Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

The brain is a highly complex structure; neurons extend axons which follow precise paths to make connections with their targets. This extension is guided by a specialised and highly motile structure at the axon tip -the growth cone- which integrates guidance cues to steer the axon through the environment. Aberrant pathfinding is likely to result in developmental impairments causing disruption to brain functions underlying emotion learning and memory. Furthermore, pre-existing connections are constantly remodelled, the ability to do so declines with age, and can have huge impacts on quality of life and well-being. Examining how changes in growth cone behaviour triggered by external cues occurs is crucial for understanding processes in both development and disease. Controlled reorganisation of growth cone cytoskeletal components, such as actin filaments, generate membrane protrusions forming lamellipodia and filopodia. Filopodium formation is commonly associated with sensing the mechanical and chemical environment of the cell. Despite our understanding of the guidance choices that can be made, how filopodia transmit information at a molecular level leading to profound changes in morphology, motility and directionality remains largely unknown. Various actin-binding proteins regulate the number, stability and branching of filopodia. They may therefore have a key role in priming or abrogating the ability of the growth cone to respond to a given guidance cue. I have shown that the actin binding proteins drebrin and cofilin, whilst displaying opposing molecular activities on actin filaments, work synergistically in a temporally regulated manner. A fluorescent membrane marker combined with tagged cofilin and drebrin enabled accurate correlation of cofilin and drebrin dynamics with growth cone morphology and filopodial turnover in live neurons. In contrast to previous in vitro experiments, cofilin was found to enhance the effect of drebrin to promote filopodia formation in intact neurons, and that growth cone spread was significantly constrained when cofilin was knocked down. Importantly, this adds to our understanding of how the two actin binding proteins contribute to directed motility in neuronal growth cone filopodia during guidance. Furthermore, following acute treatment with low concentrations of the repulsive guidance cue semaphorin-3A, neuronal growth cones expressing cofilin displayed increased morphological complexity and filopodial stability. This suggests that traditional collapse signals may serve as pause signals allowing neurons to increase the surface area to sense the environment adequately and enable precise wiring decisions. Remodeling of the cytoskeleton is perturbed in a number of degenerative diseases including Alzheimer's, Huntington's, and Amyotrophic Lateral Sclerosis. These conditions are associated with widespread synaptic loss, resulting in memory loss, cognitive impairment, and movement disorders which leads to severe deterioration in quality of life for those afflicted in addition to wider negative socioeconomic impacts. How widespread synaptic loss occurs is poorly understood. One common characteristic is neuronal stress which can be initiated through different conditions such as neuroinflammation, energetic stress, glutamate excitotoxicity, and accumulation of misfolded proteins, all of which have been associated with perturbation of the actin cytoskeleton and the initiation of the cofilin-actin rod stress response. Dysfunction of the cytoskeleton can lead to the disruption of synaptic activity by blocking the delivery of elements such as organelles and proteins required for maintenance of the synapse. Modulating this stress response offers an approach to protecting the integrity of normal synaptic function. Actin interacting protein-1 is a conserved actin binding protein that enhances the filament disassembly activity of cofilin. I have discovered that AIP-1 has a potent ability to prevent the formation of cofilin rods which are thought to contribute to the neuronal dysfunction in several neurodegenerative disorders, even when they are treated with amyloid-β or subjected to metabolic stress. This is the first study to demonstrate a molecular mechanism for preventing rod formation in the presence of a neuronal stressor and has the potential to protect against rod formation by other stressors associated with disease such as inflammation and excitotoxicity. AIP-1 offers the exciting possibility of a means to reverse cofilin rod formation and the subsequent cytoskeletal pathology associated with dementia and has potential for therapeutic exploitation in human disease. Furthermore, it is the first study to demonstrate that AIP-1 localises to areas of rapid actin remodeling in neuronal growth cones. Exploiting the action of AIP-1 therefore represents an exciting and novel therapeutic avenue to tackle neurodegeneration.

