Les technologies de type laboratoire sur puce (« lab on chip » LOC) mettent à profit la miniaturisation pour réaliser production, traitement, et analyse physico-chimiques sur un même substrat de petite taille avec comme résultat des dispositifs portables, plus rapides, demandant de plus petites quantités de réactifs, produits et opérés à plus faible coût. Les produits et les applications développés pour tirer profit de ces avantages ont le potentiel de transformer plusieurs secteurs comme ceux de la médecine et de la surveillance environnementale. Les mesures de calorimétrie revêtent un intérêt particulier pour l’intégration aux plateformes de type LOC notamment parce que la production de chaleur est un phénomène ubiquitaire. Or, cette intégration repose avant tout sur la capacité de produire des dispositifs miniaturisés suffisamment performants et compatibles avec la construction des plateformes LOC. La calorimétrie miniaturisée est un champ relativement peu développé même si, comme à l’échelle conventionnelle, elle permet d’obtenir des informations utiles pour la compréhension des phénomènes de transformations de la matière. Or, la calorimétrie miniaturisée fait face à un défi de taille. La taille réduite des échantillons résulte inévitablement en une diminution de la quantité de chaleur à mesurer. Possiblement pour faire face à cette limite, la grande majorité des calorimètres miniaturisés adopte une configuration planaire, car le positionnement du système cellule calorimétrique-échantillon sur membrane a pour effet de maximiser leur sensibilité. La configuration membranaire réduit la conduction thermique à travers le substrat ce qui, à puissance égale, résulte en davantage de signal. Cette configuration demande toutefois certains compromis. Elle pousse par exemple à construire les thermopiles à partir de films de plus en plus minces afin d’éviter d’annuler les gains. Or, des effets de « film mince », sont observés qui dégradent significativement les propriétés attendues des matériaux. Les gains apportés par la configuration membranaire peuvent aussi être annulés par la conduction thermique hors substrat qui est très sensible à la géométrie de la source de chaleur ainsi qu’aux conditions ambiantes. Ces deux phénomènes affectent significativement la sensibilité des calorimètres miniaturisés et peuvent résulter en une diminution de la précision des mesures. Dans le premier cas, on estime à 20-30% l’erreur évitée; dans le second cas, on estime à près de 30% l’erreur évitée. Les contributions présentées dans cette thèse proposent des moyens d’améliorer la précision des calorimètres miniaturisés, en renforçant la compréhension des compromis fondamentaux à négocier dans la conception de tels dispositifs et d’établir un « modèle » pour prédire avec une plus grande fidélité la performance de calorimètres miniaturisés à partir des paramètres de l’architecture. On peut donc plus précisément évaluer le potentiel de différents designs de calorimètres miniaturisés et explorer la manière de faire des calorimètres miniaturisés de bons candidats à l’intégration sur les plateformes LOC, que ce soit sur structure membranaire ou d’autres substrats.

La grande famille des facteurs de transcription Ets est caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN, le domaine ETS, qui présente une structure de type hélice-tour-hélice ailé et qui reconnaît la séquence nucléotidique GGAA/T. Ces facteurs sont des protéines modulaires, dont les domaines sont structurellement conservés, régulent la transcription de leurs gènes cibles. L’action régulatrice de ces facteurs de transcription, ainsi que leur spécificité, dépendent de leurs sites d’expression, du taux auquel ils sont exprimés ainsi que des modifications post-traductionnelles qui les touchent. Au sein de la famille Ets, les trois membres du groupe PEA3 - Erm, Pea3 et Er81 - sont impliqués dans divers processus tant physiologiques tels que le développement des neurones sensitifs et moteurs que pathologiques tels que la croissance et l’invasion tumorale ou l’apparition de métastases, au niveau mammaire notamment. Notre travail a eu pour ambition de mieux comprendre les relations structure/fonction des membres du groupe PEA3, et plus particulièrement de Erm. Pour réaliser l’étude structurelle des trois membres du groupe PEA3, nous les avons produits, via le système d’expression baculoviral, et purifiés. Dans ces conditions, nous avons obtenu plusieurs mg de la protéine Erm purifiée à plus de 