La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire. Elle réduit le dihydrofolate en tétrahydrofolate, un co-facteur impliqué dans la biosynthèse des purines et du thymidylate. La DHFRh est une cible de choix pour des agents de chimiothérapie comme le méthotrexate (MTX), inhibant spécifiquement l’enzyme ce qui mène à un arrêt de la prolifération et ultimement à la mort cellulaire. Le MTX est utilisé pour le traitement de plusieurs maladies prolifératives, incluant le cancer. La grande utilisation du MTX dans le milieu clinique a mené au développement de mécanismes de résistance, qui réduisent l’efficacité de traitement. La présente étude se penche sur l’un des mécanismes de résistance, soit des mutations dans la DHFRh qui réduisent son affinité pour le MTX, dans le but de mieux comprendre les éléments moléculaires requis pour la reconnaissance de l’inhibiteur au site actif de l’enzyme. En parallèle, nous visons à identifier des variantes plus résistantes au MTX pour leur utilisation en tant que marqueurs de sélection en culture cellulaire pour des systèmes particuliers, tel que la culture de cellules hématopoïétiques souches (CHS), qui offrent des possibilités intéressantes dans le domaine de la thérapie cellulaire. Pour étudier le rôle des différentes régions du site actif, et pour vérifier la présence d’une corrélation entre des mutations à ces régions et une augmentation de la résistance au MTX, une stratégie combinatoire a été dévelopée pour la création de plusieurs banques de variantes à des résidus du site actif à proximité du MTX lié. Les banques ont été sélectionnées in vivo dans un système bactérien en utilisant des milieux de croissance contenant des hautes concentrations de MTX. La banque DHFRh 31/34/35 généra un nombre considérable de variantes combinatoires de la DHFRh hautement résistantes au MTX. Les variantes les plus intéressantes ont été testées pour leur potentiel en tant que marqueur de sélection dans plusieurs lignées cellulaires, dont les cellules hématopoïétiques transduites. Une protection complète contre les effets cytotoxiques du MTX a été observée chez ces cellules suite à leur infection avec les variantes combinatoires. Pour mieux comprendre les causes moléculaires reliées à la résistance au MTX, des études de structure tridimensionnelle de variantes liées au MTX ont été entreprises. La résolution de la structure de la double variante F31R/Q35E lié au MTX a révélé que le phénotype de résistance était attribuable à d’importantes différences entre le site actif de la double variante et de l’enzyme native, possiblement dû à un phénomème dynamique. Une compréhension plus générale de la reconnaissance et la résistance aux antifolates a été réalisée en comparant des séquences et des structures de variantes de la DHFR résistants aux antifolates et provenant de différentes espèces. En somme, ces travaux apportent de nouveaux éléments pour la comprehension des intéractions importantes entre une enzyme et un ligand, pouvant aider au développement de nouveaux antifolates plus efficaces pour le traitement de diverses maladies. De plus, ces travaux ont généré de nouveaux gènes de résistance pouvant être utilisés en tant que marqueurs de sélection en biologie cellulaire. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an enzyme that is essential to cell proliferation. It reduces dihydrofolate to tetrahydrofolate, an important cofactor involved in purine and thymidylate biosynthesis. hDHFR is a choice target for chemotherapeutic drugs like methotrexate (MTX), which specifically inhibits the enzyme, stopping cell proliferation and leading to cellular death. MTX is used for the treatment of many proliferative diseases, including cancers. Widespread use of MTX has lead to the development of resistance mechanisms appear which impair treatment efficiency. The present work focuses on a mechanism of resistance, namely mutations in hDHFR that reduce its affinity for MTX, to better understand the underlying mechanisms of inhibitor recognition at the active site of the enzyme. In parallel, we aim at identifying the most MTX-resistant variants to offer novel selectable markers for particular cell culture systems, such as hematopoietic cell culture, which offer important perspectives for cellular therapy. To study the role of different regions of the hDHFR active site, and to verify if a correlation exists between mutations in these regions and increased resistance to MTX, a combinatorial strategy was developed enabling the creation of several hDHFR variant libraries at active site residues located in proximity to bound MTX. The libraries were selected in vivo in a bacterial system using culture media containing high concentration of the inhibitor. One library in particular, hDHFR 31/34/35, yielded a considerable number of highly MTX-resistant combinatorial hDHFR variants. The most interesting candidates were tested for their potential as selectable markers in various cell lines, including transduced hematopoietic cells. Complete protection from MTX-cytotoxicity was obtained for these cells following infection with the combinatorial variants. To better understand the molecular causes of MTX resistance, resolution of the crystal structures of variant proteins in presence of MTX was attempted. Resolution of the F31R/Q35E double variant revealed that the resistance phenotype was related to important differences in the active site relative to WT, possibly attributable to a dynamic motion effect. A more general comprehension of antifolate recognition and resistance was achieved by sequence and structural comparison of antifolate-resistant DHFR variants from different species. Overall, our work contributes to the better understanding of enzyme-inhibitor interactions, which could provide new insights into the development of more efficient clinical therapies. In addition, this work has yielded novel drug-resistance genes useful as selectable markers for cellular biology.