During development, neurons must find their way to and make connections with their appropriate targets. Growth cones are dynamic, motile structures that are integral to the establishment of appropriate connectivity during this wiring process. As growth cones migrate through their environment, they encounter guidance cues that direct their migration to their appropriate synaptic targets. The gaseous messenger nitric oxide (NO), which diffuses across the plasma membrane to act on intracellular targets, is a signaling molecule that affects growth cone motility. However, most studies have examined the effects of NO on growth cone morphology when applied in large concentrations and to entire cells. In addition, the intracellular second messenger cascade activated by NO to bring about these changes in growth cone morphology is not well understood. Therefore, this dissertation addresses the effects that a spatially- and temporally-restricted application of physiological amounts of NO can have on individual growth cone morphology, on the second messenger pathway that is activated by this application of NO, and on the calcium cascades that result and ultimately affect growth cone morphology. Helisoma trivolvis, a pond snail, is an excellent model system for this type of research because it has a well-defined nervous system and cultured neurons form large growth cones. In the present study, local application of NO to Helisoma trivolvis B5 neurons results in an increase in filopodial length, a decrease in filopodial number, and an increase in the intracellular calcium concentration ([Ca2+]i). In B5 neurons, the effects of NO on growth cone behavior and [Ca2+]i are mediated via sGC, protein kinase G, cyclic adenosine diphosphate ribose, and ryanodine receptor-mediated intracellular calcium release. This study demonstrates that neuronal growth cone pathfinding in vitro is affected by a single spatially- and temporally-restricted exposure to NO. Furthermore, NO acts via a second messenger cascade, resulting in a calcium increase that leads to cytoskeletal changes. These results suggest that NO may be a signal that promotes appropriate pathfinding and/or target recognition within the developing nervous system. Taken together, these data indicate that NO may be an important messenger during the development of the nervous system in vivo.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le titane (Ti) est largement utilisé en orthopédie et médecine dentaire. Ce matériau présente d´excellentes propriétés mécaniques, est biocompatible et résiste à la corrosion. L’interaction entre les cellules et la surface d’un implant joue un rôle décisif dans l’ostéointégration. Malgré la grande variété d’études que nous trouvons dans la littérature, le comportement des cellules en contact avec des matériaux implantables comme le Ti n’est toujours pas élucidé à toutes les échelles topographiques. Notre laboratoire a développé une méthode de modification physico-chimique de la surface de métaux à intérêt médical. Cette méthode génère des surfaces nanoporeuses qui favorisent la différenciation de cellules souches, affectent le comportement cellulaire de façon différentielle, promeuvent la formation osseuse in vitro et in vivo, et qui ont une capacité antibactérienne. Afin de mieux comprendre comment cette surface influence le comportement cellulaire, nous avons étudié leur influence sur la formation et la maturation des adhésions focales (FAs, de l’anglais) et la formation des filopodes. De plus, nous avons examiné comment les caractéristiques physico-chimiques de la surface obtenue guident l’expression génique des protéines associées aux FAs et aux filopodes en utilisant différentes lignées cellulaires. Finalement, afin de mieux comprendre la biomécanique de la cellule, la force d’adhésion à la surface des filopodes a été déterminée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Des disques de Ti commercialement pur (Cp-Ti) ont été polis a fini miroir (Ti-Control), une partie des disques a été traité avec un mélange d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène pour créer une surface nanostructurée poreuse (Ti-Nano). L’influence de la nanoporosité, de la cristallinité et la mouillabilité de cette surface sur des cellules pre-ostéoblastiques de souris (MC3T3) et des bactéries a été évalué par la microscopie électronique à balayage (MEB) et par immunofluorescence (IF). Nous avons ensuite utilisé une lignée cellulaire épithéliale (CHO-K1) qui exprime la paxilline (une protéine des FAs) de type sauvage ou la paxilline avec des mutations. De plus, la force d’interaction des filopodes avec la surface a été quantifié en mesurant la force latérale nécessaire pour les déplacer avec une pointe d’AFM. Finalement, la centrifugation a été utilisée pour étudier les changements fonctionnels des cellules MC3T3. L’analyse du comportement des cellules MC3T3 sur des surfaces amorphes et cristallines n'a pas montré de différence par rapport au nombre des cellules ou la quantité des FAs. La cristallinité de la couche superficielle n’avait également aucune incidence sur l’adhésion bactérienne. Les deux lignées cellulaires utilisées ont montré une présence abondante de filopodes avec des nanoprotrusions latérales en réponse à la nanoporosité. La taille et la forme des cellules CHO-K1 ont été grandement affectées par la topographie. L’expression génique des protéines associées aux différents marqueurs des FAs et aux protrusions a été aussi significativement augmentée sur la surface nanoporeuse, quel que soit le type de cellule. Les filopodes