L'une des voies principales du métabolisme cellulaire est la voie des Pentoses Phosphates (PPP). Cette voie métabolique est composée de deux cascades enzymatiques, une voie oxydative et une voie non oxydative. La voie oxydative de la PPP produit un cofacteur, le NADPH, qui est responsable du processus de détoxification de la cellule par son activité réductrice et un précurseur de diverses biosynthèses comme la lipogenèse. Un dysfonctionnement des trois enzymes qui composent cette étape de la PPP peut engendrer la mort cellulaire. Grâce à une nouvelle technique, la Polarisation Dynamique Nucléaire suivie par Dissolution (D-DNP), qui permet d’obtenir un gain de sensibilité par un facteur > 10 000, la quantification des paramètres cinétique dans les conditions physiologiques in cell est possible.Dans ce travail de thèse, nous utilisons un nouveau modèle de quantification des paramètres cinétiques qui offre la possibilité d’étudier une cascade enzymatique composée de 3 enzymes par D-DNP. Grâce à ces expériences, la sélectivité de la première enzyme de la voie oxydative, la G6PD, pour l’un des deux anomères de glucose-6-phosphate, ainsi que le rôle antioxydant de la deuxième enzyme de la PPP, la 6PGL, ont été observés. Pour réaliser ces études, une méthode de synthèse et de purification des différents substrats de chaque enzyme a été développée. Le tout premier inhibiteur de la 6PGL a été testé. Des études préliminaires réalisées sur des Trypanosoma brucei, parasite responsable de la maladie du sommeil, indiquent que la pénétration du glucose dans les cellules est l'étape cinétiquement limitante pour sa conversion enzymatique. / The Pentose Phosphate Pathway (PPP) is one of the main pathways of cellular metabolism. This metabolic pathway is composed of two enzymatic cascades: one is an oxidative pathway, and the other is non-oxidative. The oxidative branch of PPP produces a cofactor, NADPH, which is responsible for the detoxification process of the cell due to its reducing activity, and is also a precursor of various biosynthesis such as lipogenesis. A dysfunction of one of the three enzymes that make up this step of PPP can lead to cell death. Thanks to a new method, Dissolution Dynamic Nuclear Polarization (D-DNP), which features a sensitivity gain by a factor 10,000 compared to standard liquid-state NMR, the quantification of kinetic parameters under physiological conditions, in cell, becomes possible.In this thesis, we add to the scientific library a new model of quantification of kinetic parameters, and the possibility of studying an enzymatic cascade composed of 3 enzymes by D-DNP measurements. Based on these experiments, the selectivity of the first enzyme in the oxidative pathway, G6PD, for one of the two glucose-6-phosphate anomers, was confirmed. The antioxidant role of the second PPP enzyme, 6PGL, was equally studied. To carry out these studies, a method of synthesis and purification of the different substrates of each enzyme has been developed. The very first inhibitor of 6PGL has also been tested. Preliminary experiments on Trypanosoma brucei, a parasite responsible for sleeping sickness, indicate that glucose penetration inside cells is the limiting kinetic step for its conversion.

Les enzymes sont les catalyseurs de toutes les réactions biochimiques. Leur dérégulation peut être impliquée dans de nombreuses pathologies graves. L’étude de ces réactions est importante pour dépister les anomalies, mieux comprendre le fonctionnement des enzymes et rechercher des modulateurs de leur activité. Le présent travail de thèse présente différents types d’essais enzymatiques basés sur l’électrophorèse capillaire pour étudier la cinétique d’enzymes variées. Le mode pré-capillaire où la réaction enzymatique est effectuée à l’extérieur du capillaire et les essais homogènes en-ligne en mode discontinu où la réaction est réalisée dans le capillaire, sont appliqués. Les méthodes développées sont optimisées pour assurer un mélange optimal des réactifs et une bonne séparation électrophorétique. Les constantes cinétiques et d’inhibition (Vmax, Km et IC50) de la réaction enzymatique sont déterminées et comparées à celles obtenues par les techniques classiques. Pour les essais en-ligne, plusieurs types de mélange (par application d’un champ électrique, par diffusion longitudinale ou diffusion transversale) des créneaux de réactifs sont utilisés selon le système enzymatique étudié. Finalement, jusqu’à quatre réactifs injectés successivement dans le capillaire sont mélangés avec succès. De nombreux essais