Made available in DSpace on 2015-11-11T12:04:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 154.pdf: 1288159 bytes, checksum: 2cc2211b7c112d6211913cb143210291 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Em Cabo Verde, arquipélago situado na Costa Ocidental Africana, os primeiros casos de dengue ocorreram em 2009, com a notificação de mais de 21.000 casos, a maioria desses registrados na Ilha de Santiago. O mosquito Aedes aegypti foi identificado como vetor, e ações para seu controle, usando os inseticidas temephos (larvicida) e a deltametrina (adulticida), têm sido implementadas. Objetiva-se com esse trabalho avaliar o atual status de suscetibilidade a inseticidas e caracterizar os mecanismos de resistência nessa população. Amostras de A. aegypti da ilha de Santiago foram coletadas através de armadilhas de oviposição, para o estabelecimento de uma população a ser analisada. Foram realizados bioensaios do tipo dose diagnóstica, usando garrafas impregnadas com doses únicas dos adulticidas malathion (organofosforado), deltametrina (piretróide) e cipermetrina (piretróide), e bioensaios do tipo dose resposta, usando múltiplas concentrações dos inseticidas temephos (organofosforado), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (bactéria entomopatogênica) e diflubenzuron (inibidor de síntese de quitina). Para a investigação dos mecanismos de resistências, foram realizados testes bioquímicos com substratos específicos para quantificar a atividade das enzimas glutationa S-transferases, esterases (alfa, beta e PNPA) e oxidases de função mista, ligadas a detoxificação de xenobióticos, e a taxa de inibição da acetilcolinesterase ligada a insensibilidade do sítio alvo. / Pesquisou-se também a presença de mutaçõeso do tipo kdr (knock-down resistance) associadas à resistência a piretróides, pela análise da sequência dos exons 20 e 21 no gene do canal de sódio. Nos resultados dos bioensaios constatou-se que a população de A. aegypti investigada apresenta resistência aos piretróides deltametrina e cipermetrina (mortalidade 80 por cento) e ao organofosforado temephos (RR90=4), mas é suscetível ao malathion (mortalidade maior ou igual a 98 por cento), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (RR90=0.8) e ao diflubenzuron (RR90=2,2). Em relação a atividade das enzimas ligadas ao processo de detoxificação, foram detectadas alterações nas glutationa S-transferases (25 por cento), oxidases de função mista (18 por cento), esterase-alfa (19 por cento) e esterase-beta (17 por cento). A taxa de inibição da acetilcolinesterase (6 por cento) e a atividade da esterase-PNPA (7 por cento) mostraram que estas estão inalteradas. Nenhuma das mutações do tipo kdr pesquisadas foi detectada. Estes resultados permitem concluir que a população de A. aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, é suscetível aos inseticidas, excetuando os piretróides testados e o temephos, usados no seu controle; e que ela apresenta alterações em enzimas detoxificadoras que poderão estar implicadas na resistência a esses compostos

ALVES, Calebe de Andrade. Dinâmica de degradação e reparação de fibras elásticas sob tensão. 2013. 71 f. Dissertação (Mestrado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2015-10-23T18:48:28Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_caalves.pdf: 1922274 bytes, checksum: beae2409f015f4b21f8f423815937fa0 (MD5) / Approved for entry into archive by Edvander Pires(edvanderpires@gmail.com) on 2015-10-23T19:38:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_caalves.pdf: 1922274 bytes, checksum: beae2409f015f4b21f8f423815937fa0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-23T19:38:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_caalves.pdf: 1922274 bytes, checksum: beae2409f015f4b21f8f423815937fa0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Extracelular matrix, the biological structure that supports cells in animal tissue, is composed of elastic fibers such as collagen and elastin. It is known that enzymes activity plays an important role in maintenance of these elastic fibers. The imbalance between destruction and repair of the elastic fibers can lead to diseases such as fibrosis and emphysema. In this study, we present a simple model to simulate enzymatic digestion and repair of elastic fibers under tension. The fiber is represented by a chain of linearly elastic springs in series surrounded by two layers of sites along which particles representing enzymes and fragments can diffuse. These particles can biding-unbinding in the fiber simulating the reaction process by changing the local stiffness by a multiplicative factor. We study the distribution of the number of visits of particles to