Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes. / Hematopoietic development is regulated through a combinatorial interplay between lineage-specific activators and the general transcription machinery that enables cell-specific patterns of gene expression. This thesis reports structural and functional studies of interactions involving the transcativation domains (TAD) of activators proteins and their role in hematopoietic development. Interactions between the TAD of activators and their partners play an important role in the transcriptional regulation of all genes including those regulating hematopoiesis. The first section reports the identification and characterization of a novel interaction between the erythroid transcription factor GATA-1 and the tumor suppressor protein p53. Using a combination of isothermal titration calorimetry (ITC), NMR spectroscopy and in vivo studies, we identified and characterized the direct interaction between these two important transcription factors in an attempt to determine the role of this interaction in erythroid development. Based on our results, the TAD of p53 directly interacts with the DNA-binding domain of GATA-1 in a cell-type specific manner. Through this interaction, GATA-1 inhibits activation of select p53-regulated genes and we postulate that the inhibition of p53-dependent apoptotic pathways is essential for survival of erythroid precursor cells. In the second section, we report on the interactions between two acidic TADs and the general transcription factor IIH (TFIIH). The structure of the complexes formed by the Tfb1/p62 subunit of TFIIH (Tfb1PH/p62PH) and the acidic TAD of Herpes Simplex viral protein 16 (VP16) and the Erythroid Krüppel-like factor (EKLF) were determined by NMR spectroscopy. The structure of the Tfb1PH/VP16 complex demonstrated that a viral TAD has the ability to mimic the actions of the TAD from the human p53 with Tfb1PH/p62PH. The TADs of both VP16 and p53 adopt a 9-residue α-helix in complex with Tfb1PH/p62PH. Interestingly, the NMR structure of the EKLF/Tfb1PH complex demonstrated that despite sharing a common binding site with p53 and VP16 on Tfb1PH, the EKLF/Tfb1PH binding interface is distinctly different from the binding interfaces we previously observed with p53/Tfb1PH and VP16/Tfb1PH complexes. Surprisingly, EKLF adopted a similar binding mechanism as the general transcription factor TFIIEα in interaction with p62PH as both interact in an extended conformation. Moreover, based on our structural data, we have identified Trp73 as a key residue within the TAD of EKLF that is required for the formation of the EKLF/Tfb1PH complex. Mutations of Trp73 disrupted the binding to Tfb1PH/p62PH and significantly reduced the transcriptional activity of EKLF in red blood cells.

Face à un environnement changeant, la cellule a dû développer des systèmes de régulation lui permettant de s’adapter et d’assurer son développement et sa survie. Ces systèmes de régulation s’organisent autour de réseaux de régulation transcriptionnelle permettant l’expression des gènes codant pour les protéines dont la cellule a besoin. Dans la plupart des réseaux trancriptionnels, la régulation de la transcription des gènes est « raffinée » par la présence de circuits de rétroaction positifs et négatifs à l’origine de deux types de comportements différents: la multistabilité d’une part, et les comportements homéostatiques ou oscillants d’autre part. Deux réseaux de régulation transcriptionnelle de complexité différente ont été étudiés au cours de cette thèse :le réseau p53-Mdm2 impliqué dans l'arrêt de la croissance cellulaire, la réparation de l’ADN et l’apoptose chez les mammifères, et le réseau de facteurs transcriptionnels GATA impliqué dans la régulation du catabolisme de l’azote chez la levure Saccharomyces cerevisiae. L’analyse théorique du réseau p53-Mdm2 a eu pour principal objectif de reproduire et d’interpréter les données expérimentales disponibles dans la littérature concernant la réponse oscillante de la p53 lorsque l’ADN de la cellule est endommagé. L’analyse théorique des comportements du réseau GATA, quant à elle, a été couplée à une étude expérimentale dans les milieux de qualité intermédiaire en azote peu investigués jusqu’à présent. Pour analyser les propriétés dynamiques de ces deux réseaux, plusieurs approches complémentaires, se situant à différents niveaux de description, ont été utilisées: l’approche logique, différentielle et stochastique.<p>La première partie de cette thèse a été consacrée à l’étude du réseau p53-Mdm2 pour lequel nous avons développé un modèle simple composé d’un circuit de rétroaction positif imbriqué dans un circuit de rétroaction négatif. Les résultats de notre analyse logique montrent que les principales propriétés dynamiques du réseau peuvent être résumées par un petit nombre de diagrammes de bifurcation logique. Ces scénarios de bifurcations diffèrent par la séquence d’activation du circuit positif et négatif composant le réseau et dépendent d’une part de l’affinité de la p53 pour ses gènes cibles et d’autre part de son activité transcriptionnelle. Nous proposons que différents stress et types cellulaires pourraient correspondre à différents scénarios de bifurcation et donc conduire à des réponses différentes après irradiation. Cette première analyse qualitative nous a permis de rendre compte de différents aspects de la dynamique du réseau observés expérimentalement, tels que le changement de fréquence des oscillations en cours de réponse, les oscillations de longue durée de la p53 ou l’amortissement rapide des oscillations à l’échelle d’une population de cellules. Pour nous affranchir des fortes non-linéarités inhérentes au traitement logique, nous avons ensuite traduit le modèle logique en un modèle différentiel et montré que les principaux comportements présentés par le modèle logique sont conservés, suggérant que la structure du réseau détermine dans une large mesure les principales potentialités dynamiques du système. L’analyse des propriétés de bifurcation du modèle différentiel en fonction du niveau de dommage à l’ADN nous a également permis de mettre en évidence la présence de deux régimes oscillants d’amplitude, de valeur moyenne et de fréquence nettement différentes, séparés par une zone de bicyclicité où ces deux régimes coexistent. Cette propriété permet d’expliquer l’existence des deux fréquences d’oscillation différentes qui ont été observées expérimentalement en fonction de la dose d’irradiation. Enfin l’analyse stochastique de notre modèle nous a, en particulier, permis de rendre compte de l’augmentation du nombre de cellules oscillant à des fréquences élevées lorsque la dose d’irradiation augmente, observée expérimentalement.