Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas destes hormônios é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. As mutações inativadoras e deleções do gene do IGF1R em heterozigose vêm sendo relatadas de forma crescente nos últimos 9 anos em pacientes com história de déficit de crescimento pré e pós-natal. Postula-se que pelo menos 2 a 3% das crianças nascidas PIG poderiam apresentar defeitos no IGF1R. O quadro clínico destes pacientes apresenta grande variabilidade quanto à gravidade do retardo de crescimento pré- e pós-natal e aos parâmetros hormonais. Objetivo: Caracterizar in vitro a resistência ao IGF-1 de pacientes com defeitos no IGF1R, identificados em nosso ambulatório. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal. Destes pacientes, um paciente (SGA1) era portador de mutação missense em heterozigose no gene IGF1R (p.Arg511Trp) e os demais apresentavam baixa expressão dos IGF1R em leucócitos periféricos quando avaliados por PCR em tempo real. Um destes pacientes (SGA2) apresentava também a variante alélica p.Gly6Arg do IGF1R em heterozigose, alteração esta encontrada também em controles e familiares sem déficit de crescimento. As ações do IGF-1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da expressão do IGF-1R e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (via PI3K). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 proliferaram respectivamente 55%, 66%, 64% e 28% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, foi observada redução na expressão do IGF1R nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Por outro lado, a linhagem SGA1 mostrou expressão aumentada do IGF1R e no conteúdo da proteína em relação aos controles. Em relação á ativação da via PI3K, todas as linhagens dos pacientes apresentaram menor fosforilação de AKT após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles. Conclusão: Demonstramos a presença de insensibilidade parcial ao IGF-1 nas linhagens estudadas. A baixa expressão do IGF1R observada em leucócitos periféricos nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 foi confirmada em fibroblastos tanto em nível de RNAm quanto da sua proteína. Nestas linhagens a insensibilidade ao IGF-1 é secundária a diminuição da expressão deste receptor. Em contraste a na linhagem com a mutação p.Arg511Trp (SGA1) observou-se expressão normal do IGF-1R na superfície celular. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares neste grupo de pacientes / Small for gestational age (SGA) children are at a greater risk of having a short stature in adulthood. The type 1 and 2 insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factors determining fetal growth, and most of the known actions of these hormones are mediated via a receptor tyrosine kinase, IGF-1R. Inactivating mutations and deletions of the IGF1R gene in heterozygosis have been reported with increasing frequency in the last 9 years in patients with a history of a failure to thrive pre- and postnatally. It is postulated that at least 2-3% of the children born SGA could be defective for the IGF1R. The clinical presentation of these patients is highly variable with regard to the severity of growth retardation and pre- and post-natal hormonal parameters. Objectives: The goal of this study was to identify the in vitro insensitivity to IGF-1 in patients with defects in IGF1R. Methods: We developed fibroblast cultures from two controls (C1 and C2) and 4 patients born SGA (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4) with a suspected insensitivity to IGF-1 by the absence of catch-up growth during their postnatal life. Of these patients, one (SGA1) carried a heterozygous missense mutation in the IGF1R gene (p.Arg511Trp), and the others exhibited low expression levels of IGF1R in their peripheral leukocytes, as evaluated using real-time PCR. One of these patients (SGA2) was also heterozygous for the allelic variant p.Gly6Arg of IGF1R, an alteration also found in the controls and family members not displaying growth restriction. The actions of IGF-1 were determined using proliferation assays, an analysis of the expression of IGF- 1R and phosphorylation studies of proteins of the IGF-1 signaling pathway in fibroblasts (via PI3K).Results: The SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts proliferated 55%, 66%, 64% and 28%, respectively, less under the stimulation of IGF-1 compared to the control lines. Using real-time PCR, the IGF1R mRNA expression showed reduced levels of IGF1R in the SGA2, SGA3 and SGA4 cells compared to the controls, and the total