the springs as function of time and the consequent change of the fiber stiffness, under different initial conditions (model parameters). We show that, due to no linearity of the model, the degradation effect prevails even when the concentrations of the two type of agents are the same. There is no relation between the number of degradative and rigidifying particles that garantee that the fiber stiffness remains constant. When an anisotropy factor is included on the model and the system behaviour becomes dependent on the tension applied to the fiber, we show that the increase of tension in general contributes to the increase on enzymatic activity. We believe this study can help better understand progression of diseases such as emphysema and fibrosis. / A Matriz Extracelular, a estrutura biológica que sustenta as células em tecidos animais, é composta de fibras elásticas como colágeno e elastina. Sabe-se que a atividade enzimática desempenha papel fundamental na manutenção dessas fibras elásticas. O desequilíbrio entre destruição e reparo das fibras elásticas pode levar a doenças como fibrose e enfizema. Neste estudo, nós apresentamos um modelo simples para simular digestão enzimática e reparo de fibras sob tensão. A fibra é representada por uma cadeia de molas linearmente elásticas em série. A fibra é cercada por duas camadas de sítios ao longo dos quais partículas representantes de enzimas e fragmentos podem se difundir. Estas partículas podem se ligar e se desligar da fibra, simulando o processo de reação ao alterar a constante elástica local por um fator multiplicativo. Estuda-se a distribuição do número de visitas de partículas degradadoras e enrijecedoras às molas em função do tempo de difusão e a consequente variação da rigidez da fibra, sob diversas condições iniciais (parâmetros do modelo). Mostra-se que, devido a características matemáticas intrínsecas ao modelo, o efeito de degradação prevalece sobre o de enrijecimento ainda quando a concentração de agentes de ambos os tipos é a mesma. Não há relação entre o número de partículas degradadoras e enrijecedoras que garanta a estabilidade da constante elástica da fibra. Quanto um fator de anisotropia é incluído no modelo e o comportamento do sistema passa a depender da tensão aplicada à fibra, mostra-se que o aumento da tensão em geral contribui para o aumento da atividade enzimática. Este estudo poderá ajudar a entender a progressão da degradação de tecidos em doenças como enfisema e fibrose.

PASCOAL, N. L. O. Aplicação de proteases fúngicas na obtenção de hidrolisado de soro de queijo coalho atomizado. 61 f. 2012. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2016-03-30T12:36:07Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_nlopascoal.pdf: 2422158 bytes, checksum: 92f56e58856c6d69e97497389bc14d0c (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2016-03-31T13:41:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_nlopascoal.pdf: 2422158 bytes, checksum: 92f56e58856c6d69e97497389bc14d0c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-31T13:41:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_nlopascoal.pdf: 2422158 bytes, checksum: 92f56e58856c6d69e97497389bc14d0c (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Worldwide milk production is growing at a average rate of 2% per year. This increased amount of milk has been related to the production of larger volumes of cheese, casein, caseinate and other milk products, resulting in increased volume of whey. It represents about 85-95% of milk volume and retains about 55% of its nutrients, however, its high power pollutant led environmental bodies and other regulatory authorities to prohibit the discharge of whey into the environment untreated. From studies about whey components and with the discovery of technological and nutritional properties the status of polluter waste changed, then, nowadays, whey is considered a co-product of cheese production. One processes that promote improvement of whey properties is protein hydrolysis, characterized by the disruption of bonds of molecules protein chains releasing different sizes peptides and free amino acids. The hydrolytic treatment can be done by acids, bases or enzymes, however, enzymatic hydrolysis show many advantages in relation to chemical processes, as specificity, control of hydrolysis degree, the moderated conditions of the process and minimal formation of residual products. The objective of this study was to promote whey protein hydrolysis through the action of proteases synthesized by Aspergillus oryzae IV and spray drying this product. We evaluated the effect of temperature and time of incubation, enzyme: substrate ratio (E: S), and subsequently the pH. The