O linfonodo é um órgão linfoide secundário que apresenta uma arquitetura altamente organizada com diferentes compartimentos para tipos celulares específicos. Dentre as células estruturais que compõem este órgão, as células estromais como células fibroblásticas reticulares (FRCs) e células duplo negativas (DNCs) parecem ter papel importante na modulação da resposta imunológica e na tolerância periférica. As FRCs são caracterizadas pela expressão de podoplanina (gp38, PDPN) e localizam-se principalmente na zona de células T, enquanto as DNCs (gp38-) apresentam fenótipo, localização e função pouco descritos. Embora estas células tenham sido muito estudadas em modelos murinos os estudos sobre FRCs e DNCs humanas são escassos e, portanto nosso estudo deve contribuir para a compreensão da biologia e a função dessas células, podendo favorecer o conhecimento sobre a eficiência e as disfunções da resposta imune no linfonodo. Com esse intuito, isolamos e caracterizamos fenotípica e funcionalmente as FRCs e DNCs de linfonodos de pacientes com câncer, diverticulite e doadores de fígado. Nossos resultados mostraram a integridade e a distribuição celular no linfonodo. As células aderentes derivadas dos linfonodos estudados preecheram todos os critérios internacionais de caracterização de estroma, e, portanto, foram consideradas células estromais. Através da expressão de gp38 identificamos duas subpopulações de celulas estromais: FRCs (gp38+ e CD31-) e DNCs (gp38- e CD31-) e verificamos que as frequências destas células variam entre as amostras, sugerindo que a doença pode interferir na composição celular estromal dos linfonodos. As duas populações celulares foram estimuladas com citocinas inflamatórias como IFN-y ou TNF-alfa + IL-1beta por 24 e 48 horas e avaliadas quanto à expressão gênica e proteica. Em condições homeostáticas, genes relacionados com a indução e controle da proliferação foram diferencialmente expressos nas FRCs e DNCs, este dado foi confirmado in vitro, uma vez que as FRCs apresentaram maior potencial proliferativo em relação às DNCs. O estímulo com IFN-y induziu aumento de expressão nas DNCs e FRCs para citocinas, quimiocinas, moléculas de histocompatibilidade e moléculas envolvidas na regulação da resposta imunológica. Em resposta ao estímulo com TNF-alfa +IL-1beta, observamos aumento na expressão de moléculas comuns ao estímulo com IFN-?, entretanto, também observamos expressão de moléculas de citocinas, quimiocinas inflamatórias e moléculas de histocmpatibilidade especificamente relacionados a este sinal em ambas as populações. Em conjunto, nossos dados sugerem que DNCs e FRCs apresentam diferenças no perfil de resposta segundo os estímulos inflamatórios aos quais estão expostas, aumentando a expressão diferencial de moléculas envolvidas na regulação positiva e negativa da resposta imune / The lymph node is a secondary lymphoid organ that has a highly organized architecture with different compartments for specific cell types. Among the structural cells that comprise this organ, stromal fibroblastic reticular cells (FRCs) and double negative cells (DNCs) seems to play an important role in modulating the immune response and peripheral tolerance. FRCs are characterized by podoplanin (gp38, PDPN) expression and are located mainly in the T cell zone, while DNCs (gp38-) present phenotype, location and function not well described. Although these cells have been studied in murine models, studies on human FRCs and DNCs are limited and therefore our study should contribute to the understanding of biology and function of these cells and should promote knowledge of efficiency and disorders in the lymph node immune response. For this purpose, we have isolated and characterized phenotypic and functionally lymph nodes derived FRCs and DNCs from patients with cancer, diverticulitis and liver donors. Our results showed lymph node integrity and its cellular distribution. Adherent cells lymph nodes-derived fullfill the international criteria for stroma characterization, and therefore, they have been considered stromal cells. Using gp38 expression we were able to identify two stromal cells subpopulations: FRCs (gp38 + and CD31-) and DNCs (gp38- and CD31-) and found that this cells frequency varies among samples, suggesting that the disease may interfere with lymph nodes stromal cell composition. These two cells populations were stimulated with inflammatory cytokines such as IFN-y or TNF-alfa + IL-1beta for 24 and 48 hours and evaluated for gene and protein expression. In homeostatic conditions, genes involved in the induction and control of proliferation were differentially expressed by FRCs and DNCs, this data has been confirmed in vitro, since the FRCs showed higher proliferative potential compared to DNCs. IFN-y stimulation induced increase DNCs and FRCs expression for cytokines, chemokines, histocompatibility molecules and molecules involved in regulating the immune response.In response to TNF-alfa + IL-1beta stimulation, we observed common molecules expressed by the IFN-? stimulation, however, we also observed expression of cytokines, chemokines and histocompatibility molecules specifically related to this signal in both cells populations. Together, our data suggest that DNCs and FRCs differ in the response profile according to inflammatory stimuli to which they are exposed, increasing the differential expression of molecules involved in the positive and negative regulation of immune response

