Les mycotoxines sont des métabolites secondaires de moisissures contaminant de façon naturelle de nombreuses denrées alimentaires, notamment les céréales. Le déoxynivalénol (DON), produit par Fusarium sp., est la mycotoxine la plus répandue dans le monde. Du fait de sa grande stabilité chimique, le DON est difficile à éliminer, et se retrouve dans les céréales et les produits finis ou il induit des effets toxiques pour l'homme et l'animal. De nouvelles stratégies de lutte sont mises en places, telle la transformation biologique utilisant des bactéries ou des plantes. En effet certaines bactéries possèdent des enzymes capables de transformer le DON en de nouveaux composés, le déepoxy-déoxynivalénol (DOM-1) et le 3-épi-déoxynivalénol (3-epi-DON). De plus, certaines plantes sont naturellement capables de transformer le DON dans le but de l'éliminer et de le détoxifier, formant ainsi le deoxynivalénol-3-ß-D-glucoside (D3G). L'objectif de cette thèse était d'évaluer la toxicité de ces dérivés du DON au niveau de l'intestin et du système immunitaire par le biais d'analyses in silico, in vitro, ex vivo et in vivo. Les tests de toxicité in vitro sur la lignée humaine intestinale cellulaire Caco-2 montrent que le DOM-1, le 3-epi-DON et le D3G n'étaient pas cytotoxiques, ils ne modifiaient ni la viabilité, ni la fonction de barrière des cellules, mesurée par la résistance électrique transépithéliale. Les tests de toxicité ex vivo sur des explants jéjunum porcin ont montré que le DOM-1, le 3-epi-DON ou le D3G n'induisaient pas de modifications histomorphologiques. En revanche, les explants exposés au DON montraient des lésions morphologiques et une régulation positive de l'expression des cytokines pro-inflammatoires. L'impact de ces trois dérivés a été également analysé sur l'expression de l'ensemble des gènes du tissu, avec une analyse microarray. Ceci a montré que ces dérivés du DON n'induisaient aucun changement dans l'expression des gènes par rapport au groupe contrôle. Le DON quand a lui exprimait différentiellement 747 sondes, correspondantes à 333 gènes impliqués dans l'immunité, la réponse inflammatoire, le stress oxydatif, la mort cellulaire, le transport moléculaire et la fonction mitochondriale. L'analyse in silico a montré que le D3G, contrairement au DON était incapable de se lier au site-A du ribosome, principale cible de la toxicité pour le DON. Les deux dérivés microbiens eux, étaient capables de se fixer au site-A au sein du ribosome, mais contrairement au DON ils ne formaient que deux liaisons hydrogènes au lieu de trois. De plus, ces trois dérivés n'induisaient pas de stress ribotoxique, d'activation des MAPKs (mitogen-activated protein kinases), et de réponse pro-inflammatoire. Une étude complémentaire a été menée in vivo pour évaluer la toxicité du DOM-1 chez le porc (gavage pendant 21 jours avec .0.14mg / kg de poids vif). Les résultats ont montré que le DOM-1, contrairement au DON n'induisait pas les effets toxiques du DON au niveau des paramètres zootechniques (pas de vomissements, aucune diminution de la consommation alimentaire ou de perte de poids), sur l'intestin et le foie (pas de dommages tissulaires), ou sur la réponse immunitaire (pas de réponse inflammatoire induite). En conclusion, nos résultats montrent l'efficacité de ces transformations enzymatiques. La déepoxydation et l'épimérisation bactérienne, ainsi que la glycosylation par les plantes permettent de sensiblement diminuer la toxicité du DON, passant par une absence de toxicité sur le ribosome avec une absence d'activation des MAPKs et de réponses inflammatoires. Dans ce contexte de contamination par les mycotoxines, ces méthodes de luttes alternatives semblent être des approches prometteuses. / The Fusarium sp. mycotoxin deoxynivalenol (DON) is one of the most frequently widespread mycotoxin worldwide. Due to its high structural stability, the elimination of DON, once present in cereals or feed materials, becomes difficult. Thereby, it is present in many cereals and final feed products, inducing several toxic effects on human and animals, and causing big economic losses. New strategies of to fight against mycotoxins were developed, as biological transformation, either by the use of bacteria or plants. Indeed, some microorganisms are able to transform DON in new products, by enzymatic reaction, forming the deepoxy-deoxynivalenol (DOM-1) and the 3-epi-deoxynivalenol (3-epi-DON). Moreover, some