O verapamil (VER) é um composto quiral comercializado como mistura racêmica dos enantiômeros (+)-(R)-VER e (-)-(S)-VER. O VER é biotransformado em norverapamil (NOR) e em outros metabólitos por vias dependentes do CYP. O tolueno e o n-hexano são solventes orgânicos que podem alterar o metabolismo de medicamentos dependente do CYP. Assim, o estudo investiga a estereosseletividade na farmacocinética do verapamil administrado a ratos na dose de 10 mg kg-1, sob forma racêmica, e do seu metabólito, norverapamil, bem como a influência do n-hexano e do tolueno na disposição cinética dos enantiômeros (+)-(R) e (-)-(S)-VER e (R)- e (S)-norverapamil em animais tratados com os solventes por inalação em câmara de exposição do tipo nose only nas concentrações de 88, 176 e 352 mg/m3 para o n-hexano e 94, 188 e 376 mg/m3 para o tolueno. Os enantiômeros do VER e do NOR foram separados na coluna de fase quiral Chiralpak® AD e analisados por LC-MS/MS (m/z = 441,3->165,5 para os enantiômeros do norverapamil e m/z 455,3->165,5 para os enantiômeros do verapamil). A análise farmacocinética foi realizada com base no modelo monocompartimental. A farmacocinética do verapamil é estereosseletiva em ratos do grupo controle não tratado com os solventes com acúmulo plasmático do eutômero (-)-(S)-VER (AUC0-? = 250,8 vs 120,4 ng mL-1 h; P<=0,05, teste de Wilcoxon). O metabólito (S)-NOR também foi acumulado no plasma dos animais do grupo controle com razão S/R relativa ao parâmetro AUC0-? de 1,5. Os parâmetros farmacocinéticos AUC0-?, Cl/F, Vd/F e t1/2 relativos aos enantiômeros (-)-S e (+)-(R)-VER e aos enantiômeros (S) e (R)-NOR não foram alterados pela exposição em câmara de exposição do tipo nose only ao n-hexano nas concentrações de 88, 176 e 352 mg/m3 e ao tolueno nas concentrações de 94, 188 e 376 mg/m3; teste de Kruskall-Wallis; P<=0,05. No entanto, a exposição ao n-hexano nas concentrações de 176 mg/m3 e 352 mg/m3 e ao tolueno nas concentrações de 94 mg/m3, 188 mg/m3 e 376 mg/m3 resultou em perda da enantiosseletividade observada para o grupo controle. / Verapamil (VER) is a chiral compound which is commercialized as a racemic mixture of the (+)-(R)-VER and (-)-(S)-VER enantiomers. VER is biotransformed into norverapamil (NOR) and other metabolites through CYP-dependent pathways. Toluene and n-hexane are organic solvents that can alter the metabolism of CYP-dependent drugs. The present study investigated the stereoselectivity in the pharmacokinetics of racemic VER administered to rats at a dose of 10 mg kg-1 and of its metabolite NOR. In addition, the influence of n-hexane and toluene on the kinetic disposition of the (+)-(R) and (-)-(S)-VER and (R)- and (S)-NOR enantiomers was analyzed in animals exposed by nose-only inhalation to n-hexane at concentrations of 88, 176 and 352 mg/m3 and to toluene at concentrations of 94, 188 and 376 mg/m3. The VER and NOR enantiomers were separated on a Chiralpak® AD chiral phase column and analyzed by LC-MS/MS (m/z = 441.3->165.5 for the NOR enantiomers and m/z 455.3->165.5 for the VER enantiomers). Pharmacokinetic analysis was performed using a monocompartmental model. The pharmacokinetics of VER was stereoselective in control rats not treated with the solvents, with plasma accumulation of the (-)-(S)-VER eutomer (AUC0-? = 250.8 vs 120.4 ng mL-1 h; P<=0.05, Wilcoxon test). The (S)-NOR metabolite was also found to accumulate in plasma of control animals, with an S/R AUC0-? ratio of 1.5. The pharmacokinetic parameters AUC0-?, Cl/F, Vd/F and t1/2 obtained for the (-)-S-VER, (+)-(R)-VER, (S)-NOR and (R)-NOR enantiomers were not altered by nose-only exposure to n-hexane at concentrations of 88, 176 and 352 mg/m3 or to toluene at concentrations of 94, 188 and 376 mg/m3 (P<=0.05), Kruskal-Wallis test). However, exposure to 176 and 352 mg/m3 n-hexane and to 94, 188 and 376 mg/m3 toluene resulted in the loss of enantioselectivity observed for the control group.

INTRODUÇÃO: Estudos mostraram que, após a injeção de LDE na corrente sangüínea de mulheres portadoras de câncer de mama, ela encontra-se mais concentrada em tecido neoplásico que no tecido normal. Recentemente, estudos pré-clínicos comprovaram que a associação LDE-oleato de paclitaxel é estável, menos tóxica e com mais atividade terapêutica quando comparada ao uso de paclitaxel comercial em animais. O presente estudo teve como objetivo verificar a estabilidade dessa associação na circulação, a sua capacidade em se concentrar no tecido neoplásico e determinar os parâmetros farmacocinéticos em relação ao paclitaxel isolado. MÉTODOS: Para determinar os parâmetros farmacocinéticos foram administrados, por via intravenosa, [3H]-oleato de paclitaxel associado a [14C]- oleato de colesterol-LDE em três pacientes e [3H]-paclitaxel comercial em duas pacientes 24 horas antes do procedimento cirúrgico. Todas as pacientes eram portadoras de neoplasia maligna da mama. Amostras de sangue foram colhidas durante 24 horas. A radioatividade foi medida por cintilação líquida e os parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando um modelo multicompartimental. Fragmentos de tecido neoplásico e de tecido normal mamário foram coletados durante a cirurgia e submetidos à contagem radioativa. RESULTADOS: As taxas fracionais de remoção da LDE e do oleato de paclitaxel foram semelhantes (0,0296 ± 0,0264 e 0,0182 ± 0,0186, respectivamente, p = 0,5742). A captação tanto da LDE quanto do oleato de paclitaxel mostrou concentração 2,5 a 3 vezes maior no tecido tumoral do que no tecido mamário normal. O tempo de meia vida do oleato de paclitaxel foi maior do que o da formulação comercial (18,97 ± 7,7 horas e 7,34 ± 0,40 horas) e, a depuração plasmática, menor (1,51 ± 0,18 (L/h) e 7,95 ± 4,32 (L/h)). CONCLUSÃO: A maior parte do fármaco ficou retido na microemulsão até sua remoção da circulação e captação pelas células. O oleato de paclitaxel associado à LDE mostrou-se estável na circulação sangüínea e apresentou tempo de meia vida maior e a depuração plasmática menor do que a formulação comercial, além de se concentrar mais no tecido neoplásico da mama. Os resultados permitem sugerir que essa associação pode se constituir em uma estratégia útil no tratamento de mulheres portadoras de câncer da mama. / INTRODUCTION: Studies had shown that, after the injection of LDE in the circulation of women with breast cancer, it was more concentrate in neoplastic tissue that in the normal tissue. Recently, studies had proven that the LDE-paclitaxel oleate association is steady, less toxic and with more therapeutical activity when compared with the commercial paclitaxel in animals. The present study was designed to verify the stability of this association in the circulation, its capacity in concentrating in the neoplastic tissue and to determine the plasma kinetics of the association compared to that of paclitaxel isolated. METHODS: To determine the pharmacokinetic parameters, [3H]-paclitaxel oleate associated to LDE labeled with [14C]-cholesterol oleate was intravenously injected into three patients and [3H]-commercial paclitaxel into two patients 24 hours before the surgical procedure. All the patients had breast cancer. Blood samples were collected during 24 hours. Radioactivity was quantified in a scintillation solution and the pharmacokinetic parameters were calculated by compartmental analysis. Specimens of tumoral and normal breast were excised during the surgery and submitted to a radioactive counting. RESULTS: Fractional clearance rate of LDE and of the paclitaxel oleate were similar (0,0296 ± 0,0264 and 0,0182 ± 0,0186, respectively, p = 0,5742). The uptake of both [14C]-LDE and [3H]-paclitaxel oleate by breast malignant tissue was two and three fold greater than that of the normal breast tissue. The paclitaxel oleate plasma half-life (h) was greater than the commercial paclitaxel (T1/2 = 18,97 ± 7,7 and 7,34 ± 0,40) and the total plasma clearence (L/h) of paclitaxel oleate was lesser than the commercial (CL = 1,51 ± 0,18 and 7,95 ± 4,32). CONCLUSION: Most of the drug was restrained in the microemulsion until its removal from the circulation and captation by the cells. The paclitaxel oleate associated to LDE is stable in the bloodstream and has greater plasma half-life and lesser clearence than those for commercial paclitaxel. In addition, the association could be concentrated more in malignant breast tissue. The results allow to suggest that this association can consist in a useful strategy in the treatment of women with breast cancer.