La cellulose et ses dérivés sont utilisés dans un vaste nombre d’applications incluant le domaine pharmaceutique pour la fabrication de médicaments en tant qu’excipient. Différents dérivés cellulosiques tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) et l’hydroxyéthylcellulose (HEC) sont disponibles sur le commerce. Le degré de polymérisation et de modification diffèrent énormément d’un fournisseur à l’autre tout dépendamment de l’origine de la cellulose et de leur procédé de dérivation, leur conférant ainsi différentes propriétés physico-chimiques qui leurs sont propres, telles que la viscosité et la solubilité. Notre intérêt est de développer une méthode analytique permettant de distinguer la différence entre deux sources d’un produit CMC ou HEC. L’objectif spécifique de cette étude de maitrise était l’obtention d’un profil cartographique de ces biopolymères complexes et ce, par le développement d’une méthode de digestion enzymatique donnant les oligosaccharides de plus petites tailles et par la séparation de ces oligosaccharides par les méthodes chromatographiques simples. La digestion fut étudiée avec différents paramètres, tel que le milieu de l’hydrolyse, le pH, la température, le temps de digestion et le ratio substrat/enzyme. Une cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 fut utilisée pour la digestion partielle de nos échantillons de cellulose. Les oligosaccharides ne possédant pas de groupements chromophores ou fluorophores, ils ne peuvent donc être détectés ni par absorbance UV-Vis, ni par fluorescence. Il a donc été question d’élaborer une méthode de marquage des oligosaccharides avec différents agents, tels que l’acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS), le 3-acétylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) et la phénylhydrazine (PHN). Enfin, l’utilisation de l’électrophorèse capillaire et la chromatographie liquide à haute performance a permis la séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose. Pour chacune de ces méthodes analytiques, plusieurs paramètres de séparation ont été étudiés. / Cellulose and its derivatives are used in a wide range of applications, including the pharmaceutical industry for the manufacturing of medicines as inactive additives. Various cellulosic derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC) and hydroxyethylcellulose (HEC) are readily available for such use. The degree of polymerization and modification differs from one supplier to the other, according to the origin of the cellulose and its process of chemical modification, conferring on them different physico-chemical properties, such as viscosity and solubility. Our interest is to develop an analytical method that can distinguish between different sources of a given CMC or HEC product. The specific objective of this master’s study was to obtain a fingerprint of these complex biopolymers by developing an enzymatic digestion method to produce smaller oligosaccharides that could be separated by simple chromatographic methods. The digestion was studied as a function of various parameters, such as the composition of the hydrolysis solution, the pH, the temperature, the duration of digestion and the substrate/enzyme ratio. A cellulase enzyme from Trichoderma reesei ATCC 26921 was used for the partial digestion of our samples of cellulose. Since these oligosaccharides do not possess a chromophore or fluorophore, they can’t be detected either by absorbance or fluorescence. It was thus necessary to work out the labeling method for oligosaccharides using various agents, such as 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS), 3-acetylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) and phenylhydrazine (PHN). Finally, the use of capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography allowed the separation of the enzymatic digestion products of the cellulose derivatives (CMC and HEC). For each of these analytical separation techniques, several parameters of the separation were studied.