IGF-1R protein was also decreased in these cells. Moreover, the SGA1 cells showed increased expression levels of IGF1R mRNA and protein compared to the controls. In relation to the activation of PI3K, all of the cells showed decreased phosphorylation of AKT after the stimulation with IGF-1 compared to the control cells. Conclusion: We demonstrated the presence of a partial insensitivity to IGF-1 in the studied samples. The low expression of IGF1R observed in the peripheral leukocytes in the SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts was confirmed at both the mRNA and protein levels, and the Andréa de Castro Leal Doutorado insensitivity of the cells to IGF-1 is secondary to the decreased expression of the receptor. In contrast, the cells with the mutation p.Arg511Trp (SGA1) displayed normal IGF-1R expression on the cell surface. The patients with alterations in the IGF1R gene do not exhibit a characteristic phenotype that differentiates them from other children born SGA and with no changes in this gene, thus showing the importance of molecular studies for this group of patients

O hormônio adrenocorticotrópico, ACTH, regula função (esteroidogênese) e proliferação das células da córtex das glândulas adrenais através de um único receptor específico, ACTHR, que pertence à superfamília GPCR (G-protein coupled receptors). Embora o ACTHR tenha sido clonado há 8 anos, os mecanismos moleculares das ações mitogênica e anti-mitogênica de ACTH permanecem obscuros, cuja elucidação é objeto de estudo deste trabalho. A abordagem experimental consistiu na clonagem do ACTHR de células adrenocorticais Y-1 de camundongo e expressão funcional em fibroblastos 3T3 e células AR-1. Clones transfectantes, expressando estavelmente ACTHR, mostraram-se responsivos a ACTH através de: a) ativação de adenilato ciclase e b) indução de genes das famílias fos e jun. Por outro lado, medidas de síntese de DNA e proliferação celular indicam que ACTH não tem nenhum efeito mitogênico ou anti-mitogênico nos transfectantes ACTHR. O gene c-fos foi usado como alvo para testar vias de transdução de sinal ativadas por ACTH nos transfectantes 3T3 ACTHR. Estes testes mostraram que PKA, PKC e MAPK tem pouca ou nenhuma participação na indução de c-fos por ACTH nos clones 3T3 ACTHR, sugerindo que ACTHR pode ativar vias ainda não identificadas e motivando a busca de novas vias ativadas por ACTH nas células Y-1. Verificou-se que células Y-1 apresentam níveis constitutivamente elevados de AKT/PKB ativada (fosforilada), dependentes de PI3K e SRC, e que ACTH promove rápida desfosforilação de AKT via Gs/Adenilato Ciclase/cAMP/PKA. Ao promover a inativação de AKT, ACTH promove simultaneamente a indução da proteína p27'IND.Kip1', um mecanismo que contribui para a atividade anti-mitogênica de ACTH. / The adrenocorticotropic hormone, ACTH, regulates both function and proliferation of adrenocortical cells binding to a specific receptor, ACTHR, which belongs to superfamily of GPCR (G-protein coupled receptors). ACTHR was cloned a few years ago, but the molecular mechanisms underlying the mitogenic and anti-mitogenic actions of ACTH remain unknown, whose elucidation is aim of this project. The experimental approach was to clone the ACTHR from mouse Y-1 adrenocortical cells and to express the functional receptor in Balb 3T3 fibroblasts and AR-1 cells. Transfectant clones stably expressing the ACTHR respond to ACTH treatments by: a) adenylate cyclase activation and b) induction of fos and jun genes. On the other hand, experiments of DNA synthesis and cellular proliferation showed that ACTH has not mitogenic or anti-mitogenic effects in ACTHR transfectants. c-fos gene was used as a target to test signal transduction pathways activated by ACTH into 3T3 ACTHR transfectants. The results showed that PKA, PKC and MAPK have no relevant contribution on the ACTH c-fos induction in 3T3 ACTHR transfectants suggesting that ACTHR can activate signal transduction pathways still not identified. This conclusion prompted us to search for another signal transduction pathways triggered by ACTHR in Y-1 adrenocortical cells. This search led to the detection of high constitutive levels of activated AKT/PKB in Y-1 adrenocortical cells, which are dependent on PI3K and SRC. ACTH causes a strong and rapid downregulation of activated AKT in a Gs/Adenylate Cyclase/cAMP/PKA dependent manner. Apparently, dephosphorylation of AKT promoted by ACTH releases transcription factors that induce p27'IND.Kip1', a likely mechanism underlying ACTH anti-mitogenic effects in adrenocortical cells.