Capítulo 1 O diclofenaco de sodio é um antiinflamatório não-esteroidal que, além de atividade antiinflamatória, apresenta também propriedades analgésica e antipirética. Seus efeitos farmacológicos estão relacionados à inibição da síntese de prostaglandinas. Vários métodos utilizando técnicas cromatográficas tem sido propostos para a determinação de diclofenaco em plasma, incluindo a cromatografia gás-líquido com detecção por captura de elétrons ou por ionização de chama, a cromatografia gás-líquido-espectrometria de massa e a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica ou no ultravioleta. Descreve-se aqui um método rápido, sensível e específico para a determinação de diclofenaco em plasma usando apenas 200 &#181;l de amostra e envolvendo extração simples e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção no ultravioleta. Extraiu-se o diclofenaco adicionando-se 200 &#181;l de plasma a tubos contendo 500 ng de padrão interno (ácido 2-(p-ciclo-hexen- 1\'-il-fenil)propiônico e 100 &#181;l de ácido ortofosfórico 2,5 N. A seguir adicionaram-se 4 ml de diclorometano e extraiu-se a mistura em agitador de tubos durante 60 segundos. Após centrifugação a 3000 rpm por 20 minutos a fase aquosa foi desprezada e a fase orgânica foi filtrada em membrana Millipore&#174; FHLP 01300 de 0,4 &#181;m e evaporada em corrente de nitrogênio a 37°C. O resÍduo foi dissolvido em 100 a 1000 &#181;l de fase móvel para injeção em CLAE. Empregou-se para a separação coluna Novapak&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m e fase móvel constituída por mistura de tampão acetato 0,75 M, pH 5,O e acetonitrila (55:45, v/v). A detecção foi feita em &#955; = 282 nm. O diclofenaco e seu padrão interno foram eluidos respectivamente a 3,3 e 6,5 minutos em fluxo de 0,9 ml/min. Os limites de confiança do método foram: 10-10000 ng/ml. linearidade; 1 ng/ml, sensibilidade; 95 %, recuperação relativa e 3,5 e 5,7 %, precisão intra e interdias, respectivamente. Este micrométodo mostrou-se suficientemente sensível, preciso e exato para estudos de disposição cinética e bioequivalêneia de fomulações contendo diclofenaco. Capítulo 2 Estudou-se a biodisponibilidade do diclofenaco nos produtos Voltaren&#174; 50 (A), Voltaren Retard&#174; 100 (B) e Artren&#174; 100 (C) após administração de dose única peroral de um comprimido a oito voluntários de ambos os sexos, adultos e sadios. As formulações foram administradas seguindo protocolo de estudo estabelecido por sorteio. Os voluntários em jejum receberam os medicamentos em dose única pela manhã e as amostras de sangue foram colhidas 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração. A concentração plasmática de diclofenaco foi determinada por técnica em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de fase reversa com detecção no ultravioleta em &#955; = 282 nm após extração com solvente orgânico em meio ácido. Com base nas curvas \"concentração plasmática (C) vs tempo\" e \"logC vs tempo\" foram detenninados os parâmetros da fase absortiva para os três produtos, em X-&#177; EPM: Cmax= 741 &#177; 137 ng/ml e tmax = 2,6 &#177; 0,4 h para o produto A, Cmax = 1399 &#177; 326 ng/ml e tmax = 2,4 &#177; 0,2 h para o produto B, Cmax = 192 &#177; 70 ng/ml e tmax = 2,3 &#177; 0,2 h para o produto C. Os valores de AUCT, calculados pelo método dos trapezóides e extrapolação a infinito, foram, em X- &#177; EPM: 1603 &#177; 253 ng.h/ml para o produto A, 3177 &#177; 606 ng.h/ml para o produto B, 2237 &#177; 529 ng.h/ml para o produto C. A extensão da biodisponibilidade (EBA) do diclofenaco nos produtos Voltaren&#174; 50 (A) e Artren&#174; 100 (C) foi calculada usando-se como referência o produto Voltaren Retard&#174; 100 (B). Foram obtidos os seguintes valores, em X- &#177; EPM (mediana): 138 &#177; 35 (123) % para o produto A, 102 &#177; 35 (68) % para o produto C. A partir dos resultados obtidos sugere-se que o produto B, citado como de liberação prolongada e usado como referência neste trabalho, apresentou características de rápida liberação, semelhantes às do produto A, sugerindo possível falha de impermeabilização no revestimento dos núcleos contendo diclofenaco de sódio durante o processamento industrial do lote do qual provieram os comprimidos aqui avaliados. Capítulo 3 O diclofenaco é um antiinflamatório não-esteroidal indicado para o tratamento de pacientes portadores de inflamações dolorosas de origem reumática ou não. É biotransformado por reações de oxidação seguidas de conjugação glicurônica. Uma pequena porcentagem do fármaco original sofre glicuronização direta. Vários métodos têm sido propostos para a determinação de diclofenaco e seus produtos de biotransformação em fluidos biológicos, incluindo cromatografia a gás com detecção por captura de elétrons e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção eletroquímica ou no ultravioleta. Entretanto, nenhum dos métodos utilizando CLAE mostrou-se suficientemente seletivo para o uso em estudos de disposição cinética. Descreve-se aqui um método sensível e específico para a determinação de diclofenaco e seus produtos de biotransformação hidroxilados em urina por CLAE com detecção no ultravioleta precedida de hidrólise enzimática nas amostras e extração com solvente orgânico em meio ácido. Adicionaram-se 500 &#181;l de urina a tubos contendo 10 mg de mistura de &#946;-glicuronidase e aril-sulfatase e 500 &#181;l de tampão acetato 0,75 M. A mistura foi incubada a 37°C por uma hora e, em seguida, transferiram-se 800 &#181;l do hidrolisado para tubos contendo 3,3 &#181; de padrão interno para diclofenaco (ácido 2-(p-ciclo-hexen-1\'-fenil)propiônico) e 1,0 &#181; de padrão interno para produtos de biotransformação (fenacetina). Procedeu-se à extração com 2 ml de mistura de diclorometano e álcool isopropílico (9:1, v/v) e agitação seguida por centrifugação a 3000 rpm durante 30 minutos. Desprezou-se a fase aquosa e filtrou-se a fase orgânica em sistema Millipore&#174; com membrana FHLP 01300 0,4 &#181;m. O extrato orgânico foi evaporado em corrente de nitrogênio a 37°C e o resíduo, dissolvido em volumes de 500-2000 &#181;l de fase móvel e injetado em CLAE. Usaram-se dois sistemas cromatográficos independentes e consecutivos para a separação do diclofenaco e seus metabólitos hidroxilados. Inicialmente utilizou-se coluna de fase reversa ODS-Shimadzu, 150 x 6,0 mm, 5 &#181;m e fase móvel constituída por tampão acetato 0,01 M, pH 5,0, metanol e acetonitrila (50:40:5) a um fluxo de 1,0 ml/min para eluição do padrão interno (fenacetina) a 10 minutos, 4\',5-di-hidroxidiclofenaco a 12 minutos, 3\'-hidroxidiclofenaco a 34 minutos, 4\'-hidroxidiclofenaco a 40 minutos e 5-hidroxidiclofenaco a 44 minutos. Em seguida utilizou-se a coluna Novapak&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m e fase móvel constituída por tampão acetato 0,75 M, pH 5,0 e acetonitrila (55:45, v/v) e um fluxo de 0,9 ml/min para eluição do diclofenaco a 3,3 minutos e padrão interno (ácido 2-(p-ciclo-hexen-l\'-il-fenil)propiônico, a 6,5 minutos. Os limites de confiança do método foram: 0,4-10,0 &#181;g/ml, linearidade; 0,1 &#181;/ml, sensibilidade, 75 %, recuperação relativa média da extração e precisão intra e interdias variando de 1,3 a 2,2 % e de 3,3 a 5,7 %, respectivamente. O método mostrou-se suficientemente sensível, preciso, exato e específico para o uso em estudos de excreção urinária de diclofenaco e seus produtos de biotransformação hidroxilados. Capítulo 4 Avaliou-se a existência ou não de interação farmacocinética entre a ranitidina e o diclofenaco em voluntários sadios após administração de dose peroral de Voltaren&#174; 50. Selecionaram-se 15 e avaliaram-se oito voluntários adultos, de ambos os sexos, sadios, em estudo constituído por duas fases. Dos oito voluntários, um foi excluído do estudo. Na Fase I o diclofenaco foi administrado isoladamente aos voluntários em jejum pela manhã. Na Fase II, os voluntários foram submetidos a um tratamento de sete dias com ranitidina, depois do qual receberam