Lors de la fécondation, le sperme et l'ovule s'unissent pour former un zygote totipotent. Initialement, le zygote est transcriptionnellement inactif. Au cours des premiers clivages a lieu la mise en route du génome embryonnaire (EGA) et le développement passe alors sous le contrôle de l’information embryonnaire (au stade 8-16-cellules chez le bovin). Cette transition d’un contrôle maternel à un contrôle embryonnaire est appelée « maternal to embryonic transition (MET) ». De la même façon, lors du transfert nucléaire (clonage), un noyau de cellule somatique placé dans un ovocyte énucléé devient totipotent. Ce processus est appelé «reprogrammation nucléaire somatique?». En fait, la reprogrammation nucléaire lors du clonage est équivalente à la MET, toutefois, le clonage est très peu efficace. Les objectifs de cette étude chez les bovins sont a) d'explorer le processus de reprogrammation lors de la MET dans des embryons fécondés in vitro (FIV) et b) d’estimer l'efficacité de la reprogrammation génique après le transfert nucléaire lors du clonage. Nous émettons l'hypothèse que l'acquisition d'un profil d'expression génique correct pourrait être prédictif d’un potentiel de développement à terme de l'embryon, et pourrait être évalué dès juste après l'activation du génome embryonnaire (EGA) chez les bovins. Nous avons développé notre travail selon deux axes a) des analyses globales d'expression génique utilisant une puce dédiée à l’EGA et b) l’analyse du profil d'expression de gènes candidats par qRT-PCR dans les embryons fécondés et clonés. Dans un premier temps nous avons optimisé le protocole d'amplification d'ARNm pour l'analyse du transcriptome de matériels rares. Puis nous avons fait l'analyse du transcriptome avant et après EGA d’embryons issus d’ovocytes prélevés sur des vaches phénotypées comme « bonnes » ou « mauvaises » donneuses d’embryons. En outre, ces ovocytes ont été maturés soit in vivo soit in vitro. Nos analyses montrent que l'effet individuel est plus important que l'effet « bonne ou mauvaise donneuse » ou même que l’effet « conditions de maturation ». Nous avons ensuite analysé les expressions géniques de 5 types d'embryons clonés ayant différents potentiels de développement à terme en fonction de la lignée cellulaire utilisée comme source de cellules donneuses. Globalement, leur expression génique est proche de celle de morulae FIV, mais quelques gènes présentent une expression différente. Ces gènes varient avec la lignée de cellules donneuses et leur nombre n’est pas lié à l’aptitude au développement à terme. L’analyse d’un lien éventuel entre leur nature et cette aptitude devra être poursuivie. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les profils d'expression spatio-temporelle des transcrits et des protéines des gènes de pluripotence (OCT4, SOX2 et NANOG) et les niveaux d'ARNm de certains de leurs cibles dans les ovocytes et les embryons précoces chez le bovin. Les profils d'expression de ces gènes ont aussi été analysés dans des embryons clonés présentant différents potentiels de développement à terme. Nos résultats montrent que (1) la triade de gènes de pluripotence n'est probablement pas impliquée dans l’EGA bovine. (2) les transcrits et protéines de SOX2 et de NANOG sont restreints au lignage pluripotent plus tôt que ceux de OCT4, (3) les embryons à faible taux de développement à terme ont un taux de transcription plus élevé, néanmoins, l’équilibre précaire entre les gènes de pluripotence est maintenue. Cet équilibre pourrait permettre un développement normal in vitro, mais le taux de transcription plus élevé pourrait avoir des conséquences délétères sur le développement ultérieur. / In natural fertilization, sperm and ovum unite to form a totipotent zygote. Initially, the zygote is transcriptionally inactive and after few cleavages (8-16-cell stage in bovine) embryonic genome activation (EGA) takes place and embryo shifts from maternal to embryonic control, the process called maternal to embryonic transition (MET). Likewise, in nuclear transplantation (cloning) a somatic cell nucleus achieves totipotency when placed in an enucleated oocyte, the process called “nuclear reprogramming”. In fact, nuclear reprogramming in cloning experiments is equivalent to MET; however, this process is afflicted with low efficiency. The objectives of this study in bovine were a) to explore the process of MET reprogramming of in vitro fertilized (IVF) embryos and b) to estimate the efficiency of gene reprogramming after nuclear transfer in animal cloning. We hypothesized that the acquisition of a proper gene expression pattern could herald development potential of the embryos, which could be assessed as early as morula stage or after embryonic genome activation (EGA) in bovine. Here, we opted for a study plan consisting of