O principal controle do ciclo celular de mamíferos, que é dividido em G0/G1/S/G2/M, ocorre na transição G0→G1→S. Nesta tese mostramos que a proteína ciclina D1 desempenha um papel fundamental nos circuitos de transdução de sinais que regulam a transição G0→G1→S na linhagem Y-1 de células adrenocorticais de camundongo. Esta conclusão não é surpreendente, uma vez que, ao longo dos últimos anos, muitos laboratórios contribuíram para estabelecer a noção de que a atividade das diversas formas do complexo ciclina/CDK é essencial para a transição G0→G1→S, e também para outras etapas do ciclo celular. Em células Y-1, FGF-2 induz tardiamente (5-6h) a expressão do gene e da proteína ciclina D 1, através de um processo dependente de síntese de proteínas. Peptídeos hipofisários não identificados e vasopressina bloqueiam a indução de ciclina DI, antagonizando FGF-2. Por este mecanismo, vasopressina exerce um efeito anti-mitótico, bloqueando a transição G0→G1→S promovida por FGF-2. ACTH, que também exibe um forte efeito anti-mitótico sobre FGF-2 não afeta a indução de ciclina D1. A transfecção dupla de uma forma induzível de c-Myc (MycER) e constitutiva do cDNA de ciclina D1, em presença de ACTH mimetiza a ação mitogênica de FGF-2 em células Y-1 no estado G0. Estes resultados mostram que, em células adrenocorticais, c-Fos, c-Jun, c-Myc e ciclina D1 agem de forma independente e complementar, sendo necessários para a transição G0→G1→S do ciclo celular. / The main control of mammalian cell cycle, which is divided in G0/G1/S/G2/M, occurs in G0→G1→S transition. In this work we show that cyclin D1 protein plays a key role in signal transduction circuits underlying the G0→G1→S transition of mouse Y-1 adrenocortical cell line. This conclusion is not surprising, once in the last years, many laboratories have contributed to establish the notion that the activity of the distinct forms of cyclin/CDK complexes is essential for the G0→G1→S transition, and also for other phases transition of cell cycle. In Y-1 cells, FGF-2 causes a delayed (5-6h) induction of cyclin D1 gene and protein, through a process dependent on protein synthesis. Hypophisary peptides, not identified, as well as vasopressin, block cyclin D1 induction, antagonizing FGF-2. By this mechanism, vasopressin exert an antimitotic effect, blocking G0→G1→S transition promoted by FGF-2. ACTH, which also exhibit a strong anti-mitotic effect upon FGF-2, does not affect cyclin D1 induction. Double transfection of inducible c-Myc (MycER) and constitutive cyclin D1 cDNA, in the presence of ACTH, mimics the mitogenic action of FGF-2 in G0 Y-1 cells. Altogether, these results show that, in adrenocortical cells, c-Fos, c-Jun, c-Myc and cyclin D1 act in an independent and complementary manner, being necessary for the G0→G1→S transition of cell cycle.

Descrevemos, recentemente, que FGF2 parácrino dispara senescência nas linhagens celulares murinas Y1 e 3T3-B61, transformadas malignamente por Ras, mas sem ativação das vias apoptóticas (Costa et al., 2008). Nesta tese, estudamos os mecanismos celulares e moleculares desta resposta de estresse irreversível, disparada por FGF2. Focalizamos, principalmente, a linhagem Y1, que carrega uma amplificação do oncogene Kras, mas apresenta um controle parcial da transição G0/G1 → S do ciclo celular. Por estas características fenotípicas, as células Y1 foram utilizadas no estudo dos mecanismos das ações antagônicas de FGF2, isto é, a atividade mitogênica clássica e a nova ação citotóxica que causa senescência. Análises de citometria de fluxo e marcação com BrdU mostraram que FGF2 promove a transição G0/G1 → S (atividade mitogênica), mas bloqueia a progressão através de S e G2/M (atividade antimitogênica). Ensaios de viabilidade celular (MTS e Cyto-Tox) demonstraram que, durante o bloqueio do ciclo celular por FGF2, as células permanecem íntegras e metabolicamente ativas, embora exibam alterações morfológicas, que sugerem estresse celular. Além disso, experimentos de tomada de 3H-timidina em DNA evidenciaram que, já nas primeiras horas de G1, FGF2 dispara um processo antimitogênico que só tardiamente vai se manifestar na fase S, bloqueando a síntese de DNA. Verificamos ainda, que o inibidor específico da Tyr-quinase dos receptores de FGF, PD173074, abole completamente, tanto os efeitos mitogênicos como os antimitogênicos de FGF2 nas células Y1, demonstrando que ambos os processos iniciam-se com a ativação da Tyr-quinase dos FGFRs. Por outro lado, inibidores específicos das vias de sinalização de MEK/ERK, PI3K/AKT e PKC (todas mitogênicas e à jusante