plants naturally own the capacity to glycosylate DON in the aim to detoxify it, forming the deoxynivalenol-3-ß-D-glucoside (D3G). The aim of this thesis was to assess the toxicity of these DON derivatives, on the intestine and immune response, using several approaches such as in silico, in vitro, ex vivo and in vivo models. On the human intestinal Caco-2 cell line, DOM-1, 3-epi-DON and D3G were not cytotoxic; they did not alter its viability and barrier function, as measured by the trans epithelial electrical resistance. The expression profile of DOM-1, 3-epi-DON and D3G-treated jejunal explants was similar to that of controls and these explants did not show any histomorphology alteration. On the other hand, the treatment of intestinal explants with DON, induced morphological lesions and upregulated the expression of proinflammatory cytokines. The impact of these three derivatives was also studied on intestinal explants with a pan-genomic transcriptomic analysis. Results show that the derivatives of DON did not induce any change on the gene expression in comparison to the control-treated explants. In contrary, DON-treated explants differentially expressed 747 probes, representing 323 genes involved in immune and inflammatory responses, oxidative stress, cell death, molecular transport and mitochondrial function. In silico analysis revealed that D3G, opposing to DON, was unable to bind to the A site of the ribosome, which is the main target for DON toxicity. Both DOM-1 and 3-epi-DON were able to fit into the pockets of the A site of the ribosome but only by forming two hydrogen bonds, while in this position, DON forms three hydrogen bonds. Moreover, the three derivatives do not elicit a ribotoxic stress, MAPKinase activation, and inflammatory response. Then, an in vivo study was carried out to assess the toxicity of DOM-1 on pig (feed forced during 21 days at 0.14 mg/Kg BW). The results showed that DOM-1 does not have as much toxic effects as DON on zootechnical parameters (no emesis induced, no decrease of food consumption or weight loss observed), on intestine and liver (no tissues damages), or on the immune response (no inflammatory response induced). Our data demonstrate that bacterial de-epoxidation or epimerization of deepoxy-DON modified its interaction with the ribosome, leading to an absence of MAPKinase activation and toxicity; and that the glycosylation of DON suppresses its ability to bind to the ribosome and decreases its intestinal toxicity. The mycotoxin deoxynivalenol (DON) remains an important challenge in many regions in the world. Thus, these biological detoxifications of DON seem to represent a new promising approach helping manage the problem of its contamination.

Les flavan-3-ols et leurs polymères, les proanthocyanidines, appartiennent à une famille de flavonoïdes appelée les tannins condensés. Ces composés polyphénoliques jouent un rôle essentiel dans la qualité phytosanitaire des baies de raisin ainsi que dans les propriétés organoleptiques du vin (flaveur, astringence et couleur). La connaissance des mécanismes qui régissent leur biosynthèse est donc primordiale afin de mieux comprendre la mise en place de la typicité d’un vin. Ce mémoire est consacré à l’étude de l’une des enzymes responsables de la synthèse des flavan-3-ols : la leucoanthocyanidine réductase 1 de Vitis vinifera (VvLAR1). Dans une première partie, nous décrivons les conditions d’expression, de purification et de stabilité de l’enzyme recombinante. L’activité enzymatique est démontrée et la configuration 2R,3S des produits réactionnels caractérisée. La seconde partie de ce manuscrit décrit l’étude structurale de l’enzyme. Des monocristaux d’apoenzyme, de complexes binaires (VvLAR1 / NADPH) et d’un complexe ternaire (VvLAR1 / NADPH / (+)-catéchine) ont été obtenus. Les différentes structures permettent de décrire les modifications structurales associées à la fixation du coenzyme puis du produit. Un mécanisme catalytique basé sur les interactions intermoléculaires observées au sein du complexe ternaire est proposé. La troisième partie de ce mémoire est consacrée à la recherche de conditions expérimentales permettant la production et la stabilisation de la leucocyanidine en solution, un des substrats naturels de l’enzyme. Les résultats obtenus permettent une première approche de l’étude des propriétés cinétiques de la VvLAR1. / Flavan-3-ols and their polymerisation