parameters which have enabled higher degree of hydrolysis were determined. The temperature range studied was incubated between 30 and 50 ° C, the ratio E: S ranged in the proportions of 0,5:100 3,0:100. The best condition of hydrolysis (DH = 70%) was obtained at 50 ° C for 12 hours, employing the ratio E: S 2,0:100. An electrophoretic analysis was performed to obtain the hydrolysis influence on the peptide profile, in which confirmed the need to study the hydrolysis at different pH values. Thus, the whey pH was adjusted between 4.0 and 8.0. The hydrolyzed sample was concentrated to a solids content between 14 and 28 Brix before the atomization process. There was no significant difference regarding yield, moisture and water activity between the spray dried samples. Through the eletrophoretic analysis, from gels stained with silver solution, was possible to verify the action of proteases on proteins of different molecular weights with exception β-lactoglobulin. / Os volumes da produção de leite estão crescendo a uma taxa média de 2% ao ano em todo o mundo. Este aumento da quantidade de leite está sendo canalizado para a produção de queijo, caseína, caseinato e outros produtos lácteos, resultando no aumento do volume de soro de leite. Ele representa cerca de 85-95% do volume do leite e retém cerca de 55% de seus nutrientes, no entanto, seu alto poder poluente levou órgãos ambientais e outras autoridades reguladoras a proibir o descarte do soro de leite não tratado no ambiente. A partir de estudos sobre os componentes do soro de leite e a descoberta das propriedades tecnológicas e funcionais de suas proteínas, a visão de resíduo poluidor mudou, sendo hoje, considerado um co-produto da produção de queijo. Um dos processos que promove a melhoria de suas propriedades consiste na hidrólise protéica. Este tratamento pode ser realizado pelo emprego de ácidos, bases ou enzimas, contudo, a hidrólise enzimática apresenta diversas vantagens sobre a química, como a especificidade, o controle do grau de hidrólise (GH), as condições moderadas do processo e a formação mínima de subprodutos. O objetivo deste trabalho foi promover a hidrólise das proteínas do soro de leite, através da ação de proteases sintetizadas pelo Aspergillus oryzae IV e a secagem deste por atomização. Avaliou-se o efeito da temperatura e tempo de incubação, relação enzima:substrato (E:S), e posteriormente do pH. Determinou-se os parâmetros que permitiram maior grau de hidrólise. A faixa de temperatura de incubação estudada foi entre 30 e 50 °C, a relação E:S variou nas proporções de 0,5:100 a 3,0:100. A melhor condição de hidrólise (GH = 70%) obtida à 50 °C por 12 horas, empregando a relação E:S de 2,0:100. Avaliou-se a influência da hidrólise no perfil peptídico realizando uma análise eletroforética, em que confirmou-se a necessidade de estudar a hidrólise em diferentes valores de pH. Desta forma o pH do soro de leite foi ajustado entre 4,0 e 8,0 antes da reação para avaliar a influência deste parâmetro sobre o grau de hidrólise. A amostra hidrolisada foi concentrada até um teor de sólidos entre 14 e 28 °BRIX antes do processo de atomização. Não houve diferença significativa entre as amostras atomizados avaliados quanto ao rendimento, umidade e atividade de água. Através da análise eletroforética, a partir dos géis corados em solução de prata, foi possível confirmar a ação das proteases sobre proteínas de diversos pesos moleculares com exceção a β-lactoglobulina.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:18:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346600.pdf: 3735830 bytes, checksum: c6b2f8a55fd26d253762f87f8fd4d70c (MD5) Previous issue date: 2017 / Corantes reativos são estruturas complexas que quando descartadas no meio ambiente podem causar sérios danos ambientais. Neste trabalho foi utilizada a metodologia da superfície de resposta através de um planejamento 24 do tipo estrela, avaliando-se os principais fatores que influenciam na reação enzimática (concentração de enzima, peróxido de hidrogênio, corante e pH) e obtendo-se como resposta a descoloração do corante. As máximas remoções foram de 89 e 71% para os corantes azul reativo 221 (RB 221) e azul reativo 198 (RB 198), respectivamente. Utilizando-se os corantes vermelho reativo 195 (RR 195) e amarelo reativo 145 (RY 145) de forma isolada, não foram obtidas remoções. Quando o corante RB 221 foi avaliado na dicromia com o RR 195 e na tricromia com RR 195 e RY 145, foi observado um aumento na eficiência de remoção dos corantes azul e vermelho. Esse efeito sinergético foi observado somente para o RB 198, quando estava presente na dicromia com o RR 195 e na tricromia com RR 195 e RY 145. Os resultados obtidos