Úlcera de membros inferiores é uma das complicações do diabetes melito que acomete aproximadamente 15% dos portadores da doença e resultam em elevada taxa de mortalidade. São feridas de difícil resolução, em geral, refratárias aos diversos tipos de tratamentos. Um dos principais aspectos que contribuem para sua cronicidade é a modificação no comportamento de fibroblastos. O objetivo do estudo foi comparar in vitro modificações no comportamento de fibroblastos derivados de ferida de membro inferior de indivíduos diabéticos com fibroblastos derivados de pele normal, quanto a proliferação celular e a capacidade de contração de modelo tridimensional de matriz de colágeno povoado por células, além de investigar o perfil de expressão gênica diferencial dessas células. Para tanto, foram cultivados fibroblastos provenientes de tecido de granulação de feridas de membro inferior de pacientes com diabetes do tipo 2 (FFD) e de pele normal (FC). Foram verificadas anormalidades morfológicas no grupo FFD compatíveis com senescência celular; menor contração da matriz de colágeno povoado por fibroblastos do grupo FFD (redução de 23% da área original) comparado ao grupo FC (redução de 30% da área original p<0,001). Pela técnica de microarray foram identificados 143 genes diferencialmente expressos, em sua maioria hipoexpressos, no grupo FFD, dentre os quais, destacam-se aqueles relacionados a processos de senescência e apoptose celular, bem como déficit na síntese e contração de fibras colágenas / Lower limbs ulcer is one of the complications of diabetes mellitus that affects approximately 15% of the patients and results in high mortality. Wounds that is difficult to heal, generally refractory to many treatments. One of the main aspects that contribute to disease chronicity is the change in the fibroblast behavior. The aim of this study was to compare changes in the in vitro fibroblasts behavior from diabetic leg ulcer with fibroblasts derived from normal skin as to cell proliferation and contraction capacity of a threedimensional fibroblasts populated collagen lattice, as well as to investigate the pattern of differential gene expression in these cells. For this purpose, fibroblasts were cultured from granulation tissue of lower limb ulcer in patients with type 2 diabetes (FFD) and from normal skin (FC). Morphological abnormalities compatible with cellular senescence were observed in the FFD. Reduced matrix contraction in fibroblasts populated group (FFD reduction of 23% from the original area) compared to FC (30% reduction from the original area) - (p <0.001). Using DNA microarray 143 differentially expressed genes were identified, most of them were underexpressed in FFD group, among which are those related to senescence and apoptosis, as well as deficits in the synthesis and contraction of collagen fibers

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem mu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to study basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNAs sequences capable of moving from one region to another in the cell genome. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the induced Pluripotent Stem Cells (iPS) compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and nonviral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. Both cell types was infected with viral vectors and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, and KLF-4; transformed cells were evaluated for morphology, immunocytochemistry... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: José Buratini Junior / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Juliano da Silveira / Banca: Marcelo Marcondes Seneda / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: O oócito é responsável por regular os mecanismos da maturação do complexo cumulus oócito (COC) principalmente via secreção de fatores. parácrinos.Dentre os fatores secretados pelo oócito (OSF) desta-se o fator de crescimento dos fibroblastos 10 (FGF10), e dois fatores TGFβ mais estudados a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15) e fator de crescimento de diferenciação 9 (GDF9) e estão associados com o desenvolvimento da competência oocitária. O presente trabalho investigou a regulação do oócito sobre as células do cumulus em dois cenários atuais da maturação in vitro, na presença de hormônio folículo estimulante (FSH) ou ampirregulina (AREG). A ausência do oócito afeta a expansão das células do cumulus e também o consumo de glicose e a produção de lactato e a adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia na expansão mas não no consumo de glicose nem na produção de lactato. A oocectomia afeta também a expressão gênica reduzindo a abundância de RNAm de hialurona sintetase 2 HAS2 e elevando a expressão de prostaglandina sintase 2 (PTGS2), pentraxina 3 (PTX3) e proteína indutora do fator de necrose tumoral 6 (TNFAIP6) na presença de FSH e AREG. A adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia sobre a expressão de RNAm de AREG às 4 horas de cultivo, HAS2 e PTGS2 às 22 horas de cultivo apenas quando os complexos foram cultivados na presença de AREG. Adicionalmente foi investigado a ação isolada do FGF10 sobre a diferenciação das células do cumulus. O FGF10 re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The oocyte is responsible for regulating mechanisms of cumulus oocyte complex (COC) maturation mainly through secretion of paracrine factors. Including oocyte secreted factors (OSF) are the fibroblast growth factor 10 (FGF10), and two TGF beta factors most studied, bone morphogenetic protein 15 (BMP15) differentiation and growth factor 9 (GDF9), and they are associated with the oocyte development of competence. This study investigated the regulation of oocyte cumulus cells on two current scenarios in vitro maturation in the presence of follicle stimulating hormone (FSH) or ampirregulina (AREG). The absence of oocyte affects the expansion of the cumulus cells and also the glucose consumption and lactate production and addition of denuded oocytes reverses the effect of the expansion oocectomia but not glucose consumption or lactate production. The oocectomia also affects gene expression by reducing the abundance of mRNA hialurona synthetase 2 HAS2 and raising synthase prostaglandin expression 2 (PTGS2), pentraxin 3 (PTX3) and inducing protein of the tumor necrosis factor 6 (TNFAIP6) in the presence of FSH and AREG. The addition of denuded oocytes reverses the effect of AREG on oocectomia mRNA expression at 4 hours of culture, HAS2 and PTGS2 to 22 hours of cultivation only when complexes were grown in the presence of AREG. Additionally it investigated the isolated FGF10 action on the differentiation of cumulus cells. FGF10 reverses the effect of on the expansion of the cells and the expression of HAS2 and GFPT1apenas to 22 hours in cumulus but not glucose consumption or lactate production, which shows a delayed effect of FGF10 necessitating the presence of other OSF to soon effect as seen previously in the literature. Complementary to the results, it appears that the cumulus cells have an intracumulus control Smad2-activation by the presence of GDF9 and BMP15 in cumulus cells. In summary the oocyte... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Resolvina D1 y Resolvina E1 inhiben la activación de AKT, ERK1/2 y NF-kB dependiente de LPS y previenen la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 en fibroblastos cardíacos Los fibroblastos cardiacos (FC) son células que tienen como función regular la matriz extracelular (MEC), pueden responder a estímulos endógenos o exógenos que alteren la homeostasis del sistema, y en caso de injuria, pueden proliferar y migrar hacia el sitio de daño. Uno de los agentes proinflamatorios más estudiados y utilizados es el lipopolisacárido (LPS) bacteriano, éste desencadena la respuesta inflamatoria activando las vías de señalización Akt, ERK1/2 y NF-κB, que conducen a la expresión de citoquinas proinflamatorias y factores de crecimiento los que, a su vez, aumentan la expresión de proteínas de adhesión como ICAM-1, VCAM-1, E-selectina, L-selectina, entre otras; permitiendo que células del sistema inmune viajen desde la circulación sanguínea hasta el sitio de injuria, para cicatrizar la herida. La inflamación puede ser terminada activamente por mediadores proresolutivos. Unos de estos mediadores son la Resolvina (Rv) D1 y E1. La RvD1 proviene del ácido docosahexaenoico y la RvE1 del ácido eicosapentaenoico. Estas se biosintetizan durante la inflamación y se les ha asociado propiedades antiinflamatorias, limitando la infiltración de neutrófilos, estimulando la fagocitosis de los macrófagos y reduciendo el nivel de dolor inflamatorio y fibrosis. Sin embargo, no existe evidencia de los efectos que podría tener en FC. El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de RvD1 y RvE1 en FC, para así estudiar las acciones que tendría en un contexto inflamatorio inducido por LPS, evaluando la actividad en las vías de señalización Akt, ERK1/2 y NF-κB y sobre la expresión de las proteínas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1. 12 Los resultados obtenidos muestran que RvD1 presenta una significativa disminución de la activación de Akt y ERK1/2, no así de NF-κB. RvE1 disminuye significativamente la activación de ERK1/2, sin embargo, no presenta cambios significativos respecto al control en la fosforilación de Akt y NF-κB. Además, se demostró que en FC estimulados con LPS y pretratados con RvD1, disminuyó la activación de las vías Akt, ERK1/2 y NF- κB respecto a LPS, y consecuentemente disminuyó la expresión de VCAM-1, pero no de ICAM-1. Por otro lado, RvE1 disminuyó significativamente la activación de Akt, no así la activación de ERK1/2 y NF-κB estimuladas por LPS. Además, disminuyó la expresión de ICAM-1 estimulado por LPS, pero no de VCAM-1. En conclusión, nuestros resultados sugieren que tanto RvD1 como RvE1 poseen propiedades resolutivas en un modelo de inflamación en FC, lo cual posibilitaría su uso como nuevas herramientas terapéuticas en enfermedades cardiacas / Resolvin D1 and Resolvin E1 inhibit AKT, ERK1/2 and NF-kB activation LPSdependent and prevent ICAM-1 and VCAM-1 