ATAD2 est un facteur très conservé mais peu caractérisé qui possède différents domaines fonctionnels : un domaine AAA ATPase et un bromodomaine (BRD). Normalement, ATAD2 est exprimé fortement dans les cellules germinales males ainsi que dans les cellules souches embryonnaires (cellules ES). De plus, la surexpression de cette protéine a été détectée dans de nombreux cancers. Il a été montré qu'ATAD2 agit comme co-activateur des récepteurs aux androgènes et aux œstrogènes. Cette protéine semble aussi agir comme co-facteur de l’oncogène Myc et joue un rôle dans la voie pRb/E2F. La surexpression d’ATAD2 prédit un mauvais prognostic dans les cancers du poumon et du sein. Toutes ces caractéristiques font d'ATAD2 un candidat de choix comme biomarqueur pronostic et une cible potentielle pour des agents thérapeutiques dans le cadre de cancers agressifs.Dans ce projet de thèse, nous montrons que hATAD2 interagit avec l'histone H4 acétylée via son bromodomaine, et que le domaine ATPase est responsable de la multimérisation d’ATAD2 et permet au BRD d’interagir avec les lysines acétylées dans les cellules. Des investigations complémentaires, comprenant notamment des études structurales, montrent que le BRD d'ATAD2 est responsable de son interaction spécifique avec la forme acétylée de la lysine 5 de l'histone H4. Nous avons aussi analysé le domaine AAA ATPase et découvert des éléments qui contrôlent son rôle dans la multimérisation des protéines. De plus, nous avons étudié ATAD2 dans la lignée de cellules cancéreuses pulmonaires, H1299, ainsi que dans les cellules ES et démontré que ce facteur est essentiel pour la prolifération des cellules en l'absence des facteurs de croissance. En combinant des approches ChIP-seq, ChIP-protéomics et RNA-seq dans les cellules ES, nous avons montré qu'ATAD2 est très enrichi dans les régions à haute activité transcriptionnelle et maintient la chromatine accessible pour les facteurs impliqués dans les activités de la chromatine. Ces données indiquent qu'ATAD2, dans son contexte physiologique, assure un rôle essentiel dans les activités générales de la chromatine, telles que la transcription, en maintenant l'accessibilité de la chromatine pour les facteurs de transcription.Enfin, afin de caractériser la structure d’ATAD2 et celle de son homologue dans Schizosaccharomyces pombe, ABOI, différents fragments contenants le domaine AAA ATPase ont été produits dans des bactéries ainsi que dans des cellules d'insectes en utilisant des vecteurs d’expression de baculovirus. Les conditions de production de fragments solubles ont été établies et certains de ces fragments ont été purifiés. Néanmoins, l’obtention de la structure cristalline de l'ATAD2 nécessite des travaux supplémentaires. / ATAD2 is an evolutionarily conserved but poorly characterized factor that bears different types of func¬tional domains: an AAA ATPase domain and a bromodomain (BRD). ATAD2 is normally highly ex¬pressed in male germ cells and in embryonic stem cells (ESC), however the overexpression of this protein has been detected in a large variety of independent cancers. ATAD2 is proposed to act as a co-activator of androgen and estrogen receptors and in addition, this protein also seems to act as a co-factor for Myc oncogene and plays a role in the pRb/E2F pathway. Moreover, the overexpression of ATAD2 predicts poor prognosis in lung and breast cancers. All of these characteristics make ATAD2 a valuable prognosis biomarker and a promising therapeutic target in aggressive cancers.Herein, we show that hATAD2 binds to acetylated H4 tail through its BRD, and that its ATPase domain enables ATAD2 multimerization, affecting the ability of the BRD to bind acetylated lysine in cells. Additional investigations, including structural studies, show that ATAD2’s BRD is responsible for its specific interaction with acetylated lysine 5 of histone H4. We have also functionally analyzed the AAA ATPase domain and discovered elements that control its role in protein multimerization. In addition, we studied ATAD2 in ESC and in the H1299 lung cancer cell line, and demonstrated that this factor has crucial roles in cell proliferation in the absence of growth factors. Moreover, by using a combination of ChIP-seq, ChIP-proteomics and RNA-seq experiments in ESC, we found that ATAD2 is highly enriched in regions with high transcriptional activity and that it keeps chromatin accessible for chromatin templated factors. These data indicate that ATAD2 in its physiological context ensures a critical role in general chromatin-templated activities, such as transcription, by maintaining the accessibility of chromatin for transcription factors. Finally, in order to structurally characterize either ATAD2 or its homologue in Schizosaccharomyces pombe, ABOI, different fragments containing the AAA ATPase domain were produced in bacteria as well as in insect cells using baculovirus expression vectors. Conditions to produce soluble fragments were established and some of these fragments were purified. Nonetheless, solving the crystal structure of ATAD2 still requires further investigation.