para a tricromia RB 198, RR 195 e RY 145 foram utilizados nos estudos de reúso do processo de tingimento. Observou-se que com reúso de 50% do efluente de tingimento foi obtido um valor maior de ?E* do que o obtido com a lavagem enzimática que foi realizada com 100% de água limpa. No teste de escala piloto foi obtida uma economia de água e energia e ainda um tecido com uma baixa perda de cor (?E* de 0,6) e uma boa nota de solidez à lavagem (4). Os corantes RB 221 e RB 198 também foram avaliados em estudos de imobilização de enzimas utilizando como suporte alginato de cálcio. Nesses estudos a máxima remoção obtida foi de 93% para o RB 221 e de 75% para o RB 198, em pH 5,5, concentração de H2O2 de 43,75 µmol/L para o RB 221 e 37,5 µmol/L para o RB 198, 30 ºC, tempo de 180 min para o RB 221 e de 240 min para o RB 198, massa de cápsulas 0,120 g para o RB 221 e 0,110 g para o RB 198. Foi possível reusar o biocatalisador em até 3 vezes. O modelo numérico proposto para o alginato forneceu um bom ajuste em relação aos dados experimentais. Nos ensaios de imobilização utilizando espuma de poliuretano, a máxima degradação de 58% para o RB 221 e de 72% para o RB 198 foi obtida em pH 6 e 7, respectivamente, 30 ºC, 30 min de reação, concentração de H2O2 37,5 µmol/L para o RB 198 e 50,0 µmol/L para o RB 221.<br> / Abstract : Reactive dyes are complex structures that when discharged into the environment cause serious environmental damage. In this work we used the methodology of response surface through a 24 experimental design of type star, evaluating the main factors that influence the enzymatic reaction (enzyme concentration, H2O2, dye and pH) and obtaining an answer to removal of the dye. The maximum removals were 89 and 71%, respectively, for the Reactive blue dye 221 (RB 221), and Reactive blue 198 (RB 198). Using the dyes reactive red 195 (RR 195) and reactive yellow 145 (RY 145) alone, removals were not obtained. When the dye RB 221 was evaluated in dichrome with the RR 195 and trichrome with RR 195 and RY 145, there was an increase in removal efficiency of blue and red dyes. This synergistic effect was observed only for RB 198 when it was present in the dichrome with the RR 195 and trichrome with RR 195 and RY 145. The results obtained for trichrome RB 198, RR 195 and RY 145 were used in the reuse studies of the dyeing process. It was observed that with a reuse of 50% of the dye effluent a higher value of ?E* was obtained than that obtained with the enzymatic washing that was performed with 100% of clean water. In the pilot scale test, a water and energy saving was obtained, as well as a fabric with a low color loss (?E* 0.6) and a good washing fastness (4). RB 221 and RB 198 dyes were also evaluated in enzyme immobilization studies using calcium alginate as support. In these studies, the maximum removal obtained was 93% for RB 221 and 75% for RB 198, at pH 5.5, concentration of H2O2 of 43.75 µmol /L for RB 221 and 37.5 µmol/L for RB 198, 30 ° C, time of 180 min for RB 221 and 240 min for RB 198, capsule mass 0.120 g for RB 221 and 0.110 g for RB 198. It was possible to reuse the biocatalyst in up to 3 times. The numerical model proposed for alginate provided a good fit over the experimental data. In the immobilization tests using polyurethane foam, the maximum degradation of 58% for RB 221 and 72% for RB 198 was obtained at pH 6 and 7, respectively, 30 ° C, 30 min of reaction, concentration of H2O2 37, 5 µmol/L for RB 198 and 50.0 µmol /L for RB 221.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-10-24T03:18:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348180.pdf: 2733043 bytes, checksum: f863f0bdf4971f7dccd35314bd054f4b (MD5) Previous issue date: 2017 / Visando a conservação dos recursos naturais, o estudo da produção de biomoléculas, como exemplo os biossurfactantes, tem crescido nos últimos anos. A maioria dos biossurfactantes conhecidos é de origem bacteriana, sendo pouco investigada a capacidade de produção utilizando fungos. Neste trabalho, foi avaliada a produção de biossurfactantes por fungos em diferentes sistemas de cultivo. O fungo Trametes versicolor CECT 20817 foi cultivado em sistema sólido utilizando como fonte de carbono um resíduo da produção bifásica do azeite de oliva. Foi verificada a produção de metabólitos com atividade de superfície e enzimas oxidativas durante 14 dias de cultivo a 25 °C, obtendo-se valores de tensão superficial (TS) da ordem de 30 mN.m-1. O biossurfactante produzido foi classificado como um derivado de lipopeptídeo, sendo capaz de reduzir a TS do meio aquoso para 26,4 ± 0,2 mN.m-1, exibindo propriedades interfaciais satisfatórias. Além disso, o biossurfactante produzido se mostrou particularmente