expression in cardiac fibroblasts Cardiac fibroblasts (CF) are cells that regulate the extracellular matrix (ECM), they can respond to endogenous or exogenous stimuli that alter the homeostasis of the system, and in case of cardiac tissue injury, they can proliferate and migrate to the site of damage. One of the most studied and used proinflammatory agents is bacterial lipopolysaccharide (LPS), it triggers the inflammatory response activating the signaling pathways Akt, ERK1/2 and NF-κB, which lead to the expression of proinflammatory cytokines and growth factors that increase the expression of adhesion proteins such as ICAM-1, VCAM- 1. E-selectin, L-selectin, among others. These effects of LPS favor to the cells of the immune system extravasate to the site of injury to degrade the microorganism and heal the wound. Inflammation can be actively terminated by proresolving mediators, such as RvD1 and RvE1. RvD1 derived from docosahexaenoic acid and RvE1 from eicosapentaenoic acid. These are biosynthesized during inflammation and have been associated with anti- inflammatory properties, limiting the infiltration of neutrophils, stimulating the phagocytic activity of macrophages and reducing the level of inflammatory pain and fibrosis. However, there is no evidence respect of the effects it could have on FC. In this study, we investigated the role of RvD1 and RvE1 in FC, to study the actions that would have in an inflammatory context induced by LPS, evaluating the activity in the signaling pathways Akt, ERK1/2 and NF-κB and the expression of adhesion proteins ICAM-1 and VCAM-1. 14 The results show that RvD1 exert a significant decrease of Akt and ERK1/2 activity, but not NF-κB; RvE1 significantly decreases the activation of ERK1/2, however, it does not present significant effect in regard to the control in the phosphorylation of Akt and NF-κB. In addition, the pretreatment with RvD1, has decreased the activation of the Akt, ERK1/2 and NF-κB pathways respect to LPS, and consequently decreased the expression of VCAM-1, but not ICAM-1. On the other hand, RvE1 has significantly decreased the activation of Akt stimulated by LPS, but not of ERK1/2 nor NF-κB. Additionally, the expression of ICAM-1 stimulated by LPS has decreased, but not of VCAM-1. In conclusion, our results suggest that RvD1 and RvE1 have resolutive properties in an inflammatory model in CF, which would make possible its use as new therapeutic tool in cardiac diseases / Proyecto Fondecyt N° 1170425

O colágeno é a proteína fibrosa predominante da matriz extracelular e é a maior proteína constituinte do tecido conectivo. Alterações nas taxas de colágeno tipo I na derme ocorrem durante o envelhecimento. A introdução de um agente eficaz para a manutenção da pele durante o envelhecimento é importante, possibilitando a redução destes efeitos. Neste projeto foram avaliados os efeitos proliferativos e de biossíntese de colágeno, em fibroblastos humanos de derme normal tratados com colágeno bovino e derivados de diferentes perfis moleculares, colágeno super hidrolisado, colágeno hidrolisado e gelatina, em diferentes experimentos, adesão e viabilidade celular, síntese de colágeno e análises das fases do ciclo celular. Os resultados sugerem que o colágeno bovino e derivados induzem as propriedades adesivas nos fibroblastos, não desencadeiam efeitos citotóxicos e induzem a biossíntese de colágeno pelos fibroblastos. Os resultados de síntese de colágeno indicam que concentrações menores de colágeno super hidrolisado e colágeno hidrolisado podem ser utilizadas em relação à amostra de gelatina. Comparando os resultados após 48 horas de cultura na síntese de colágeno e nas modificações na fase S do ciclo celular, as células tratadas com as amostras de colágeno super hidrolisado e colágeno hidrolisado induziram aumentos significativos. / Collagen is the predominant fibrous protein of the extracellular matrix and it is a major protein constituting connective tissue. Alterations in the rate of collagen type I deposition occur during aging. The introduction of an efficient agent for the maintenance of the skin during the aging process is important as it can reduce those effects. Thus, the proliferative effects and collagen biosynthesis in normal dermis of human fibroblasts were evaluated in this project. The fibroblasts were treated with bovine collagen and its derivates from different molecular mass, as well as super hydrolysate collagen, hydrolysate collagen and gelatine. Different assays were applied as adhesion, cell viability, collagen biosynthesis, and cell cycle phases analysis. The results suggest that the bovine collagen and its derivates can induce to adhesion properties in fibroblasts, they do not produce cytotoxic effects, and they can induce the collagen biosynthesis by fibroblasts. The results also show that super hydrolysate collagen and hydrolysate collagen can be used in lower concentrations than gelatine in collagen biosynthesis analysis. Analyzing the results after 48 hours of culture, the cells treated with the samples of super hydrolysate collagen and hydrolysate collagen had significant improvement in the collagen biosynthesis and in the modifications in the S phase of the cell cycle.