Durant ces dernières décennies, la fertilité masculine est en constante diminution à l’échelle mondiale. Même si les facteurs environnementaux ont une part de responsabilité indéniable, il n’en reste pas moins que les altérations génétiques mais également épigénétiques semblent aussi largement impliquées. La compréhension des mécanismes épigénétiques qui régulent la fertilité masculine est récente mais essentielle pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, l’objectif de mes travaux de thèse s’est focalisé sur l’étude du rôle du variant d’histone H3.3 dans la spermatogenèse. H3.3 possède la capacité de remplacer l’histone canonique H3 dans la chromatine modifiant ainsi les propriétés épigénétiques de cette dernière. H3.3 est nécessaire à la spermatogenèse mais son rôle reste à élucider. Grace à plusieurs modèles murins, mes travaux de thèse ont montré que la forme H3.3B est essentielle à la reproduction masculine notamment pour la transition méiose/post-méiose. Lors de cette transition, on observe une forte régulation des piARN, des rétrotransposons et des chromosomes sexuels. Nos expériences révèlent pour la première fois que la perte de H3.3B provoque une chute de l’expression des piARN. À l’inverse, l’absence de H3.3B est aussi associée à une augmentation de l’expression de l’ensemble des gènes des chromosomes sexuels comme des rétrotransposons RLTR10B et RLTR10B2. Ces changements d’expression se traduisent par une spermatogenèse altérée et une infertilité. Par des expériences de ChIP-seq, nous avons observé que H3.3 est fortement enrichie sur les piRNA, les rétrotransposons RLTR10B et RLTR10B2 et l'ensemble des chromosomes sexuels. Toutes ces expériences ont permis de mieux caractériser la fonction régulatrice de l’histone H3.3B au cours de la spermatogenèse. En particulier, elles démontrent que H3.3B, en fonction de sa localisation sur la chromatine, intervient dans la régulation positive ou négative de l'expression de régions chromatiniennes définies. Ces résultats montrent l’importance des contrôles épigénétiques au cours de la spermatogenèse et ouvrent de nouvelles pistes dans la compréhension des causes d’infertilité masculine. / In last decades, male fertility has been steadily declining worldwide. Even if environmental factors have an undeniable responsibility, the fact remains that both genetic and epigenetic alterations also seem to be widely implicated. The understanding of the epigenetic mechanisms that regulate male fertility is recent but essential to develop a new therapeutic approaches. In this context, the objective of my thesis work focused on the study of the role of histone variant H3.3 in spermatogenesis. H3.3 has the ability to replace the H3 canonical histone in chromatin thus modifying the epigenetic properties of chromatin. H3.3 is necessary for spermatogenesis but its role remains unclear. Used to several mouse models, my thesis work has shown that the H3.3B form is essential for male reproduction and especially for the meiosis/post-meiosis transition. During this transition, there is a strong regulation of piRNAs, retrotransposons and sex chromosomes. Our experiments reveal at the first time that the loss of H3.3B resulted in down-regulation of the expression of piRNA. In contrast, the absence of H3.3B is also associated with increased expression of all sex chromosom genes as well as of both RLTR10B and RLTR10B2 retrotransposons. These expression changes result in altered spermatogenesis and infertility. By ChIP-seq experiments, we observed that H3.3 is markedly enriched on the piRNA clusters, RLTR10B and RLTR10B2 retrotransposons and the whole sexual chromosomes. All these experiments allowed bettering characterizing the regulatory function of histone H3.3B during spermatogenesis. In particular, he demonstrates that H3.3B, depending on its chromatin localization, is involved in either up-regulation or down-regulation of expression of defined chromatin regions. These results show the importance of epigenetic controls during spermatogenesis and open new tracks for understanding the causes of male infertility.