estável quanto a variação de pH e temperatura e apresentou atividade antibacteriana moderada contra Escherichia coli. Também foi investigada a produção de biossurfactantes por um fungo isolado de um resíduo de refinaria de petróleo em sistema submerso, utilizando hidrocarbonetos derivados de petróleo como fonte de carbono. A estirpe apresentou uma velocidade específica máxima de crescimento igual a 0,0184 h-1, obtendo-se um fator de conversão de substrato em célula ( ) igual a 0,5412 g.g-1. A produção de biossurfactantes foi detectada a partir de 6 dias de cultivo, confirmada pela redução da TS do meio (valores inferiores a 35 mN.m- 1). Foi verificado que a produção de biossurfactantes auxilia o processo de biodegradação de óleo diesel, sendo observada uma eficiência de degradação igual a 78,30 ± 0,76 %, nas condições ótimas estabelecidas. Ainda, a presença do tensoativo no sistema interfere na transferência de oxigênio do meio líquido, sendo observada uma diminuição nos coeficientes volumétricos de transferência de oxigênio (KLa). De acordo com as análises de caracterização, o biossurfactante foi classificado como um derivado de glicolipídeo, apresentando estabilidade em relação a variações de temperatura e pH. Estes resultados corroboram para a viabilidade da utilização de microrganismos produtores de biossurfactantes em processos de biorremediação.<br> / Abstract : Concerning over the natural resources preservation, the study of the biomolecules production, such as biosurfactants, has increased in recent years. Most of the known biosurfactants are from bacterial origin, with insufficient investigation of production capacity using fungi. In this study, the biosurfactants production by fungi in different cultivate systems were evaluated. The fungus Trametes versicolor CECT 20817 was cultivated in a solid system, using the two-phase olive mill waste as a substrate. The surface active metabolites and oxidative enzymes production during 14 days of cultivation at 25 °C was verified, obtaining surface tension (ST) in the order of 30 mN.m-1. The biosurfactant produced was classified as a lipopeptide derivative, being able to reduce the ST of the aqueous medium to 26.4 ± 0.2 mN.m-1, exhibiting satisfactory interfacial properties. In addition, the biosurfactant produced by T. versicolor proved to be particularly stable in pH and temperature and exhibited moderate antibacterial activity against Escherichia coli. We also investigated the biosurfactant production by fungus isolated from oil refinery residue in submerged system using petroleum-derived hydrocarbon as a carbon source. The strain showed a specific growth rate of 0.0197 ± 0.0184 h-1 and it was obtained a cell yield coefficient ( / ) equal to 0.5412 g.g-1. The expressive biosurfactant production was detected from 6 days of cultivation, confirmed by the reduction of the ST values. It was verified that the biosurfactant production enhanced the diesel oil biodegradation process, where a degradation efficiency equal to 78.30 ± 0.76 % was observed under the optimal conditions established. Furthermore, the presence of surfactant in the system influence the oxygen transfer in the liquid medium and it was observed a decrease in the volumetric oxygen transfer coefficients (KLa). According to the characterization analyzes, the biosurfactant was classified as a glycolipid derivative, presenting good stability in relation to temperature and pH variations. These results corroborate the viability of the use of biosurfactant producer microorganisms in bioremediation processes.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

Ingeniera Civil en Biotecnología / La alimentación saludable es un tema que ha ido cobrando importancia, tanto para las personas como para el Gobierno y las industrias. El mercado de los alimentos saludables representa actualmente el 19% de la ventas del retail nacional (US$ 3 billones) y se proyecta siga creciendo. En esta línea, Maltexco S.A. considera la posibilidad de elaborar leche de avena, aprovechando su alto contenido de β-glucanos, el cual actúa reduciendo el colesterol en la sangre. Este trabajo busca diseñar un proceso enzimático para la elaboración de leche de avena que sea compatible con los equipos disponibles en la empresa y permita mantener las características funcionales del grano. Para ello, se definen a escala de laboratorio los parámetros y condiciones de operación que luego se pre-evalúan técnicamente en una planta piloto. Además, se determinan las etapas en las que se medirán β-glucanos para monitorear su proceso de extracción. El proceso diseñado consta de 5 etapas: molienda, maceración, filtración, tratamiento térmico y decantación. En base a éste, el producto