dos FGFRs) bloqueiam a progressão no ciclo celular, sem proteger as células Y1 de FGF2, evidenciando que estas vias mitogênicas não participam dos mecanismos moleculares citotóxicos disparados por FGF2. Entretanto, inibidores das Tyr-quinases Src protegem parcialmente as células Y1 de FGF2, implicando a família Src na transformação maligna destas células. Para buscar novos genes pertinentes à ação citotóxica de FGF2 analisamos expressão gênica por RT-qPCR, dando continuidade a estudos anteriores desenvolvidos no laboratório, através de microarranjos de cDNA (Asprino & Armelin, 2006). Desta busca, resultaram genes codificantes de proteínas envolvidas no controle de ciclo celular, adesão e citoesqueleto, com destaque para proteínas reguladoras de RhoGTPases e os receptores de FGF. Procuramos também examinar especificidades entre os FGFRs, quanto ao disparo das ações antagônicas de FGF2. As células Y1 expressam FGFR1IIIc, FGFR2IIIc e FGFR5 enquanto as 3T3-B61 expressam FGFR1IIIc e FGFR5. A redução da expressão de FGFR2 por RNAi, em células Y1, não impediu a ação citotóxica de FGF2, mas a redução de FGFR1 protegeu as células da ação morfológico-estressante de FGF2. Como FGFR5 não possui domínio de Tyr-quinase, concluímos que o FGFR1 é o receptor mais relevante para o efeito citotóxico de FGF2, em ambas as células. Em conclusão, FGF2 ativa a Tyr-quinase dos FGFRs, disparando mecanismos moleculares antagônicos, paralelos e independentes, onde o efeito final é o bloqueio do ciclo celular nas fases S e G2/M e, consequentemente, senescência celular. / We have recently described that paracrine FGF2 triggers senescence in Ras-driven murine cell lines Y1 and 3T3-B61, without activation of apoptotic pathways (Costa et al., 2008). On this thesis, we studied the molecular and cellular mechanisms of this irreversible stress response triggered by FGF2. We have mainly focused on the Y1 cell line, which carries Kras oncogene amplification, but presents a certain control of the G0/G1 → S cell cycle transition. Because of these phenotypic features, the Y1 cells were utilized to study the mechanisms of FGF2 antagonic actions, i. e., the classical mitogenic activity and the new cytotoxic action, which causes senescence. Flow cytometer analysis and BrdU labeling have shown that FGF2 promotes the G0/G1 → S transition (mitogenic activity), but arrests the progression through S and G2/M (antimitogenic activity). Viability assays (MTS and Cyto-Tox) have shown that, during the cell cycle arrest by FGF2, cells remain intact and metabolically active, although exhibiting morphologic alterations, which suggested cellular stress. Moreover, 3H-thymidine uptake into DNA has evidenced that, within the first hours of G1, FGF2 triggers an antimitogenic process that only lately will manifest in S phase, blocking DNA synthesis. We have further verified that the specific Tyr-kinase inhibitor, PD173074, completely abolishes both FGF2 mitogenic and antimitogenic effects, showing that both processes start at FGFRs Tyr-kinase. On the other hand, specific inhibitors of MEK/ERK, PI3K/AKT and PKC signaling pathways (all mitogenic and downstream of FGFRs) block the cell cycle progression, but do not protect cells from FGF2, showing that these pathways do not participate of the cytotoxic molecular mechanisms triggered by FGF2. However, Src Tyr-kinases inhibitors partially protect Y1 cells from FGF2, implicating the Src family on malignant transformation of these cells. To search new genes pertinent to the cytotoxic action of FGF2, we analyzed gene expression by RT-qPCR, continuing previous studies developed in our laboratory through cDNA microarrays (Asprino & Armelin, 2006). This search revealed protein-coding genes involved on cell cycle control, cellular adhesion and cytoskeleton, in which we highlighted regulatory proteins of RhoGTPases and FGF receptors. We also examined specificities among FGFRs in relation to FGF2 antagonic actions. Y1 cells express FGFR1IIIc, FGFR2IIIc and FGFR5 whereas 3T3-B61 cells express FGFR1IIIc and FGFR5. In Y1 cells, the knockdown of FGFR2 expression by RNAi do not stop FGF2 cytotoxic actions, but knockdown of FGFR1 expression protects cells from the FGF2 morphologic-stressing action. Since FGFR5 lacks Tyr-kinase domain, we concluded that FGFR1 is the most relevant receptor for FGF2 cytotoxic effect in both cells. In conclusion, FGF2 activates FGFRs Tyr-kinase, triggering parallel and independent antagonic molecular mechanisms, in which the final effect is the S and G2/M cell cycle arrest and, consequently, cellular senescence.