Des changements de méthylation de l'ADN peuvent affecter l'expression des gènes et pour certains être transmis au travers des générations. De telles " épimutations " qui concernent des groupes de cytosines à proximité ou dans les gènes sont donc une source potentielle de variation phénotypique héritable en absence de changements de la séquence de l'ADN. Chez les plantes la méthylation de l'ADN est cependant principalement observée au niveau des séquences répétées. Il reste à déterminer dans quelle mesure les changements de méthylation au niveau de ce type de séquences peuvent être héritées et affecter les phénotypes. Afin de répondre à ces questions, plus de 500 épiRIL (epigenetic Recombinant Inbred Lines) quasi-isogéniques a été générée chez Arabidopsis thaliana. Cette population a été obtenue par le croisement d'un parent sauvage et d'un parent mutant pour le gène DDM1 présentant une très forte réduction du taux de méthylation de l'ADN. Après un rétrocroisement de la F1 avec une plante sauvage, les individus sauvages pour le gène DDM1 ont été sélectionnés et propagées sur 6 générations par autofécondation. Nous avons montré par l'analyse du méthylome de plus de 100 épiRIL que l'hypométhylation induite par ddm1 présente selon les séquences affectées différents degrés de transmission au travers des générations. La réversion de l'hypométhylation concerne des régions associées à une abondance élevée en sRNA de 24 nt. Nous avons utilisé l'hypométhylation stablement transmise dans les épiRIL induite par ddm1 afin de détecter des QTL (Quantitative Trait Loci) affectant le temps de floraison et la longueur de la racine primaire, deux caractères pour lesquels les variations observées dans les épiRIL présentent une héritabilité importante. En dernier lieu, nous avons recherché par différentes approches les variations causales de ces QTL.

Implications des complexes Polycomb et Trithorax au cours du développement précoce chez Ciona intestinalisLes protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) ont été initialement découvertes chez Drosophila melanogaster. Ces deux groupes sont classiquement connus pour leurs rôles respectifs de répresseurs et d'activateurs épigénétiques qui contrôlent et maintiennent les états chromatiniens au cours du temps. Ces facteurs régulent de nombreux gènes cibles dont les gènes homéotiques. Au cours de ma thèse, j'ai étudié trois composants de ces deux groupes : Enhancer of zeste (E(z)), appartenant au complexe PRC2 du PcG et responsable du dépôt de la marque de répression génique H3K27me3, Polyhomeotic (Ph), appartenant au complexe PRC1 du PcG et dont le rôle exact reste à déterminer, et Trithorax (Trx), appartenant au complexe TAC1 du TrxG et responsable du dépôt de la marque d'activation génique H3K4me3. Jusqu'à présent, aucune étude n'a abordé la régulation épigénétique via les PcG et TrxG chez l'ascidie solitaire Ciona intestinalis. Cette espèce présente un cluster des gènes Hox désorganisé et ne possède pas la protéine Polycomb (Pc) du PRC1, responsable de la reconnaissance de la marque de répression H3K27me3 déposée par la protéine E(z).Nos travaux montrent que la protéine E(z) est fonctionnelle et conserve son activité méthyltransférase sur le résidu H3K27 chez Ciona intestinalis. Nous avons ensuite observé, par des expériences de knockdown par micro-injection de morpholinos, que les inhibitions protéiques d'E(z), Ph et Trx ont des conséquences dramatiques sur la différenciation et la mise en place des différents tissus au cours du développement larvaire, notamment sur la mise en place de la notochorde puisque celle-ci est totalement absente chez les morphants E(z) et Ph. Les défauts de phénotype du morphant E(z) sont corrélés à la perte du dépôt d'H3K27me3 et nous avons mis en évidence, lors de l'inhibition d'E(z), une dérépression des gènes tissu-spécifiques impliqués dans le développement embryonnaire précoce alors que les gènes tardivement exprimés sont réprimés. De plus, l'expression des gènes Hox n'est pas significativement modifiée au cours du développement embryonnaire lorsque la protéine E(z) est inhibée, à l'exception du gène Hox12 qui est déréprimé, comme attendu.L'ensemble de ces résultats permet d'émettre l'idée innovante selon laquelle les protéines des PcG et TrxG jouent un rôle déterminant dans la régulation de l'expression génique lors de l'embryogénèse de Ciona intestinalis tout en ayant une implication mineure dans la régulation de l'expression des gènes Hox à ce stade du développement. / Implications of Polycomb and Trithorax complexes in the early development of Ciona intestinalisPolycomb and Trithorax group (PcG and TrxG) proteins were discovered originally in Drosophila melanogaster. Both groups are classically known for their roles in the maintenance of silenced and active chromatin states over time, respectively. These factors regulate many target genes including the homeotic genes. During my PhD, I studied three components of these two groups: Enhancer of zest (E(z)), belonging to the PRC2 complex of PcG and responsible for H3K27me3 mark deposit for gene repression, Polyhomeotic (Ph), belonging to the PRC1 complex of PcG whose role remains to be determined, and Trithorax (Trx), belonging to the TAC1 complex of TrxG and responsible for H3K4me3 mark deposit for gene activation. Until now, no study addresses the epigenetic regulation mediated by PcG and TrxG in the solitary ascidian Ciona intestinalis. This specie has a disorganized Hox cluster and in which the Polycomb (Pc) protein of PRC1, responsible for the recognition of the repressive H3K27me3 mark, is absent.Our work shows that the E(z) protein is functional and retains its methyltransferase activity on H3K27 residue in Ciona intestinalis. Then, we demonstrated, by knockdown experiments with morpholino microinjection, that the inhibition of E(z), Ph and Trx has dramatic consequences on differentiation and on the establishment of different tissues during larval development, particularly on the notochord establishment since it is totally absent in E(z) and Ph morphants. E(z) morphant phenotypic defects are correlated with lack of H3K27me3 mark deposit and we highlighted that, during the E(z) inhibition, tissue-specific genes implied in early development are de-repressed while late-expressed genes are down-regulated. In addition among Hox genes, only Hox12 expression is significantly modified and found to be de-repressed in E(z) morphant context, as expected.Altogether, our results present the innovative idea that the PcG and TrxG proteins play a major role in the gene expression regulation during embryogenesis of Ciona intestinalis while having a minor involvement in the regulation of Hox genes expression at this stage of development.