La dihyrofolate réductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactérienne encodée par un plasmide donc aisément transmissible. Elle catalyse la réaction de réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifération cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dépend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est différente, structurellement et génétiquement, de l’enzyme DHFR chromosomale présente chez tous les organismes et elle est résistante au triméthoprime (TMP) qui est largement utilisé dans les traitements antibactériens chez l’Homme. Aucun inhibiteur sélectif contre la DHFR R67 n’est actuellement répertorié. Le but de cette étude a été d’identifier des molécules qui pourront inhiber la DHFR R67 sélectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vérification de la qualité des essais enzymatiques en conditions déterminées pour le criblage d’inhibiteurs sur plusieurs lectrices à plaques a identifié des appareils appropriés pour l’analyse. L’étude de l’activité enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en présence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel d’inhibiteurs, a montré que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel basé sur l’approche du design d’un inhibiteur à partir de petites molécules, a révélé des molécules primaires qui inhibent la DHFR R67 de façon faible, mais sélective. Le test des composés biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montré l’augmentation de l’affinité entre la DHFR R67 et les composés testés. Trois composés ont été déterminés comme des inhibiteurs sélectifs prometteurs pour la DHFR R67. / Type II R-plasmid encoded dihyrofolate reductase (DHFR), R67 DHFR is a bacterial enzyme that catalyzes the reduction of dihydrofolate (DHF) to tetrahydrofolate (THFA) which is essential for cell proliferation. R67 DHFR is an enzyme that depends on the cofactor NADPH as the hydride donor. R67 DHFR is distinct, structurally and genetically, from E. coli chromosomal DHFR (DHFR Ec) and it provides drug resistance to the widely-administered antibiotic trimethoprim (TMP). No selective inhibitor against R67 DHFR exists currently. The goal of this study was to discover molecules that can selectively inhibit R67 DHFR, without affecting human DHFR (hDHFR). Verification of the quality of enzyme assays under defined conditions for inhibitor screening on plate readers found several appropriate instruments for analysis. The study of the enzymatic activity of R67 DHFR and hDHFR in the presence of organic solvents and ionic liquids (ILs), as co-solvents for rational screening of inhibitors, showed that ILs can provide alternative media for enzymatic assays. Rational screening based on the approach of fragment-based drug design, revealed primary molecules that inhibited DHFR R67 weakly, but selectively. The testing of more complex compounds with known biological activities gave ligands with increased affinity for R67 DHFR. Three compounds were identified as promising selective inhibitors for R67 DHFR.

La transcétolase thermostable de Geobacillus stearothermophilus (TKgst, EC 2.2.1.1) permet de synthétiser efficacement à haute température des cétoses à 4, 5 et 6 atomes de carbone de configuration d-thréo (3S, 4R), par formation stéréosélective d’une liaison C-C, à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2R) à courte chaîne. L’objectif de ces travaux est d’utiliser la TKgst à 60°C pour gagner en efficacité et étendre son spectre de substrats à de nouveaux donneurs et accepteurs par Evolution dirigée, selon une approche semi-rationnelle, basée sur la mutagenèse par saturation de site. Ainsi, à l’issue du criblage des banques générées, les TKgst mutées les plus performantes (L382D/D470S, L191I, L382F/F435Y, R521Y/H462N et R521V/S385D/H462S) ont été sélectionnées pour leurs activités spécifiques supérieures à celle de la TKgst sauvage (gain de 3,3 à 5) vis-à-vis d’aldéhydes α-hydroxylés (2S) et d’aldéhydes α-hydroxylés (2R) à longue chaîne polyhydroxylée (C5-C6). La TKgst sauvage, ainsi que ces TKgst mutées performantes ont permis d’obtenir, à 60°C, onze cétoses, dont neuf de configuration l-érythro (3S, 4S) à 5 à 6 atomes de carbone et de configuration d-thréo (3S, 4R) de 4 à 8 atomes de carbone d’intérêt biologique, avec de très bons rendements, quatre étant inaccessibles avec les TKs microbiennes utilisées jusqu’alors. D’autres TKgst mutées ont par ailleurs conduit à une amélioration significative de l’activité de la TKgst vis-à-vis d’aldéhydes aliphatiques et aromatiques, mais également vis-à-vis d’un nouveau substrat donneur, l’acide pyruvique et d’analogues, ouvrant le champs des applications aux 1-désoxycétoses. De plus, ces travaux ont permis de développer un procédé multi-enzymatique innovant et éco-comptatible, dans lequel les substrats donneurs et accepteurs de la TKgst sont générés par voie enzymatique, via l’utilisation d’une transaminase ou d’une d-aminoacide oxydase et d’une aldolase, à partir de composés naturels et peu coûteux. Cette stratégie pourra être appliquée aux