con mejores resultados se obtiene tras utilizar α-amilasa, β-amilasa y pululanasa en una mezcla de agua con harina de avena pelada y estabilizada en una relación de 8 [l] por cada kilogramo de avena. Las concentraciones de enzimas utilizadas son: 187,5 [FAU/ml], 5.000 [DP°/ml] y 412,5 [PU/ml], respectivamente, mientras que la curva de maceración propuesta considera tres pares de temperaturas y tiempos de incubación: 55 [°C] por 10 [min], 65 [°C] por 40 [min] y 90 [°C] por 50 [min]. El producto elaborado posee textura cremosa y una concentración de β-glucanos que sólo alcanza el 42% de lo que establece la norma chilena para considerar a un producto como saludable. Esto se debe, principalmente, a los bajos rendimientos de extracción originados por problemas de agitación y difusión de las enzimas en la mezcla. Tras evaluar el proceso, se descarta el uso tanto del tratamiento térmico como la decantación, debido a la pérdida de β-glucanos y el aumento en la duración del proceso total. Finalmente, se propone un proceso con 4 etapas principales: molienda, maceración, centrifugación y pasteurización. Si a esto se suma una optimización en la etapa de maceración se podría aumentar el rendimiento y disminuir la cremosidad.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-19T12:33:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T12:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos e plantas produzem enzimas que possuem as mais diversas aplicações biotecnológicas. Uma possível e promissora aplicação dessas enzimas é o controle de nematoides, em substituição aos nematicidas químicos prejudiciais à saúde humana e animal, ao meio ambiente e à microbiota do solo. Outra possível aplicação das enzimas de fungos é o uso da dextranase na redução de dextrana na indústria sucroalcooleira. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a produção de enzimas pelo fungo Pleurotus eryngii e pelas plantas Euphorbia milii e E. trigona, purificar e caracterizar as enzimas de E. milii, E. trigona e Pochonia chlamydosporia, e testar a atividade nematicida das enzimas das plantas E. milii, E. trigona e do fungo P. eryngii. O fungo P. eryngii e seu extrato reduziram significativamente (p<0,01) o número de larvas intactas de Panagrellus sp. após 24 horas de tratamento em 60 e 90%, respectivamente. Este efeito não está relacionado à atividade enzimática, mas sim à presença de outros metabólitos. Os ovos de Meloidogyne javanica, quando tratados com o extrato de P. eryngii, mostraram redução de 53% (p<0,01) no número de ovos intactos. A redução de ovos intactos de M. javanica é atribuída à atividade enzimática, uma vez que o extrato apresentou atividade quitinolítica e proteolítica de, respectivamente, 32,74 e 3,57 U/mL. A purificação do látex de E. trigona por cromatografia de exclusão molecular permitiu a purificação de três proteases distintas. O peso molecular das proteases foi estimado em aproximadamente: 36, 31 e 29 kDa, para a trigonina 1, 2 e 3, respectivamente. O pH e a temperatura que proporcionaram maior atividade de protease foram 4,0, 6,0 e 9,0, e temperatura de 70 °C. As proteases foram inibidas por fluoreto de fenilmetilsulfonila e iodoacetamida. O pool das três proteases presentes no látex de E. trigona reduziram significativamente (p<0,01) o número de J 2 vivas de M. incognita em 96% após 24 horas de tratamento. A purificação parcial das proteases presentes no látex de E. milii indicou que estas proteases correspondem à milina e miliina. Estas enzimas reduziram em 65,59% e 96,46% o número de larvas de Panagrellus redivivus após 24 e 48 h, respectivamente (p<0,01). A dextranase produzida pelo fungo P. chlamydosporia foi purificada à homogeneidade em duas etapas, com rendimento de 152%, fator de purificação de 6,84 e atividade específica de 358,63 U/mg. Seu peso molecular foi estimado por SDS-PAGE em 64 kDa. A enzima apresentou maior atividade a 50 °C e pH 5,0, usando tampão citrato-fosfato 100 mM, foi inibida por Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , e apresentou K M de 1,77 g/L. A dextranase madura é composta por 585 resíduos de aminoácidos, com peso molecular predito de 64,38 kDa e pI 5,96. Esta dextranase demonstrou forte semelhança filogenética em comparação à dextranase de Trichoderma harzianum. Sua estrutura consiste de dois domínios: o primeiro composto por 15 cadeias beta, e o segundo composto por uma β-hélice paralela. Esses resultados evidenciam o potencial biotecnológico desses fungos, plantas e suas enzimas extracelulares informações acerca no da controle dextranase de nematoides, produzida pelo e fornecem fungo P. chlamydosporia, que podem ser utilizadas para futuras aplicações industriais desta enzima. / Fungi and