Les papillomavirus humains (HPV) sont des petits virus non enveloppés à ADN double brin, qui infectent les épithéliums cutanés et muqueux. Très largement répandus dans la population humaine, les infections sont la plupart du temps asymptomatiques, tandis qu'une minorité provoquent des verrues cutanées, des condylomes acuminés et des carcinomes. Les cancers induits par HPV représentent 640 000 cas en 2012 dans le monde et sont localisés au niveau anogénital et au niveau des voies aérodigestives supérieures.La transformation des cellules est induite en particulier par la surexpression de deux oncoprotéines virales : E6 et E7, qui sont nécessaires à l'initiation, la promotion et la progression du phénotype cancéreux. Leur extinction provoque d'ailleurs la mort des cellules cancéreuses. E6 et E7 favorisent par exemple la dégradation de p53 et pRb, induisant ainsi une prolifération non contrôlée et accrue des cellules infectées. Mais les deux oncoprotéines virales interagissent aussi avec plus de 150 partenaires protéiques et dérégulent l'homéostasie cellulaire. Fait intéressant, E6 et E7 modulent l'expression de nombreuses protéines impliquées dans l'établissement des marques épigénétiques, impliquées dans la régulation de l'expression des gènes. D'ailleurs, la surexpression des oncoprotéines virales peut être liée à la méthylation de l'ADN d'une partie du génome viral.Puisque E6 et E7 détournent la machinerie épigénétique de la cellule, l'objectif du travail de thèse a été d'étudier les mécanismes moléculaires régulant l'expression des oncoprotéines lors du traitement des cellules de cancers du col par un agent déméthylant de l'ADN, le 5-aza-2'-déoxycytidine (5azadC).Dans des cellules issues de cancers du col de l'utérus, nous avons observé qu'un traitement déméthylant induisait une répression de la protéine E6 et une déstabilisation de ses transcrits, suggérant l'implication d'un miARN. Parmi les miARN ciblant les transcrits viraux, le miR-375 était le plus susceptible d'être impliqué dans la déstabilisation des transcrits car (i) la méthylation de son promoteur augmente avec la gravité des lésions du col de l'utérus, (ii) il cible les transcrits viraux au niveau de cinq régions différentes, et (iii) son expression est augmentée lors du traitement de cellules dérivées du cancer du col de l'utérus avec le 5azadC. Il s'est avéré que le miR-375 était effectivement impliqué dans la répression partielle des transcrits viraux lors du traitement. Les résultats de cette étude suggèrent par ailleurs qu'un autre mécanisme moléculaire pourrait être impliqué dans cette répression. C'est pourquoi, dans un deuxième temps, nous avons étudié l'implication possible d'un facteur de transcription, TBX2, dans la répression des transcrits viraux. Bien que le taux transcriptionnel de TBX2 soit augmenté lors du traitement des cellules avec des fortes concentrations de 5azadC, nos résultats suggèrent que la protéine n'est pas exprimée dans les cellules, même après traitement, et que TBX2 ne régule pas l'activité du promoteur viral intégré au génome cellulaire.Le traitement des cellules par l'agent déméthylant entraîne aussi une perte de viabilité en particulier des cellules Ca Ski. En effet, le 5azadC induit un blocage du cycle en G2/M dans ces cellules, une augmentation du pourcentage de cellules en Sub-G1 et un clivage de la PARP. Si le 5azadC est déjà utilisé en clinique pour le traitement d'autres cancers, nos données apportent un éclairage nouveau sur les mécanismes moléculaires du 5azadC dans les cancers induits par HPV, qui pourraient ainsi être traités par cette molécule. / Human papillomaviruses (HPV) are small, non-enveloped double-stranded DNA viruses and infect cutaneous and mucosal epithelia. Highly widespread in the human population, infections are mostly asymptomatic, while a minority causes cutaneous and genital warts, and carcinomas. HPV-induced cancers represent 640 000 cases in 2012 worldwide and are localized at the anogenital and head and neck sites.Cell transformation is induced by the overexpression of two viral oncoproteins E6 and E7, which are necessary for the initiation, promotion and progression of the cancerous phenotype. Indeed, their extinction causes cancer cell death. E6 and E7, for example, promote the degradation of p53 and pRb, thus inducing uncontrolled and