two axes a) global gene expression analysis using an EGA-dedicated microarray and b) candidate gene expression profiling through qRT-PCR in the fertilized and cloned bovine embryos. Firstly, we optimized the protocol of mRNA amplification for transcriptome analysis which generates antisens-RNA (aRNA). Then we did transcriptomic analysis of the 4-cell and morulae derived from two genotypes having better and two genotypes having poorer in vitro embryonic development potentials. In addition, these oocytes were either matured in vivo or in vitro. We observed that the effect of individual genotype was more important than the effect of the phenotypic category (poorer or better) or conditions of oocyte maturation. Furthermore, we explored the expression patterns of 5 types of cloned embryos having different full term developmental potentials depending upon the donor cell line used. Their genes expression patterns closely resembled to the IVF morulae, except for few genes which present differences. These genes vary with the cell line used as somatic cell donor for SCNT and the number of these deregulated genes did not increase with the poorer developmental potential of the cloned embryos. The analysis of an eventual correlation between the potential for embryonic development to term and nature of the deregulated genes should be addressed. Secondly, we charted quantitative and/or qualitative spatio-temporal expression patterns of transcripts and proteins of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and mRNA levels of some of their downstream targets in bovine oocytes and early embryos. Furthermore, to correlate expression patterns of these genes with term developmental potential, we used cloned embryos, instead of gene ablation, having similar in vitro but different full term development rates. We chose these genes to be analysed since pluripotency genes are implicated in mouse embryonic genome activation (EGA) and pluripotent lineage specification. Moreover, their expression levels have been correlated with embryonic term development. Our findings affirm: first, the core triad of pluripotency genes probably is not implicated in bovine EGA since their proteins were not detected during pre-EGA phase, despite the transcripts for OCT4 and SOX2 were present. Second, an earlier ICM specification of SOX2 and NANOG makes them better candidates of bovine pluripotent lineage specification than OCT4. Third, embryos with low term development potential have higher transcription rates; nevertheless, precarious balance between pluripotency genes is maintained. This balance presages normal in vitro development but, probably higher transcription rate disturbs it at later stage that abrogates term development.

Dans l'embryon de vertébrés l'hématopoïèse se met en place à partir de deux vagues successives de précurseurs hématopoïétiques (PH). Alors que les précurseurs de la première vague, générée dans le Sac Vitellin (SV), présentent des capacités de maintenance et de différenciation réduites, ceux qui sont issus de la seconde présentent toutes les caractéristiques des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Elles sont en effet capables de se différencier dans tous les lignages sanguins et permettent d'assurer, à long terme, la reconstitution hématopoïétique de souris létalement irradiées.<br />Le facteur de transcription GATA-3 est exprimé dans l'embryon au cours des phases de détermination et de génération des CSH. Il n'est jamais exprimé aux stades équivalents dans le SV. GATA-3 pourrait jouer un rôle important dans la génération des CSH et dans l'acquisition des propriétés différentes des précurseurs hématopoïétiques des deux sites.<br />Nous avons développé une démarche expérimentale permettant d'effectuer l'analyse fonctionnelle de gènes présentant une expression différente entre les deux sites de génération des précurseurs hématopoïétiques de l'embryon. Nous avons sélectionné l'électroporation in situ pour perturber l'expression génique au moment de la détermination de ces précurseurs, et la transduction rétrovirale pour cibler les PH au moment de leur génération.<br />Nous avons réalisé l'expression ectopique de GATA-3 dans les PH du SV en utilisant l'infection rétrovirale. Nos résultats montrent que GATA-3 est capable d'amplifier et de maintenir des PH immatures. Des tests effectués en parallèle en effectuant l'expression forcée de GATA-5 (naturellement absent du SV), ou la surexpression GATA-1, nous ont permis de conclure à la spécificité de ces effets. De façon remarquable, GATA-3 est également capable d'amplifier une population répondant à un phénotype de type mésodermique/pré-hématopoïétique.<br />En conclusion, nos résultats montrent que GATA-3 pourrait être impliqué dans les phénomènes liés au maintien du contingent de CSH.