TKgst mutées, afin d’accéder efficacement et à moindre coût, à d’autres cétoses rares hautement valorisables. / Thermostable transketolase from Geobacillus stearothermophilus (TKgst, EC 2.2.1.1) catalyzes efficiently the synthesis of d-threo (3S, 4R) ketoses having 4, 5 and 6 carbon atoms, by the stereoselective formation of a new C-C bond, from short chain (2R)-α-hydroxylated aldehydes. The aim of this work is to use TKgst at 60°C, in order to increase reaction rates and to broad its substrate scope to new donors and acceptors by Directed Evolution, according to a semi-rationnal approach, based on site saturation mutagenesis. Thus, the screening of the libraries led to TKgst variants (L382D/D470S, L191I, L382F/F435Y, R521Y/H462N and R521V/S385D/H462S) having significantly improved specific activities towards (2S)-α-hydroxylated aldehydes and (2R)-α-hydroxylated aldehydes having a long polyhydroxylated chain (C5-C6), compared to wild type TKgst (3,3 to 5-fold increased activity). Wild-type TKgst as well as these TKgst variants were used, at 60°C, to obtain eleven, including nine l-erythro (3S, 4S) ketoses having 5 and 6 carbon atoms and d-threo (3S, 4R) ketoses having from 4 to 8 carbon atoms of biological interest, with good yields, four being inaccessible using common TK sources. Besides, other TKgst variants led to significantly improved activities towards hydrophobic aldehydes and towards a new donor substrate, pyruvic acid and derivatives, extending TKgst product scope to 1-deoxyketoses. In addition, a multienzymatic innovative and environmentally friendly process, in which TKgst substrates are generated through enzymatic pathways, using a transaminase or a d-aminoacid oxidase and an aldolase, from non-expensive and natural compounds was developed, in the presence of wild-type TKgst and will be able to be applied to TKgst variants, in order to synthesize efficiently and at lower cost, other highly valuable rare ketoses.

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L'imagerie de fluorescence s'est particulièrement développée au fil de ces dernières décennies notamment pour l'exploration des systèmes biologiques. De nombreux développements portant à la fois sur les instruments d'analyse et les agents de contraste (sondes) ont été entrepris pour améliorer cette technique de bioanalyse. Mes travaux de thèse avaient pour but d'explorer diverses plateformes moléculaires pro-fluorescentes pouvant générer, sous l'effet d'un stimulus biologique / chimique, un fluorophore organique. Cette approche de synthèse chimique in-situ met en jeu des réactions domino caractérisées par la formation et la rupture de liaisons covalentes. Ce processus devrait ouvrir la voie à des sondes fluorogéniques possédant des rapports signal sur bruit élevés. Cette étude avait aussi pour but d'étudier la synthèse in-situ de fluorophores déclenchée par plusieurs stimuli afin de concevoir des portes logiques moléculaires de type "AND", dans un but de détection "multi-analytes". Pour établir la preuve de principe, la formation d'un coeur 7-hydroxy-2-iminocoumarine fluorescent déclenchée par divers couples d'enzymes (hydrolase / nitroréductase) a été étudiée. L'ensemble de ces travaux sont décrits dans le chapitre I de ce manuscrit. Par la suite et comme présenté dans les chapitres II et III, notre intérêt s'est porté sur le développement des plateformes fluorogéniques libérant des fluorophores ayant des maxima d'absorption / émission décalés vers le rouge en comparaison de ceux des coumarines. Une première réalisation a concerné la conception d'un précurseur "cagé" agissant comme sonde à peptidases ou nitroréductase par libération d'un dérivé pyronine. Des travaux portant sur la formation in-situ d'une benzophénoxazine sont également en cours et sont présentés au chapitre III. Un dernier aspect de ce travail a concerné la chimie d'une nouvelle famille de fluorophores proche-IR (les hybrides dihydroxanthène-hémicyanine) dont la formation in-situ pourra être envisagée pour des applications in-vivo. / Fluorescence imaging is a growing field of biology over the past decades. Intensive works mainly focused on instrumental developments and chemistry of contrast agents (probes), were already done to improve such bioanalytical technique. The main goal of this Ph. D. thesis was to explore various fluorogenic molecular platforms responsive to various (bio)chemical stimuli and capable of releasing organic fluorophores in the biological medium to analyze. This approach named "in-situsynthesis" is based on domino reactions belonging to the repertoire of "covalent chemistry", triggered by the target (bio)analyte. This kind of process should provide advanced fluorogenic probes with high signal-to-noise ratio. Another purpose of this work was to investigate some dualtriggering events to access to fluorogenic molecules acting as "AND-type" molecular logic gates for dual-analytes detection applications. To establish this approach, the formation of highly fluorescent7-hydroxy-2-iminocoumarin scaffolds triggered by several enzyme pairs (hydrolase and nitroreductase) was studied and now described in the first chapter of this manuscript. The second part of this work, described in chapters II and III, was devoted to the development of original "caged" precursors able to release fluorophores whose absorption / emission maxima are dramatically redshifted compared to those of coumarin derivatives. The first achievement concerned the detection of protease or nitroreductase activities through in-situ formation of a pyronin scaffold. Further works, currently in progress, are focused on "caged" precursors whose the dual reaction with a model protease should lead to the release of a benzophenoxazine derivative. Finally, some chemistry aspects related to an emerging and promising class of NIR fluorophores (dihydroxanthene-hemicyanine hybrids) are presented and the opportunity to form them in biological media, upon enzymatic triggering is also discussed.

Les composés phénoliques sont impliqués dans les propriétés organoleptiques majeures des aliments dérivant d’une matrice végétale. Ils sont notamment responsables de l’amertume, de l’astringence et de la couleur des produits cidricoles. Le brunissement observé lors de la transformation des fruits est lié à la formation de pigments jaunes-orangés. Il est initié par l’activité d’une enzyme plastidiale, la polyphénol oxydase, qui catalyse l’oxydation des polyphénols en présence d’oxygène. Cela aboutit à la formation de quinones, espèces chimiques très réactives qui sont rapidement impliquées dans des voies réactionnelles ultérieures. Certains produits néoformés sont colorés. Un profilage des molécules colorées présentes dans quatre jus de pomme monovariétaux aux couleurs contrastées a été réalisé en CLHP-DBD-SM. Il a mis en évidence l’existence de tannins oxydés colorés et de composés jaunes-orangés non tannants. Parmi ces derniers, des produits d’oxydation de la phloridzine, dérivant de la classe des dihydrochalcones, ont été clairement identifiés (POPj, XGPOPj). Des approches couplées en milieu réel et solution modèle ont en outre permis d’identifier une nouvelle structure colorée dérivant d’un couplage oxydatif entre une dihydrochalcone et un flavanol monomère. Enfin, des déhydrotrimères d’épicatéchine ont pu être caractérisés en solution synthétique mais n’ont pas été détectés directement dans les jus. Par ailleurs, la couleur exprimée par les pigments formés peut subir des modulations en fonction de l’environnement physico-chimique. A titre d’exemple, la fermentation cidricole génère classiquement une décoloration des moûts ; or la composition du milieu fermentaire évolue sous l’influence de différents paramètres tels que le pH ou le potentiel redox. L’impact d’un milieu réducteur sur la couleur du POPj et d’une déhydrotriépicatéchine de type A, sélectionnés comme pigments modèles des jus de pomme, a été exploré par voltammétrie cyclique et spectroélectrochimie UV-visible. En outre, les changements de propriétés spectrales du POPj liés à son état de protonation ont été rationalisés par des approches de TD-DFT. / The phenolic compounds are involved in the main organoleptic properties of plant-derived foods. They are especially responsible for the bitterness, the astringency and the color of apple cider products. The browning observed during fruit processing is related to the formation of yellow-orange pigments. By its catalytic activities, the polyphenol oxidase, a plastidial enzyme, initiates the oxidation of polyphenols in the presence of oxygen. It leads to the formation of quinones, very reactive species which are quickly involved in further chemical reactions. Some of the neoformed products are colored. Four apple juices, showing contrasted colors, were analyzed by reversed-phase HPLC-DAD-MS in order to obtain their profiles in colored compounds. The presence of yellow-orange oxidized tanning and non-tanning compounds was highlighted. Within the latter compounds, some phloridzin oxidation products, deriving from dihydrochalcones, were clearly identified (POPj, XGPOPj). In parallel, coupled approaches in real media and model solutions led to the identification of a new colored structure deriving from an oxidative coupling between a dihydrochalcone and a flavanol monomer. Finally, catechin trimers were also characterized in synthetic medium but they were not detected directly in apple juices. Moreover, the color expressed by the yellow-orange pigments can suffer some variations as a function of the physical-chemical environment. For instance, the cider fermentation results generally in a loss of color in apple juices; but the composition of the fermentative medium evolves under the influence of several parameters, such as pH and redox potential. The impact of reducing conditions on the color of POPj and A-type dehydrotriepicatechin, both selected as model pigments of apple juices, was explored by cyclic voltammetry and UV-visible spectroelectrochemistry. Besides, the changes in spectral properties of POPj, related to its protonation state, were rationalized by TD-DFT calculations.