increased proliferation of infected cells. But the two viral oncoproteins also interact with more than 150 protein partners and deregulate cell homeostasis. Interestingly, E6 and E7 modulate the expression of many proteins involved in the establishment of epigenetic marks, regulating gene expression. Furthermore, the overexpression of viral oncoproteins may be related to viral genome DNA methylation.Since E6 and E7 hijack epigenetic mechanisms, the aim of the thesis was to study the molecular mechanisms regulating the oncoprotein expression during the treatment of cervical cancer cells by a DNA demethylating agent, the 5-aza-2'-deoxycytidine (5azadC).In cervical cancer cells, we observed that a demethylating treatment induced E6 protein repression and destabilization of its transcripts, suggesting the involvement of a miRNA. Among miRNAs targeting viral transcripts, miR-375 was most likely to be involved this destabilization because (i) its promoter methylation increases with the severity of cervical lesions, (ii) it targets viral transcripts at five different regions, and (iii) its expression is increased in cervical cancer cells treated with 5azadC. In our experiences, miR-375 was indeed involved in the partial repression of viral transcripts during treatment. The results of this study further suggest that another molecular mechanism might be implicated in this repression. This is why, in a second step, we studied the possible involvement of a transcription factor, TBX2, in the viral transcript repression. Although the transcriptional rate of TBX2 is increased in cells treated with high concentrations of 5azadC, our results suggest that the protein is not expressed in cells, even after treatment, and that TBX2 does not regulate the viral promoter activity integrated into the cellular genome.Cell treatment with demethylating agent also leads to loss of viability, in particular in Ca Ski cells. Indeed, 5azadC induces a G2/M cycle arrest in these cells, an increase of Sub-G1 cells percentage and a PARP cleavage. While 5azadC is already used in clinical practice for the treatment of other cancers, our data shed new light on the molecular mechanisms of 5azadC in cancers induced by HPV, which could be treated by this molecule or analogues.

Les protéine arginine méthyltransférases (PRMT) sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, incluant la régulation de l’expression des gènes, le contrôle de l’épissage, le maintien de l’intégrité du génome et la transduction du signal. De nombreuses études montrent que la dérégulation de l’activité des PRMT est associée au développement de pathologies, et en particulier de cancers. Les PRMT constituent ainsi une des nouvelles cibles potentielles en chimiothérapie. Les travaux présentés dans ce manuscrit portent sur trois cibles : PRMT2, PRMT3 et PRMT4/CARM1. Combinant des approches biochimiques, biophysiques et structurales (cristallographie et cryo- microscopie électronique), ces travaux comportent deux aspects : (I) comprendre au niveau atomique la régulation de la réaction de méthylation des protéines (reconnaissance protéines-protéines et interactions entre modifications post-traductionnelles) ; (II) découvrir des inhibiteurs spécifiques et puissants de plusieurs PRMT cibles. / Protein arginine methyltransferases (PRMT) are involved in many cellular processes, including gene expression regulation, splicing control, maintenance of genome integrity and signal transduction.Since deregulation of those biological processes appears to be implicated in the pathogenesis of different diseases, PRMTs have emerged as potential new targets for the development of novel therapeutic modulators. Despite the large amount of biological and structural data on PRMTs, two challenges remain to be solved by structural biology ; (I) understanding how PRMTs recognize and bind their full-length substrates ; (II) revealing how PRMTs achieve specific arginine methylation on different target sites. The works presented here focused on 3 targets: PRMT2, PRMT3 and PRMT4/ CARM1. We used biochemical, biophysical and structural methods (bio-crystallography and cryo- electron microscopy) to decipher structural clues that drive PRMT-substrate recognition. We developed new chemical probes that can be used in early drug discovery for the conception of PRMT inhibitors.