O desmame precoce (DP) causa mudanças na mucosa gástrica, como o aumento da proliferação celular e da expressão do Fator de Crescimento Transformante (TGFa). Neste trabalho, avaliamos o papel desse peptídeo e seu receptor EGFR no controle do crescimento gástrico. Ratos com 15 dias de vida foram divididos em: amamentados (controle) e DP, no qual os filhotes foram separados da mãe e alimentados com pasta de ração. O DP aumentou o número de células marcadas para EGFR, acelerou a diferenciação de células mucosas do colo e elevou a expressão de mucina 6. A inibição do EGFR com AG1478 diminuiu a proliferação celular e o número de células mucosas do colo. Entre as proteínas envolvidas na sinalização de EGFR e ciclo celular, detectamos que o DP elevou os níveis de p-ERK1/2 e p-Src e não alterou p-Akt, p21 e p27. Nós sugerimos que o padrão alimentar influencia a proliferação e diferenciação no epitélio gástrico, e que TGFa/EGFR podem regular esses processos durante o desenvolvimento pós-natal, provavelmente por ativação das vias de sinalização de MAPK e Src. / Early weaning (EW) causes changes in the gastric mucosa, including the increase in cell proliferation and Transforming Growth Factor (TGFa). In the present study, we evaluated the role of this peptide and its receptor EGFR in the control of the gastric growth. 15-d-old rats were divided into two groups: suckling (control) and EW, in which the pups were separated from the dam and fed with powdered chow. EW increased the number of EGFR-positive cells, accelerated the differentiation of mucous neck cells and augmented the expression of mucin 6. EGFR inhibition with AG1478 decreased cell proliferation and the number of mucous neck cells. Among the proteins involved on EGFR signaling pathways and cell cycle, we found that EW increased the levels of p-ERK1/2 and p-Src, but did not change p-Akt, p21 and p27. We suggest that the diet pattern influences proliferation and differentiation in the gastric epithelium, and the TGFa/EGFR can regulate these processes throughout the postnatal development, probably by activating MAPK and Src signaling pathways.

Introdução: O objetivo foi avaliar a expressão de algumas proteínas no endométrio durante a fase lútea do ciclo menstrual de mulheres férteis e inférteis, por meio imunoistoquímica de micro-arranjos teciduais (TMA). Métodos: Analisou-se a expressão de dez proteínas em 52 amostras de endométrio obtidas nas fases lútea inicial, intermediária (janela de implantação) e final. Resultados: As proteínas, fator inibidor de leucemia (LIF), fator de crescimento insulinóide tipo 1 (IGF-1), receptor de progesterona (PR), claudina-4, receptor de fator de crescimento vascular endotelial 3 (VEGFR-3) e citoqueratina 7 (CK-7) mostraram-se expressas no endométrio nas fases lútea inicial, intermediária e final. A proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4) expressou-se no endométrio nas fases lútea inicial e intermediária. As proteínas citoqueratina 17 (CK-17), substância solúvel 100 (S100) e calretinina não se expressaram no endométrio durante os três períodos avaliados. Houve correlação entre as expressões protéicas de LIF, IGF-1 e PR. As proteínas LIF e BMP-4 foram diferencialmente expressos no endométrio nas fases lútea inicial, intermediária e final. As proteínas claudina-4 e PR não se expressam simultâneamente no endométrio durante a fase lútea. Conclusão: Baseados nos resultados deste estudo podemos sugerir que a presença das proteínas LIF, IGF-1 e PR durante a janela implantacional teria relevância como preditor do adequado desenvolvimento do endométrio. / Introduction: The objective of this study was to evaluate endometrial protein expressions from fertile and infertile women during the luteal phase of the menstrual cycle by immunohistochemistry in tissue microarrays (TMA). Method: The expression of ten proteins obtained from 52 endometrial samples in the initial, mid (window of implantation) and late (premenstrual) phases of the menstrual cycle were evaluated. Results: The proteins leukemia inhibitory factor (LIF), insulin like growth factor 1 (IGF-1), progesterone receptor (PR), claudin-4, vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR-3), and cytokeratin 7 (CK-7) were expressed in the endometrium in the three intervals of the luteal phase. Endometrial expression of the morphogenetic bone protein 4 (BMP-4) occurred during the initial and mid luteal phases. Cytokeratin 17, substance 100 and calretinin were not expressed in the luteal phase. There were positive correlations among endometrial expressions of LIF, IGF- 1, and PR. LIF and BMP-4 were differently expressed in the initial, mid and late phases of the luteal phase. Claudin-4 and PR did not express simultaneously during the different intervals of the luteal phase. Conclusion: These findings suggest that positively correlated endometrial expressions of LIF, IGF-1 and PR at the window of implantation could characterize an adequately developed and receptive endometrium.