Evidências sugerem que o fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2), produzido por melanomas, possui importante papel no crescimento tumoral, angiogênese e metástase. Assim, o uso de anticorpo monoclonal (mAb) que reconhece e bloqueia a atividade de FGF2 é uma abordagem a ser considerada em oncologia. O propósito desse estudo foi avaliar a aplicação diagnóstica e terapêutica de um novo anticorpo anti-FGF2, 3F12E7 IgG1, em melanoma experimental B16-F10. Para isso, camundongos C57Bl/6 foram implantados subcutaneamente (ou intravenosamente, para ensaios de metástase) com células de melanoma murino B16-F10 (5x105 células/animal). Quando tumores alcançaram 3-4 mm de diâmetro (ou 24 h pós-inóculo de células B16-F10, no caso de ensaios de metástase), camundongos foram tratados com anti-FGF2 3F12E7 IgG. Animais controle receberam igual volume do veículo ou quantidade de anticorpo controle de isotipo. Grupos: animais tratados com (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1; (2) ligante de CEA IgG1 (controle de isotipo); e (3) veículo. O tratamento dos camundongos portadores de tumor com anti-FGF2 IgG resultou, comparado com os controles salina e de isotipo, em uma redução no número de focos metastáticos nos pulmões (ANOVA, p < 0,05), em ensaios de metástase experimental, bem como em uma menor taxa de crescimento de tumores subcutâneos (n=7/grupo). Esse resultado é acompanhado por uma redução na densidade vascular do tumor, conforme determinado por imunomarcação para CD34 ou CD31. A captação tumoral de anti-FGF2 3F12E7 IgG foi avaliada por métodos de medicina nuclear, usando esse anticorpo radiomarcado com tecnécio-99m. Estudos SPECT/CT in vivo e de biodistribuição ex vivo revelaram que 99mTc-anti-FGF2 3F12E7 IgG pode atingir eficientemente tumores subcutâneos e metastáticos de B16-F10. Assim, esses dados sugerem que anti-FGF2 3F12E7 IgG pode ser uma estratégia antitumoral promissora para melanoma, bem como uma potencial ferramenta de imagem a ser explorada, atuando como um possível traçador para rastrear tumores FGF2-positivos e mapear esse estímulo angiogênico no microambiente tumoral. Aprovado pelo comitê de ética (CAPPesq): número 0942/09 / Compelling evidence suggests that fibroblast growth factor 2 (FGF2), produced by melanomas, plays important role in tumor growth, angiogenesis and metastasis. Therefore, the use of a monoclonal antibody (mAb) that recognizes and blocks FGF2 activity is seen as an approach to be considered in oncology. The purpose of this study was to evaluate the diagnostic and therapeutic application of a new anti-FGF2 antibody, 3F12E7 IgG1, in experimental melanoma B16-F10. For this, C57Bl/6 mice were subcutaneously (or intravenously, for experimental metastasis assay) implanted with murine melanoma B16-F10 cells (5x105 cells/animal). When tumors reached 3-4 mm in diameter (or 24 h after B16-F10 cells injection, in the case of metastasis assay), mice started receiving anti-FGF2 3F12E7 IgG. Control mice received equal volume of vehicle or isotype control IgG amount. Groups: (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1-treated, (2) CEA-binding IgG1-treated (isotype control) and (3) vehicle-treated mice. The treatment of tumor-bearing mice with anti-FGF2 IgG, compared with saline and isotype controls, led to a reduction in the number of metastatic foci in the lungs (ANOVA test, p < 0.05), in experimental metastasis assays, as well as to a lower subcutaneous tumor growth rate (n=7 per group). This result is accompanied by a reduction in the tumor vascular density, as determined by CD34 or CD31 staining. The anti-FGF2 3F12E7 IgG tumor uptake was evaluated by nuclear medicine approaches, using this antibody radiolabeled with technetium-99m. In vivo SPECT/CT and ex vivo biodistribution studies reveled that 99mTc-anti-FGF2 IgG could efficiently achieved B16-F10 subcutaneous and metastatic tumors. Thus, these data suggest that the anti-FGF2 3F12E7 IgG may be a promising antitumor strategy for melanoma, as well as a potential imaging tool to be explored, working as a possible tracer to identify FGF2-positive tumors and map this angiogenic stimulus in the tumor microenvironment. Ethics committee (CAPPesq) approval number 0942/09

Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção do periodonto. Alloderm® (MDA) é um substituto alógeno muito utilizado e estudado em periodontia. O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, se a MDA é uma matriz tridimensional adequada, através de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais e células neoplásicas; e, ainda, se os subprodutos da MDA influenciam o comportamento celular. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais de cão (FGC) e fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de, respectivamente, três indivíduos e três cães saudáveis. As células FGC, FGH e B16F10 de melanoma murino foram cultivadas sobre a MDA por até 14 dias. Os seguintes parâmetros foram avaliados: presença, morfologia e distribuição de FGC, FGH e B16F10 por fluorescência direta; viabilidade de FGC e FGH por MTT; e o efeito do meio de cultura condicionado (MC) em MDA por 24 h na viabilidade celular de FGC por MTT. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn para comparações múltiplas (nível de significância: 5%). Resultados: A epifluorescência revelou que, em 12 h, FGH e FGC estavam aderidos à superfície da MDA em baixa densidade celular, exibindo morfologia poligonal com núcleos esféricos, enquanto que, aos 7 e 14 dias, essas células apresentavam com formato alongado, núcleos ovalados e citoesqueleto de actina com fibras de estresse. Aos 7 e 14 dias, FGC apresentavam-se distribuídos de forma desigual sobre a MDA, formando uma camada celular descontínua, sem aumento no número de células entre os períodos; FGH formaram uma monocamada celular na superfície da MDA, estando presentes em maior número após 14 dias de cultivo (p<0,05); e B16F10 exibiram um aumento no número de células de 12 h para 7 dias (p<0,05), apresentando-se dispostas em aglomerados celulares, principalmente na superfície da MDA, com a formação de camada contínua aos 14 dias. Notou-se maior número de células nas amostras cultivadas com B16F10, seguido por FGH e FGC aos 7 dias (p<0,05). Aos 14 dias, FGH e B16F10 estavam presentes em maior número, com diferença estatística significante em relação aos FGC (p<0,05). Foi observada maior porcentagem de células na superfície (p<0,05) do que no interior da MDA e essa proporção manteve-se estável durante os períodos avaliados para todos os tipos celulares. O ensaio de MTT indicou maior viabilidade celular nas amostras cultivadas com FGH comparado a FGC (p=0,024), aos 7 e 14 dias. Notou-se um decréscimo na viabilidade celular em culturas cultivadas em MC, com diferença estatística entre os grupos em 48 e 72 horas (p<0,05). Conclusão: Podemos concluir que fibroblastos gengivais e mesmo células altamente proliferativas, como B16F10, povoam apenas superficialmente a MDA e que FGC são afetados negativamente pelos subprodutos da MDA, reduzindo sua viabilidade. / Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Alloderm® (Alloderm® - ADM) is the most used and studied allogeneic substitute. The aim of this investigation was to verify if ADM is a suitable threedimensional matrix, through its in vitro response to gingival fibroblasts and cancerous cells lineage and, also, if ADM end products affect cellular behavior. Methods: Canine gingival fibroblasts (CGF) and human gingival fibroblasts (HGF) cultures were established by the explant technique of gingival connective tissues of three dogs and three healthy patients, respectively. CGF, HGF and B16F10 cells of murine melanoma were seeded on ADM and grown for up to 14 days. The following parameters were assessed: presence, morphology and distribution of CGF, HGF e B16F10 by direct fluorescence; CGF and HGF viability by MTT; and the effect of culture medium conditioned (CM) in the MDA for 24 h on CGF viability by MTT. Quantitative data were submitted to Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, followed by Dunn\'s method. Results: Epifluorescence revealed that CGF and HGF were adherent and exhibited a polygonal morphology at 12 h while at 7 and 14 days they were spread, exhibiting an elongated shape and the actin cytoskeleton assembled into stress fibers. CGF were unevenly distributed on ADM surface, showing no increase in cell number over the experimental periods; HGF formed a monolayer on the ADM surface, in a higher number at 14 days (p<0,05); B16F10 exhibited na increase in cell number in 7 days (p<0,05), and were mainly arranged in cell aggregates on the ADM, forming a continuous layer at 14 days. A higher percentage of cells on the ADM surface (p <0.05) compared to inside the matrix was observed for all cell types in all periods. MTT values indicated higher cell viability in samples cultured with HGF compared to CGF (p=0.024). A significantly lower cell viability for CGF grown in CM compared to cells grown in non conditioned medium at 48 and 72 h (p <0.05) was noticed. Conclusion: Gingival fibroblasts and even highly proliferative cells as B16F10 can be only superficially located on ADM and CGF are negatively affected by ADM end products, reducing its viability.