La méthylation de l'ADN est un processus vital pour le développement des mammifères. Sa distribution anormale,notamment au niveau des régions répétées du génome, est une signature pathologique. La découverte de maladies héréditaires touchant la stabilité du génome a permis des avancées considérables dans l'identification des acteurs et des mécanismes. Nous avons choisi d'étudier le syndrome ICF (Immunodéficience, instabilité Centromérique et anomalies Faciales), première maladie génétique identifiée avec des défauts de la méthylation de l’ADN, liés à une instabilité chromosomique. Lorsque j'ai commencé ma thèse, des mutations dans les gènes DNMT3B et ZBTB24 avaient été décrites comme causes génétiques du syndrome. Cependant, d'autres causes génétiques restaient inconnues. Nos travaux ont permis d'identifier deux nouveaux gènes, CDCA7 et HELLS, dont les mutations sont responsables du syndrome. J'ai montré que leur perte de fonction dans les cellules somatiques entraîne un défaut de méthylation des répétitions centromériques, suggérant leur rôle dans le maintien de la méthylation de l'ADN. Par conséquent, l'étude de l'étiologie d'une maladie génétique rare a permis d'identifier de nouveaux « gardiens » de la stabilité du génome, avec des fonctions jusqu'alors insoupçonnées dans les processus de méthylation de l'ADN et dans le développement. Au cours de mon doctorat, j'ai établi des cartes de méthylation des cellules de patients ICF afin d'identifier les cibles communes et distinctes de ces facteurs, ainsi que leurs caractéristiques génomiques et épigénomiques. Contrairement aux mutations de DNMT3B,celles de ZBTB24, CDCA7 et HELLS affectent la méthylation dans des régions pauvres en CpG, dans des régions intergéniques et dans des répétitions d'ADN intercalées. Plus généralement, ce sont les régions d'hétérochromatine qui sont les plus touchées et en particulier des clusters des gènes codants et non codants, dont certains sont exprimés de manière monoallélique. Pour mieux caractériser le rôle de ZBTB24 dans le développement et la méthylation de l'ADN,nous avons généré un modèle murin mutant qui nous a permis de monter que ZBTB24 était essentielle pour le développement embryonnaire précoce. De plus, ZBTB24 jouerait un rôle dans l'établissement de la méthylation des séquences répétées de l'ADN, à la fois en tandem ou intercalé. Fait intéressant, ZBTB24 semble être également impliqué dans l'établissement de la marque répressive H3K9me3, suggérant un rôle de la protéine dans le "dialogue" entre la méthylation de l'ADN et celle des histones. Dans l'ensemble, mon travail met l'accent sur la façon dont la méthylation de l'ADN et les marques d'hétérochromatine sont établies et maintenues à des gènes uniques et des répétitions de l'ADN, et fournit de nouveaux acteurs et mécanismes à considérer dans les études sur le maintien de la stabilité du génome. / DNA methylation is an essential process for the development of mammals. Its abnormal distribution, particularly at the level of the repeated regions of the genome, is a pathological signature. The discovery of hereditary diseases affecting DNA methylation and the stability of the genome allowed a considerable progress in the identification of their actors and mechanisms. We chose to study the ICF (Immunodeficiency, Centromeric Instability and Facial Abnormalities) syndrome, the first genetic disorder identified with defects in the distribution of DNA methylation, linked to chromosomal instability. When I started my PhD, mutations in two genes had been described to cause the ICF syndrome: DNMT3B and ZBTB24. However, the genetic origin of a subset of ICF patients remained unknown. We identified mutations in CDCA7 and HELLS as causative of the ICF syndrome. I showed that their loss of function in somatic cells results in the loss of DNA methylation at centromeric repeats, strongly suggestive of a role DNA methylation maintenance. Hence, the study of the aetiology of a genetic disease provided new candidate “guardians” of DNA repeats and genome stability, with virtually unknown functions but with exciting potential roles in the DNA methylation machinery and in development. During my PhD, I established methylation maps in ICF patients cells to identify common and distinct targets of these factors, as well as their genomic and epigenomic characteristics. In contrast to DNMT3B mutations, those in ZBTB24, CDCA7 and HELLS affect methylation at CpG-poor regions in intergenic genomic locations and at interspersed DNA repeats, and more generally, at genomic locations with heterochromatic features. Their integrity is required for the methylated status of coding and non-coding clusters of genes, some of which are expressed in a monoallelic manner. To better characterize the role of ZBTB24 in development and DNA methylation pathways, we generated a mouse model carrying mutations in ZBTB24. We showed that ZBTB24 is essential for early development, while it seemed to be dispensable for in vitro differentiation of murine ES cells. We implicated ZBTB24 in the establishment of DNA methylation at DNA repeats, both in tandem or interspersed, in differentiating ES cells. Interestingly, ZBTB24 seems to be also implicated in the establishment of the repressive mark H3K9me3 suggesting that ZBTB24 may indirectly control DNA methylation through an interplay with histone marks. As a whole, our work sheds light on how DNA methylation and heterochromatin marks are established and maintained at unique genes and DNA repeats, and provides new actors and mechanisms to consider in studies of the maintenance of genome stability.