Cette thèse comporte quatre fichiers vidéo. This thesis comes with four video files. / L'industrie chimique mondiale est en pleine mutation, cherchant des solutions pour rendre la synthèse organique classique plus durable. Une telle solution consiste à passer de la catalyse chimique classique à la biocatalyse. Bien que les avantages des enzymes incluent leur stéréo, régio et chimiosélectivité, cette sélectivité réduit souvent leur promiscuité. Les efforts requis pour adapter la fonction enzymatique aux réactions désirées se sont révélés d'une efficacité modérée, de sorte que des méthodes rapides et rentables sont nécessaires pour générer des biocatalyseurs qui rendront la production chimique plus efficace. Dans l’ère de la bioinformatique et des outils de calcul pour soutenir l'ingénierie des enzymes, le développement rapide de nouvelles fonctions enzymatiques devient une réalité. Cette thèse commence par un examen des développements récents sur les outils de calcul pour l’ingénierie des enzymes. Ceci est suivi par un exemple de l’ingénierie des enzymes purement expérimental ainsi que de l’évolution des protéines. Nous avons exploré l’espace mutationnel d'une enzyme primitive, la dihydrofolate réductase R67 (DHFR R67), en utilisant l’ingénierie semi-rationnelle des protéines. La conception rationnelle d’une librarie de mutants, ou «Smart library design», impliquait l’association covalente de monomères de l’homotétramère DHFR R67 en dimères afin d’augmenter la diversité de la librairie d’enzymes mutées. Le criblage par activité enzymatique a révélé un fort biais pour le maintien de la séquence native dans un des protomères tout en tolérant une variation de séquence élevée pour le deuxième. Il est plausible que les protomères natifs procurent l’activité observée, de sorte que nos efforts pour modifier le site actif de la DHFR R67 peuvent n’avoir été que modérément fructueux. Les limites des méthodes expérimentales sont ensuite abordées par le développement d’outils qui facilitent la prédiction des points chauds mutationnels, c’est-à-dire les sites privilégiés à muter afin de moduler la fonction. Le développement de ces techniques est intensif en termes de calcul, car les protéines sont de grandes molécules complexes dans un environnement à base d’eau, l’un des solvants les plus difficiles à modéliser. Nous présentons l’identification rapide des points chauds mutationnels spécifiques au substrat en utilisant l'exemple d’une enzyme cytochrome P450 industriellement pertinente, la CYP102A1. En appliquant la technique de simulation de la dynamique moléculaire par la force de polarisation adaptative, ou «ABF», nous confirmons les points chauds mutationnels connus pour l’hydroxylation des acides gras tout en identifiant de nouveaux points chauds mutationnels. Nous prédisons également la conformation du substrat naturel, l’acide palmitique, dans le site actif et nous appliquons ces connaissances pour effectuer un criblage virtuel d'autres substrats de cette enzyme. Nous effectuons ensuite des simulations de dynamique moléculaire pour traiter l’impact potentiel de la dynamique des protéines sur la catalyse enzymatique, qui est le sujet de discussions animées entre les experts du domaine. Avec la disponibilité accrue de structures cristallines dans la banque de données de protéines (PDB), il devient clair qu’une seule structure de protéine n’est pas suffisante pour élucider la fonction enzymatique. Nous le démontrons en analysant quatre structures cristallines que nous avons obtenues d’une enzyme β-lactamase, parmi lesquelles un réarrangement important des résidus clés du site actif est observable. Nous avons réalisé de longues simulations de dynamique moléculaire pour générer un ensemble de structures suggérant que les structures cristallines ne reflètent pas nécessairement la conformation de plus basse énergie. Enfin, nous étudions la nécessité de compléter de manière informatisée un hémisphère où l’expérimental n’est actuellement pas possible, à savoir la prédiction de la migration des gaz dans les enzymes. À titre d'exemple, la réactivité des enzymes cytochrome P450 dépend de la disponibilité des molécules d’oxygène envers l’hème du site actif. Par le biais de simulations de la dynamique moléculaire de type Simulation Implicite du Ligand (ILS), nous dérivons le paysage de l’énergie