sont effectués sur des matrices complexes (cellules, extraits de plantes). Le criblage d’inhibiteurs de référence et de synthèse est réalisé sur plusieurs kinases humaines : CDK1/cycline B, CDK5/p25, DYRK1A, GSK3!, PI3K, Akt et mTOR. Les essais développés se sont avérés être simples, rapides, quantitatifs, économes en réactifs et répétables. / Enzymes catalyze all enzymatic reactions. Their deregulation can be involved in several severe diseases. The study of these reactions is important to detect anomalies, to better understand enzyme functioning and to seek modulators of their activity. This thesis presents capillary electrophoresis based enzymatic assays developed to study kinetics of various enzymes. The pre-capillary mode in which the enzymatic reaction occurs outside the capillary and the incapillary plug-plug mode of homogenous assays where the reaction is performed inside the capillary are applied. The methods developed are optimized to ensure optimum reactant mixing and a good electrophoretic separation. The kinetic and inhibition constants (Vmax, Km and IC50) of the enzymatic reaction are determined by these assays and compared to the results obtained using conventional techniques. For in-capillary assays, several mixing types (by application of an electric field, by longitudinal diffusion or transverse diffusion) of the reactant plugs are used depending on the enzymatic system studied. Finally, up to four reactants injected successively in the capillary are successfully mixed. Many assays are performed on complex matrices (cells, plant extracts). Screening of referenced and synthesized inhibitors on several human kinases: CDK1/cyclin B, CDK5/p25, DYRK1A, GSK3!, PI3K, Akt and mTOR are performed. Developed assays proved to be quantitative, simple, economic, fast and robust.

La pomme de terre produit des glycoalcaloïdes comme la plupart des Solanacées. Deux composés, en particulier, l’α-solanine et l’α-chaconine, sont produits en plus grande quantité lorsque le tubercule est exposé à la lumière et subit des dégradations. Ces molécules sont toxiques et peuvent représenter un danger pour le consommateur et des nuisances pour l’environnement. Dans le cadre de cette thèse, les teneurs en α-solanine et α-chaconine dans la chaire de pomme de terre verdie, en germination ou en décomposition retrouvées sur les marchés d’Abidjan (Côte d'Ivoire) ont été analysées. Les résultats ont montré que la chaire de ces pommes de terre contient des quantités élevées de ces deux composés, dépassant 2 à 5 fois la limite recommandée. Pour des raisons de sécurité sanitaire, ces pommes de terre doivent être proscrites de l’alimentation humaine. En revanche, la teneur élevée en glycoalcaloïdes dans ces pommes de terre représente une source de solanidine, un précurseur pour la synthèse d'hormones et de composés pharmacologiquement actifs, qui mérite d’être exploitée. Dans cet objectif, nous avons développé une méthode chimio-enzymatique simple, comprenant un traitement acide partiel suivi d’une hydrolyse enzymatique par la β-glycosidase de la blatte Periplaneta americana dont le gène a été isolé à partir d’une librairie génomique de cDNA afin de détoxifier ces composés et produire la solanidine. / Potato produce glycoalkaloids as most plants of Solanaceae family. The principal glycoalkaloids, α-chaconine and α-solanine are produced in greater quantities when potato tubers are exposed to light and are subject to deteriorations. These compounds are toxic and can represent a real danger for the consumer and the environment where they are discharged during their degradation. In this work, the estimation of glycoalkaloids in the flesh of different types of decayed potatoes usually found in different market places of Abidjan (Ivory Coast) was evaluated. The results showed that turned green and also sprouting or rotting potato flesh contain high amounts of toxic solanine and chaconine, exceeding by 2 to 5-fold the recommended limit. For safety consideration, these decayed potatoes should be systematically set aside. The accumulation of α-chaconine and solanine in potatoes can be seen as an attractive source of solanidine that is an important precursor for hormone synthesis and some pharmacologically active compounds. To this end, we proposed herein a simple chemo-enzymatic protocol comprising a partial acidic hydrolysis followed by an enzymatic treatment with the β-glycosidase from Periplaneta americana whose gene was isolated from a cDNA genomic library in order to detoxify these compounds and produce solanidine.