plants produce enzymes that have several biotechnological applications. A possible and promising application of these enzymes is the control of nematodes, replacing chemical nematicides harmful to human and animal health, to the environment and to the soil microbiota. Another possible application of fungi enzymes is the use of dextranase to reduce dextran content in sugar industry. The objective of this work was to investigate the production of enzymes by Pleurotus eryngii, Euphorbia milii and E. trigona, to purify and characterize the enzymes from E. milii, E. trigona and Pochonia chlamydosporia, and to test the nematicidal activity of E. milii, E. trigona and P. eryngii. P. eryngii fungus and its extract significantly reduced (p<0.01) the number of intact Panagrellus sp. larvae after 24 hours treatment in 60 and 90%, respectively. This effect is not related to enzymatic activity, but to the presence of other metabolites. M. javanica eggs, when treated with P. eryngii extract, showed a 53% reduction (p<0.01) in the number of intact eggs. The M. javanica intact eggs reduction is attributed to enzymatic activity, once the extract showed proteolytic and chitinolytic activities of, respectively, 32.74 and 3.57 U/mL. The purification of E. trigona latex with size-exclusion chromatography allowed partially purification of three distinct proteases. The molecular weight of proteases was estimated at approximately: 36, 31 and 29 kDa, for trigonin 1, 2 and 3, respectively. The pH and temperature that provided highest protease activity were 4.0, 6.0 and 9.0, and temperature of 70 °C. The proteases were inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride and iodoacetamide. The pool of three proteases present in E. trigona latex reduced significantly (p<0.01) the number of live M. incognita J 2 in 96% after 24 hours treatment. The partial purification of the proteases present in E. milii latex indicated that these proteases are milin and miliin. These enzymes reduced the Panagrallus redivivus larvae number by 65.59 % and 96.46 % after 24 and 48 hours, respectively (p<0.01). Dextranase produced by the fungus P. chlamydosporia was purified to homogeneity in two steps, with a yield of 152 %, purification factor of 6.84 and specific activity of 358.63 U/mg. Its molecular weight was estimated by SDS-PAGE at 64 kDa. The enzyme presented higher activity at 50 °C and pH 5.0, using 100 mM citrate-phosphate buffer, was inhibited by Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , and presented K M of 1.77 g/L. Mature dextranase is composed of 585 amino acids residues, with a predicted molecular weight of 64.38 kDa and pI 5.96. This dextranase showed a strong phylogenetic similarity when compared to Trichoderma harzianum dextranase. Its structure consists of two domains: the first composed by 15 β strands, and the second composed by a right-handed parallel β-helix. These results evidence the biotechnological potential of these fungi, plants and their extracellular enzymes to nematodes control, and provide information about the dextranase produced by P. chlamydosporia fungus, which can be used for future industrial applications of this enzyme.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T20:14:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-29T18:49:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T18:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) Previous issue date: 2014 / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é responsável por uma significante mortalidade e morbidade nas Américas Central e do Sul, afetando um número significativo da população mundial. A doença desenvolveu-se ao longo de décadas e a presença de mediadores inflamatórios e a hipertrofia cardíaca são características comuns. Buscando uma compreensão dos mecanismos moleculares que ocorrem no processo inflamatório e que subsidiem a caracterização de marcadores moleculares na patologia chagásica, a proteína COX-2 tornou se objeto de estudo. Sabe- se que a regulação desta proteína pode se dar a nível transcricional e/ou pós traducional, envolvendo um conjunto de fatores protéicos e incluindo a participação de miRNAs. Estudos recentes tem mostrado uma possível co-regulação indireta entre os níveis de PTEN e de COX-2, mas até o momento, os resultados preliminares ainda não elucidaram esses mecanismos. Particularmente, em relação à Doença de Chagas, poucos são os estudos que focam na elucidação do processamento do mRNAs na doença e nos fatores que co-regulam a proteína COX-2. Sendo assim, objetivou se nesse estudo analisar os moduladores do processo pró-inflamatório/ hipertrófico em células H9c2 infectadas pela cepa Berenice-62 do T.cruzi, buscando a