95%. Nous avons dès lors réalisé des études par dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge qui ont mis en évidence une faible structuration de la protéine. Ces résultats corrèlent avec les prédictions bioinformatiques pour la structuration en hélice alpha. Néanmoins, certaines divergences sont apparues en ce qui concerne la détermination de la structuration en feuillets beta, ces derniers étant probablement surévalués dans les études expérimentales suite à une forte propension à l’agrégation protéique. En parallèle, nous avons pris part à la démonstration du fait que la protéine Erm est modifiée par ubiquitinylation. Cette modification post-traductionnelle a pour conséquence de diriger Erm vers la voie de dégradation par le protéasome et donc de rendre ce facteur de transcription très labile. C’est ainsi qu’à l’heure actuelle, les tentatives de cristallisation de la protéine sont restées sans succès. Afin de mettre en évidence les gènes régulés par les membres du groupe PEA3 dans le cancer mammaire métastatique, nous avons effectué des études par micro-array dans la lignée humaine MDA-MB-231. Lors d’expériences où l’expression de erm et de er81 a été diminuée par la technique des shRNA, nous n’avons malheureusement pas pu identifier de gènes dont l’expression était modulée de façon reproductible. Enfin, dans le but de mieux cerner les mécanismes qui conduisent à la surexpression des facteurs de transcription du groupe PEA3, nous nous sommes intéressés à la régulation de leur expression. Aussi, suite au travail initié préalablement au laboratoire sur le gène erm humain, nous avons déterminé une région de 24 nucléotides au sein du promoteur sensible à l’activation par la voie des PKCs conventionnelles (cPKCs). Cette région contient des sites putatifs de liaison pour plusieurs facteurs de transcription. Les expériences de mutagenèse dirigée et de retard sur gel indiquent que la régulation positive de erm par la voie des cPKCs semble être le résultat de la modification de l'activité d'un ou plusieurs facteur(s) transcriptionnel(s) qui reste(nt) à identifier.

Le fer est un cofacteur enzymatique indispensable à la survie de tous les eucaryotes. La biodisponibilité du fer est à ce point critique que des mécanismes homéostatiques sont enclenchés afin d'en réduire la consommation en période de carence. Cette stratégie a pour but d'économiser le fer et de le conserver pour des processus cellulaires fer-dépendants essentiels à la survie cellulaire. Chez la majorité des eucaryotes, la nature de ces mécanismes est toujours inconnue. Mes travaux de doctorat ont donc porté sur l'élucidation du mécanisme par lequel la levure modèle Schizosaccharomyces pombe parvient à limiter l'utilisation de son fer lorsque celui-ci se raréfie. Lors de mes travaux, j'ai identifié trois gènes codant pour des composantes fer-dépendantes chez S. pombe qui subissent une répression lors d'une carence en fer : pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Il a été déterminé que des éléments en cis de type CCAAT sont au centre de leur expression différentielle. Des évidences génétiques et biochimiques ont montré qu'un hétérocomplexe protéique formé des sous-unités Php2/3/4/5 est impliqué dans la régulation fer-dépendante de la transcription de pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Plus précisément, c'est la sous-unité Php4 qui est responsable de la répression de leur expression en carence de fer. Il s'avère aussi que la transcription du gène codant pour Php4 (php4[indice supérieur +]) est elle-même régulée par le statut en fer. Il a d'ailleurs été démontré que le facteur de transcription de type GATA Fep1 réprime l'expression de php4[indice supérieur +] en présence de fer, et ce, en s'associant à son promoteur de manière fer-dépendante. Une étude à large spectre à l'aide de micropuces à ADN a révélé que, lors d'une carence en fer, Php4 réprime la transcription d'un régulon composé de 86 gènes, dont la majorité codent pour des protéines fer-dépendantes ou des composantes impliquées dans l'homéostasie du fer. Parmi ceux-ci se trouve le gène codant pour le répresseur Fep1 (fep1[indice supérieur +]). Cette découverte a mis au jour une boucle de régulation réciproque entre les facteurs de transcription Fep1 et Php4. La capacité de Php4 à réprimer directement la transcription a été confirmée par des essais de type simple-hybride. Ces essais ont également démontré que la fonction de Php4 est inactivée post-traductionnellement en