nova dose de diclofenaco. A administração de ranitidina continuou por mais três dias. Foram colhidas amostras de sangue e urina no intervalo de 0-72 horas após a administração de diclofenaco nas duas fases do estudo. Determinou-se a concentração plasmática e urinária de diclofenaco e a concentração urinária de seus produtos de biotransformação hidroxilados por técnica de cromatografia líquida de alta eficiência, em dois perfis independentes e consecutivos para diclofenaco e produtos de biotransformação, precedida por extração com solvente orgânico em meio ácido e, no caso das amostras de urina, precedida também por hidrólise enzimática. Os valores de \"clearance\" de formação (Clf) dos produtos de biotransformação hidroxilados foram, em X &#177; EPM (mediana): 15,9 &#177; 2,9 (15,2) ml/min para o 4\',5-hidroxidiclofenaco, 3,3 &#177; 0,9 (2,6) ml/min para o 3\'-hidroxidiclofenaco, 22,1 &#177; 5,9 (23,5) ml/min para o 4\'-hidroxidiclofenaco e 8,74 &#177; 1,43 (7,4) ml/min para o 5-hidroxidiclofenaco quando se administrou diclofenaco isoladamente. Não houve alteração significativa destes valores pela associação com a ranitidina. Da mesma forma, o \"clearance\" renal (Clr) do diclofenaco, de 7,1 &#177; 2,8 (5,1) ml/min após administração de diclofenaco isolado, não sofreu alteração significativa pela associação com a ranitidina. A associação com a ranitidina provocou um aumento significativo de cerca de 43 % na meia-vida de eliminação do diclofenaco em plasma, que passou de 1,01 &#177; 0,13 h (X &#177; EPM) na Fase I (fármaco isolado) para 1,44 &#177; 0,34 h na Fase II (fármaco associado), além de causar redução da excreção urinária do produto de biotransformação 4\'-hidroxidiclofenaco, que teve sua fração eliminada total (FelT) reduzida de 5,85 &#177; 1,12 (5,06) % (X &#177; EPM (med)) na Fase I para 4,39 &#177; 0,75 (3,73) % na Fase II. Com base nestes resultados sugere-se que a ranitidina reduza a biotransformação do diclofenaco pela diminuição da excreção renal de seu principal produto de biotransformação hidroxilado (4\'-hidroxidiclofenaco) com conseqüente aumento da meia-vida de eliminação plasmática do diclofenaco. Apesar da interação farmacocinética aqui registrada, a associação diclofenaco-ranitidina é vantajosa para pacientes com história de úlcera péptica, suscetíveis a ulceração recorrente. / Capítulo 1 Diclofenac sodium is a non-steroid anti-inflammatory agent which shows a high degree of anti-inflammatory, analgesic and antipyretic activity . It inhibits prostaglandin biosynthesis in vitro and in vivo, and this inhibitory effect at least partly explains the mechanism of action of the drug. Several methods have been described for the determination of diclofenac in human plasma or serum, including gas chromatography with electron-capture or flame ionization detection, gas-chromatography-mass spectrometry, and high-performance liquid chromatography with UV-detection. We describe a rapid, sensitive and specific procedure for the determination of diclofenac in plasma, using only 200 &#181;l of biological sample, involving single extraction and high-performance liquid chromatography (HPLC) with UV-detection. An extraction with dichlormethane was performed by adding 200 &#181;l of plasma to a test tube containing 500 ng internal standard (2-(p-ciclohexen-1\'-fenil)propionic acid) and 100 &#181;l 2,5 N phosphoric acid. HPLC grade dichlormethane (4 ml) was added and the mixture was agitated with a vortex mixer and eentrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The aqueous phase was discarded and the organic phase filtered through a 0,4 &#181;m FHLP 01300 Millipore&#174; filter and evaporated in a stream of nitrogen at 37°C. The residue was dissolved in 100-1000 &#181;l mobile phase and injected into the liquid chromatograph. Analytical separation was performed in an isocratic system on a reverse-phase column (Novapk&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m). The mobile phase was 0,75 M acetate buffer, pH 5,0 and acetonitrile (55:45, v/v). Peaks were monitored at 955; = 282 nm. Diclofenac and its internal standard were eluted at 3,3 and 6,5 minutes, respeCtively, at a flow rate of 0,9 ml/min. Confidence limits for diclofenac measurements in plasma were: 10-10000 ng/ml, linearity; 1 ng/ml, sensitivity; 95 %, relative recovery, and intra and interassay precision of 3,5 and 5,7%, respectively. This micromethod proved to be sufficiently sensible, precise and accurate for kinetic disposition or bioequivalence studies. Capítulo 2 Bioavailability of diclofenac in two test formulations was compared to a reference after single oral dose to healthy adult volunteers of both sex. Formulations were administered after a fasting night following a randomized study protocol. Blood samples were collected at 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 and 24 hours after dose administration. Diclofenac plasma levels were measured by HPLC technique using a reversed phase system after single extraction with organic solvent in acidic medium.. Peaks were monitored at UV-282 nm. Based on \"plasma concentration vs time\" curves, parameters were determined,expressed as X-&#177; SEM: Cmax = 741 &#177; 137 ng/ml and tmaxm = 2,6 &#177; 0,4 h, product A, Cmax = 1399 &#177; 326 ng/ml and tmax = 2,4 &#177; 0,2 h, product B and Cmax = 192 &#177; 70 ng/ml and tmax = 2,3 &#177; 0,2 h, product C AUCT values, determined by trapezoidal rule and integration to infinity, were, expressed as X- &#177; SEM: 1603 &#177; 253 ng.h/ml, product A, 3177 &#177; 606 ng.h/ml, product B and 2237 &#177; 529 ng.h/ml, product C. Bioavailability (EBA) of diclofenac in test products (A, B) was calculated against reference (B). EBA, expressed as X- &#177; SEM (median), were: 138 &#177;35(123) %, product A and 102 &#177;35 (68) %, product C. Based on this data formulation A and B are bioequivalents while C and B are not bioequivalents. There is a strong evidence that product B, slow-release formulations, as described by the manufacturer, presented fast-release properties. Capítulo 3 Diclofenac is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) advocated for use in painful and inflammatory rheumatic diseases and certain non-rheumatic conditions. Diclofenac is extensively metabolized mainly by oxidative pathways followed by glucuronide conjugation. A small percentage of the original drug is glucuronidated directly. Many methods have been described for the determination of diclofenac and its metabolites in biological fluids, including gas-chromatography with electron-capture detection and high-performance liquid chromatography (HPLC) with UV or electrochemical detection. However, none of the HPLC methods was sufficiently specific for use in kinetic disposition studies. We describe a sensitive and specific procedure for the determination of diclofenac and its hydroxy metabolites in urine, involving single extraction after enzymic hydrolysis of the glucuronic conjugates and HPLC with UV detection. The enzymic hydrolysis was performed by adding 500 &#181;l of urine to test tubes containing 10 mg of a mixture of &#946;-glucuronidase and aril-sulphatase and 500 &#181;l of acetate buffer 0,75 M, pH 5,0. This mixture was incubated at 37°C for one hour. Then, 800 &#181;l of the mixture were transferred to test tubes containing 3,3 &#181;g internal standard for diclofenac (2-(p-ciclohexen-l\'-il-phenyl)propionic acid) and 1 &#181;g internal standard for metabolites (phenacetine). Dichlormethane and isopropyl alcohol (9:1, v/v) (2 ml) was added and the mixture was agitated with a vortex mixer and centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. The aqueous phase was discarded and the organic phase filtered through a 0,4 &#181;m FHLP 01300 Millipore&#174; filter and evaporated in a stream of nitrogen at 37°C. The residue was dissolved in 500-2000 &#181;l mobile phase and injected in the liquid chromatograph. Analytical separation was performed in two independent consecutives isocratic