Au printemps, la seiche commune Sepia officinalis effectue des migrations du large vers la côte pour se reproduire et mourir. La ponte a lieu en zone côtière, sujette à la contamination métallique d'origine anthropique, ce qui pose la question de la toxicité des éléments traces sur le développement embryonnaire. Dans ce travail, l'exposition à neuf radiotraceurs (110mAg, 241Am, 109Cd, 57Co, 134Cs, 203Hg, 54Mn, 210Pb et 65Zn) durant toute la durée du développement révèle que l'œuf de seiche possède de grandes capacités de bioaccumulation des éléments traces. Dans ce contexte, la capsule glycoprotéique de l'œuf joue un rôle majeur en fixant la plus grande proportion de ces éléments. La distribution des radiotraceurs dans l'œuf montre que cette capsule constitue une barrière protectrice contre la pénétration des métaux depuis la ponte jusqu'à la fin de l'organogenèse. Cependant, lorsque la phase de croissance de l'embryon et de l'œuf commence, la capsule montre progressivement une perméabilité sélective aux éléments traces jusqu'à l'éclosion. La disposition des composants de la capsule à les laisser diffuser à travers les différentes enveloppes qui la composent semble dépendante des propriétés chimiques des éléments traces mais aussi des processus biologiques liés à l'embryogenèse. Ainsi, certains éléments pénètrent dans l'œuf et s'accumulent dans l'embryon avec une affinité variable (i.e. Ag >> Zn > Hg > Mn > Co ≈ Cd > 134Cs ≠ 241Am, Pb).<br />Des expositions sur le long terme à l'Ag, au Cd et au Cu dissous (1, 0,5 et 250 µg.l-1, respectivement) en condition expérimentale, n'ont aucun effet sur la croissance de l'œuf et n'induisent ni malformation, ni mortalité des embryons, confirmant l'effet protecteur de la capsule pendant les stades sensibles de l'embryogenèse. Néanmoins, pendant la période de croissance de l'embryon, l'Ag et le Cd semblent ralentir l'augmentation de l'activité des phosphatases acides, impliquée dans les processus digestifs alors que le Cu révèle un effet stimulateur. De même, l'activité de type phénoloxydase, impliquée dans les fonctions immunitaires des Invertébrés, décrite pour la première fois dans l'embryon de seiche, est modulée par l'Ag et le Cu, lors de la phase post-organogenèse. <br />Malgré le rôle protecteur de la capsule durant l'organogenèse, les éléments traces peuvent s'accumuler dans les embryons dès les premiers stades de développement du fait de leur apport par transfert maternel. Dans ce contexte, l'utilisation des radiotraceurs montre que le transfert de la mère à l'œuf est sélectif, 1) seuls l'Ag, le Se et le Zn étant transférés suite à une exposition de la mère par de la nourriture marquée au 110mAg, à l'241Am, au 109Cd, au 60Co, au 134Cs, au 54Mn, au 75Se et au 65Zn et 2) le Se et du Zn étant stockés dans le vitellus de l'œuf alors que l'Ag se retrouve à la fois dans le vitellus et la capsule.