présence d'ions de fer. Php4 est donc un régulateur transcriptionnel capable de jauger les niveaux de fer intracellulaires. L'étude de la régulation de la fonction de Php4 par le fer a permis de découvrir que le répresseur Php4 se localise au noyau lors d'une déficience en fer, tandis qu'il est exporté vers le cytosol par l'exportine Crm1 en présence de fer. Cet exportation nucléaire fer-dépendante implique la glutarédoxine Grx4. L'action inhibitrice de Grx4 sur la fonction de Php4 ne se limite pas à la régulation de sa localisation cellulaire. J'ai pu démontrer qu'en présence de fer, l'activité transcriptionnelle de Php4 est directement inhibée au noyau par Grx4. Cette régulation de Php4 par Grx4 s'avère directe étant donné l'association de ces deux protéines in vivo chez S. pombe. En conclusion, j'ai découvert que le répresseur Php4 est un élément central de la régulation de l'utilisation du fer chez la levure fissipare S. pombe . La découverte du rôle de Grx4 dans la régulation post-traductionnelle de Php4 pave la voie à l'élucidation d'un sentier signalétique par lequel une cellule eucaryote communique son statut en fer à ses régulateurs homéostatiques. La biodisponibilité du fer étant un facteur de virulence majeur chez les levures pathogènes, l'acquisition de nouvelles connaissances quant à la régulation de l'homéostasie du fer chez les mycètes devient cruciale pour le développement de nouveaux agents antifongiques.

L'objectif de mes travaux de doctorat était d'approfondir les connaissances sur le mode d'action du répresseur transcriptionnel Fep1 et de découvrir les mécanismes posttraductionnels par lesquels son activité serait régulée. Mes travaux ont été entrepris dans un contexte génétique php4[delta], où la régulation Php4-dépendante a été abolie. Ceci a permis d'exprimer Fep1 constitutivement et par conséquent d'étudier les effets directs du fer sur la protéine en la découplant de sa régulation transcriptionnelle par Php4. Dans le but de mieux caractériser la fonction de liaison à l'ADN de Fep1 dans un contexte in vivo, j'ai procédé par une approche d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Grace à une protéine de fusion TAP-Fep1, j'ai démontré que Fep1 s'associe à la chromatine de manière fer-dépendante. En utilisant différentes versions mutantes de la protéine TAP-Fep1, j'ai démontré que la région N-terminale de Fep1 est requise pour la liaison à la chromatine, cette région couvrant les 241 premiers acides aminés. Le rôle de la région C-terminale serait d'assurer la répression transcriptionnelle des gènes cibles étant donné qu'elle s'associe avec les corépresseurs Tup. Au niveau de la région N-terminale de Fep1, plusieurs motifs sont nécessaires pour une liaison optimale de Fep1 à la chromatine, notamment, deux doigts de zinc (ZF1 et ZF2) et une région riche en résidus cystéines (CRD). Lorsque la région 1-241 est fusionnée au domaine VP16 de transactivation, cette nouvelle protéine agit comme un activateur fer-dépendant, ce qui suggère que le domaine de liaison à la chromatine de Fep1 agit de façon modulaire et ce, indépendamment de la région C-terminale de la protéine. Afin d'élucider le mécanisme post-traductionnel impliqué dans l'inactivation de Fep1 en situation de carence de fer, j'ai procédé par une approche génétique. Grâce à une délétion du gène qui code pour la monothiolglutarédoxine Grx4, j'ai pu démontrer son rôle dans l'inactivation de Fep1 en réponse à la carence en fer. En effet, dans une souche grx4A, Fep1 agit comme un répresseur transcriptionnel constitutif. J'ai pu démontrer que la présence de Grx4 est nécessaire pour assurer le relargage de Fep1 de la chromatine en réponse à la carence en fer. La monothiolglutarédoxine, Grx4, est caractérisée par la présence de deux domaines fonctionnels: un domaine en N-terminal appelé thiorédoxine (TRX) et un domaine C-terminal appelé glutarédoxine (GRX). L'étude d'interaction de Fep1 avec Grx4 a révélé que le domaine TRX interagit avec la région C-terminale de Fep1 et ce, de manière constitutive. Par contre, le domaine GRX de Grx4 s'associe avec la région N-terminale de Fep1 et ce, d'une manière fer-dépendante. De plus, dans une souche grx4[delta], le domaine GRX s'est révélé être nécessaire à la fonction d'inhibition de Fep1 en réponse à la carence en fer. Le régulateur Fep1 possède plusieurs homologues fonctionnels potentiels chez les levures filamenteuses pathogènes, notamment Sfu1 chez Candida albicans. Grâce à l'expression de la protéine Sfu1 