O hormônio adrenocorticotrópico, ACTH, regula função (esteroidogênese) e proliferação das células da córtex das glândulas adrenais através de um único receptor específico, ACTHR, que pertence à superfamília GPCR (G-protein coupled receptors). Embora o ACTHR tenha sido clonado há 8 anos, os mecanismos moleculares das ações mitogênica e anti-mitogênica de ACTH permanecem obscuros, cuja elucidação é objeto de estudo deste trabalho. A abordagem experimental consistiu na clonagem do ACTHR de células adrenocorticais Y-1 de camundongo e expressão funcional em fibroblastos 3T3 e células AR-1. Clones transfectantes, expressando estavelmente ACTHR, mostraram-se responsivos a ACTH através de: a) ativação de adenilato ciclase e b) indução de genes das famílias fos e jun. Por outro lado, medidas de síntese de DNA e proliferação celular indicam que ACTH não tem nenhum efeito mitogênico ou anti-mitogênico nos transfectantes ACTHR. O gene c-fos foi usado como alvo para testar vias de transdução de sinal ativadas por ACTH nos transfectantes 3T3 ACTHR. Estes testes mostraram que PKA, PKC e MAPK tem pouca ou nenhuma participação na indução de c-fos por ACTH nos clones 3T3 ACTHR, sugerindo que ACTHR pode ativar vias ainda não identificadas e motivando a busca de novas vias ativadas por ACTH nas células Y-1. Verificou-se que células Y-1 apresentam níveis constitutivamente elevados de AKT/PKB ativada (fosforilada), dependentes de PI3K e SRC, e que ACTH promove rápida desfosforilação de AKT via Gs/Adenilato Ciclase/cAMP/PKA. Ao promover a inativação de AKT, ACTH promove simultaneamente a indução da proteína p27'IND.Kip1', um mecanismo que contribui para a atividade anti-mitogênica de ACTH. / The adrenocorticotropic hormone, ACTH, regulates both function and proliferation of adrenocortical cells binding to a specific receptor, ACTHR, which belongs to superfamily of GPCR (G-protein coupled receptors). ACTHR was cloned a few years ago, but the molecular mechanisms underlying the mitogenic and anti-mitogenic actions of ACTH remain unknown, whose elucidation is aim of this project. The experimental approach was to clone the ACTHR from mouse Y-1 adrenocortical cells and to express the functional receptor in Balb 3T3 fibroblasts and AR-1 cells. Transfectant clones stably expressing the ACTHR respond to ACTH treatments by: a) adenylate cyclase activation and b) induction of fos and jun genes. On the other hand, experiments of DNA synthesis and cellular proliferation showed that ACTH has not mitogenic or anti-mitogenic effects in ACTHR transfectants. c-fos gene was used as a target to test signal transduction pathways activated by ACTH into 3T3 ACTHR transfectants. The results showed that PKA, PKC and MAPK have no relevant contribution on the ACTH c-fos induction in 3T3 ACTHR transfectants suggesting that ACTHR can activate signal transduction pathways still not identified. This conclusion prompted us to search for another signal transduction pathways triggered by ACTHR in Y-1 adrenocortical cells. This search led to the detection of high constitutive levels of activated AKT/PKB in Y-1 adrenocortical cells, which are dependent on PI3K and SRC. ACTH causes a strong and rapid downregulation of activated AKT in a Gs/Adenylate Cyclase/cAMP/PKA dependent manner. Apparently, dephosphorylation of AKT promoted by ACTH releases transcription factors that induce p27'IND.Kip1', a likely mechanism underlying ACTH anti-mitogenic effects in adrenocortical cells.