Les techniques d'assistance médicale à la procréation particulièrement l'induction de l'ovulation, la maturation in vitro des ovocytes et la culture embryonnaire prolongée impliquent la manipulation des gamètes ainsi que les embryons à des moments critiques de leur maturation et développement qui sont également des étapes clé du remodelage épigénétique. Par conséquent, elles pourraient interférer avec la reprogrammation épigénétique, en particulier la mise en place de la méthylation des gènes soumis a empreinte au cours de l'ovogenèse, ou son maintien au cours du développement préimplantatoire. Afin d'évaluer ce risque nous avons analysé le profil de méthylation de KvDMR1, qui régule l'expression de KCNQ1OT1, dans des ovocytes humains mûris in vivo ou in vitro, provenant de patientes stimulées ou non. Nos résultats montrent que la mise en place de la méthylation au niveau de KvDMR1 se poursuit au cours de la maturation de l'ovocyte du stade VG au stade MII, in vivo et in vitro et que l'induction ovarienne des patientes génère des ovocytes épigénétiquement immatures. Par ailleurs, l'étude de la méthylation de H19 DMR qui régule l'expression d'Igf2 et H19 dans des embryons d'ICSI, atypiques bloqués en culture prolongée et dans les spermes correspondants met en évidence une hypométhylation de l'allèle paternel et une méthylation de l'allèle maternel dans certains embryons, sans que l'on puisse établir de lien entre les dérégulations de l'empreinte et l'arrêt du développement au stade blastocyste.

Entre les personnes et les choses, les embryons et les cadavres sont souvent représentés comme des objets juridiques non-identifiés. Cependant, une analyse détaillée du travail de la jurisprudence et du législateur dans l’élaboration de leur de leur régime montre que la qualification des corps n’est pas tant imprécise qu’éludée. L’extrême sensibilité politique de la question conduit à la construction d’un droit fractionné, proposant des solutions ponctuelles à des questions précises, sans véritable souci de cohérence catégorielle.Pourtant, présentant la qualification comme une véritable question de connaissance du droit, une partie de la doctrine semble parfois éluder la dimension politique de cette construction. Recourant , pour identifier la nature des corps, à des disciplines extérieures au droit (biologie, psychanalyse, philosophie…) sans toujours mettre en lumière les difficultés épistémologiques liées à cette démarche, les auteurs renouvellent en la matière une approche jusnaturaliste prescriptive qui ne dit pas toujours son nom.Or, l’étude de l’évolution des qualifications et des régimes appliqués aux embryons et aux cadavres montre que le véritable problème est surtout que les catégories établies entre les corps par le droit sont avant tout des classements. Tous les corps ne bénéficient pas de la même protection du droit et le statut des embryons et des cadavres reflète bien souvent les hiérarchies existant entre les personnes : distinctions sociales, religieuses, genrées, racialisées etc.. Se pose alors la question des remèdes possibles à ces multiples catégorisations des corps : assouplissements ponctuels ou transformation radicale du droit ? / Embryos and corpses are often presented as unidentified legal objects, in between people and things. However, a detailed analysis of French case law and statute law shows that the classification of bodies is not unclear, but eluded. The extreme political sensitivity of the matter leads to the construction of a subdivided law, offering one-time solutions to specific questions, without due regard to categorical coherence. Most of the doctrine seems to elude the political dimension of this construction and presents classification as an actual question of legal knowledge. Resorting to extraneous disciplines (biology, psychoanalysis, philosophy…) in order to identify the nature of the bodies, authors seem to repeat a prescriptive approach based on natural law theory even if they often deny it.In contrast, a historical approach of classification and legal systems applied to embryos and corpses reveals that the main issue is that the bodies’ categories induced by law are above all hierarchization. All bodies do not benefit from the same legal protection and the status of embryos and corpses very often reflects existing hierarchies between individuals – distinctions based on social level, religion, gender, ethnicity… Hence a question arises as to possible solutions to this manifold categorization of bodies : should the law be relaxed in isolated cases or should a more radical transformation of the law be considered ?