dans une souche fep1[delta], nous avons révélé le haut degré de conservation entre ces deux facteurs de transcription. En effet, l'expression hétérologue de Sfu1 dans S. pombe restaure tous les phénotypes observés suite à l'inactivation du gène fep1[indice supérieur +]. En conclusion, durant mes travaux de doctorat, j'ai caractérisé des déterminants moléculaires qui dictent la fonction du répresseur transcriptionnel Fep1. Ainsi, j'ai déterminé des régions nécessaires de Fep1 qui assurent sa liaison à la chromatine. J'ai aussi identifié un nouveau mécanisme de régulation post-traductionnelle de Fep1 faisant intervenir la monothiolglutarédoxine Grx4. De plus, j'ai démontré le potentiel qu'offre la compréhension des mécanismes de régulation de l'homéostasie du fer chez la levure à fission, puisque ce modèle peut être transposé jusqu'à un certain degré aux autres levures pathogènes, notamment, C. albicans. Enfin, étant donné l'importance de l'assimilation du fer pour le pouvoir infectieux de plusieurs levures pathogènes, il devient évident que les modes de régulation de l'acquisition du fer doivent être élucidés afin de contrer les levures pathogènes"--Résumé abrégé par UMI

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’objectif de ce travail était d’examiner la prévention des blessures du complexe pied-cheville chez les athlètes adolescents au travers de trois approches: les facteurs de risque de blessure du complexe pied-cheville liés à la course, l’épidémiologie des blessures du complexe pied-cheville et la mise en œuvre de stratégies de prévention. L’approche relative aux facteurs de risque de blessure du complexe pied-cheville liés à la course avait pour objectif de déterminer (i) comment la fatigue induite par la course pouvait affecter la force et la fatigabilité des fléchisseurs plantaires et dorsaux de la cheville, la répartition des pressions plantaires, la mécanique de la course et la raideur de l’arche médiale, (ii) comment le chaussage (chaussures à pointes ou “runnings”) pouvait affecter la répartition des pressions plantaires en sprint et enfin (iii) comment l’allure de course pouvait influencer la répartition des pressions plantaires. L’approche relative à l’épidémiologie des blessures du complexe pied-cheville avait pour objectif de recueillir et d’analyser, sur trois saisons, les blessures subies au niveau du complexe pied-cheville par de jeunes athlètes très entrainés et leurs relations potentielles avec le niveau de maturité de ces athlètes. L’approche présentant la mise en œuvre de certaines stratégies de prévention avait pour but d’abord de concevoir puis de valider une méthode pratique et fiable pour mesurer la souplesse. Le second objectif de cette approche était d’évaluer sur le terrain les effets d’un protocole de renforcement musculaire par électrostimulation sur la raideur de l’arche médiale du pied puis les effets d’un programme de renforcement musculaire combiné sur la répartition des pressions plantaires et la performance en sprint. / The aim of this work was to examine the foot-ankle injury prevention in adolescent athletes through three approaches: the running-related foot-ankle injury risk factors, the epidemiology of foot-ankle injuries and the implementation of prevention strategies. The approach dealing with the running-related foot-ankle injury risk factors aimed to determine (i) how running-induced fatigue may affect the force and the fatigability of the ankle plantar and dorsal flexor muscles, the foot plantar pressure distribution, the running mechanics and the medial arch stiffness, (ii) how the shoe wear (spikes or running shoes) may affect the plantar load distribution while sprinting and (iii) how running velocity may alter the plantar load distribution. The approach related to epidemiology of foot-ankle injuries aimed at collecting and analysing, over three seasons, the foot-ankle injuries sustained by highly-trained adolescent athletes and their potential relations with the maturity status of these athletes. The approach presenting some prevention strategies implementations aimed firstly to design and validate a convenient and reliable flexibility measurement method. The second purpose of this approach was to assess on the field the effects of a neuromuscular electromyostimulation strengthening protocol on the foot medial arch stiffness and the effects of a combined foot-ankle strengthening training on the foot plantar pressure distribution and the performance while sprinting.