Introdução: O objetivo foi avaliar a expressão de algumas proteínas no endométrio durante a fase lútea do ciclo menstrual de mulheres férteis e inférteis, por meio imunoistoquímica de micro-arranjos teciduais (TMA). Métodos: Analisou-se a expressão de dez proteínas em 52 amostras de endométrio obtidas nas fases lútea inicial, intermediária (janela de implantação) e final. Resultados: As proteínas, fator inibidor de leucemia (LIF), fator de crescimento insulinóide tipo 1 (IGF-1), receptor de progesterona (PR), claudina-4, receptor de fator de crescimento vascular endotelial 3 (VEGFR-3) e citoqueratina 7 (CK-7) mostraram-se expressas no endométrio nas fases lútea inicial, intermediária e final. A proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4) expressou-se no endométrio nas fases lútea inicial e intermediária. As proteínas citoqueratina 17 (CK-17), substância solúvel 100 (S100) e calretinina não se expressaram no endométrio durante os três períodos avaliados. Houve correlação entre as expressões protéicas de LIF, IGF-1 e PR. As proteínas LIF e BMP-4 foram diferencialmente expressos no endométrio nas fases lútea inicial, intermediária e final. As proteínas claudina-4 e PR não se expressam simultâneamente no endométrio durante a fase lútea. Conclusão: Baseados nos resultados deste estudo podemos sugerir que a presença das proteínas LIF, IGF-1 e PR durante a janela implantacional teria relevância como preditor do adequado desenvolvimento do endométrio. / Introduction: The objective of this study was to evaluate endometrial protein expressions from fertile and infertile women during the luteal phase of the menstrual cycle by immunohistochemistry in tissue microarrays (TMA). Method: The expression of ten proteins obtained from 52 endometrial samples in the initial, mid (window of implantation) and late (premenstrual) phases of the menstrual cycle were evaluated. Results: The proteins leukemia inhibitory factor (LIF), insulin like growth factor 1 (IGF-1), progesterone receptor (PR), claudin-4, vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR-3), and cytokeratin 7 (CK-7) were expressed in the endometrium in the three intervals of the luteal phase. Endometrial expression of the morphogenetic bone protein 4 (BMP-4) occurred during the initial and mid luteal phases. Cytokeratin 17, substance 100 and calretinin were not expressed in the luteal phase. There were positive correlations among endometrial expressions of LIF, IGF- 1, and PR. LIF and BMP-4 were differently expressed in the initial, mid and late phases of the luteal phase. Claudin-4 and PR did not express simultaneously during the different intervals of the luteal phase. Conclusion: These findings suggest that positively correlated endometrial expressions of LIF, IGF-1 and PR at the window of implantation could characterize an adequately developed and receptive endometrium.

Danos teciduais de qualquer natureza desencadeiam uma série de eventos que irão promover a regeneração ou a cicatrização do tecido lesado. Este reparo é um processo complexo que envolve a interação de diversos tipos celulares que são ativados por uma vasta gama de mediadores químicos, componentes da matriz extracelular, microorganismos e alterações físico químicas no microambiente da lesão e das áreas adjacentes. A participação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e de seus dois principais receptores (VEGFR-1 e -2) é de grande importância nos processos de cicatrização levando-se em conta a neovascularização. Após uma análise circunstanciada da literatura sobre os efeitos da radioterapia na neovascularização e a relação com a expressão do VEGF e VEGFR-1 e -2 na cicatrização observou-se que ainda há uma série de questões a serem investigadas. O objetivo desse projeto de pesquisa é estudar a expressão imuno-histoquímica do VEGF e VEGFR-1 e -2 e a densidade vascular sanguínea (DVS) após incisão e reparação cutânea em animais sob influência da radioterapia e em um período de aproximadamente seis meses. Neste estudo foram utilizados 60 ratos da linhagem Wistar distribuídos aleatoriamente em seis grupos (controle 3 e 6 meses, radioterapia pré-cirúrgica 3 e 6 meses, radioterapia pós-cirúrgica 3 e 6 meses). Após a eutanásia dos animais de acordo com os princípios bioéticos, foram retirados os espécimes alvo que foram avaliados macro e microscopicamente. O estudo imuno-histoquímico dos VEGFs foram realizados usando os anticorpos específicos supracitados nas diluições especificadas pelo fabricante, enquanto o estudo do DVS foi realizado com o anticorpo Von Willebrand Factor (VWF) que foi utilizado para marcar especificamente as células endoteliais. Nos períodos de tempo estudados, evidenciou-se a expressão significativa destes fatores de crescimento no tecido, na maioria dos casos. Os casos primeiramente irradiados apresentaram celularidade bizarra, com células gigantes e multinucleadas, estruturas do estroma hialinizadas e necrose imunomarcadas de moderada a forte para receptores de VEGF no endotélio e vasos sanguíneos. Essas características são consistentes com a literatura, uma vez que a forte relação do VEGFR-2 e a sua persistência na neovascularização e formação de tecido de granulação foram evidenciados. Os resultados mostraram que a expressão de VEGF é constantemente expressa em diferentes tempos da cicatrização de feridas e formação de cicatriz / Tissue damages of any nature unchain a series of events that will promote regeneration or healing of the injured tissue. This repair is a complex process that involves the interaction of various cells types. These cells are activated by a vast gamma of chemical mediators of the extracellular matrix, microorganisms and chemical and