systems on reverse-phase column. In the first HPLC profile an ODS-Shimadzu column, 150 x 6,0 mm, 5 &#181;m and a mobile phase constituted of acetate buffer 0,01 M, pH 5,0, methanol and acetonitrile (50:40:5, v/v) at a flow rate of 1,0 <l/min were used for the elution of internal standard (phenacetine) at 10 minutes, 4\',5-dihydroxydiclofenac at 12 minutes, 3\'-hydroxydiclofenac at 34 minutes, 4\'-hydroxydiclofenac at 40 minutes and 5-hydroxydiclofenac at 44 minutes. In the secondonea Novapak&#174; C18 column, 150x 3,9 mm, 4 &#181;m and a mobile phase constituted of acetate buffer 0,75 M, pH 5,0 and acetonitrile (55:45, v/v) at a flow rate of 0,9 ml/min were used for the elution of diclofenac at 3,3 minutes and internal standard (2-(p-cyclohexen-1\'-phenyl)propionic acid) at 6,5 minutes. Confidence limits for diclofenac an its hydroxy metabolites were: 0,4-10,0 &#181;g/ml, linearity; 0.1 &#181;g/ml, sensitivity, 75 %, mean extraction recovery, and intra and interassay precision ranging from 1,3 to 2,2 % and 3,3 to 5,7 %, respectively. This method proved to be sufficiently sensitive, precise, accurate and specific for urinary excretin studies involving diclofenac and its hydroxy metabolites. Capítulo 4 The pharmacokinetic interaction between diclofenac and ranitidine was evaluated in 8 healthy volunteers after peroral single administration of Voltaren&#174; 50 in a two-phase study protocol. On phase I, diclofenac was administered alone, while on Phase II the volunteers were submitted to a chronic treatment with ranitidine for seven days; then a dose of diclofenac was administered and ranitidine continued for three days afterwards. Blood and urine samples were collected at time intervals 0-72 hours after diclofenac administration. Diclofenac and its hydroxylated metabolites in biological fluids were determined by two independent profiles using HPLC technique after a single extraction with organic solvent in acidic medium. Enzymic hydrolysis was necessary for the cleavage of conjugates in urine. Diclofenac elimination half-life was increased by 43 % ranging from 1,01&#177; 0,13 h to 1,44 &#177; 0,34 h (X &#177; SEM) when ranitidine was coadministered. Significant decrease on FelT of 4\'-OH-D ranging from 5,85 &#177; 1,12 (5,06) % to 4,89 &#177; 0,75 (3,73) % (X &#177; SEM (med)) was obtained by ranitidine association. Clf of metabolites expressed as X &#177; SEM (med) were, in ml/min: 15,9 &#177; 2,9 (15,2) for 4\',5-0H-D, 3,3 &#177; 0,9 (2,6) for 3\'-OH-D, 22,1 &#177; 5,9 (23,5) for 4\'-OH-D and 8,7&#177; 1,4 (7,4) for 5-0H-D after peroral single dose of diclofenac alone. These data showed no significant difference when ranitidine was administered. Diclofenac renal clearance (Clr), expressed as X &#177; SEM (med), was 7,1 &#177; 2,8 (5,1) ml/min after diclofenac and 5,4 &#177; 1,9 (3,5) ml/min, ranitidine. Based on these data, ranitidine decreases the biotransformation of diclofenac by inhibition of hydroxylation affecting urinary excretion of its main hydroxy metabolite, 4\'-hydroxydiclofenac. In spite of this pharmacokinetic interaction, without clinical relevance, patients with a history of peptic ulcer and more susceptible to recurrent ulceration, could benefit from the association diclofenac-ranitidine.

O presente estudo visa descrever a farmacocinética, o metabolismo e a excreção renal da doxorrubicina, uma antraciclina utilizada no tratamento do câncer de mama. A doxorrubicina é biotransformada a doxorrubicinol pelas enzimas carbonil redutase 1 e 3 e aldo-ceto redutase. Foram investigadas 12 pacientes portadoras de câncer de mama no primeiro ciclo de tratamento adjuvante ou neoadjuvante com doxorrubicina (60 mg/m2) administrada por infusão intravenosa durante 30 min. As amostras seriadas de sangue foram colhidas até 48 h após o início da infusão e a urina foi coletada em intervalos de 4 h por 48 h. Os métodos de análise da doxorrubicina e doxorrubicinol em urina e em plasma como concentração total e concentração livre foram desenvolvidos empregando LC-MS/MS. Os métodos não apresentaram efeito matriz ou efeito residual e mostraram-se lineares para ambos os analitos nos intervalos de 0,4-200 ng/mL para concentração total em plasma; 0,4-40 ng/mL para concentração livre em plasma e 20-8000 ng/mL de urina. Os parâmetros farmacocinéticos da doxorrubicina foram calculados com base nas curvas de concentração plasmática total versus tempo empregando o programa Phoenix® WinNonlin® por modelo tricompartimental com observação de meias-vidas de distribuição, de eliminação rápida e de eliminação terminal de 0,10; 2,55 e 40,87 h, respectivamente. A fração livre de doxorrubicina foi de 16,05% e de doxorrubicinol de 17,34%. A fração da dose de doxorrubicina recuperada na urina (0-48 h) foi de 2,35% para o fármaco inalterado e de 1,35% para o fármaco metabolizado a doxorrubicinol. Os valores médios de clearances na população do estudo foram de 58,07 L/h para o total, 1,45 L/h para o renal, 56,62 L/h para o hepático e 0,71 L/h para o clearance de formação do metabólito doxorrubicinol. Logo, os dados inferem que a eliminação da doxorrubicina é preponderantemente biliar. Os valores de clearance total não corrigidos em função do peso ou área superficial corpórea mostraram coeficiente de variação de 95,32%, enquanto para valores de clearance total corrigidos em função do peso ou da área superficial corpórea, foram obtidos valores similares, respectivamente, 88,74% e 89,84%. O estudo detalhado da farmacocinética da doxorrubicina e seu metabólito doxorrubicinol permitiu, pela primeira vez, o cálculo da razão de extração hepática (E=0,63) em humanos, classificando a doxorrubicina como um fármaco de extração hepática intermediária. / The aim of this study is to describe the pharmacokinetics, metabolism and renal excretion of doxorubicin, an anthracycline used in breast cancer treatment. Doxorubicin is metabolised to doxorrubicinol by carbonyl reductase 1 and 3, and aldo-keto reductase enzymes. Twelve breast cancer patients with indication of adjuvant or neoadjuvant treatment were assessed during the first cycle of doxorubicin administration (60 mg/m2, iv-infusion, 30 min). Serial blood samples were collected up to 48 hours after the start of iv-infusion; urine was collected in 4-hour intervals, during 48 h. Methods for simultaneous quantification of doxorubicin and doxorubicinol in urine, as well as total and unbound fraction in plasma were developed applying LC-MS/MS. Neither matrix effect or carryover effect were observed. The methods were linear for both analytes in the ranges of 0.4-200 ng/mL for total plasma concentration; 0.4-40 ng/mL for unbound fraction concentration in plasma and 20-8000 ng/mL urine. Doxorubicin pharmacokinetic parameters were calculated based on total plasma concentration versus time curves applying Phoenix® WinNonlin® software by tricompartmental model analysis. Distribution, fast elimination and slow elimination half-lives were observed to be 0.10, 2.55 and 40.87 h, respectively. Unbound fractions were 16.05% for doxorubicin and 17.34% for doxorubicinol. The fraction of doxorubicin dose recovered in urine (0-48 h) was 2.35% for the drug excreted unchanged and 1.35% for doxorubicinol. The clearance mean values for the assessed population were 58.07 L/h for total clearance, 1.45 L/h for renal clearance, 56.62 L/h for hepatic clearance and 0.71 L/h for doxorubicinol metabolite formation clearance. Thus, the data suggest that doxorubicin elimination is carried out mainly by biliary excretion. Initial total clearance values demonstrated 95.32% variation coefficient, while total clearance values corrected to weight or body surface area presented similar variation coefficients, respectively 88.74% and 89.84%. The detailed pharmacokinetics study of doxorubicin and its metabolite doxorubicinol made it possible to calculate, for the first time in humans, the hepatic extraction ratio (E = 0.63), categorising doxorubicin as an intermediate hepatic-extraction-ratio drug.