L'embryon humain est aujourd'hui au centre d'une multitude de préoccupations : personnelles, familiales, scientifiques, sociales, politiques et éthiques. Sa manipulation dans le cadre de la recherche scientifique constitue aujourd'hui une question controversée et polémique au Brésil et en France. En s'appuyant sur la théorie des représentations sociales, nous nous intéressons à comprendre comment des éléments contextuels façonnent la construction de l'embryon humain en tant qu'objet social. Nous avons entrepris un programme de recherche pluri-méthodologique afin d'étudier la production et l'actualisation des représentations concernant l'embryon humain et la recherche sur l'embryon humain en fonction des différentes dimensions contextuelles d'ordre cognitif et social au Brésil et en France. Ce programme s'inscrit dans une approche multi-niveaux des représentations sociales dont l'enjeu théorico-méthodologique est l'étude des phénomènes représentationnels dans différents lieux de production et d'actualisation (formation des savoirs et des attitudes, communications sociales, pratiques institutionnelles ; situations de naturalité et situations provoquées d'expression des représentations). Le croisement des différentes techniques nous permet d'accéder à des observations qui corroborent pour montrer l'incidence du social dans la construction de l'embryon humain en tant qu'objet de représentation et de statuer sur le caractère local/global de cette incidence. Nous discutons l'ensemble de ces résultats afin de montrer l'intérêt heuristique des représentations sociales dans les approches comparatives contextuelles en psychologie sociale et notamment dans le champ de la bioéthique. / The human embryo is at the center of a wide range of personal, familial, scientific, social, political and ethical concerns. Scientific use of the human embryo represents today a controversial issue in Brazil and France. Using the theory of social representations, we investigate how contextual elements shape the construction of the human embryo qua social object. We have undertaken a multi-methodological study to determine the production and realization of the representations regarding the human embryo and the scientific research on human embryos according to the different contextual dimensions of cognitive and social development in Brazil and in France. This program is a multi-level approach using social representations for which the theoretical and methodological challenge is the study of representational phenomena in different places of production and realization (construction of knowledge and attitudes, social communication, institutional practices; situations of naturalness and situations induced by the expression of the representations). The unification of different techniques has allowed us access to convergent observations that show the impact of the social construction of the human embryo qua represented object and to arbitrate the local / global character of that impact. In the discussion of the results we demonstrate the heuristic interest of the approach of social representations in the context of comparative approaches in social psychology, particularly in the field of bioethics.

L’hématopoïèse est assurée par une population de cellules souches hématopoïétiques (CSH) générées au cours du développement embryonnaire. L’objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes qui régulent l’émergence des CSH dans la niche hématopoïétique intra-embryonnaire. Nous avons démontré la présence dans cette région d’un Système Rénine- Angiotensine local et fonctionnel qui agit via la production de l’Angiotensine II sur les précurseurs pré-hématopoïétiques et les CSH émergentes. Egalement, nous avons mis en évidence la présence d’une accumulation de macrophages d’origine vitelline et démontré que ces cellules ont un rôle crucial dans l’émergence de l’hématopoïèse définitive en permettant la migration des précurseurs pré-hématopoïétiques. Une étude moléculaire nous a permis de démontrer que l’ACE - un marqueur des précurseurs pré-hématopoïétiques et CSH humaines - est une cible du facteur de transcription CDX2 qui en régule l’expression. Ces travaux contribuent à une meilleure compréhension de la mise en place du système hématopoïétique au cours du développement et sont prometteurs pour des fins thérapeutiques. / The continuous generation of blood cells throughout life relies on the existence of hematopoietic stem cells (HSC) generated during embryogenesis. The aim of my thesis was to understand the mechanisms underlying HSC emergence in the intra-embryonic hematopoietic niche. Many effectors have been detected in this region, including a functional and local Renin- Angiotensin System which acts directly on pre-HSC precursors and HSC emergence through the production of Angiotensin II . We have also observed an accumulation of yolk sac-derived macrophages in the same region and demonstrated that these cells have a crucial role in the establishment of definitive hematopoiesis, allowing the migration of the pre-HSC precursors in the mesenchyme. In addition, by a molecular study, we have demonstrated that ACE - a cell surface marker of human HSC also expressed on pre-hematopoietic cells - is a transcriptional target of the CDX2 homeoprotein. All these results contribute to a better understanding of the hematopoietic system during development and are promising for therapeutic purposes.