libre de petites molécules neutres de gaz pour cartographier les canaux potentiels empruntés par les gaz dans les cytochromes P450 : CYP102A1 et CYP102A5. La comparaison pour les gaz CO, N2 et O2 suggère que ces enzymes évoluent vers l’exclusion du CO inhibiteur. De plus, nous prédisons que les canaux empruntés par les gaz sont distincts des canaux empruntés par le substrat connu et que ces canaux peuvent donc être modifiés indépendamment les uns des autres. / The chemical industry worldwide is at a turning point, seeking solutions to make classical organic synthesis more sustainable. One such solution is to shift from classical catalysis to biocatalysis. Although the advantages of enzymes include their stereo-, regio-, and chemoselectivity, their selectivity often reduces versatility. Past efforts to tailor enzymatic function towards desired reactions have met with moderate effectiveness, such that fast and cost-effective methods are in demand to generate biocatalysts that will render the production of fine and bulk chemical production more benign. In the wake of bioinformatics and computational tools to support enzyme engineering, the fast development of new enzyme functions is becoming a reality. This thesis begins with a review of recent developments on computational tools for enzyme engineering. This is followed by an example of purely experimental enzyme engineering and protein evolution. We explored the mutational space of a primitive enzyme, the R67 dihydrofolate reductase (DHFR), using semi-rational protein engineering. ‘Smart library design’ involved fusing monomers of the homotetrameric R67 DHFR into dimers, to increase the diversity in the resulting mutated enzyme libraries. Activity-based screening revealed a strong bias for maintenance of the native sequence in one protomer with tolerance for high sequence variation in the second. It is plausible that the native protomers procure the observed activity, such that our efforts to modify the enzyme active site may have been only moderately fruitful. The limitations of experimental methods are then addressed by developing tools that facilitate computational mutational hotspot prediction. Developing these techniques is computationally intensive, as proteins are large molecular objects and work in aqueous media, one of the most complex solvents to model. We present the rapid, substrate-specific identification of mutational hotspots using the example of the industrially relevant P450 cytochrome CYP102A1. Applying the adaptive biasing force (ABF) molecular dynamics simulation technique, we confirm the known mutational hotspots for fatty acid hydroxylation and identify a new one. We also predict a catalytic binding pose for the natural substrate, palmitic acid, and apply that knowledge to perform virtual screening for further substrates for this enzyme. We then perform molecular dynamics simulations to address the potential impact of protein dynamics on enzyme catalysis, which is the topic of heated discussions among experts in the field. With the availability of more crystal structures in the Protein Data Bank, it is becoming clear that a single protein structure is not sufficient to elucidate enzyme function. We demonstrate this by analyzing four crystal structures we obtained of a β-lactamase enzyme, among which a striking rearrangement of key active site residues was observed. We performed long molecular dynamics simulations to generate a structural ensemble that suggests that crystal structures do not necessarily reflect the conformation of lowest energy. Finally, we address the need to computationally complement an area where experimentation is not currently possible, namely the prediction of gas migration into enzymes. As an example, the reactivity of P450 cytochrome enzymes depends on the availability of molecular oxygen at the active-site heme. Using the Implicit Ligand Sampling (ILS) molecular dynamics simulation technique, we derive the free energy landscape of small neutral gas molecules to map potential gas channels in cytochrome P450 CYP102A1 and CYP102A5. Comparison of CO, N2 and O2 suggests that those enzymes evolved towards exclusion of the inhibiting CO. In addition, we predict that gas channels are distinct from known substrate channels and therefore can be engineered independently from one another.