FLI-1 est un facteur de transcription de la famille ETS dont le gène activé dans les érythroleucémies murines induites par le virus F-MuLV. Le gène fli-1 est également activé par le facteur SPI-1 / PU.1, un autre facteur ETS dont le gène est lui-même activé dans les érythroleucémies induites par le virus SFFV. Mon travail de thèse visait à définir la contribution de FLI-1 dans les érythroleucémies induites par SPI-1 / PU.1. Par déplétion inductible de FLI-1, j'ai montré qu'il contribue effectivement à la prolifération et au blocage de la différenciation de cellules érythroleucémiques surexprimant

Trois ARN polymérases sont responsables de la transcription du génome plastidial. L'une d'entre elle, la PEP (Plastid-Encoded RNA Polymerase), est de type eubactérien et multimérique. Cette enzyme interagit avec des facteurs de transcription de type sigma au niveau des régions promotrices des gènes cibles. Chez Arabidopsis thaliana, six facteurs sigma sont codés par des gènes nucléaires et sont localisés dans les plastes. Nous avons étudié la fonction du facteur sigma 3 (SIG3), à l'aide de mutants d'insertion d'ADN-T d'Arabidopsis. L'analyse du profil d'expression des gènes plastidiaux (transcriptome) par puce à ADN nous a permis de montrer que le complexe PEP/SIG3 transcrit spécifiquement le gène psbN et régule l'expression des gènes atpH, atpA, atpE, atpF et atpB. Le gène psbN se trouve sur le brin opposé de l'opéron psbB, entre les gènes psbT et psbH. L'expression de psbN produit des ARNs antisens de psbT. Des expériences de protection à la RNase A/T1 nous permettent de suggérer que les transcrits sens et antisens de psbT forment in vivo un ARN double brin. Nous avons montré que chez le mutant sig3, le transcrit antisens de psbT est totalement absent alors que la protéine PsbT est plus abondante par rapport au sauvage. Ces résultats suggèrent que la formation d'un ARN double brin psbT sens/antisens diminue l'efficacité de la traduction de la protéine PsbT. Ainsi, le complexe SIG3-PEP, en reconnaissant spécifiquement le promoteur du gène psbN, permet la synthèse de transcrits complémentaires à psbT ce qui constitue un outil de régulation de l'expression de la protéine PsbT. Les gènes atpH et atpB font partie respectivement de l'opéron atpI/atpH/atpF/atpA et l'opéron atpB/atpE. En utilisant la spectinomycine, nous avons montré que l'expression des différents gènes codant les sous unités de l'ATP synthase plastidiale est exclusivement contrôlée par l'ARN polymérase plastidiale, PEP. Nous avons ensuite analysé l'expression de ces opérons dans le mutant sig3. Le gène atpH code la sous unité CF0-III du complexe de l'ATP synthase, 5-12 fois plus abondante que les autres sous unités. Le gène atpB code la sous unité β du complexe CF1 de l'ATP synthase. Nous avons observé par puce à ADN chez la plante sauvage que l'accumulation de l'ARNm atpH est 5 à 12 fois plus importante que les autres transcrits codant les sous unités de l'ATP synthase. Nous avons montré que l'ARNm atpH est produit soit par co-transcription des gènes atpI/atpH soit par transcription à partir d'un promoteur (PatpH-413) reconnu par le complexe SIG3-PEP. Nous suggérons ainsi que le complexe PEP/SIG3 pourrait participer par la régulation transcriptionnelle de l'expression du gène atpH à l'établissement de la stœchiométrie de l'ATP synthase plastidiale chez Arabidopsis thaliana. Par contre, l'opéron atpB/atpE est transcrit à partir de deux promoteurs: PatpB -520 et PatpB -467. Seul le promoteur PatpB -467 est sous le contrôle du facteur SIG3. Ces résultats suggérent donc que le facteur SIG3 régule de manière plus atténuée l'expression de l'opéron atpB/atpE.