A Química Medicinal é ciência multidisciplinar com ação direta sobre conhecimentos específicos focalizando Química, Biologia, Medicina, Fisiologia, entre outras áreas de estudos no domínio fundamental e tecnológico. Esta ciência atua ainda entre várias interfaces científicas tais como a Bioquímica, Biofísica, Biologia Molecular, Química Biológica e outras. <br /> A investigação no metabolismo de fármacos é a primeira e essencial fase na moderna farmacologia, uma vez que os parâmetros Farmacocinéticos são os mais relevantes dados iniciais a serem considerados no início da Fase 3 em testes clínicos com humanos. Em sua totalidade os dados farmacocinéticos são conhecidos como ADME (Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção) e, ao lado dos Parâmetros Toxicológicos responde por no mínimo 70 % das avaliações finais negativas de fármacos (não recomendáveis) durante a Fase 3 em testes clínicos com humanos. <br /> Esta dissertação emprega Métodos Quiminformáticos para obter parâmetros metabólicos de fármacos conhecidos com o objetivo de se chegar a modelos de metabolismo preditivos baseados em correlações entre estrutura e atividade e, por intermédio desta avaliação, desenvolver abordagem similar para fármacos desconhecidos tentando obter modelos metabólicos preditivos baseando-se em correlações de estrutura e reatividade, envolvendo as enzimas citocromo P450 dentro do grupo de enzimas CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 e CYP3A4. A validação do modelo in silico foi desenvolvida por meio de estudos comparativos de perfis metabólicos empregando-se o critério de superposição de dados de compostos com estruturas de referência que mostrem as melhores correlações de estrutura e reatividade considerando enzimas CYP2C9, CYP2D6 e CYP3A4. <br /> Os modelos obtidos podem ser muito úteis na previsão de metabolismo considerando enzimas CYP2C9, CYP2D6 e CYP3A4 para novos tipos de possíveis fármacos, pois, o comportamento referente a tendências de metabolismo de novas entidades químicas pode levar a análises por antecipação de reações enzimáticas. Certamente, este estudo preditivo na Fase I do estudo de fármacos na farmacoterapia reduzirá drasticamente o perfil temporal e o impacto de custos no desenvolvimento de novas substâncias bio-ativas no planejamento da gênese de novos fármacos. / The Medicinal Chemistry is a multidisciplinary science with direct action over specific knowledge focusing Chemistry, Biology, Medicine, Physiology, among others domains of fundamental and technologic studies. This science also acts between several scientific interfaces like Biochemistry, Biophysics, Molecular Biology, Biologic Chemistry, and others <br /> The investigation on drugs metabolism is the first and essential phase on modern Pharmacotherapy since the pharmacokinetics\' parameters are the most relevant impute on the beginning of the Phase 3 on Human Clinical Tests. <br /> The overall pharmacokinetics data base is known as ADME (Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion) and side by side with the Toxicological Parameters responds at least of 70 % of the total final evaluation of drugs negatively evaluated (not recommended) during the Phase 3 on Human Clinical Tests. <br /> This dissertation employs Chemoinformatic Methods to obtain metabolic parameters of known drugs with the mean objective of to ends up a predictive metabolic pattern based on correlation of structure and activity, and by mean of this evaluation, to perform similar approaches on unknown drugs trying to get predictive metabolic pattern based on correlation of structure and reactivity, involving the cytochrome enzymes P450 on the group of CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 e CYP3A4. The pattern in silico validation was developed by mean of a comparative studies of metabolic profile ad by using the superposition criteria of the reference structures compounds data base having better correlation of structure and reactivity considering the enzymes CYP2C9, CYP2D6 e CYP3A4. <br /> The obtained pattern can be useful on metabolism prediction considering enzymes CYP2C9, CYP2D6 e CYP3A4 for new kinds of possible drugs, since this behavior concerning metabolic trends of newer chemical entities can arise anticipated analysis of enzymatic reactions. Surely, this predictive studies on Phase 1 of drugs on Pharmacotherapy will reduces drastically the time profile and the costs impacts on developing of new bioactive substances on planning genesis of new drugs.

7-cetocoleterol (7KC) é um oxisterol conhecido por inibir a proliferação celular e por ser citotóxico. Desenvolvemos uma nanoemulsão contendo 7KC (LDE/7KC) que demonstrou efeito anti-proliferativo sobre as linhagens RPMI 8226 (mieloma) e melanoma (B16F10), in vitro, sendo preferencialmente captada via receptores de LDL. No presente trabalho avaliamos, in vivo, a cinética plasmática, biodistribuição, ação anti-tumoral e parâmetros tóxico-hematológicos em camundongos portadores de melanoma. A cinética plasmática apresentou um decaimento estatisticamente igual entre os animais portadores de melanoma e não portadores. Em relação à biodistribuição da nanoemulsão, houve um acúmulo de seus componentes radioativamente marcados, principalmente no fígado e no tumor, sugerindo sua captação via receptores de LDL. LDE/7KC promoveu uma redução superior a cinqüenta por cento do tamanho do tumor, que apresentou maior área de necrose e menor quantidade de vasos. Nos camundongos tratados com LDE/7KC houve um aumento da sobrevida. As análises toxico-hematológicas demonstraram que a nanoemulsão apresentou pouca ou nenhuma toxicidade. Os resultados demonstram a possibilidade da utilização da nanoemulsão LDE/7KC como um agente no tratamento do câncer, com poucos efeitos colaterais, devido a sua seletividade aos receptores da LDL. / 7-ketocholesterol (7KC) is an oxysterol known to inhibit cell proliferation and to be cytotoxic. A nanoemulsion containing-7KC (LDE/7KC) was shown to have antiproliferative effects on RPMI 8226 myeloma cell line and melanoma (B16F10), in vitro. This particle is taken up mainly by LDL receptors. Here we have evaluated the plasma kinetic, biodistribution, anti-tumoral action and hematologic toxicity of LDE/7KC in melanoma bearing mice. The nanoemulsion accumulated in the liver and tumor, tissues with a high expression of LDL receptors. LDE/7KC promoted a tumor size reduction over fifty percent. An increased necrosis area and a decreased amount of blood vessels were found. An increased survival rate was observed. The hematolgic analyses demonstrated a lack of toxicicity. The results shows the possibility to use the LDE/7KC nanoemulsion as an agent for cancer treatment, with few collateral effects probably due to its internalization by LDL receptors.

O bussulfano (Bu) é um agente alquilante usado no condicionamento que precede o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) em crianças. Sua farmacocinética (FC) apresenta uma grande variabilidade interindivíduo, que pode ser parcialmente explicada pelas variantes genéticas de GSTA1, gene da enzima glutationa S-transferase α1, crucial para o metabolismo do Bu. Vários métodos de predição da FC do Bu são usados para calcular sua dose, essencialmente com base na idade e peso do paciente. Até o momento, apenas um modelo adulto incorporou as variantes de GSTA1 no cálculo da sua dose do Bu. No presente trabalho, avaliou-se, inicialmente, o desempenho de métodos atualmente disponíveis em pediatria, em função das variantes genéticas de GSTA1. Foram avaliados os parâmetros de FC da primeira dose de 101 crianças e adolescentes submetidos a TCTH alogênico no CHU Sainte-Justine, Montreal, Canadá, após regime de condicionamento que incluía Bu intravenoso (BuCR, do inglês busulfan-containing regimen). Os haplótipos GSTA1 foram interpretados em pares (diplótipos) e depois classificados em três grupos com base nos seus diferentes potenciais de expressão enzimática. As AUCs (area under the curve) medidas e as AUCs calculadas a partir de doses de Bu preditas por 11 modelos diferentes foram classificadas de acordo com a sua capacidade para atingir a AUC-alvo (900 a 1.500 μM.min). Também foram calculados os erros de previsão do clearance do Bu. Após a primeira dose, as AUCs medidas atingiram a AUC-alvo em 38,7%. Os diplótipos de GSTA1 relacionados ao metabolismo lento (G3) e regimes contendo fludarabina (FluCR, do inglês fludarabine-containing regimen) foram os únicos fatores associados à AUC no alvo (OR 4,7, IC 95%, 1,1 - 19,8, p = 0,04 e OR 9,9, IC 95%, 1,6 - 61,7, p = 0,01, respectivamente). Utilizando os outros métodos para o cálculo da dose, a percentagem de AUC no alvo variou de 16% a 74%. G3 e FluCR foram, em alguns modelos, associados à AUC no alvo ou na faixa tóxica, enquanto que os metabolizadores rápidos (G1) foram por vezes associados a AUCs subterapêuticas. Essas associações foram confirmadas na análise de predição do clearance, em que os diplótipos da GSTA1 e o regime de condicionamento influenciaram significativamente a maioria dos erros de previsão dos métodos testados. Uma vez que GSTA1 mostrou influenciar significativamente os algoritmos disponíveis, pretendeu-se desenvolver um modelo de FC de população que incluísse variantes genéticas de GSTA1 como um fator no cálculo de dose do Bu. Para tanto, foram analisados os dados de concentração-tempo de 112 crianças e adolescentes que receberam um BuCR mieloablativo antes de 115 TCTH (autólogos e alogênicos), realizados também no CHU Sainte-Justine. Para a construção do modelo de FC de população, utilizou-se uma análise mista não linear. Sexo, doença de base (maligna vs. não maligna), idade pós-menstrual (PMA) ou idade cronológica, regime de condicionamento e diplótipos de GSTA1 foram avaliados como fatores potenciais. Um modelo de um compartimento com eliminação de primeira ordem foi o que melhor descreveu os dados disponíveis. Um fator de maturação do metabolismo de Bu (Fmat) e o peso elevado a exponencial alométrico teórico foram incluídos no modelo de base. A análise dos fatores revelou PMA (ΔOFV = -26,7, p = 2,3x10-7) e grupos de diplótipos de GSTA1 (ΔOFV = -11,7, p = 0,003) como fatores significativamente associados, respectivamente, ao volume e ao CL do Bu. Os CL dos metabolizadores rápidos (G1) foram preditos como sendo 7% mais elevados que os definidos como metabolizadores normais (G2), enquanto que os metabolizadores lentos (G3) foram descritos com CL 12% menor que os G2. Em conclusão, após se evidenciar que os métodos disponíveis para o cálculo de dose do Bu não são adequados para todos os grupos de diplótipos de GSTA1, propôs-se o primeiro algoritmo de cálculo de dose de Bu em pediatria baseado em farmacogenética. Seu uso pode contribuir para uma melhor previsibilidade da FC do Bu e, desta forma, melhor predizer a exposição de crianças e adolescentes à droga, de acordo com a capacidade metabólica de cada indivíduo. / Busulfan (Bu) is an alkylating agent used in the conditioning before hematopoietic stem cells transplantation (HSCT) in children. Its pharmacokinetics (PK) presents a great inter-individual variability, which can be partially explained by GSTA1 genetic variants, gene coding for the enzyme glutathione s-tranferase α1, crucial for Bu metabolism. Several methods of predicting PK are available and are used to calculate the Bu dose, based essentially on patients’ age and anthropometric characteristics. So far, a single adult model successfully incorporated this factor into the Bu dose calculation. In the present work, we initially evaluate the performance of the currently available guidelines across the different GSTA1 genetic variants. The PK parameters from the Bu first doses from 101 children and adolescents who have undergone allogenic SCT at the CHU Sainte-Justine, Montreal, Canada following a IV Bu-containing conditioning regimen (BuCR). GSTA1 haplotypes were interpreted in pairs (diplotypes) and then classified in 3 groups based on different potentials of enzyme expression. Measured AUCs and AUCs calculated from Bu doses predicted by 11 different models were classified according to their ability to achieve the AUC target (900 and 1500μM.min). Clearance prediction errors were also calculated. After the first dose, measured AUCs achieved the target in 38.7%. GSTA1 diplotypes groups related to poor Bu metabolism (G3) and fludarabine-containing regimens (FluCR) were the only factors associated with AUC within target (OR 4.7, 95% CI, 1.1 - 19.8, p=0.04 and OR 9.9, 95% CI, 1.6 - 61.7, p=0.01, respectively). Using other methods for dose calculation, percentage of AUCs within target varied from 16% to 74%. G3 and FluCR were, in some models, associated to AUC within the target and in the toxic range, whereas rapid-metabolizers (G1) were correlated with sub therapeutic AUCs. These associations were confirmed in clearance-prediction analysis, where GSTA1 diplotypes groups and conditioning regimen consistently influenced methods’ most prediction errors. Once GSTA1 status was demonstrated to influence significantly the available Bu dosing algorithms, we aimed to develop a population PK (PPK) model which included GSTA1 genetic variants as a covariate. For that, concentration-time data from 112 children and adolescents receiving IV Bu as a component of the conditioning regimen for 115 stem cell transplantations (autologous and allogenic) performed at CHU Sainte-Justine were analyzed. Non-linear mixed effects analysis was used to build a PPK model. Sex, baseline disease (malignant vs. non-malignant), post-menstrual age (PMA) or chronological age, conditioning regimen and GSTA1 diplotypes groups were evaluated as potential covariates. A one-compartment model with first-order elimination best described the data. A factor of Bu metabolism maturation (Fmat) and theoretical allometric scaling of weight were included in the base model. Covariate analysis revealed PMA (ΔOFV=-26.7, p=2.3x10-7) and GSTA1 diplotypes groups (ΔOFV=-11.7, p=0.003), as significant factors on volume and clearance (CL), respectively. CL of rapid metabolizers (G1) were predicted as being 7% higher and that of poor ones (G3) 12% lower than CL of those defined as normal metabolizers (G2). In conclusion, after evidencing that available Bu dosing methods are not suitable for all GSTA1 diplotypes groups, we have proposed the first pharmacogenomics-based dosing algorithm for Bu to be used in a pediatrics. Its use may contribute considerably to better predict Bu exposure in children and adolescents tailoring the dose according to individual metabolic capacity.

O objetivo desta tese foi desenvolver um modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) aplicável a avaliação de esquemas posológicos de antifúngicos sistêmicos no tratamento de infecções cerebrais associadas ao Cryptococcus neorformans. Inicialmente um modelo de infecção cerebral em ratos Wistar machos imunocompetentes foi estabelecido. Os animais foram inoculados a partir da administração iv de 1.106 UFC/mL na veia lateral caudal, de uma cepa de Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957). A presença da levedura em cérebro, pulmão, fígado, rins e coração foi avaliada após 7, 10 e 14 dias. Paralelamente foram investigados os parâmetros bioquímicos (contagem de leucócitos, TGO, TGP, uréia, creatinina, albumina e CK) e a permeabilidade vascular cerebral com azul de Evans. Após 10 dias de inoculação foi produzida uma infecção com características semelhantes a doença em humanos. C. neoformans esteve presente em todos os tecidos investigados pelas análises histológicas e microbiológicas e diferenças nos níveis de albumina, ureia, TGP e CK, alteração no número de leucócitos (monócitos e neutrófilos) e elevação da permeabilidade cerebral ao azul de Evans foram observadas nos animais infectados. Após estabelecida e caracterizada a infecção, foi avaliada a farmacocinética plasmática e tecidual cerebral através da técnica de microdiálise, do fluconazol (FLU) (20 mg/kg, i.v. bolus) e do voriconazol (VRC) (5 mg/kg, i.v. bolus) em ratos Wistar sadios (n = 13) e infectados (n = 13). De posse dos dados das concentrações plasmáticas e teciduais vs tempo dos grupos sadios e infectados construiu-se um modelo farmacocinético populacional (PopPK) para cada fármaco investigado. A penetração cerebral do VRC demonstrou-se elevada nos animais infectados (fTsadios = 0,85 vs fTinfectados = 1,86). O modelo PopPK de dois compartimentos e eliminação por Michaelis Menten descreveu o perfil de concentrações versus tempo de VRC em plasma e tecido, simultaneamente. A covariável infecção foi incluída em V2 e VM. Observou-se o grande potencial do VRC para tratar meningite associada a C. neoformans, pois os níveis alcançados em tecidos infectados foram superiores aos valores descritos para CIM de VRC contra C. neoformans (0,03 - 0,5 μg/mL). A farmacocinética do FLC foi descrita através de um modelo PopPK de dois compartimentos com eliminação linear incluindo dados de concentrações plasmáticas e livres cerebrais para ambos os grupos investigados. Nesse modelo a covariável infecção foi atribuída ao parâmetro k21 e covariável peso foi atribuída aos parâmetros V1 e V2. De posse desse modelo popPK, foram investigados os desfechos farmacodinâmicos considerando o nível de exposição cerebral nas doses de 125 e 250 mg/kg para ratos e 400-2000 mg para humanos observado em tecido sadio e infectado através da probabilidade de atingir o alvo terapêutico (PTA - fASC/CIM = 389) do FLC usando simulações de Monte Carlo. Essas simulações demonstraram um uso limitado de fluconazol em monoterapia para o tratamento de meningite por C. neoformans. Após a etapa farmacocinética procederam-se os estudos farmacodinâmicos através da metologia de curvas de morte em função do tempo do fluconazol e voriconazol frente a C. neoformans. Os dados da curva de morte foram modelados adequadamente com o modelo PK-PD de Emax modificado incluindo um termo de atraso de crescimento. A CIM foi determinada para ambos os fármacos por microdiluição e os valores foram de 0,03 μg/mL para voriconazol e 0,5 μg/mL para fluconazol, indicando que esta cepa ATCC 28957 é sensível a ambos os fármacos. Os valores de k, EC50 e kmax foram determinados para vários múltiplos das CIM de cada fármaco (0,03×, 0,06×, 0,25×, 0,5×, 1× 4×, 16×, 32× e 64×). O valor médio de k foi de 0,38 h-1, EC50 foi de 1,26 ± 0,18 μg/mL e 0,32 ± 0,06 μg/mL e kmax foi de 0,95 ± 0,21 h-1 e 0,64 ± 0,12 h-1 para FLC e VRC, respectivamente. Por fim, de posse dos parâmetros calculados através do modelo PK-PD foram realizadas simulações dos desfechos de tratamento para meningite criptocócica no cenário clínico para ambos os fármacos após administração das doses 200 e 400 mg de voriconazol e 800 e 2000 mg de fluconazol por dez semanas. Através das simulações conclui-se que para fluconazol há 25% de insucesso na dose de 800 mg e 10% na dose de 2000 mg com um tempo médio de 3 semanas para erradicação da levedura. Para o voriconazol, o EC50 teve pouco impacto sobre a erradicação do fungo e, em todos os cenários foi observada uma erradicação completa do fungo em curto espaço de tempo (1 - 2 semanas). Os resultados incentivam o uso de voriconazol nos pacientes com meningite criptocócica e uma reavaliação do uso de fluconazol. / The aim of this thesis was to develop a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model for the evaluation of systemic antifungal dosing regimens for the treatment of brain infections associated with Cryptococcus neorformans. Firstly a model of brain infection in immunocompetent male Wistar rats was established. The animals were inoculated by intravenously administration of 1. 