physical alterations in the injury microenvironment and adjacent areas. The participation of vascular endothelial growth factors (VEGF) and their two main receptors (VEGFR-1 and -2) has great importance in the healing process considering neovascularization. After a detailed analysis of the literature about radiotherapy effect in neovascularization and its relation with the expression of VEGF and VEGFR-1 and -2 in the healing, it was observed that there are many questions to be investigated. The objective of this study was to evaluate the immunohistochemical expression of VEGF and VEGFR-1 and -2 and sanguineous vessel density (DVS) after incision and cutaneous repairing in animals under influence of the radiotherapy at three and six months. This study used 60 Wistar rats randomly distributed in six groups: control, preoperative radiotherapy and postoperative radiotherapy, of 3 and 6 month each. The specimens evaluated macro/microscopically were removed after animal\'s sacrifice, in accordance to clinical ethics principles. The immunohistochemistry study of VEGFs were conducted using above-mentioned specific antibodies in manufacturer specified dilutions, while the study of the DVS was performed with the Von Willebrand Factor antibody (VWF) which was used to mark endothelial cells specifically. In both periods studied, surgical wound and radiation damages are similar in most cases. The primarily irradiated cases presented bizarre cellularity, multinucleated giant cells, stromal hyalinization structures, moderate to strong necrosis, overexpression of VEGF receptors in the endothelium and blood vessels in consequence of radiotherapy. These findings are in accordance to the literature, since the strong relationship between VEGFR-2 receptor and its persistence in neovascularization and granulation tissue formation were seen. Our results have shown that VEGF expression is constantly expressed in different times of wound healing and scar formation

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-09-29T20:17:35Z No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T20:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 josehenriquemferreira_dissert.pdf: 1670640 bytes, checksum: 3707d57cc4f4e98d8edb6594786c1b7e (MD5) Previous issue date: 2014-10-20 / Introduction: Mammary neoplasms are the most common type of tumor in dogs. Some proteins play an important role in tumor progression, thus are candidate prognosis markers. During tumor growth, the transcription factor induced by hypoxia (HIF-1α) activates the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), promoting angiogenesis. Interleukin-8 (IL-8) is a pro-inflammatory and pro-angiogenic cytokine and has been associated with tumor progression. Objectives: To evaluate the prognostic value of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins in tumor tissue in dogs with mammary tumors, correlating them with clinicopathological parameters, clinical outcome and survival. Material and Methods: The concentrations of HIF-1α, VEGF and IL-8 proteins were evaluated by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent) in macerated tumor of 25 bitches with mammary tumors and control samples and compared statistically. Results: The levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were higher in dogs over the age of 10 years and that had died (p <0.05). Moreover, HIF-1α concentrations were elevated in the tumors of dogs who developed metastases (p = 0.04), while VEGF levels were highest in tumors with clinical stages III and IV (p = 0.03) and IL-8 tumors in tumor with development greater than six months (p = 0.03). Still, high levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 were also related to shorter overall survival (p <0.05). Conclusions: High levels of HIF-1α, VEGF and IL-8 are associated with features of poor prognosis, suggesting that the assessment of these proteins in tumor macerated has important prognostic value. / Introdução: As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de tumor na espécie canina. Algumas proteínas exercem importante papel na progressão tumoral e portanto, são candidatos marcadores de prognóstico. Durante o crescimento tumoral, o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF-1α) ativa a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), promovendo a angiogênese. A interleucina-8 (IL-8) é uma citocina pró-inflamatória e pró-angiogênica e tem sido associada à progressão tumoral. Objetivos: Avaliar o valor prognóstico das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 no tecido tumoral em cadelas com neoplasia mamária, relacionando-os com os parâmetros clínico-patológicos, evolução clínica e sobrevida. Material e Métodos: As concentrações das proteínas HIF-1α, VEGF e IL-8 foram avaliadas pelo método de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent Assay) no macerado tumoral de 25 cadelas com neoplasia mamária e amostras controle e comparadas estatisticamente. Resultados: Os níveis de HIF-1α, VEGF e IL-8 foram maiores em cadelas com idade superior a 10 anos e que vieram a óbito (p < 0,05). Além disso, concentrações de HIF-1α foram elevadas nos tumores de cadelas que desenvolveram metástase (p = 0,04), enquanto os níveis de VEGF foram maiores em tumores com estadiamento clínico III e IV (p = 0,03), e de IL-8 em tumores com evolução tumoral maior que seis meses (p = 0,03). Ainda, níveis elevados de HIF-1α, VEGF e IL-8 também foram relacionados com menor tempo de sobrevida global (p < 0,05). Conclusões: Altas concentrações de HIF-1α, VEGF e IL-8 estão associadas com características de pior prognóstico, sugerindo que a avaliação dessas proteínas no macerado tumoral possui importante valor prognóstico.