O câncer é um problema de saúde pública mundial. O Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou que no Brasil, no ano de 2015, 576 mil novos casos surgiram, representando a segunda maior causa de mortes por esta doença. Entre os tratamentos oferecidos para o câncer, podemos destacar a radioterapia, que utiliza fontes ionizantes para erradicar ou impedir a proliferação das células tumorais. Entretanto, o uso da radiação ionizante (R.I), pode acarretar danos às células não tumorais circunvizinhas ao tumor. Assim, tratamentos coadjuvantes que possam diminuir os efeitos deletérios da radiação são extremamente importantes. Neste contexto, o laser de baixa potência (LBP) surge como alternativa para modular a resposta das células frente à radiação ionizante. Sendo esse nosso objetivo, células de fibroblastos de gengiva humana (FMM1) e câncer de mama (MDA-MB-231) foram expostas as doses de 2,5 e 10 Gy e após 24 h receberam LBP (&lambda;= 660 nm, 40 mW e 0,04 cm²) com as densidades de energia de 30, 60, 90, 120 e 150 J/cm². A viabilidade celular foi quantificada através do teste de exclusão com azul de tripan durante quatro dias. A influência do LBP nas fases do ciclo celular e a expressão do Antígeno Nuclear de Proliferação celular (PCNA) foram realizadas por citometria de fluxo. A expressão de &beta;-Galactosidase foi considerada para quantificar a senescência celular. Considerando os parâmetros utilizados, observou-se aumento na viabilidade celular, da expressão de PCNA, maior população nas fases S e G2/m do ciclo celular, e a diminuição de células senescentes para as células não tumorais, enquanto que para as tumorais, nenhuma resposta foi observada na viabilidade celular, maior população nas fases S e G2/m do ciclo celular e na quantidade de células senescentes enquanto que a expressão de PCNA diminuiu. Diante disso, concluímos que o LBP exerceu efeitos em ambas as linhagens celulares. / Cancer is considered a public health problem worldwide. According to the Brazils National Cancer Institute (INCA), 576,000 new cases of cancer were estimated for 2015 in Brazil, representing the second leading cause of death. Radiotherapy may be a treatment to several of types of cancer, frequently using ionizing radiation to eradicate or prevent the proliferation of tumor cells. This treatment, however, can lead to death of non-tumor cells around in irradiated tissue. Given this, adjuvant therapies that can minimize the side effects of ionizing radiation are of extremely importance. In this context, low power laser (LPL) may be an alternative to modulate the response of healthy cells to ionizing radiation. In this study, cells of human gingival fibroblasts (FMM1) and breast cancer (MDAMB- 231) were exposed to gamma radiation at doses of 2.5 and 10 Gy. After twenty-four hours, cell were irradiated with LPL (&lambda;= 660 nm, 40 mW and total area of 0.04 cm²) with energy densities of 30, 60, 90, 120 and 150 J/cm². The cell viability was measured during four days, using the trypan blue technique. The influence of LPL on the cell cycle and on expression of the nuclear antigen of cellular proliferation (PCNA) was evaluated by flow cytometry. The expression of &beta;-Galactosidase was the chosen method to assess cell senescence. Considering our adopted parameters, and focusing on the non-tumor cells, we have observed an increase in: 1) cell viability; 2) cell population in phases S and G2/M cell cycle; 3) PCNA expression with decrease in senescence. No alterations were observed in the cell viability, with greater population in phases S and G2/M cell cycle, while the number of senescent cells and the expression of PCNA were decreased. Therefore, we have concluded that the LPL promoted effects on both cell lineages, with increased cell viability on FMM1 cells, whether cancer cells maintained a decreased proliferation.