Contexte: La maladie de Fabry (MF) se caractérise par l'accumulation de sphingolipides dans de multiples organes dont l'oreillette gauche (OG). La littérature existante ne permet pas d'établir si les fonctions réservoir, conduit et pompe de l'OG étudiées par échocardiographie de suivi des marqueurs acoustiques (speckle-tracking echocardiography, STE) sont affectées dans la MF et si la thérapie de remplacement enzymatique (TRE) permet d'améliorer la fonction de l'OG. Méthodes: Dans cette étude de cohorte rétrospective, la déformation, le taux de déformation et les volumes phasiques de l'OG ont été étudiés chez 50 patients atteints de la MF et comparés à 50 contrôles sains. Résultats: Les trois fonctions phasiques de l'OG étaient altérées. La déformation positive maximale (fonction réservoir) était de 38,9 ± 14,9 % vs. 46,5 ± 10,9 % (p=0,004) et la déformation télédiastolique (fonction pompe) était de 12,6 ± 5,9 % vs. 15,6 ± 5,3 % (p=0,010). Chez 15 patients ayant débuté la TRE pendant l'étude, la majorité des paramètres de fonction de l'OG se sont améliorés après un suivi d'un an (déformation positive maximale de 32,0 ± 13,5 % à 38,0 ± 13,5 %; p=0,006) alors qu'il y a eu une tendance vers une détérioration des paramètres chez 15 patients n'ayant jamais reçu de traitement (déformation positive maximale de 47,3 ± 10,8 % à 41,3 ± 9,3 %; p=0,058). Neuf patients atteints de la MF (21%) ont développé une fibrillation auriculaire ou un accident vasculaire cérébral pendant un suivi de quatre ans. La déformation positive maximale et la déformation protodiastolique étaient plus fortement associés aux événements cliniques que les paramètres cliniques et les paramètres échocardiographiques standards. Conclusions: Les fonctions réservoir, conduit et pompe de l'OG par STE étaient affectées dans la MF. La TRE a permis d'améliorer la fonction de l'OG. Les paramètres de déformation de l'OG étaient associés à la survenue de fibrillation auriculaire et d'accidents vasculaires cérébraux. / Background: Fabry disease (FD) is characterized by the accumulation of sphingolipids in multiple organs including the left atrium (LA). It is uncertain if the LA reservoir, conduit and contractile functions evaluated by speckle-tracking echocardiography are affected in Fabry cardiomyopathy and whether enzyme replacement therapy can improve LA function. Methods: In this retrospective cohort study, LA strain, strain rates and phasic LA volumes were studied in 50 FD patients and compared to 50 healthy controls. Results: All three LA phasic functions were altered. The peak positive strain (reservoir function) was 38.9 ± 14.9 % vs. 46.5 ± 10.9 % (p=0.004) and the late diastolic strain (contractile function) was 12.6 ± 5.9 % vs. 15.6 ± 5.3 % (p=0.010). In 15 patients who started enzyme replacement therapy during the study, most of the LA parameters improved at one-year follow-up (peak positive strain from 32.0 ± 13.5 % to 38.0 ± 13.5 %; p=0.006) whereas there was a trend towards deterioration in 15 patients who never received treatment (peak positive strain from 47.3 ± 10.8 % to 41.3 ± 9.3 %; p=0.058). Nine FD patients (21%) experienced new-onset atrial fibrillation or stroke during four-year follow-up. By univariate analysis, peak positive strain and early diastolic strain demonstrated significant associations with clinical events, surpassing conventional echocardiographic parameters and clinical characteristics. Conclusions: Left atrial reservoir, conduit and contractile functions by speckle-tracking echocardiography were all affected in FD. Enzyme replacement therapy improved LA function. Left atrial strain parameters were associated with atrial fibrillation and stroke.