sur Ti-Nano ont montré une plus grande résistance au détachement latéral, ce qui indique qu'ils adhèrent à la surface avec plus de force. Également, l’analyse par MEB a révélé une restructuration de la membrane cellulaire accompagnée d’un changement de la forme cellulaire après centrifugation. Parce que les mitochondries fournissent de l’énergie pour les processus cellulaires, l’organisation du réseau mitochondrial a été influencée aussi par la topographie de surface et la centrifugation. Bien qu’il ne puisse pas être exclu que la cristallinité et la mouillabilité de la surface contribuent dans une certaine mesure à déterminer le comportement des cellules, nos résultats suggèrent que les caractéristiques physiques des surfaces représentent le principal déterminant. Nous avons démontré aussi, pour la première fois, que la topographie de surface peut modifier l’interaction adhésive d’une structure subcellulaire qui est fondamentale dans la détection des caractéristiques physico-chimiques des surfaces. En conclusion, nos résultats montrent que la topographie de surface peut modifier des propriétés fondamentales dans les cellules. Dans leur ensemble, ils soulèvent la possibilité que les surfaces nanostructurées puissent être utilisées non seulement pour guider/accélérer l’intégration de biomatériaux dans des conditions normales, mais également dans des situations où l’activité cellulaire est compromise ou également pour les prothèses soumises à des charges externes, telles que les implants orthopédiques et dentaires. / Titanium (Ti) is widely used in orthopedics and dentistry. This material has excellent mechanical properties, is biocompatible and corrosion resistant. The interaction between the cells and the surface of an implant plays a key role in osseointegration. Despite the wide variety of studies found in the literature, the behavior of cells in contact with implantable materials such as Ti is not yet fully elucidated at all topographic scales. Our laboratory has developed a method for the physicochemical modification of the surface of medically relevant metals. This method generates nanoporous surfaces that promote stem cell differentiation, differentially affect cellular behavior, promote bone formation in vitro and in vivo and have antibacterial capacity. To better understand how this surface influences cell behavior, we studied their influence on the formation and maturation of focal adhesions (FAs) and filopodia formation. Furthermore, we examined how the physicochemical characteristics of the resulting surface guide the gene expression of proteins associated with FAs and filopodia using different cell lines. Finally, to better understand the biomechanics of the cell, the adhesion strength of filopodia to the surface was determined using atomic force microscopy (AFM). Commercially pure Ti discs (Cp-Ti) were polished to a mirror finish (Ti-Control), some of the polished discs were treated with a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide to create a nanostructured surface (Ti-Nano). The influence of nanoporosity, crystallinity and wettability of this surface on mouse pre-osteoblastic cells (MC3T3) and bacteria was evaluated by scanning electron microscopy (SEM) and immunofluorescence. Then, to evaluate the response to nanotopography, we used an epithelial cell line (CHO-K1) that expresses wild type paxillin (a protein of FAs) or paxillin with mutations. In addition, the interaction forces of the filopodia with the surface were quantified by measuring the lateral force required to displace these structures from the surface with an AFM tip. Finally, centrifugation was used to study functional changes in MC3T3 cells. Analysis of the behavior of MC3T3 cells on amorphous and crystalline surfaces showed no difference in cell number or the number of focal adhesions. The crystallinity of the surface layers also had no effect on bacterial adhesion. Both cell lines used showed abundant presence of filopodia 4 with lateral nanoprotrusions in response to nanoporosity. The size and shape of CHO-K1 cells was greatly affected by the topography. Gene expression of proteins associated with different focal adhesion markers and protrusions was also significantly increased on the nanoporous surface, regardless of cell type. Filopodia on the Ti-Nano showed greater resistance to lateral detachment force, indicating that they adhere to the surface with greater strength. Also, SEM analysis revealed a restructuring of the cell membrane accompanied by a corresponding change in cell shape after centrifugation. Because mitochondria provide energy for cell processes, the organization of the mitochondrial network was also influenced by surface topography and centrifugation. Although it cannot be excluded that surface crystallinity and wettability contribute to some extent to determining cell behavior, our results suggest that the physical characteristics of the surfaces represent the main determinant. We have also shown for the first time that surface topography can modify the adhesive interaction of a subcellular structure that is fundamental in the detection of the physicochemical characteristics of surfaces. In conclusion, our results show that surface topography can modify fundamental properties in cells. Together, they raise the possibility that nanostructured surfaces can be used not only to guide/accelerate the integration of biomaterials under normal conditions, but also in situations where cellular activity is compromised or also for prostheses under external loads, such as orthopedic and dental implants.