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la plus fréquente des leucémies qui touchent le monde occidental. Cette pathologie est toujours incurable et se caractérise par une hétérogénéité d’évolution clinique marquée par une survie globale oscillant de quelques mois à des dizaines d’années. Il est donc primordial de savoir à quel type d’évolution le patient sera confronté afin d’adapter au mieux le suivi de la maladie et la précocité ou non du traitement. Au cours de ce travail, nous avons comparé les facteurs pronostiques les plus courants (stade de Binet, statut mutationnel des IgVHs, expression de ZAP70, du CD38 et de la LPL) afin d’évaluer leur association avec la survie sans traitement (treatment-free survival ou TFS) et la survie globale (overall survival ou OS) tout en mettant au point une technique de mesure de ZAP70 par PCR quantitative en temps réel (qPCR). Cette étude a conclu que ZAP70 mesuré par qPCR est un puissant facteur pronostique et le meilleur facteur de substitution du statut mutationnel parmi l’ensemble des marqueurs testés. Nous avons également mis en évidence que le temps de doublement du CD23 soluble (TDCD23s), un nouveau facteur pronostique associé à la dynamique de la maladie, pouvait prédire le TFS, l’OS mais également affiner le pronostic des patients. Finalement, nous avons démontré que la diminution de deux microARNs, miR-29c et miR-223, était fortement corrélée à une LLC agressive, une masse tumorale élevée et à d’autres facteurs de mauvais pronostic. De plus, l’association du pouvoir pronostique de ces deux microARNs avec celui de ZAP70 et de la LPL a permis de générer un score qPCR (de 0 à 4 facteurs de mauvais pronostic) permettant littéralement de stratifier le risque de besoin de traitement et la survie des patients LLC. Dans le but de comprendre les différences géniques entre les patients de bon et de mauvais pronostic, nous avons comparé le transcriptome de patients différant fortement pour l’expression de ZAP70. 27 gènes ont ainsi été mis en évidence comme différentiellement exprimés avec un FDR<10%, 135 avec une P<0.001 et 932 sondes avec P<0.05. Parmi ces gènes, nombreux sont capables de prédire le TFS et l’OS. Une analyse bioinformatique de type « gene set enrichment » a révélé la sur-représentation de gènes impliqués dans l’adhésion et la migration. Nous avons donc évalué la capacité d’adhésion et de migration de cellules de LLC issues de patient à pronostic différent au sein d’un microenvironnement stromal et en réponse à du milieu conditionné par les cellules stromales. De cette manière, avons démontré les meilleures capacités d’adhésion, de migration et de réponse aux stimuli du microenvironnement des cellules ZAP70+. Ces observations nous ont amenés à conclure que la classification d’un patient en bon ou mauvais pronostic selon de nombreux marqueurs n’est qu’un reflet de la capacité des cellules leucémiques à interagir avec leur microenvironnement et que la faculté des cellules ZAP70+ à adhérer/migrer dans leur microenvironnement explique leur meilleure survie et donc l’agressivité de la maladie. Le troisième volet de cette thèse s’est intéressé à une nouvelle stratégie thérapeutique pour la LLC : nous avons observé, in vitro, que l’acide valproïque (VPA) induisait l’apoptose des cellules de LLC en ciblant de nombreux gènes anti- et pro-apoptotiques. De plus, nos expériences ont démontré que le VPA pouvait inhiber la prolifération des cellules leucémiques en perturbant l’expression des gènes du cycle cellulaire. Finalement, l’association du VPA à différentes drogues chimiothérapiques augmente la chimiosensibilité des cellules de LLC. L’ensemble de ces résultats supporte fortement l’utilisation du VPA dans le traitement de la LLC, en particulier en combinaison avec d’autres agents antileucémiques.