products, proanthocyanidins, belong to a flavonoid family named condensed tannins. These polyphenolic compounds play a major role in the protection of grape berries to intruders and in the organoleptic properties of wine (flavour, astringency and colour). Knowledge of the mechanisms which govern their biosynthesis is thus essential to better understand wine typical composition. The present thesis is devoted to the investigation of one of the two enzymes which catalyse the flavan-3-ols formation: leucoanthocyanidin reductase 1 from Vitis vinifera (VvLAR1). In the first part of the manuscript, we describe the expression, purification and stability conditions of the recombinant enzyme. The enzyme activity is demonstrated and the reaction product 2R,3S configuration is characterised. The second part of this report describes the structural studies of the enzyme. Monocrystals of the apoenzyme and of binaries (VvLAR1 / NADPH) and a ternary (VvLAR1 / NADPH / (+)-catechin) complexes were obtained. These different structures allow the description of the structural changes associated with the coenzyme and then the substrate binding. A catalytic mechanism, based on the intermolecular interactions within the ternary complex, is proposed. The last part of the work is devoted to the investigation of the experimental conditions leading to the stability of leucocyanidin in solution, one of the natural substrates of the enzyme. The results obtained allow a first study of the VvLAR1 kinetic properties.

Caractériser la fonction des protéines est crucial pour notre compréhension des mécanismes moléculaires de la vie, des maladies, et aussi pour inspirer de nouvelles applications en bionanotechnologie. Pour y arriver, il est nécessaire de caractériser la structure et la dynamique de chaque état occupé par la protéine durant sa fonction. La caractérisation expérimentale des états transitoires des protéines représente encore un défi majeur parce que les techniques à haute résolution structurelle, telles que la spectroscopie RMN et la cristallographie aux rayons X, peuvent difficilement être appliquées à l’étude des états de courte durée. De plus, les techniques à haute résolution temporelle, telles que la spectroscopie de fluorescence, nécessitent généralement une chimie complexe pour introduire des fluorophores à des endroits spécifiques dans la protéine. Dans cette thèse nous introduisons l’utilisation des nanoantennes fluorescentes en tant que nouvelle stratégie pour détecter et signaler les changements de conformation des protéines via des interactions non covalentes entre des fluorophores spécifiques et la surface de la protéine. En utilisant des expériences et des simulations moléculaires, nous démontrons que des fluorophores chimiquement divers peuvent se lier et être utilisés pour sonder différentes régions d’une enzyme modèle, la phosphatase alcaline (PA). Ces nanoantennes peuvent être fixées directement aux protéines ou utilisées à l'aide du système de fixation simple et modulaire, le complexe biotine-streptavidine (SA), qui permet un criblage rapide et efficace de la nanoantenne optimale tant dans sa composition que sa longueur. Dans le cas de la PA, nous montrons que nos nanoantennes permettent la détection et la caractérisation des conformations distinctes incluant les changements conformationnels nanoscopiques produisant durant la catalyse du substrat. Nous démontrons également que les signaux fluorescents émis par la nanoantenne peuvent également permettre de caractériser la cinétique enzymatique d’une protéine en une seule expérience tout en incluant la détermination des paramètres « Michaelis-Menten » de ses substrats et inhibiteurs. Nous avons également exploré l'universalité de la stratégie ces nanoantennes fluorescentes en utilisant une autre protéine modèle, la Protéine G et son interaction avec les anticorps, et avons démontré son utilité pour mettre au point un essai permettant de détecter les anticorps. Ces nanoantennes simples et faciles à utiliser peuvent être appliquées pour détecter et analyser les changements conformationnels de toutes tailles et nos résultats suggèrent qu'elles pourraient être utilisées pour caractériser n’importe quel type de fonction. / The characterisation of protein function is crucial to understanding the molecular mechanisms of life and disease, and inspires new applications in bionanotechnology. To do so, it is necessary to characterise the