Estudos relataram a atividade antimicrobina de Equisetum giganteum e Punica granatum, reduzindo o risco do desenvolvimento da estomatite protética, doença relacionada principalmente à colonização das próteses pelo fungo Candida albicans. Diante disso, é necessário que essas plantas sejam bem toleradas pelos tecidos bucais e, se possível, auxiliem no processo de reparo. Objetivo: Realizar um estudo fitoquímico de substâncias potencialmente ativas de Equisetum giganteum e Punica granatum e avaliar a viabilidade de fibroblastos gengivais humanos frente a diferentes concentrações destas plantas, após diferentes períodos in vitro. Material e Métodos: Após a identificação dos compostos das plantas por HPLC-PAD, foram selecionadas as frações com melhor atividade antifúngica perante Candida albicans. Os extratos brutos e frações selecionadas de P. granatum e E. giganteum foram testados em diferentes concentrações (0.23, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5, 15 e 30 mg) e períodos (12, 24, 36 e 60 h) sobre fibroblastos gengivais humanos (FGH), para a avaliação de suas citotoxicidades através da análise da viabilidade dos FGH, pelo ensaio LIVE/DEAD. Por meio desse ensaio, analisamos quantitativamente a viabilidade celular através das leituras das unidades relativas de fluorescência (URF) e qualitativamente por meio da analise da morfologia e da densidade observadas pela microscopia invertida de fluorescência, após três experimentos independentes para cada período de avaliação. Os resultados quantitativos paramétricos foram representados como média e desvio padrão (SD) com análise de Variância ANOVAOne- Way, seguida da análise comparativa pelo teste de Tukey HSD. Os resultados quantitativos não paramétricos foram apresentados como mediana e quartis e foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido de análise comparativa pelo teste de Dunn, de acordo com as análises de normalidade (Teste de Kolmogorov-Smirnov). Valores de p< 0.05 foram indicativos de significância estatística. Conclusões: Foram identificados compostos fenólicos, como flavonoides e taninos em E.giganteum e P. granantum, respectivamente. Identificamos uma citotoxicidade concentração-dependente para as duas plantas testadas, independente do tempo. Sob as menores concentrações das plantas a viabilidade e a morfologia dos FGH foram preservadas. Dentro deste contexto, acreditamos na possibilidade de se utilizar essas plantas como terapia alternativa em diversas áreas de saúde, porém em concentrações biocompatíveis. / Studies have reported the antimicrobial activity of Equisetum giganteum and Punica granatum, reducing the risk of development of denture stomatitis, a disease mainly related to the colonization of prostheses by the fungus Candida albicans. In view of this, it is necessary that these plants be well tolerated by the oral tissues and, if possible, assist in the repair process. Objective: To carry out a phytochemical study of potentially active substances of E. giganteum and P. granatum and to evaluate the viability of human gingival fibroblasts against different concentrations of these two plants, after different periods in vitro. Material and Methods: After the identification of the plant compounds by HPLC-PAD, the fractions with the best antifungal activity against Candida albicans were selected. The crude extracts and selected fractions of P. granatum and E. giganteum were tested at different concentrations (0.23, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5, 15 and 30 mg) and periods (12, 24, 36 and 60 h) against human gingival fibroblasts (FGH), for the evaluation of their possible cytotoxicity through the analysis of the viability of FGH by the LIVE/DEAD assay. By means of this assay we quantitatively analyzed the cell viability through the readings of the relative units of fluorescence (URF) and qualitatively by analysis of the cellular morphology and density using inverted fluorescence microscopy, after three independent experiments. The parametric quantitative results were represented as mean and standard deviation (SD) with ANOVA-One-Way Variance analysis, followed by comparative analysis by the Tukey HSD test. The non-parametric quantitative results were presented as medians and quartiles and were submitted to the Kruskal-Wallis test, followed by comparative analysis by the Dunn test, according to normality tests (Kolmogorov-Smirnov test). Values of p <0.05 were indicative of statistical significance. Conclusions: Phenolic compounds, such as flavonoids and tannins, were identified in E. giganteum and P. granantum, respectively. We identified a concentration-dependent cytotoxicity for the two plants tested, regardless of the time. Under the lowest concentrations of plants the viability and morphology of FGH were preserved when compared to the control. Within this context, we believe in the possibility to use these plants as alternative therapy in several health areas, but in biocompatible concentrations.