La bioconversion en méthane de biomasses lignocellulosiques est l’une des alternatives les plus prometteuses pour la production de méthane issu de la digestion anaérobie. Toutefois, les biomasses lignocellulosiques présentent des caractéristiques bio-physico-chimiques très variables en raison leur composition biochimique et de l’organisation structurale très diverses. Par ailleurs, leur faible biodégradabilité en conditions anaérobie nécessite de les prétraiter avant méthanisation pour optimiser la production de méthane. Ce travail vise à évaluer l’influence des caractéristiques d’une large gamme de substrats lignocellulosiques sur leur biodégradabilité anaérobie et les corrélations entre leurs caractéristiques bio-physico-chimiques et le potentiel biométhanogène, et d’étudier les effets du prétraitement fongique en présence de Ceriporiopsis subvermispora sur le potentiel biométhanogène de biomasses lignocellulosiques sélectionnées dans la présente étude et de caractériser les changements de leurs caractéristiques après le prétraitement fongique. La caractérisation de 36 biomasses lignocellulosiques représentatives d’une large gamme de gisements potentiellement mobilisables a permis de mettre en évidence les corrélations linéaires entre le potentiel biométhanogène des biomasses et certaines de leur caractéristiques bio-physico-chimiques, dont la teneur en lignine et la demande biochimique en oxygène. Les biomasses sylvicoles et agricoles ont montré des caractéristiques distinctes de la biodégradabilité aérobie et anaérobie. Les résultats de prétraitement fongique sur les 5 biomasses ont permis de mettre en évidence que le champignon de pourriture blanche Ceriporiopsis subvermispora réagit distinctement selon la biomasse prétraitée. Pour certaines biomasses, le prétraitement fongique conduit à augmenter significativement la production de méthane et la vitesse de bioconversion en méthane. Cette espèce présente la capacité de dégrader sélectivement la lignine sur certaines biomasses et, sur d’autres, celle de dégrader de manière non-sélective des polysaccharides et des lignines. De plus, pour les deux souches de Ceriporiopsis subvermispora testées, des métabolismes différents ont été mis en évidence sur une même biomasse. Les résultats de compositions et ceux de l’analyse structurale des biomasses (initiales, autoclavées, contrôles, et prétraitées par Ceriporiopsis subvermispora) ont montré que leur structure peut être modifiée sans toutefois observer une transformation significative de leur composition biochimique. / Bioconversion to methane lignocellulosic biomass is one of the most promising alternatives for the production of methane from anaerobic digestion. However, lignocellulosic biomass has various bio-physicochemical characteristics due to their biochemical composition and diverse structural organization. Moreover, their low biodegradability in anaerobic condition requires pretreatment before methanation to optimize methane production. This work aims to evaluate the influence of the characteristics of a wide range of lignocellulosic substrates on their anaerobic biodegradability and correlations between their bio-physical-chemical characteristics and biomethane potential, and study the effects of fungal pretreatment in the presence of Ceriporiopsis subvermispora on the biogas potential of lignocellulosic biomass selected in this study and characterize their changes of their characteristics before and after the fungal pretreatment. The characterization of 36 representative lignocellulosic biomass of a wide range of potentially mobilized deposits allowed to highlight the linear correlations between biomethane potential of biomass and some of their bio-physical-chemical characteristics, of which the lignin content and biochemical oxygen demand. The forest and agricultural biomass exhibited distinct characteristics of the aerobic and anaerobic biodegradability. The results of fungal pretreatment of the 5 biomass indicated that the white rot fungus Ceriporiopsis subvermispora reacts distinctly depending on the pretreated biomass. For some biomass, fungal pretreatment leads to significant increase of methane production and the bioconversion rate of methane. This species presents the ability to selectively degrade lignin on some biomasses, in others, the ability to non-selectively degrade polysaccharides and lignins. In addition, for both strains of Ceriporiopsis subvermispora tested, different metabolisms were highlighted on the same biomass. The results of compositions and those of the structural analysis of biomass (initials, autoclaved, controls, and pretreated with Ceriporiopsis subvermispora) showed that their structure can be modified without observing a significant transformation of their biochemical composition.