Au vu de l'impact croissant du changement climatique global et en particulier de la sécheresse sur les forêts, il est nécessaire de comprendre les mécanismes de réponse des arbres face à des variations de disponibilité en eau. Ces dernières années, des études ont montré un contrôle épigénétique et notamment par la méthylation de l'ADN de la plasticité phénotypique des plantes en réponse aux variations environnementales. Dans ce contexte, cette thèse visait à évaluer le rôle de la méthylation de l'ADN des cellules du méristème apical caulinaire dans la plasticité développementale de la tige feuillée en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier, un arbre modèle. A cette fin, le méthylome de la chromatine non condensée dans le méristème apical caulinaire de Populus trichocarpa a été caractérisé. Ensuite, l'impact de variations de disponibilité en eau sur la méthylation de l'ADN a été étudié dans l'apex caulinaire de différents hybrides (P. × euramericana). Les loci et les réseaux de gènes affectés pour leur expression et leur méthylation ont ainsi été identifiés. Ces travaux ont montré que dans le méristème apical caulinaire, la majorité des gènes étaient dans un état non condensé de la chromatine et méthylés dans leur corps. Ils ont également mis en évidence une forte variation de la méthylation globale de l'ADN selon les génotypes et en réponse à des variations de disponibilité en eau. De plus, des corrélations ont été établies entre les niveaux de croissance des arbres et de méthylation globale de l'ADN dans l'apex caulinaire. Enfin, les variations de la méthylation de l'ADN en réponse aux variations de la disponibilité en eau s'accompagnent de variations d'expression et ont ciblé particulièrement des gènes impliqués dans la signalisation par les phytohormones ou la morphogenèse. Ainsi, les travaux effectués lors de cette thèse suggèrent un rôle de la méthylation de l'ADN dans la plasticité phénotypique en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier via le contrôle de l'expression de réseaux de gènes dans le méristème apical caulinaire.

De par les centaines de milliers de données qui les caractérisent, les bases de données épigénétiques représentent actuellement un défi majeur. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer la performance d’outils statistiques développés pour les données de grande dimension, en explorant l’association entre facteurs alimentaires reliés au cancer du sein (CS) et méthylation de l’ADN dans la cohorte EPIC.Afin d’étudier les caractéristiques des données de méthylation, l’identification des sources systématiques de variabilité des mesures de méthylation a été effectuée par la méthode de la PC-PR2. Ainsi la performance de trois techniques de normalisation, très répandues pour corriger la part de variabilité non désirée, a été évaluée en quantifiant l’entendu de variabilité attribuée aux facteurs de laboratoire avant et après chaque méthode de correction.Une fois la méthode de normalisation la plus appropriée identifiée, la relation entre le folate, l’alcool et la méthylation de l’ADN a été analysée par le biais de trois approches : une analyse individuelle des sites CpG, une analyse de DMR et la régression fused lasso. Les deux dernières méthodes visent à identifier des régions spécifiques de l’épigénome grâce aux corrélations possibles entre les sites proches. La méthylation globale a aussi été utilisée pour étudier la relation entre méthylation et risque de CS.Grâce à une évaluation exhaustive d’outils statistiques révélant la complexité des données de méthylation de l’ADN, cette thèse offre un aperçu instructif de connaissances pour les études épigénétiques, avec une possibilité d’application de méthodologie similaire aux analyses d’autres types de données -omiques / Epigenetics data are challenging sets characterized by hundreds of thousands of features. The main objective of this thesis was to evaluate the performance of some of the existing statistical methods to handle sets of large dimension data, exploring the association between dietary factors related to breast cancer (BC) and DNA methylation within the EPIC study.In order to investigate the characteristics of epigenetics data, the identification of random and systematic sources of variability of methylation measurements was attempted, via the principal component partial R-square (PC-PR2) method. Using this technique, the performance of three popular normalization techniques to correct for unwanted sources of variability was evaluated by quantifying epigenetics variability attributed to laboratory factors before and after the application of each correction method.Once a suitable normalization procedure was identified, the association between alcohol intake, dietary folate and methylation levels was examined by means of three approaches: an analysis of individual CpG sites, of differentially methylated regions (DMRs) and using fused lasso regression. The last two methods aim at the identification of specific regions of the epigenome using the potential correlation between neighboring CpG sites. Global methylation levels were used to investigate the relationship between methylation and BC risk.By performing an exhaustive evaluation of the statistical tools used to disclose complexity of DNA methylation data, this thesis provides informative insights for studies focusing on epigenetics, with promising potentials to apply similar methodology to the analysis of other -omics data