Collective cell migration is a defining feature of many morphogenetic processes. Diseases such as congenital heart diseases and cancer arise due to mis-regulation of collective migratory behaviour and animal models have played a pivotal role in dissecting the molecular mechanisms which underlie this process. During embryonic heart development, cardiac precursors undergo a stage of collective migration in both vertebrates and invertebrates. We developed a paradigm to quantitatively assess collective cell migration of cardiac precursors in live embryos of Drosophila, which is the simplest genetic model organism with a heart. Therefore, we studied processes which are commonly observed in most collective cell migration models such as guidance signalling and extracellular matrix remodelling. Our results demonstrate that leading edge of migrating cardioblasts is highly active and that this behaviour is regulated by guidance cues, Slit and Netrin and their respective receptors Robo/Robo2 and Frazzled/Uncoordinated5. These molecules cooperatively promote leading edge motility and epithelial characteristics of the cardioblasts. Next, we determined that matrix restructuring around the cardioblasts requires proteases Mmp1 and Mmp2, which are members of the highly conserved Matrix Metalloproteinase family. We demonstrate that Mmp1 and Mmp2 have distinct roles during lumen formation, however, both Mmp1 and Mmp2 are required for collective motility of the cardioblast leading edge. Hence, we propose that embryonic heart development in Drosophila is an effective and amenable model of collective cell migration which can be applied to discover unique mechanisms which coordinate cell movement in groups. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

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Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer. / During this study we first localised the receptors CB1 and CB2 on neuronal structures. We have shown that those receptors expressed on dendrites and filopodia. Likewise and based on Bouchard’s previous laboratory results showing an implication of the netrin-1 receptor, Deleted in Colorectal Cancer (DCC), on the synaptogenesis process mediated by the receptor CB1 we localized the receptor DCC on neuronal structures. We have shown that the receptor DCC is expressed on dendrites, axons and filopodia. These results suggest an implication of the receptor DDC in a synaptogenesis process that would be mediated by the receptor CB2. We then evaluated the effects triggered by the receptor CB2’s ligands on the synaptogenesis process. We found no evidences of any effects on synaptogenesis mediated by the receptor CB2 inverse agonists (AM630 and JTE907) and agonists (JWH015 and JWH133) in term of filopodia density and synaptic contacts density variations. We witnessed highly variable results that were irreproducible. Visual quantifications of filopodia and synaptic contacts density were variable as we quantified two times the same set of photos. We have therefore developed a computer based quantification method by which we were able to obtained reproducible results. Nevertheless we found no evidence of any implication of the receptor CB2 on the synaptogenesis process. These preliminary results do not allow us neither to rule out nor to confirm eventual CB2 receptor effects on synaptogenesis. An exhaustive study is required to access possible CB2 receptors effect on synaptogenesis.

Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer. / During this study we first localised the receptors CB1 and CB2 on neuronal structures. We have shown that those receptors expressed on dendrites and filopodia. Likewise and based on Bouchard’s previous laboratory results showing an implication of the netrin-1 receptor, Deleted in Colorectal Cancer (DCC), on the synaptogenesis process mediated by the receptor CB1 we localized the receptor DCC on neuronal structures. We have shown that the receptor DCC is expressed on dendrites, axons and filopodia. These results suggest an implication of the receptor DDC in a synaptogenesis process that would be mediated by the receptor CB2. We then evaluated the effects triggered by the receptor CB2’s ligands on the synaptogenesis process. We found no evidences of any effects on synaptogenesis mediated by the receptor CB2 inverse agonists (AM630 and JTE907) and agonists (JWH015 and JWH133) in term of filopodia density and synaptic contacts density variations. We witnessed highly variable results that were irreproducible. Visual quantifications of filopodia and synaptic contacts density were variable as we quantified two times the same set of photos. We have therefore developed a computer based quantification method by which we were able to obtained reproducible results. Nevertheless we found no evidence of any implication of the receptor CB2 on the synaptogenesis process. These preliminary results do not allow us neither to rule out nor to confirm eventual CB2 receptor effects on synaptogenesis. An exhaustive study is required to access possible CB2 receptors effect on synaptogenesis.