Les vasières intertidales sont le siège d’une forte production primaire sous la forme d’un biofilmmicrophytobenthique qui se développe en surface à marée basse. Ce biofilm se compose principalement de diatomées et de bactéries hétérotrophes. Ces deux composantes sécrètent des substances polymériques extracellulaires (EPS) qui jouent différents rôles dans le biofilm. Le travail présenté s’est basé sur différentes échelles d’observation (in situ à 2 saisons, mésocosme en laboratoire, et échelle fine du biofilm en microscopie confocale) et a permis de mettre en évidence les interactions des diatomées et des bactéries à différents moments de la marée et du nycthémère. L’utilisation d’une nouvelle méthode d’extraction des EPS a permis d’éclaircir leur rôle en évitant les contaminations par les substances internes provoquées par les méthodes classiques. Les EPS colloïdales particulièrement riches en glucose s’associent au déplacement des diatomées, notamment lors d’un stress (sursalure, carence en nutriments) et sont préférentiellement consommées par les bactéries, après leur dégradation par les enzymes ou leur hydrolyse dans l’eau interstitielle. Les EPS liées au frustule, et plus particulièrement les sucres, inhiberaient le développement bactérien à proximité de la cellule algale. Elles sont surtout sécrétées lors de la mise en place du biofilm et pour protéger la cellule quand les conditions sont osmotiquement défavorables et leur richesse en protéine leur confère un potentiel intéressant pour les bactéries qui peuvent les utiliser comme substrat azoté en cas de carence. D’autres substances ont été plutôt sécrétées parles bactéries telles que les N-acétylglucosamines et les protéines colloïdales de bas poids moléculaire,certainement des enzymes bactériennes, ainsi que le glucose qui semble être associé au EPS colloïdaux des diatomées mais aussi aux EPS bactériens selon l’analyse en microscopie confocale en utilisant des lectines comme marqueurs d’EPS. / Microphytobenthic biofilms that develop at the intertidal mudflat surface are responsible of a substantialprimary production. These biofilms are composed of diatoms and heterotrophic bacteria, both excretingextracellular polymeric substances (EPS) that have various functions into the biofilm. The present thesis is basedon different observation scales that have highlighted the complex interactions between diatoms and bacteria fordifferent moment of the biofilm development (in situ at 2 seasons, in laboratory mesocosm and at the scale of thebiofilm at confocal microscopy). Furthermore, a new extraction method that avoids contamination with internalsubstances was used and provides new insights about the role of EPS. Colloidal EPS are excreted during thediatom migrations, notably in case of environmental stress (nutrient depletion, high salinity). They arepreferentially consumed by bacteria, after hydrolysis or enzymatic cleavage. Bound EPS are associated to abacterial inhibition, especially sugars. These EPS are mainly excreted during biofilm formation and also in caseof osmotic stress, if diatoms cannot migrate toward favorable slices. Some substances are associated to bacterialdevelopment, such as N-acetylglucosamine, low molecular weight proteins that probably consist of bacterialenzymes and also glucose that seems to be associated to colloidal EPS secreted by diatoms as well as bacterialEPS, when analyzing the biofilm with confocal microscopy by using lectins as EPS biomarkers.

Les jasmonates de méthyle sont des oxylipines asymétriques impliquées dans les mécanismes de défense, de développement et de régulation des organismes photosynthétiques terrestres ou marins face à des stress biotiques et abiotiques. Parmi les quatre stéréoisomères, seuls l’épi-jasmonate et l’ent-épi-jasmonate de méthyle possèdent de bonnes propriétés organoleptiques mais aussi une forte activité phytohormonale permettant l’élicitation de métabolites secondaires bioactifs. En ciblant spécifiquement une hexokinase mitochondriale régulant le métabolisme des cellules cancéreuses, les jasmonates de méthyle constituent d’excellents candidats pour de nouveaux agents thérapeutiques. Dans la recherche constante de nouvelles molécules thérapeutiques issues du milieu naturel, notre laboratoire s’est donc focalisé sur la synthèse énantiosélective de l’épi-jasmonate et l’ent-épi-jasmonate de méthyle, au départ de diols bicycliques homochiraux monoprotégés dérivant du cyclooct-1,5-diène.Afin d’obtenir ces diols bicycliques énantiopurs, une stratégie innovante a consisté en l’étude de la réaction d’électrocyclisation du méso-époxyde dérivé du cyclooct-1,5-diène assistée par des ligands chiraux métallés diversement fonctionnalisés, les