Dans une première partie du travail, nous nous sommes intéressés à l'effet de l'acrylamide sur la tumorigénèse thyroïdienne. En effet des chercheurs suédois avaient récemment attiré l’attention de la communauté scientifique sur la présence de ce xénobiotique dans des denrées alimentaires couramment utilisées. Des études antérieures avaient montré que l’acrylamide, administré chroniquement à des rats pendant deux ans, induisait des tumeurs parmi lesquelles les tumeurs thyroïdiennes étaient les plus fréquentes. Pour ces raisons l’acrylamide est considéré comme une substance potentiellement cancérigène pour l’homme. Nous avons voulu investiguer les mécanismes d’action possibles de l’acrylamide dans la tumorigénèse thyroïdienne avec un modèle in vitro et ensuite un modèle in vivo.<p>Dans le modèle in vitro, nous avons d’abord testé l’effet de l’acrylamide sur les propriétés caractéristiques de la thyroïde, qui pourraient expliquer la spécificité de cette substance pour ce tissu. Dans un premier temps, nous avons donc testé l’effet de l’acrylamide sur l’accumulation d’AMPc (médiateur de la croissance) et sur la génération d’H2O2 potentiellement cancérigène mais nous avons montré qu’aucun de ces deux paramètres n’est modulé suite au traitement des cellules thyroïdiennes. Nous avons ensuite montré que l’acrylamide n’avait pas d’effet sur la prolifération dans les lignées thyroïdienne de rat, un facteur qui aurait pu expliquer l’effet tumorigène de l’acrylamide mais pas sa spécificité thyroïdienne. Nous avons enfin testé en utilisant l’essai comète la capacité de l’acrylamide à générer des cassures au niveau de l’ADN. Ceci nous a permis de montrer que l’acrylamide était capable d’induire des cassures dans l’ADN de lignées thyroïdiennes de rat ainsi que dans des cultures primaires de thyroïde humaines, de chien et de mouton. Afin de déterminer que l’effet observé sur l’ADN était dû à des cassures double brin, nous avons utilisé une technique de détection de l’histone H2AX phosphorylée. En effet, la phosphorylation de cette histone se produit lorsque des cassures d’ADN double brin sont présentes. Les résultats obtenus ne soutiennent pas l’hypothèse que l’acrylamide provoque des cassures double brin. Néanmoins ces dommages à l’ADN sont susceptibles d’induire des mutations qui peuvent jouer un rôle dans le processus de tumorigénèse de l’acrylamide.<p>Nous avons donc testé l’effet de l’acrylamide sur un modèle in vivo. Pour cela nous avons traité des souris avec de l’acrylamide additionné à l’eau de boisson à des doses comparables à celles administrées aux rats pendant 2, 6 ou 8 mois. Ce traitement a également été combiné avec de la thyroxine (T4) afin de mettre la thyroïde au repos ou avec du méthimazole qui inhibe la sécrétion des hormones thyroïdiennes et par conséquent induit la sécrétion de TSH, ce qui a pour effet de stimuler la glande. Ces traitements modérés ont eu les effets attendus au niveau des taux de TSH et de T4 circulants ainsi que sur la morphologie de la glande. L’acrylamide a eu de faibles effets sur le système nerveux périphérique traduit par une paralysie des membres postérieurs. Par contre nous n’avons pas observé d’apparition de tumeurs dans la thyroïde des souris. La cible thyroïdienne de l’acrylamide chez le rat semble donc spécifique de l’espèce et jette un doute sérieux sur un rôle cancérigène potentiel chez l’homme au niveau thyroïdien.<p><p>Dans une deuxième partie, nous avons investigué la réexpression de certains gènes thyroïdiens dans des lignées cancéreuses humaines. En effet nous avons montré au sein du laboratoire que la plupart des lignées thyroïdiennes les plus utilisées avaient perdu les gènes de différentiation spécifiques de la thyroïde. Pour cela nous avons utilisé des agents capables de modifier soit la méthylation de l’ADN comme la 5-aza-2’-déoxycytidine (5-AzadC) soit la compaction de la chromatine comme la trichostatine A (TSA), ce qui a pour conséquence de moduler le niveau d’expression des gènes. Ces traitements ont été utilisés à différentes concentrations, différents temps, seuls ou en combinaison. La 5-AzadC, utilisée seule a permis de réexprimer fortement les gènes Duox1 et Duox2 et faiblement NIS. En combinaison avec la TSA et la forskoline (un activateur de la voie AMPc), nous avons montré une forte réexpression de NIS mais au stade actuel de notre étude celui-ci n’est pas fonctionnel. Ceci montre que les agents modifiant la chromatine peuvent influencer l’expression des gènes de différenciation, cependant nous devons investiguer de façon plus large les différents agents ainsi que les conditions de culture pouvant mener à la réexpression d’un NIS fonctionnel. Grâce à ce traitement différenciant, qui permettrait un rétablissement du transport de l’iodure, un traitement par l’I131 des cancers indifférenciés de la thyroïde pourrait être réenvisagé.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished