció, la qual cosa determinarà el rendiment del dispositiu final.
En aquest treball, s'han desenvolupat dos tipus de microarrays, un per a oligonucleòtids i un altre per a anticossos. Després, s'ha realitzat una caracterització dels resultats aconseguits. Totes les rutes tenen en comú l'ús de la llum per a catalitzar la unió dels biorreceptores en els substrats de la superfície, emprant reaccions de la química clic.
En el primer capítol, es facilita una visió general de l'estat de l'art de la tecnologia de microarrays amb un enfocament especial en els aspectes principals del disseny de microarrays.
En el segon capítol, s'estableixen els objectius d'aquesta tesi doctoral. Aquests objectius generals s'aborden en els següents capítols experimentals.
En el tercer capítol, s'estudia l'efecte de la hidrofòbia i l'ús de sondes amb múltiples punts d'unió, en el rendiment del microarray. D'aquesta manera, es va dur a terme la modulació de superfícies de vidre amb grups alquenil i alquinil per a l'ancoratge de sondes de oligonucleòtids mono i multitiolades mitjançant les reaccions de foto ancoratge del tiol-doble enllaç i tiol-triple enllaç, respectivament. Les superfícies modificades amb el silà més hidrofòbic (alquinil) i les sondes politiolades ancorades, van revelar els millors rendiments. Aquests sistemes de microarrays es van aplicar a la discriminació de SNPs i a la detecció de productes de PCR de bacteris.
En el quart capítol, es realitza un disseny racional per a la preparació de microarrays d'anticossos. L'enfocament d'immobilització mostra l'ancoratge orientat dels fragments d'anticossos que contenen el grup tiol sobre superfícies de vidre alquenilades mitjançant reacció de foto ancoratge del tiol-doble enllaç. D'aquesta forma, es demostra la detecció multiplexada de biomarcadors cardíacs. El microarray dissenyat mostra una major capacitat de reconeixement en comparació amb els microarrays d'anticossos complets.
En el cinqué capítol, s'ha desenvolupat una nova metodologia per a millorar l'ancoratge de oligonucleòtids tiolats. Donat l'interés de modificar superfícies altament hidròfobes, s'estableix una nova reacció fotoinduïda. Gràcies a les característiques de l'anomenada "reacció de fotoacoplament de fluor-tiol", es va aconseguir la immobilització de sondes tioladas a superfícies que contenen enllaços C-F d'una manera ràpida, fàcil i biocompatible amb medis aquosos. La hidrofobicitat de les superfícies es va controlar per a obtindre bones hibridacions reeixides. A causa de l'alta hidrofobicidad de les superfícies, s'aconsegueix un gran confinament de les sondes, la qual cosa permet l'aproximació dels anàlits únicament on està unida la sonda i manté una alta repulsió en la superfície restant. Les superfícies de vidre perfluorades van millorar les densitats d'immobilització i la capacitat de detecció, respecte a les superfícies alquenilades i alquinilades, i també van permetre la discriminació de SNPs i la detecció de productes de PCR bacterians.
En el sisé capítol, s'exploren altres superfícies diferents al vidre. Per tant, membranes de fluorur de polivinilidé es van emprar com a substrats per al desenvolupament de microarrays d'oligonucleòtids. Per a això, es va desenvolupar un procés de funcionalització ràpid, fàcil i suau, mitjançant l'ús d'irradiació UV i la química dels organosilan / Agradecer al Ministerio de Economía y Competitividad de España, por su programa de
becas doctorales FPI / Jiménez Meneses, P. (2020). Study of substrate modulation and bioreceptor anchoring for the development of high performance microarrays [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137993 / TESIS
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Hipusinación del factor de traducción eIF5A dependiente de poliaminasBelda Palazón, Borja 30 March 2015 (has links)
RESUMEN
La hipusinación es una modificación post-traduccional dependiente de espermidina
que activa al factor de traducción eIF5A, y que es esencial en todos los eucariotas.
En los últimos años se ha sugerido un importante papel para eIF5A en los procesos
de senescencia y respuesta a estrés ambiental en plantas, en el establecimiento de la
polaridad celular en levadura y su implicación en enfermedades tales como
diabetes, VIH-1 o cáncer en humanos. Con el objetivo de caracterizar a nivel
molecular la actividad biológica de eIF5A en plantas, hemos establecido una
metodología basada en técnicas bioquímicas e inmunológicas para determinar el
patrón de hipusinación de eIF5A en A. thaliana. La puesta a punto de esta
metodología nos ha permitido demostrar que el tratamiento con ácido abscísico
inhibe la activación por hipusinación de la isoforma eIF5A1. Además, para tratar
de estudiar la función de eIF5A durante el desarrollo de A. thaliana, hemos
realizado estudios funcionales basados en la caracterización de plantas transgénicas
capaces de desactivar genéticamente la ruta dependiente de eIF5A mediante ARN
de interferencia, condicionado a la aplicación de dexametasona. La desactivación
condicional de la enzima de hipusinación desoxihipusina sintasa, produjo
alteraciones durante el desarrollo y en respuesta a condiciones adversas de
crecimiento, tales como floración temprana, inhibición del crecimiento de la raíz,
alteraciones en los pelos radiculares, ramificación exacerbada del tallo, presencia
de elementos traqueales completamente lignificados en hipocotilos, niveles
reducidos de óxido nítrico e hipersensibilidad al ácido abscísico, sal y glucosa.
Recientemente se ha demostrado que eIF5A es necesario para la traducción de
proteínas con más de 3 prolinas sucesivas en su secuencia. El análisis de ontología
realizado reveló un enriquecimiento de proteínas con poli-prolinas entre las
implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. La alteración de la
actividad de eIF5A provocó defectos en la estructuración de los filamentos de
actina en A. thaliana, S. cerevisiae y H. sapiens. El estudio de mutantes
termosensibles de levadura demostró el requerimiento de eIF5A durante el proceso
de reproducción sexual a través de la traducción de la formina Bni1. Los
experimentos de regulación traduccional en células HeLa demostraron que el
silenciamiento vía ARN de interferencia de eIF5A1 provocaba un defecto en la tasa
de traducción de la formina FMNL1 y la proteína ezrina. Estos resultados
confirman que la actividad esencial de eIF5A en el ribosoma parece conservada en
organismos eucariotas, y afecta fundamentalmente a proteínas con poli-prolinas
implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. / Belda Palazón, B. (2014). Hipusinación del factor de traducción eIF5A dependiente de poliaminas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48474 / TESIS
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