catalyseurs de Jacobsen. En mettant à profit notre savoir-faire sur les désymétrisations enzymatiques, une stratégie parallèle optant pour la résolution énantiosélective de diols homochiraux monocycliques, ou de diols bicycliques C2-symétriques nous a permis d’accéder à des silanyloxyindèn-5-ones chirales, précurseurs clé des cis-jasmonates de méthyle énantiopurs. Enfin, la synthèse racémique de deux jasmonoïdes clé, la (±)--jasmolactone, puis le (±)-épi-jasmonate de méthyle a été validée en 15 étapes à partir du cyclooct-1,5-diène. / Methyl jasmonates are asymmetric oxylipins involved in defensive, developmental and regulative mechanisms of terrestrial and marine photosynthetic organisms in response to biotic and abiotic challenges. Among the four stereoisomers, only methyl epi-jasmonate and ent-epi-jasmonate show good organoleptic properties but also phytohormonal activity allowing the elicitation of bioactive secondary metabolites. Because they specifically target a mitochondrial hexokinase regulating the metabolism of cancer cells, methyl jasmonates have become excellent candidates as new therapeutic agents. With a constant attention on new therapeutic agents derived from the natural environment, our laboratory has focused on the enantioselective synthesis of methyl epi-jasmonate and ent-epi-jasmonate using monoprotected homochiral diols derived from cyclooct-1,5-diene.In order to obtain these chiral bicyclic diols, an innovative strategy has involved the study of the chemo-stereoselective electrocyclization of the cyclooct-1,5-diene-derived meso-epoxide assisted by chiral metallated ligands known as Jacobsen’s catalysts. Taking advantage of our knowledge of enzymatic desymmetrization, a second strategy opting for the enantioselective resolution of monocyclic homochiral diols or C2-symmetric bicyclic diols led access to chiral silanyloxyinden-5-ones, key precursors to chiral methyl cis-jasmonates. Meanwhile, the racemic synthesis of (±)--jasmolactone and methyl (±)-epi-jasmonate was validated in 15 steps starting from cyclooct-1,5-diene.

Les isoprénoïdes constituent une vaste famille de constituants cellulaires synthétisés chez la plupart des organismes vivants. Chez les plantes, la biosynthèse des isoprénoïdes est réalisée dans trois compartiments : le plaste, le cytoplasme-réticulum endoplasmique et la mitochondrie. Nous avons orienté nos travaux vers l'étude moléculaire et fonctionnelle du rôle de 2 types d'isoprénoïdes cytosoliques (dolichols et stérols) au cours du développement chez les plantes. Pour mener à bien notre étude, nous avons créé des lignées mutantes « knockdown » via la technique de !'ARN interférence (RNAi) et caractérisé des mutant~d'insertion T-DNAs « knockout » pour les gènes d'intérêt chez Arabidopsis.Dans le premier chapitre, nous montrons que les isoprénoïdes sont impliqués de façon indirecte dans la Nglycosylation de protéines via le Dolichol-P-Mannose (Dol-P-Man) dont la synthèse est catalysée par la dolichol phosphate mannose synthase (DPMS). Nous démontrons que chez les plantes, la DPMS est organisée en un complexe hétéromérique localisé dans le réticulum endoplasmique (RE) qui comprend 3 sous unités DPMS1, DPMS2 et DPMS3 codées par 3 gènes. Seule DPMS1 possède une activité catalytique. Les lignées DPMS 1-RNAi et dpms 1 présentent une hypo N-glycosylation des protéines, une forte chlorose et une inhibition de la croissance racinaire. Ces traits sont associés à une hypersensibilité à l'ammonium et à une induction de la« unfolded protein response »au niveau du RE. L'ensemble de ces données montrent que les gènes DPMS jouent un rôle important dans la N-glycosylation des protéines et le développement des plantes.Dans le deuxième chapitre, nous avons porté notre attention sur le rôle des intermédiaires de biosynthèse des stérols («SBls») dans la régulation du développement des plantes en choisissant comme cible ERG28,une protéine impliquée dans le complexe enzymatique de déméthylation en C-4 des stérols « SC4DM ». Nous montrons que ERG28 est localisée dans le RE et assemble 3 enzymes du complexe« SC4DM », la«sterol 4a-methyl oxidase ». la « 4a-carboxysterol-C3-dehydrogenase/C4-decarboxylase » et la « sterone ketoreductase ». Nous démontrons que la perte de fonction de ERG28 dans les lignées ERG28-RNAi eterg28 se traduit par des phénotypes caractéristiques d'une inhibition du transport polaire de l'auxine« PAT»(différenciation d'inflorescence de type «PIN», perte de dominance apicale, fusion des feuilles et inhibition du développement racinaire ... ). Ces phénotypes sont corrélés à l'accumulation de méthylène-cycloartanol-4-carboxy-4-méthyl (MCCM), un« SBI »qui inhibe de façon spécifique le« PAT». Ces données