Les macrophages (MΦ) du système nerveux central forment la microglie, qui contrôle son homéostasie. Plusieurs modèles de "fate mapping" ont montré que la microglie provenait du Sac vitellin (SV). Celui-ci produit les MΦ en deux vagues indépendantes. Dans la première, des progéniteurs restreints génèrent des MΦ primitifs, alors que dans la seconde, des progéniteurs érythro-myéloïdes produisent des MΦ définitifs. Les progéniteures primitifs et définitifs ont les mêmes phenotype et voie de différenciation. Leurs spécificités et leurs contributions aux étapes ultérieures du développement sont donc encore incomprises. Nous montrons que l'expression du facteur de transcription Lyl-1 discrimine les populations de MΦ primitifs et définitifs. Les MΦ primitifs Lyl-1+ fournissent la microglie de l'embryon. De plus, l'invalidation de Lyl-1 disruption conduit à une production accrue de MΦ primitive dans le SV précoce, puis à une réduction du contingent microglial à deux stades spécifiques du développement. Lyl-1 est spécifiquement exprimé par la microglie et aucun autre type cellulaire nerveux. Son inactivation conduit à des modifications comportementales typiques de l'anxiété sociale. Nous identifions donc Lyl-1 comme un marqueur des MΦ primitifs du SV qui donnent naissance à la microglie de l'embryon. Nous montrons également que Lyl-1 contrôle l'expansion et la différenciation de la microglie, et est ainsi impliqué dans la régulation des processus du neuro-développement. / Microglia are tissue macrophages (MΦ) of the central nervous system that control tissue homeostasis. Different fate mapping models have shown that microglia originates from the yolk sac (YS). Macrophages production in the YS occurs in two independent waves. In the first, primitive MΦ originate from restricted progenitors, while in the second, definitive MΦ are produced by erythro-myeloid progenitors. Because primitive and definitive MΦ progenitors share the same phenotype and differentiation pathway, their specific features and contribution to further developmental steps are still poorly understood. We here show that the expression of thee transcription factor Lyl-1 discriminates primitive and definitive MΦ populations. YS-derived Lyl-1+ primitive MΦ contribute to embryonic microglia. Moreover, Lyl-1 disruption results in an increased production of primitive MΦ progenitors in the early YS. It also leads to the reduction of the microglia pool at two specific development stages. Lyl-1 is specifically expressed in microglia, but not other brain cells and its inactivation leads to behavioral changes typical for social anxiety disorders. Thus, we identify Lyl-1 as a marker for YS primitive MΦ that will give rise to the entire microglia. We show that Lyl-1 controls microglia expansion and differentiation and is involved in the regulation of neurodevelopmental processes.

Depuis quelques années, une biopsie testiculaire suivie d’une congélation du tissu testiculaire est proposée aux enfants atteints de cancer avant introduction d’un traitement gonadotoxique. Cette procédure de préservation de la fertilité est proposée avec l’espoir qu’une méthode de restauration de la fertilité soit développée. Le tissu testiculaire décongelé pourrait ainsi être utilisé afin d’effectuer une maturation in vitro, évitant la réintroduction de cellules tumorales, pour produire des spermatozoïdes. Ce travail de thèse a consisté, dans un premier temps, à évaluer la mise en place de la méthylation de l’ADN au sein du tissu testiculaire prépubère de souris au cours de la spermatogenèse in vitro. La culture de tissu testiculaire frais ou décongelé de souris prépubère permet le maintien des niveaux d’expression des ADN méthyltransférases 1 et 3a dans les spermatogonies et les spermatocytes. De plus, la méthylation de l’ADN est retrouvée jusque dans les spermatozoïdes produits in vitro. Par la suite, la qualité nucléaire des spermatozoïdes ainsi obtenus a été analysée. La culture de tissu testiculaire n’a pas d’impact sur le taux d’aneuploïdie, la condensation de la chromatine et la fragmentation de l’ADN spermatique. Cependant, la congélation suivie par la culture organotypique augmente la proportion de spermatozoïdes avec un ADN oxydé. Enfin, la fonctionnalité des spermatozoïdes produits in vitro a été analysée par micro-injection ovocytaire et la dynamique de différentes marques épigénétiques a été étudiée au cours du développement préimplantatoire. Les taux de développement embryonnaire sont diminués par l’utilisation de spermatozoïdes produits in vitro. Les niveaux des histones H3K4me3, H3K27me3 et