Les protéines d’adhésions homophiles N-cadhérine jouent un rôle majeur dans le développement du cerveau, notamment en agissant sur la croissance et la plasticité synaptique. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de la N-cadhérine dans ces deux processus en utilisant des neurones issus de cultures primaires déposés sur des substrats micropatternés. Ces substrats sont recouverts de N-cadhérine purifiée afin d’induire des adhésions N-cadhérines sélectives au niveau de micro-motifs régulièrement espacés. Mes deux premières études sont basées sur le modèle d’embrayage moléculaire, décrivant le processus par lequel la motilité du cytosquelette d’actine se couple aux adhésions au niveau de la membrane cellulaire afin de générer des forces de traction aux zones de contact avec le substrat, permettant ainsi l’avancée cellulaire (Giannone et al., 2009). Plusieurs études ont mis en avant l’existence d’un tel modèle (Mitchison et Kirschner, 1988 ; Suter et Forscher, 1998), cependant le mécanisme exact permettant d’expliquer ce couplage mécanique de l’actine aux protéines d’adhésions reste mal connu. Via des techniques de pinces optiques, des travaux précédemment menés dans l’équipe ont prouvé l’existence d’un couplage entre le flux d’actine et les adhésions N-cadhérine permettant la migration du cône de croissance (Bard et al., 2008). Cette technique n’a cependant pas permis la visualisation directe de l’engagement d’un tel mécanisme. Nous avons donc couplé l’utilisation des substrats micro-patternés à la microscopie haute résolution sptPALM/TIRF afin de visualiser directement la dynamique des protéines impliquées dans l’embrayage moléculaire. Dans le premier article, j’ai montré pour la première fois l’existence d’interactions transitoires entre le flux d’actine et les adhésions N-cadhérines au niveau du cône de croissance, reflétant un embrayage glissant à l’échelle de la molécule unique (Garcia et al., en préparation). Dans le second article, en travaillant sur des neurones plus matures, nous avons pu montrer l’engagement d’un embrayage moléculaire trans-synaptique entre adhésions N-cadhérines et flux d’actine permettant la stabilisation du filopode dendritique et ainsi sa transition en épine mature (Chazeau/Garcia et al., en préparation). J’ai également participé à une troisième étude dans laquelle j’ai observé l’effet des substrats micropatternés recouverts de N-cadhérine, sur la synaptogenèse. J’ai ainsi pu prouver que la N-cadhérine déposée sur les micro-motifs, stimule la croissance dendritique et axonale et joue un rôle prépondérant dans la maturation morphologique des neurones. Cependant, la N-cadhérine est incapable d’induire la formation de synapses contrairement aux protéines d’adhésion neurexine/neuroligine ou SynCam (Czöndör et al., 2013). / The homophilic adhesion molecule N-cadherin plays major roles in brain development, notably affecting axon outgrowth and synaptic plasticity. During my PhD work, I addressed the role of N-cadherin in these two processes, using primary neurons cultured on micro-patterned substrates. These substrates are coated with purified N-cadherin to trigger selective N-cadherin adhesions in a spatially controled manner. My two first studies are based on the “molecular clutch” paradigm, by which the actin motile machinery is coupled to adhesion at the cell membrane to generate forces on the substrate and allow cells to move forward (Giannone et al., 2009). Many publications have provided evidence for such a mechanism (Mitchison et Kirschner, 1988 ; Suter et Forscher, 1998), but the exact mechanisms underlying the molecular coupling between the actin retrograde flow and adhesion proteins remain elusive. The team previously inferred, using optical tweezers, that a molecular clutch between the actin flow and N-cadherin adhesions drives growth cone migration (Bard et al., 2008), but could not achieve a direct visualization of the engagement process with this technique. Here, we combined the use of micropattern substrates with high resolution microscopy sptPALM/TIRF to visualize directly the dynamics of the main proteins involved in the molecular clutch. In my first paper, I reveal for the first time transient interactions between the actin flow and N-cadherin adhesions in growth cones, reflecting a slipping clutch process at the individual molecular level (Garcia et al., in preparation). In a second study, working with more mature neurons, we revealed that engagement of a molecular clutch between trans-synaptic N-cadherin adhesions and the actin flow underlies the stabilization of dendritic filopodia into mature spines (Chazeau/Garcia et al., in preparation). I also participated to a third study, where I observed the effect of N-cadherin coated substrates on synaptogenesis. I showed that, although N-cadherin on micro-patterned substrates stimulated axonal and dendritic elongation and played a major role in morphological maturation, it was not able to induce synapse formation like neurexin/neuroligin or SynCAM adhesions (Czöndör et al., 2013).