mettent en évidence un nouveau type d'interaction entre l'auxine et les stérols. / Isoprenoids represent important cell constituents synthesized in many living organisms. ln plants, isoprenoid biogenesis occurs in three compartments : plastids, the endoplasmic reticulum-cytosol and mitochondrie.We focused on the molecular and functional studies of the role of Iwo cytosolic isoprenoids ( dolichol andsterol) in the development of plants. The key Io our strategy is the targeted silencing of specific Arabidopsis genes using the RNAi technology (knockdown) and the identification of T-DNA insertion mutants (knockout). ln the first chapter, we show that isoprenoids are involved indirectly in protein N-glycosylation via Dolichol P-Mannose derived from dolichol phosphate mannose synthase (DPMS). We demonstrate that plant DPMSis organized as a heteromeric enzyme complex localized in the endoplasmic reticulum (ER) and consists of DPMS1 acting as the catalytic core and two interacting subunits DPMS2 and DPMS3. The DPMS1-RNAiand dpms1 lines display an altered N-glycosylation pattern and exhibit extensive chlorosis, strong inhibition of root growth and hypersensitivity to ammonium. These phenotypic defects are associated with an «unfolded protein response» in the ER. These data demonstrate that the DPMS genes are essential for the protein N-glycome and plant development. ln the second chapter, we focused on the potentiel roles of sterol biosynthetic intermediates (SBls) in plant development using ERG28 protein, a component of the sterol C-4 demethylation (SC4DM) complex, as a target. We demonstrate that ERG28 is localized in ER and tethers 3 enzymes, sterol 4alpha-methyl oxidase, 4alpha carboxysterol-C3-dehydrogenase/C4- decarboxylase and sterone ketoreductase. We show that the Arabidopsis ERG28-RNAi and erg28 lines develop the hallmarks of altered polar auxin transport (PAT) including the differentiation of pin-like inflorescences, the loss of apical dominance, leaf fusion and inhibition root growth. The observed phenotypes correlate with the accumulation of methylene-cycloartanol-4-carboxy-4-methyl, a cryptic SBI. Our data provide a new level of interaction between sterols and auxin.

Cette thèse s’est articulée autour de l’élaboration de revêtements surfaciques à base de polymères et de composants naturels. Dans un premier projet, des surfaces mécano-sensibles pour des applications de libération de molécules bioactives ont été élaborées. Des films de multicouches polyélectrolytes constitués d'une strate « réservoir » permettant le chargement d’une molécule bioactive, le paclitaxel, et d'une strate « barrière » mécano-sensible recouvrant ce réservoir et confinant le paclitaxel ont été élaborés. Lors de la mise sous étirement du film, la barrière est rendue perméable vis-à-vis d'une enzyme présente dans le surnageant. Cette enzyme induit ensuite la dégradation enzymatique du « réservoir » et la libération du paclitaxel. Dans un second projet, des substrats cellulaires nourriciers ont été réalisés à partir de films minces de gélatine réticulés mimant la matrice extracellulaire. Ces films peuvent être chargés: 1) en facteurs de croissance, ce qui permet de s'affranchir ensuite de l'ajout de ces molécules dans le milieu de culture; 2) en nanoparticules afin de moduler les propriétés mécaniques des films; 3) en agents antimicrobiens pour assurer une stérilité de la culture cellulaire. Ainsi, ces substrats aux propriétés biochimiques et biophysiques modulables permettent un contrôle précis du microenvironnement cellulaire. / This PhD work is about designing surface coatings with polymers and natural compounds. In the first project, mechanosensitive surfaces have been developed for drug release applications. Polyelectrolyte multilayer films have been designed with i) one reservoir strata for the loading of a bioactive molecule, paclitaxel, and ii) one mechanosensitive barrier strata on top of the reservoir to confine the molecule. When a mechanical stretch is applied on the structure, the barrier becomes permeable and enables the diffusion of an enzyme within the film.This enzyme degrades the reservoir strata and triggers the release of paclitaxel. In a second project, ECM-mimicking feeder substrate has been developed with crosslinked gelatin thin films. These films can be loaded with: i) growth factors to prevent any further addition of these compounds in the culture medium; ii) nanoparticles to modulate mechanical properties of the substrate; iii) antimicrobial agents to ensure sterility during cell culture experiments. Finally, these substrates have some biochemical and biophysical tunable properties that enable the precise control of cell microenvironment.