structure and dynamics of each state that proteins adopt during their function. Experimental study of protein transient states, however, remains a major challenge because high-structural-resolution techniques, including NMR spectroscopy and X-ray crystallography, can often not be directly applied to study short-lived protein states. On the other hand, high-temporal-resolution techniques, such as fluorescence spectroscopy, typically require complicated site-specific labelling chemistry. This thesis introduces the use of fluorescent nanoantennas as a new strategy for sensing and reporting on protein conformational changes through noncovalent dye-protein interactions driven by a high local concentration. Using experiments and molecular simulations, we first demonstrate that chemically diverse dyes can bind and be used to probe different regions of a model enzyme, intestinal alkaline phosphatase (AP). These nanoantennas can be attached directly to proteins or employed using the simple and modular biotin-streptavidin (SA) attachment system, which enables rapid and efficient screening for high sensitivity by tuning their length and composition. We show that these nanoantennas enable the detection and characterisation of distinct conformational changes of AP, including nanoscale conformational changes that occur during substrate catalysis. We also show that the fluorescent signal emitted by the nanoantenna enables complete characterisation of enzyme kinetics in one experiment, including determination of Michaelis-Menten parameters of substrates and inhibitors of AP. We then explored the universality of the nanoantenna strategy by using a different model protein system. Protein G was shown to interact with antibodies, using a rapid screening strategy for antibody detection. These effective and easy-to-use nanoantennas could potentially be employed to monitor various conformational changes, and our results offer potential for characterising various protein functions.

L’habileté des enzymes à évoluer joue un rôle fondamental dans l'adaptation des organismes à leur environnement, leur permettant de s'adapter aux changements de température, aux nutriments disponibles ou encore à l'introduction de composés cytotoxiques. Au cours des dernières décennies, cette capacité a conduit à l'émergence rapide de mécanismes de résistance aux antibiotiques chez des bactéries pathogènes pour l’humain, notamment dans le cas de l'antibiotique synthétique triméthoprime. Dix ans après l'introduction de cet antibiotique, l'enzyme dihydrofolate réductase de type B (DfrB) a été identifiée comme conférant une résistance aux bactéries l'exprimant en catalysant par voie d’enzyme alternative la réaction inhibée par l’antibiotique. Des études structurales, cinétiques et mécanistiques de la DfrB en ont révélé la nature atypique, et suggèrent que cette enzyme est un modèle d’enzyme primitive. En particulier, son site actif unique est formé via l’interface de quatre protomères identiques. Puisque les DfrB ne sont pas apparentées sur le plan évolutif à des protéines connues et caractérisées, on ne connait pas comment elles ont évolué pour ultimement contribuer à la résistance au triméthoprime, et en particulier comment leur capacité catalytique a émergé au sein du petit domaine codé par leurs gènes. Ainsi, cette thèse vise à approfondir notre compréhension de l’évolution des enzymes en examinant spécifiquement l’évolution des DfrB et les propriétés qui ont guidé ce processus. Puisque les gènes des DfrB ont rarement été rapportés, je présente d’abord nos efforts déployés pour identifier et caractériser de manière génomique les DfrB dans les bases de données publiques. Ces efforts ont conduit à la découverte, pour la première fois, de DfrB en dehors du contexte clinique. Nous avons ensuite caractérisé, sur le plan biophysique et enzymatique, des homologues protéiques aux DfrB que nous avons identifiés dans des bases de données de protéines putatives. Nous avons démontré la capacité d’homologues identifiés dans des contextes environnementaux, non associés aux activités humaines, à catalyser la réduction du dihydrofolate de la même façon que les DfrB. Enfin, une large exploration d’homologues de séquence, suivie d'une caractérisation expérimentale et computationnelle, nous a permis d'identifier des homologues distants des DfrB, certains capables de procurer une résistance au triméthoprime, et d'autres dépourvus de cette capacité. Ces résultats nous ont permis de proposer un modèle expliquant l’émergence de l'activité catalytique au sein du domaine protéique des DfrB. En résumé, cette thèse présente une approche multidisciplinaire pour l’exploration et la caractérisation de l’espace de séquence d’une famille de protéines. Cette approche, qui comprend des analyses génomiques, enzymologiques, biophysiques et bio-informatiques, nous a permis d’identifier les caractéristiques structurales et de séquences nécessaires à la formation d’une enzyme DfrB fonctionnelle. Nous avons également proposé un modèle pour expliquer l’évolution de cette enzyme primitive. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent que la capacité catalytique des DfrB a évolué indépendamment de l’introduction de l’antibiotique triméthoprime, et donc que ce mécanisme de résistance existait dans l’environnement préalablement à son recrutement génomique dans un contexte clinique. Ces travaux contribuent à notre compréhension fondamentale des mécanismes sous-jacents à l’émergence de l’activité catalytique au sein d’un domaine protéique non catalytique, et informent les études des mécanismes développés par les bactéries pour proliférer en présence d’antibiotiques. / The ability of enzymes to evolve plays a fundamental role in the adaptation of organisms to their environment, allowing them to adjust to changes in temperature, available nutrients, or the introduction of cytotoxic compounds. In recent decades, this ability has led to the rapid emergence of antibiotic resistance mechanisms in human pathogenic bacteria, particularly in the case of the synthetic antibiotic trimethoprim. Ten years after the introduction of this antibiotic, the type B dihydrofolate reductase (DfrB) was identified as conferring resistance to bacteria expressing it by providing an alternative enzyme to catalyze the reaction inhibited by the antibiotic. Structural, kinetic, and mechanistic studies of DfrB have revealed its atypical nature and suggest that this enzyme is a model of a primitive enzyme. In particular, its unique active site is formed by the interface of four identical protomers. Since DfrB enzymes are not evolutionarily related to any known and characterized proteins, it is not known how they evolved to ultimately contribute to trimethoprim resistance, and in particular how their catalytic ability arose within the small domain encoded by their genes. Thus, this thesis aims to deepen our understanding of enzyme evolution by specifically examining the evolution of DfrB and the properties that guided this process. Since DfrB genes have rarely been reported, I first present our efforts to genomically identify and characterize DfrB in public databases. These efforts led to the first discovery of DfrB genes outside the clinical context. We then biophysically and enzymatically characterized protein homologues of the DfrB we identified in putative protein databases. We demonstrated the ability of homologues identified in environmental contexts unrelated to human activities to catalyze dihydrofolate reduction in the same manner as DfrB. Finally, a broad search for sequence homologues, followed by experimental and computational characterization, allowed us to identify distant DfrB homologues, some capable of conferring resistance to trimethoprim and others lacking this ability. These results have allowed us to propose a model that explains the emergence of catalytic activity within the DfrB domain. In summary, this thesis presents a multidisciplinary approach to explore and characterize the sequence space of a protein family. This approach, which includes genomic, enzymatic, biophysical and bioinformatic analyses, has enabled us to identify the structural and sequence features necessary for the formation of a functional DfrB enzyme. We have also proposed a model to explain the evolution of this primitive enzyme. Overall, our results suggest that the catalytic capacity of DfrB evolved independently of the introduction of the antibiotic trimethoprim, and thus that this resistance mechanism existed in the environment prior to its genomic recruitment in a clinical context. This work contributes to our fundamental understanding of the mechanisms underlying the emergence of catalytic activity within a non-catalytic protein domain, and informs studies of the mechanisms developed by bacteria to proliferate in the presence of antibiotics.