106 CFU/mL of Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957) into the tail lateral vein. The presence of yeasts in the brain, lung, the liver, kidneys and the heart was evaluated after 7, 10 and 14 days. The biochemical parameters (leucocytes counting, GOT, GPT, urea, creatinine, albumin and CK) and cerebral vascular permeability with Evans blue were investigated. After 10 days post inoculation an infection with characteristics similar in humans was produced. C. neoformans was present in all tissues investigated by histological and microbiological analyzes and differences in albumin, urea, GPT and CK levels, alterations in the number of leukocytes (monocytes and neutrophils), and elevation of cerebral permeability to Evans blue were observed in infected animals. After establishing and characterizing the infection, the plasma and cerebral tissue pharmacokinetics were evaluated by microdialysis after administration of fluconazole (FLU) (20 mg/kg, iv bolus) and voriconazole (VRC) (5 mg/kg, iv bolus) in healthy (n = 13) and infected Wistar rats (n = 13). A population pharmacokinetic model (PopPK) was build for each drug, based on data from plasma and tissue concentrations vs. time of healthy and infected groups. The brain penetration of voriconazole was shown to be high in infected animals (fThealthy = 0.85 vs fTinfected = 1.86) than in healthy ones. The two-compartment model with Michaelis Menten elimination best described the concentration of VRC in plasma and tissue. The covariate infection was included in V2 and VM. The great potential of voriconazole to treat meningitis associated with C. neoformans was observed, as the levels reached in infected tissues were higher than the values described for MIC against C. neoformans (0.03 - 0.5 μg/mL). The pharmacokinetics of FLC was described using a two-compartment model with linear elimination including data from plasma and brain free concentrations for both groups investigated. In this model the covariate infection was attributed to parameter k21 and covariate weight was assigned to parameters V1 and V2. With this popPK model, the pharmacodynamic outcomes were investigated considering the level of brain exposure at doses of 125 and 250 mg/kg for rats and 400 - 2000 mg for humans observed in healthy and infected tissue through the probability of attaining the target (PTA - fAUC/MIC = 389) of fluconazole using Monte Carlo simulations. These simulations demonstrated limited use of fluconazole in monotherapy for the treatment of C. neoformans meningitis. After the pharmacokinetics modeling, the pharmacodynamic studies were carried out using the methodology of time-kill curves of fluconazole and voriconazole versus C. neoformans. The kill curves data were suitably modeled with the modified Emax PK-PD model including a growth delay term. MIC was determined for both drugs by microdilution and values were 0.03 μg.mL-1 for voriconazole and 0.5 μg.mL-1 for fluconazole, indicating that this ATCC 28957 strain is sensitive to both drugs. The values of k, EC50 and kmax were determined for several MIC multiples of each drug (0.03 ×, 0.06 ×, 0.25 ×, 0,5×, 1 × 4 ×, 16 ×, 32 × and 64 ×). The mean value of k was 0.38 h-1, EC50 was 1.26 ± 0.18 μg.mL-1 and 0.32 ± 0.06 μg.mL-1 and kmax was 0.95 ± 0.21 h -1 and 0.64 ± 0.12 h-1 for FLC and VRC, respectively. Finally, the parameters obtained using the PK-PD model were used to simulate treatment outcomes for cryptococcal meningitis in the clinical setting for both drugs after administration of 200 and 400 mg of voriconazole and 800 and 2000 mg of fluconazole for 10 weeks. By the simulations it is concluded that for fluconazole there is a 25% rate of failure at the dose of 800 mg and 10% at the dose of 2000 mg with an average time of 3 weeks for eradication of the yeast. For voriconazole, the EC50 had little impact on fungus eradication and, in all scenarios complete eradication of the fungus was observed in a short time (1 - 2 weeks). The results encourage the use of voriconazole in patients with cryptococcal meningitis and a reassessment of fluconazole use.

Atualmente a cucurbitacina E é considerada uma candidata a fármaco em razão de sua atividade anticâncer, reconhecimento de seus alvos moleculares e sinergismo com outros fármacos utilizados no tratamento do câncer. Porém, ainda não é possível seu uso na clínica devido a importantes lacunas na literatura relativas a ensaios de farmacocinética pré-clínicos e clínicos. A cucurbitacina E é hidrolisada a cucurbitacina I em plasma e em microssomas de fígado humano. O presente estudo visa avaliar a farmacocinética populacional e ligação as proteínas plasmáticas da cucurbitacina E e seu metabólito cucurbitacina I em plasma de ratos. O método de análise sequencial da cucurbitacina E e cucurbitacina I em plasma de ratos foi desenvolvido utilizando LCMS/ MS. Alíquotas de 50 ?L de plasma foram desproteinizadas com acetonitrila e os resíduos reconstituídos com acetonitrila:água (1:1, v/v) e adicionados do padrão interno clobazam. Os extratos foram injetados na coluna RP-18 com fase móvel constituída por mistura de acetonitrila:água:metanol (32:35:33, v/v/v). O método é preciso e exato com linearidade no intervalo de 1-100 ng de cucurbitacina E/mL de plasma e de 0,4-200 ng de cucurbitacina I/mL de plasma. O método foi aplicado na avaliação da farmacocinética da cucurbitacina E administrada a ratos machos Wistar em dose única oral (gavagem) e intravenosa de 1mg/kg dissolvida em DMSO e tampão fosfato salino pH 7,4 (5:95, v/v). As amostras seriadas de sangue foram coletadas até 24 h após a administração oral ou intravenosa. As concentrações plasmáticas de cucurbitacina E foram quantificadas até 16 h somente após a administração intravenosa, enquanto as concentrações plasmáticas de cucurbitacina I permaneceram abaixo dos valores de LIQ seguindo a administração oral ou intravenosa. O modelo de farmacocinética populacional foi desenvolvido para a cucurbitacina E administrada por via intravenosa com o auxílio do programa NONMEM com adequada qualidade de ajuste e desempenho preditivo. O perfil farmacocinético da cucurbitacina E administrada por via intravenosa foi descrito por modelo bicompartimental com distribuição e eliminação de primeira ordem com os seguintes parâmetros farmacocinéticos: tempo de liberação (D) de 0,45 h, volume de distribuição (Vd) de 27,22 L, clearance (Cl) de 4,13 L/h e meiavida de eliminação (t1/2) de 4,57 h. As interações da cucurbitacina E e cucurbitacina I com as albuminas séricas humana (HSA) e de rato (RSA) foram investigadas utilizando biossensor óptico baseado em ressonância de plasma de superfície (SPR) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Os dados de ligação das cucurbitacinas a albuminas foram obtidos por experimentos de competição de CD com biliverdina. Os dados de SPR revelaram um evento de ligação inédito entre a cucurbitacina I e a HSA e as afinidades de ligação da cucurbitacina E e cucurbitacina I são maiores para a RSA do que para a HSA. A cucurbitacina E e a cucurbitacina I podem ser classificadas como substâncias de alta afinidade de ligação com a HSA e com a RSA. A análise de CD mostrou que a cucurbitacina E e a cucurbitacina I modificam a ligação da biliverdina as albuminas através de modulação alostérica oposta (positiva para HSA, negativa para RSA), confirmando a necessidade de cuidados na extrapolação de dados farmacocinéticos pré-clínicos para clínicos. / Cucurbitacin E is currently considered a drug candidate due to its anticancer activity, recognition of its molecular targets, and synergism with other drugs used for cancer treatment. However, the use of cucurbitacin E in clinical practice is not possible because of important research gaps regarding its preclinical and clinical pharmacokinetic characteristics. Cucurbitacin E is hydrolyzed to cucurbitacin I in plasma and in human liver microsomes. The aim of this study was to evaluate the population pharmacokinetics and plasma protein binding of cucurbitacin E and of its metabolite cucurbitacin I in rats. The method for the sequential analysis of cucurbitacins E and I in rat plasma was developed using LC-MS/MS. Plasma aliquots of 50 ?L were deproteinized with acetonitrile, the residues were reconstituted in acetonitrile:water (1:1, v/v), and clobazam was added as internal standard. The extracts were injected into an RP-18 column using a mobile phase consisting of a mixture of acetonitrile:water:methanol (32:35:33, v/v/v). The method was precise and accurate, showing linearities at a range of 1-100 ng cucurbitacin E/mL plasma and of 0.4-200 ng cucurbitacin I/mL plasma. The method was applied to the pharmacokinetic evaluation of cucurbitacin E administered to male Wistar rats at a single oral (gavage) or intravenous dose of 1 mg/kg dissolved in DMSO and phosphate-buffered saline, pH 7.4 (5:95, v/v). Serial blood samples were collected up to 24 h after oral or intravenous administration. The plasma concentrations of cucurbitacin E were quantified up to 16 h only after intravenous administration, while the plasma concentrations of cucurbitacin I remained below the limit of quantification after oral or intravenous administration. The population pharmacokinetic model was developed for administered intravenously cucurbitacin E using the NONMEM program, with adequate goodness of fit and predictive performance. The pharmacokinetic profile of intravenously administered cucurbitacin E was described by a two-compartment model with first-order distribution and elimination. The following pharmacokinetic parameters were obtained: release time (D) of 0.45 h, volume of distribution (Vd) of 27.22 L, clearance (Cl) of 4.13 L/h, and elimination half-life (t1/2) of 4.57 h. The interactions of cucurbitacin E and I with human (HSA) and rat (RSA) serum albumins were investigated using an optical biosensor by surface plasmon resonance (SPR) and circular dichroism (CD) spectroscopy. The binding data of the cucurbitacins to albumins were obtained by CD competition experiments with biliverdin. The SPR data revealed an undescribed binding event between cucurbitacin I and HSA and the binding affinities of cucurbitacin E and cucurbitacin I were higher for RSA than for HSA. Cucurbitacin E and cucurbitacin I can be classified as substances with high binding affinity for HSA and RSA. CD analysis showed that cucurbitacin E and cucurbitacin I modify the binding of biliverdin to albumins through opposite allosteric modulation (positive for HSA, negative for RSA), confirming that care should be taken when extrapolating the pharmacokinetic data between species.

O metoprolol, um fármaco aceito no tratamento da hipertensão durante a gestação, está disponível na clínica como mistura racêmica dos enantiômeros S-(-) e R-(+), embora o S-(-)-metoprolol seja considerado o eutômero em termos do bloqueio do receptor 1 adrenérgico. O presente estudo avalia a influência do Diabetes mellitus gestacional na disposição cinética e no metabolismo enantiosseletivos do metoprolol em parturientes hipertensas. As parturientes hipertensas investigadas (n=35) com idade gestacional de 35-42 semanas e fenotipadas como metabolizadoras extensivas tipo metoprolol, foram distribuídas nos grupos controle (n=24) ou portadoras de Diabetes mellitus gestacional (n=11). As parturientes foram tratadas com dose única oral de 100 mg de tartarato de metoprolol racêmico 1-11 h antes do parto. Foram coletadas amostras seriadas de sangue materno (0-24h) e no momento do parto foram coletados simultaneamente sangue materno, sangue do cordão umbilical e líquido amniótico. Os enantiômeros do metoprolol e seus metabólitos foram quantificados por LC-MS/MS ou por detecção por fluorescência. A disposição cinética do metoprolol é enantiosseletiva em parturientes hipertensas com observação de maiores concentrações plasmáticas (AUC0- 113,42 vs 62,65 ng.h/mL) e menor clearance total aparente (344,21 vs 623,14 L/h) para o eutômero S-(-)-metoprolol. A formação do metabólito -hidroximetoprolol também é estereosseletiva com favorecimento do novo centro quiral 1R (AUC0- 1R/1S=2,84). O favorecimento da formação do R-(+)-ácido O-desmetilmetoprolóico (AUC0- 2,77 vs 2,66 g.h/mL) explica o acúmulo plasmático do S-(-)-metoprolol. O Diabetes mellitus gestacional compensado prolonga o tmax para ambos os enantiômeros do metoprolol (1,5 vs 2,5 h) e ácido O-desmetilmetoprolóico (2,0 vs 3,5 h) e para todos os isômeros do -hidroximetoprolol (2,0 vs 3,0 h). O Diabetes mellitus gestacional compensado não altera as razões isoméricas de concentrações plasmáticas do metoprolol, -hidroximetoprolol e ácido O-desmetilmetoprolóico. As razões de concentrações líquido amniótico/plasma materno obtidas para ambos os enantiômeros do metoprolol (3,0 para o R-(+)-metoprolol e 3,2 para o S-(-)-metoprolol) e para os isômeros do -hidroximetoprolol (5,1 para o 1\'S,2R; 4,0 para o 1\'S,2S; 1,6 para o 1\'R,2R e 2,3 para o 1\'R,2S) evidenciam maiores concentrações dos fármacos no líquido amniótico do que no plasma materno. No entanto, os enantiômeros do ácido O-desmetilmetoprolóico atingem menores concentrações no líquido amniótico do que no plasma materno das parturientes hipertensas (líquido amniótico/plasma materno = 0,29 e 0,37 respectivamente para os enantiômeros R-(+)- e S-(-)). A distribuição transplacentária é próxima a 1 para ambos os enantiômeros do metoprolol e para todos os isômeros do -hidroximetoprolol e próxima a 0,8 para ambos os enantiômeros do ácido O-desmetilmetoprolóico em parturientes hipertensas. O Diabetes mellitus gestacional compensado reduz em aproximadamente 20% a distribuição transplacentária dos isômeros 1S,2S; 1R,2R; e 1R,2S--hidroximetoprolol mas não altera a distribuição dos enantiômeros do metoprolol. / Metoprolol is a drug accepted in the treatment of hypertension during pregnancy and it is clinically available as a racemic mixture of its enantiomers S-(-) and R-(+) metoprolol, although S-(-)-metoprolol is considered the eutomer responsible for 1 adrenergic receptor blockade.This study evaluates the influence of gestational Diabetes mellitus on the kinetic disposition and metabolism of metoprolol enantiomers in hypertensive parturients. The investigated parturients (n=35) presented gestational age within 35 to 42 weeks, were phenotyped as extensive metabolizers of metoprolol and were distributed in the control group (n=24) or in the gestational Diabetes mellitus group (n =11). The parturients were treated with single oral dose of 100 mg racemic metoprolol tartrate 1-11 h before delivery. Maternal blood samples were collected until 24h after drug administration, whereas maternal blood, umbilical cord blood and amniotic fluid were simultaneously collected at delivery. Metoprolol enantiomers and its metabolites were quantified by LC-MS/MS or by fluorescence detection. Kinetic disposition of metoprolol is enantioselective in hypertensive parturients with observation of higher plasma concentrations (AUC0- 113.42 vs 62.65 ng.h/mL) and lower apparent total clearance (344.21 vs 623.14 L/h) for the S-(-)-metoprolol eutomer. The formation of -hydroxymetoprolol metabolite is also stereoselective in favor of the new chiral center 1\'R (AUC0- 1\'R/1\'S = 2.84). The formation in favor of R-(+)-metoprolol acid metabolite (AUC0- 2.77 vs 2.66 g.h/mL) explains the plasma accumulation of S-(-)-metoprolol. Gestational Diabetes mellitus prolongs tmax for both metoprolol enantiomers (1.5 vs 2.5 h), metoprolol acid metabolite (2.0 vs 3.5 h) and for all -hydroxymetoprolol isomers (2.0 vs 3.0 h). Gestational Diabetes mellitus does not alter the isomeric ratios of plasma concentrations of metoprolol, -hydroxymetoprolol and metoprolol acid metabolite. The concentrations of both metoprolol enantiomers (amniotic fluid/maternal plasma = 3.0 for R-(+)-metoprolol and 3.2 for the S-(-)-metoprolol) and -hydroxymetoprolol isomers (liquid amniotic fluid/maternal plasma = 5.1 for 1\'S,2R; 4.0 for 1\'S,2S; 1.6 for 1\'R,2R and 2.3 for 1\'R,2S) are higher in amniotic fluid than in maternal plasma. However, metoprolol acid metabolite enantiomers reach lower concentrations in amniotic fluid than in maternal plasma of hypertensive parturients (amniotic fluid/maternal plasma = 0.29 and 0.37 respectively for the R-(+)- and S-(-)- enantiomers). The transplacental distribution is approximately 1 for both enantiomers of metoprolol and all isomers of -hydroxymetoprolol and approximately 0.8 for both metoprolol acid metabolite enantiomers in hypertensive parturients. Gestational Diabetes mellitus reduces in approximately 20% the transplacental distribution of the isomers 1\'S,2S; 1\'R,2R and 1\'R,2S--hidroximetoprolol but does not alter the transplacental distribution of both metoprolol enantiomers.