Dans ce travail, le comportement des protéines de pois vis-à-vis de la gélification enzymatique par la transglutaminase microbienne (MTGase) a été évalué à l’état natif et après dénaturation (réduction chimique ou thermo-dénaturation). L’application finale concernait la formation de microparticules protéiques permettant d’encapsuler la riboflavine, choisie comme molécule active hydrophile modèle. Le procédé d’extraction des fractions protéiques de pois a été optimisé de manière à affecter le moins possible la structure des protéines et de récupérer des fractions natives riches en albumines (Alb) et en globulines (Glob), ou leur mélange. La mise en place des méthodes de suivi de la réaction enzymatique a permis de mettre en évidence leur complémentarité ainsi que leurs limites. Deux nouvelles méthodes de suivi de la réticulation enzymatique ont été développées. L’une basé sur la RMN permet la détermination simultanée de la quantité du fragment glutamine-lysine, produit de la réaction enzymatique, et le degré de réticulation ; l’autre méthode, basée sur les techniques de mesure de taille (SDS-PAGE et DLS), permet de visualiser les liaisons intramoléculaires. L’étude du traitement enzymatique appliqué aux fractions Alb et Glob de pois à l’état natif et dénaturé, ainsi qu’en mélange natif, a montré que la réaction enzymatique est fortement liée à la structure et à la conformation des protéines. Contrairement à la fraction Alb, la fraction Glob constitue un bon substrat pour la MTGase et la réticulation met en jeu des sous-unités constitutives des globulines différentes pour chaque condition de traitement. Néanmoins, la fraction Alb peut être utilisée en tant que booster de réaction enzymatique ce qui peut faire l’objet d’une voie innovante d’amélioration de la susceptibilité des protéines vis-à-vis de la MTGase. Le mécanisme semble basé sur un phénomène d’affinité sélective. Les bonnes propriétés mécaniques et de capacité de rétention d’eau du gel de la fraction protéique de pois totale ont été exploitées pour produire des microparticules à partir de la dispersion de la solution protéique sous forme d’émulsion suivie d’une gélification enzymatique par la MTGase. Les microparticules ont été pratiquement insolubles dans les milieux gastro-intestinaux en absence d’enzymes et lentement dégradable en présence d’enzymes. La libération de la riboflavine est gouvernée par un phénomène de diffusion en absence d’enzyme et de dégradation de support en présence d’enzymes selon des cinétiques compatibles avec des applications nutraceutiques. / In this work, pea proteins behavior toward enzymatic gelation by microbial transglutaminase (MTGase) was studied at native state and after denaturation (chemical reduction or thermal denaturation). The final application was the formation of protein microparticules to encapsulate riboflavin, chosen as hydrophilic active molecule model. The extraction process of the pea protein fractions has been optimized in such a way to minimize as possible protein denaturation and recover native fractions rich in albumin (Alb) and globulin (Glob) or a mixture of both.The setting up of the enzymatic reaction monitoring methods has brought out their complementarity as well as their limits. Two new monitoring methods of enzymatic cross-linking reaction have been developed. The first one, based on the NMR, allows to the simultaneous determination of the glutamine-lysine isopeptide bond, product of the enzymatic reaction, and the degree of crosslinking; the second method, based on size measuring techniques (SDS-PAGE and DLS), permit to view the intramolecular links. The study of enzymatic treatment applied to pea Alb and Glob at the native and denatured states, as well as thier native mixture showed that the enzymatic reaction is strongly related to the structure and conformation of proteins. Unlike Alb, the Glob fraction is a good substrate to transglutaminase and crosslinking reaction involves different subunits constituting globulins for each treatment condition. However, the Alb can be used as a booster of enzyme reaction which can be an innovative way for improving the proteins susceptibility toward transglutaminase treatment. The mechanism seems to be based on a selective affinity phenomenon. The good mechanical properties and water holding capacity of total pea proteins gel have been exploited to produce microparticles from a water-in-oil emulsion followed by enzymatic gelation. The produced microparticles were practically insoluble in gastrointestinal media in the absence of enzymes and slowly degradable in the presence of enzymes. The release mechanisms of riboflavin in digestive environments are governed by a diffusion phenomenon in the absence of enzymes and by support degradation phenomenon in the presence of enzymes according to kinetics compatible with nutraceutical applications.