Les polyesters aliphatiques, comme le poly(acide malique) et ses dérivés, sont une famille de polymères aux propriétés de bio(comptabilité) et de bio(dégradabilité) remarquables, qui en font des candidats de choix pour l'élaboration de systèmes de vectorisation de principes actifs. Généralement, ces polymères sont synthétisés via des réactions de polymérisation utilisant des amorceurs, voir des catalyseurs, organiques, organométalliques ou métalliques. La présence de ces molécules, même à l'état de traces, peut être à l'origine d'une toxicité non souhaitée. Par conséquent, l'utilisation de biocatalyseurs, comme les lipases, se développe pour apporter une solution à cet inconvénient. Cependant, cette voie de synthèse enzymatique fait face à d'autres problèmes, tels qu'une polymérisation moins bien maîtrisée et des polymères de masses molaires faibles. Cette thèse a donc pour objectif de mettre au point une voie de polymérisation du malolactonate de benzyle utilisant la lipase de pancréas de porc (PPL) comme amorceur. Dans un premier temps, nous avons optimisé certains paramètres réactionnels permettant d'obtenir des poly(malate de benzyle) , PMLABe, de masses molaires suffisamment élevées pour que ces polymères puissent être utilisés dans la formulation de vecteurs de principes actifs, grâce à l'utilisation et l'extrapolation d'un plan d'expérience. Nous nous sommes ensuite intéressés à la compréhension du mécanisme réactionnel de la polymérisation enzymatique du malolactonate de benzyle, une β-lactone β-substituée. Les différentes études menées ont permis d'approfondir notre connaissance dans ce domaine. Deux mécanismes ont été proposés et des expériences sont en cours pour confirmer l'un d'entre eux. Finalement, comme l'objectif initial est de proposer une méthode de synthèse de dérivés du PMLA plus biocompatibles conduisant à des polymères sans résidus d'amorceurs chimiques toxiques, nous avons comparé les activités biologiques de nanoparticules préparées à partir de PMLABe synthétisés par voie chimique et par voie enzymatique. Pour cela, nous avons mesuré la captation de ces nanoparticules, encapsulant une sonde de fluorescence, par des cellules hépatiques HepaRG. Puis, nous avons évalué la toxicité aiguë et la toxicité chronique de ces nanoparticules vis-à-vis des cellules HepaRG. Ces études ont permis de mettre en évidence certaines propriétés des nanoparticules ayant une influence sur la survie cellulaire et le métabolisme des cellules HepaRG. De la compréhension théorique aux applications potentielles, cette thèse apporte des connaissances sur la polymérisation enzymatique des lactones substituées, un domaine peu décrit dans la littérature. / Aliphatic polyesters, like poly(malic acid)and its derivatives, are a family of polymers with outstanding properties, such as bio(degradability) and bio(compatibility). Therefore, these polyesters can be considered as excellent candidates for the design of drug carriers. These kinds of polymers are usually synthesized thanks to polymerization reactions using organic, organometallic or metallic initiators or catalysts. The presence of such molecules, even in trace amounts, can cause undesired toxicities. Therefore, the use of biocatalysts, like lipases, is attracting more and more interest and research work to circumvent this problem. However, this enzymatic polymerization method has to face to other issues, such as a lower controlled of the polymerization process and polymers with lower molar masses. Therefore, this PhD research work aimed at setting up the enzymatic polymerization of benzyl malolactonate, using porcine pancreatic lipase (PPL). Firstly, we have optimized some reactional parameters allowing to obtain poly(benzyl malate), PMLABe, with molar masses adapted to their uses for the design of drug carriers, thanks to a Design of Experiments (DoE) and its extrapolation. We were then interested by the comprehension of the enzymatic polymerization mechanism of the benzyl malolactonate. The different studies we carried out allowed us to deepen our knowledges of such enzymatic polymerization. Two non-canonical mechanisms were proposed and further experiments are in progress to confirm the one which is the more probable. Finally, because our initial goal was to propose a more biocompatible polymerization method to obtain PMLABe free of traces of chemical initiator, we compared biologic activities of different nanoparticles prepared from PMLABe synthesized using chemical or enzymatic pathway. For that, we have first measured the uptake of these nanoparticles encapsulating a fluorescent dye, by the hepatic cells HepaRG. Then, we have studied the acute and chronic toxicity of the nanoparticles on the HepaRG cells. Results of these studies have highlighted that certain properties of the nanoparticles and/or of the polymers which constituted them have an influence on the cells viability and on the cells metabolism. From the theoretical mechanism to the probable applications, this thesis brings knowledge about the enzymatic polymerization of substituted lactone, a field poorly described in the literature.