caracterização de marcadores moleculares do processo inicial da Doença de Chagas. Para isso, os tempos de infecção de 0, 2, 6, 12, 24 e 48 horas foram estudados, logo após 2 horas de interação com o parasito. A comprovação da infectividade foi feita por ensaios de microscopia pela coloração com Giemsa e Dapi. A análise transcricional de genes correlatos ao processo inflamatório/ hipertrófico e de microRNAs foram realizados por ensaios de qRT-PCRs e as análises das proteínas COX-2, PTEN, P-PTEN foram investigadas nos ensaios de Western blots. Outros ensaios bioquímicos, como o de viabilidade celular e o de mensuração de prostaglandina E2, foram realizados. Com os resultados, conclui-se que a infecção com a cepa Be-62 diminui a viabilidade celular após 48 horas de infecção e modula os níveis de expressão dos marcadores de hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β –myhc, além de modular o ambiente pró-inflamatório nos intervalos iniciais de infecção, considerando-se o aumento da expressão e da atividade da proteína COX-2 e no aumento na produção de PGE2. Os resultados também demonstraram uma relação entre os genes Cox-2, Pten, Akt, sugerindo uma possível correlação cruzada entre COX-2 e PTEN. Os microRNAs-26b, -463,-1 e -21, respectivamente, indicaram uma possível regulação pós-traducional das proteínas COX-2 e PTEN, demonstrando um papel fundamental na instalação do quadro de hipertrofia. Estudos futuros poderão validar o papel dessas moléculas como marcadores moleculares e espera-se que os resultados do presente estudo possam direcionar a caracterização de moléculas que auxiliem no prognóstico e tratamento da doença de maneira direcionada, considerando-se a grande variabilidade genética das cepas do T. cruzi. ____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is responsible for significant mortality and morbidity in Central and South America, affecting a significant number of the world population. The disease develops over decades and the presence of inflammatory mediators and cardiac hypertrophy are common features. Searching for an understanding of the molecular mechanisms that occur during the inflammatory process, and that subsidize the characterization of molecular markers in Chagas disease, COX - 2 protein became an object of study. It is known that the regulation of this protein can occur at transcriptional and/ or post- translational level, involving a number of protein factors and including the involvement of miRNAs. Recent studies have shown a possible indirect co-regulation in the levels of PTEN and COX - 2, but so far the preliminary results not yet elucidated these mechanisms. Particularly in relation to Chagas disease, there are few studies that focus on the elucidation of the processing of mRNAs in this disease and in the factors that co - regulate COX - 2 protein. Therefore, this study was aimed to analyze the hypertrophic/ proinflammatory process modulators in H9c2 cells infected with strain Berenice -62 of the Trypanosoma cruzi, searching for characterize the molecular markers of the initial process of Chagas disease. For this reason, the time of infection of 0, 2, 6, 12, 24 and 48 hours were studied soon after 2 hours from the interaction with the parasite. The proof of the infectivity was performed by microscopy assays by the staining with Giemsa and Dapi. The transcriptional analysis of genes related to the inflammatory / hypertrophic process and microRNAs were performed by qRT- PCR assays and the analyzes of COX-2, PTEN, PTEN - P proteins were explored in Western blots assays. Other biochemical assays such as cell viability and measurement of prostaglandin E2 were performed. From the results, it is concluded that infection with Be- 62 strain decreases cell viability after 48 hours of infection and modulates the levels of expression of markers of cardiac hypertrophy Anf and Bnp β - myhc, in addition to modulate the environment pro-inflammatory in the initial intervals of infections, considering the increased expression and COX -2 protein activity and in the increased production of PGE2. The results also demonstrated a relationship among cox-2, pten, akt genes suggesting a possible cross- correlation between COX-2 and PTEN. MicroRNAs-26b, - 463, -21 and -1 respectively indicate a possible posttranslational regulation of COX-2 and PTEN protein, demonstrating a crucial role in the installation of hypertrophy. Future studies could validate the role of these molecules as molecular markers and it is expected that the results of this study may direct the characterization of molecules that assist in the prognosis and treatment of disease in targeted way, considering the high genetic variability of strains of T. cruzi.