Ces travaux de thèse pluridisciplinaires à l‘interface entre biocatalyse et nanomatériaux visent la conception de matériaux biohybrides innovants par assemblage dans des conditions douces de matériaux inorganiques de type hydroxydes doubles lamellaires (HDL) avec des enzymes. La première partie de ce mémoire est consacrée à la caractérisation des interactions physico-chimiques entre les HDL et la fructose-6-phosphate aldolase (FSA) catalysant la formation stéréosélective de liaisons C-C pour conduire à des polyols chiraux. Les structures lamellaires HDL permettent un confinement efficace de systèmes enzymatiques grâce à leur structure bidimensionnelle poreuse, leurs propriétés physico-chimiques favorables à l‘échange ionique et leur biocompatibilité. Différentes stratégies d‘immobilisation de la FSA dans des matrices d‘HDL ont été explorées, le taux d‘immobilisation et l‘activité biocatalytique étant fortement dépendant de la méthode d‘assemblage et de la nature des phases HDL. Le taux d‘immobilisation de l‘enzyme obtenu par coprécipitaton est supérieur à celui obtenu par adsorption. Dans une deuxième partie, un bioréacteur a été élaboré par un assemblage hiérarchisé constitué de la FSA, de nanoplaquettes d‘HDL et de billes de polysaccharide, ce dernier jouant le rôle de matrice macrostructurante. De façon notable, le taux d‘encapsulation de l‘enzyme dans la matrice macroscopique est amélioré lorsque le biocatalyseur est pré-encapsulé dans les nanoplaquettes d‘HDL. Ceci est attribué aux interactions électrostatiques favorables entre les chaînes de polysaccharide et les HDL, facilitant une charge de matière plus importante. L‘efficacité catalytique du bioréacteur obtenu et sa recyclabilité ont été démontrés. Dans la troisième partie de cette thèse, nous décrivons pour la première fois la conception de bionanoréacteurs enzymes@HDL par co-immobilisation de systèmes bi- ou tétra-enzymatiques dans les HDL permettant de réaliser des cascades multienzymatiques biomimétiques. L‘immobilisation des différentes enzymes prises séparément a d‘abord été optimisée afin de déterminer les conditions de co-immobilisation et de réaliser les cascades biocatalytiques en phase hétérogène. Ces bionanoréacteurs, dont nous avons démontré la recyclabilité, ont été appliqués pour la synthèse de sucres phosphorylés de série D. Enfin, une cascade multienzymatique a été conçue de novo en solution aqueuse et optimisée pour synthétiser différents sucres phosphorylés rares de série L. / This multidisciplinary thesis at the biocatalysis/nanomaterial interface perfectly aims at designing innovative biohybrid materials by the assembly of inorganic materials the Layered Double Hydroxides (LDH) with enzymes under mild conditions. The first part of this thesis is devoted to the characterization of physico-chemical interactions between the LDH and the fructose-6-phosphate aldolase (FSA) catalyzing the stereoselective C-C bond formation to provide chiral polyols. LDH structures allow the effective confinement of enzymatic systems thanks to their opened two-dimensional structure as well as their chemical surface properties at the nanoscale and their biocompatibility. The FSA immobilization in different LDH matrices by different methods was studied. Biocatalytic activity is highly dependent on the method of assembling, modulating the final amount of FSA. The retaining activity rate of co-precipitated material was higher than that obtained for the adsorbed enzyme. In a second part, a bionanoreactor was developed based on a hierarchized assembly of FSA, LDH nanoplatelets and polysaccharide beads acting as a macrostructuring matrices. Significantly, the encapsulated enzyme rate in the beads was improved when the biocatalyst was pre-encapsulated in LDH nanoplatelets. This is attributed to favorable electrostatic interactions between the polysaccharide chains and LDH, facilitating a higher catalyst loading. The catalytic efficiency of the prepared bioreactor and its recyclability were demonstrated. In the third part of this thesis, we describe for the first time the design of bionanoreactors ―enzymes@LDH‖ by co-immobilisation of two and four enzymes in LDH allowing biomimetic multienzymatic cascades. We first studied the immobilization of the different enzymes taken separately. Then we worked on the optimization of the biocatalytic cascades in heterogeneous phase. These bionanoreactors, for which we have shown the recyclability, have been applied to the synthesis of D-series phosphorylated sugars. Finally, a multienzymatic cascade was de novo designed in aqueous homogeneous solution. It was optimized for the synthesis of rare L-phosphorylated sugars.