H3K9ac sont peu modifiés dans les embryons issus de spermatozoïdes générés in vitro alors que la méthylation et déméthylation de l’ADN sont plus impactées. La production de spermatozoïdes après culture de tissu prépubère frais ou décongelé dans le modèle murin a permis de mettre en évidence que cette procédure n’est pas sans impact sur l’embryon précoce bien que la qualité des spermatozoïdes produits soit peu altérée. / In recent years, testicular biopsy followed by the freezing of testicular tissue has been proposed to children with cancer before the introduction of a gonadotoxic treatment. This fertility preservation procedure is offered with the hope that a fertility restoration method will be developed. The thawed testicular tissue could thus be used to perform in vitro maturation, avoiding the reintroduction of tumor cells, to produce spermatozoa. This thesis work first consisted in assessing the establishment of DNA methylation in mouse prepubertal testicular tissue during in vitro spermatogenesis. The culture of fresh or thawed mouse testicular testicular tissue allows the expression levels of DNA methyltransferases 1 and 3a to be maintained in spermatogonia and spermatocytes. In addition, DNA methylation is found even in in vitro produced spermatozoa. The nuclear quality of these spermatozoa was then analyzed. The culture of testicular tissue has no impact on sperm aneuploidy rate, chromatin condensation and DNA fragmentation. However, freezing followed by organotypic culture increases the proportion of spermatozoa with oxidized DNA. Finally, the functionality of in vitro produced spermatozoa was analyzed by oocyte microinjection and the dynamics of different epigenetic marks was studied during preimplantation development. Embryo developmental rates are decreased when using in vitro produced spermatozoa. The levels of H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac are slightly modified in embryos derived from spermatozoa generated in vitro whereas DNA methylation and demethylation are more affected. The production of spermatozoa after culture of fresh or thawed prepubertal tissue in the mouse model has shown that this procedure is not without impact on the early embryo, although the quality of the spermatozoa produced is relatively unaltered.

Les marqueurs épigénétiques, en particulier la méthylation de l’ADN des gènes soumis à empreinte parentale, sont sensibles aux changements environnementaux. Les techniques de l’aide médicalisée à la procréation (AMP) nécessitant la manipulation des gamètes et des embryons in vitro et dans la plupart des cas la stimulation hormonale de l’ovulation des patientes, peuvent interférer avec la reprogrammation et/ou le maintien de la méthylation des gènes soumis à empreinte. Afin d’évaluer ce risque nous avons analysé le profil de méthylation de KvDMR1, qui régule l’expression de KCNQ1OT1, dans des ovocytes humains mûris in vivo ou in vitro, provenant de patientes stimulées ou non. Nos résultats montrent que la mise en place de la méthylation au niveau de KvDMR1 se poursuit au cours de la maturation de l’ovocyte après reprise de la méiose, in vivo et in vitro et que la superovulation des patientes en AMP génère des ovocytes épigénétiquement immatures. Par ailleurs, l’étude de la méthylation de KvDMR1 et de H19 DMR (qui régule l’expression d’Igf2 et H19) dans des embryons issus d’ICSI, évolutifs ou présentant un défaut de développement, n’établit pas de lien entre les dérégulations de l’empreinte et l’arrêt du développement embryonnaire au stade blastocyste. / Epigenetic modifications, particularly DNA methylation of imprinted genes are sensible to environment. Techniques of assisted reproduction require in vitro manipulation of gamete and embryos and currently superovulation of patients. These technologies may interfere with eprogramming and maintenance of methylation at imprinted genes. To evaluate such a risk, we have determined the methylation profile of KvDMR1, the region that regulates KCNQ1OT1 imprinted gene, in human oocytes retrieved from stimulated or unstimulated cycles, at different phases of their maturation in vivo or in vitro. Our results show that the timing of establishment of the methylation profile of KvDMR1 covers the maturation phase of 199 oocyte growth, in vivo and in vitro, and that hyperstimulation likely recruits young follicles epigenetically immature. Analysis of the methylation profile of KvDMR1 and H19DMR (DMR of IGF2/H19) in ICSI embryos suggests that imprinting disorders are not responsible of embryo developmental failure prior the blastocyst stage