<p>La deuxième partie de notre thèse a été consacrée à l’étude du réseau de facteurs GATA chez la levure S.cerevisiae. Ce réseau, constitué des activateurs Gln3 et Nil1 et des répresseurs Dal80 et Gzf3, comporte plusieurs circuits de rétroaction positifs et négatifs interconnectés. Dans le but d’aider à comprendre le rôle et le fonctionnement du réseau GATA, nous avons effectué une analyse théorique et expérimentale de son comportement dynamique en fonction de la qualité de la source azotée. L’analyse différentielle montre la possibilité d’un comportement bistable dans les milieux de qualité intermédiaire en azote et d’oscillations amorties suite à un transfert nutritionnel d’une condition azotée à une autre, lorsque l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 est synergique ou lorsque le gène Gln3 est supprimé. Gzf3 serait le répresseur clef impliqué dans la bistabilité tandis que Dal80 serait le répresseur clef impliqué dans les comportements oscillants. L’analyse stochastique nous a permis d’étudier l’effet des fluctuations moléculaires sur ces comportements et les distributions de variables importantes du système dans une population de cellules. Pour le modèle synergique de la souche sauvage et celui du mutant gln3°, elle a montré l’existence, dans des milieux de qualité intermédiaire en azote, de deux populations de cellules qui coexistent :une population où l’expression de Dal80 est réprimée, une autre où son expression est activée. Enfin, l’étude de la dynamique du couplage entre la protéine fluorescente Gfp, sous le contrôle du promoteur de DAL80, et le réseau GATA montre que, pour des ordres de grandeur physiologique de la vitesse de disparition de la Gfp, la bimodalité présente au niveau du réseau GATA devrait se refléter au niveau de la Gfp.<p>Les comportements bistables et oscillants mis en évidence dans notre étude théorique du réseau GATA ont ensuite été testés expérimentalement en suivant la Gfp sous le contrôle du promoteur de DAL80 en fonction de la concentration de la source azotée glutamine. Cette étude expérimentale nous a permis de mettre en évidence l’existence d’oscillations amorties de la fluorescence de la protéine de fusion Dal80-Gfp. De telles oscillations cependant n’ont pas été observées dans les expériences réalisées sur les autres souches testées pour lesquelles le gène de la Gfp est fusionné au promoteur de DAL80. Notre étude expérimentale montre également l’existence, chez la souche sauvage, d’une population unique de cellules fluorescentes quelle que soit la concentration du milieu extérieur en glutamine testé (0.2mM à 10mM). Un modèle additif où l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 n’est pas synergique serait donc en meilleur accord avec nos observations. Chez les souches où le facteur Gln3 est inactivé, par contre, deux populations cellulaires, l’une de forte fluorescence et constituée de cellules de grande taille, l’autre de plus faible fluorescence et constituée de cellules de taille plus petite, coexistent pour des concentrations intermédiaires du milieu extérieur en glutamine. La forte corrélation observée entre la taille et la fluorescence des cellules suggère que le comportement bimodal observé au niveau de la fluorescence est lié au comportement bimodal observé au niveau de la taille. Enfin, un modèle phénoménologique de la croissance cellulaire nous a permis de reproduire l’existence de deux populations cellulaires de taille distincte.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

When infrastructure is under construction there may be a necessity for temporary land access. This thesis aims to explore the temporary needs of land while municipal streets and roads are being constructed. Needs that doesn´t remain when the street is completed. Those needs can for example be temporary cargo roads or - as the cover image shows - a work area by the side of the road. When national infrastructure is constructed there are legal possibilities to arrange temporary land access compulsively. Temporary usufruct can be created forcibly through work plans according to the Railway Construction Act and the Road Act. On the other hand, when municipal infrastructure is constructed these legislations do not apply. There is no law that directly regulates municipal road construction. In special legislation which regulates municipal land access there is no explicit support for compulsive temporary land access. An empirical study shows that municipalities to a high degree rely on voluntary agreements to access land temporary. In those situations where agreements cannot be met, but there is still a great need of temporary land access, the municipality turn to the cadastral authority. However, the cadastral authority has dubious support in legislation to establish rights of a temporary nature compulsively. A solution that has been applied in practice is formation of temporary easement by the cadastral authority, to meet the necessity of temporary work areas. This solution would be contrary to the requirement of that the purpose of easements must be of permanent significance. Interviews has also indicated that easements formed by the cadastral authority for permanent roadside ditches sometimes also are used as temporary work areas during construction of streets. If such an easement is used for another purpose than a ditch, the easement’s right is exceeded. It cannot be considered a legal secure order that easements are used for other purposes than intended. There have not been found a satisfactory way in the legislation to compulsively meet the need of temporary land access for municipalities. It is therefore proposed that a change is made in the legislation to allow the cadastral authority to form temporary easements for temporary land access. The change should be an exception of the requirement for permanent significance in those cases the purpose of the easement fulfills an important public interest and is temporary. As an alternative, enabling of temporary usufruct through zoning plans could be a solution to the problem. / Vid anläggande av infrastruktur kan det finnas behov av tillfällig markåtkomst. Detta examensarbete tar sikte på de tillfälliga behov av mark som finns vid anläggande av kommunala gator och vägar. De tillfälliga behoven kan utgöras av alltifrån tillfälliga transportvägar till – som bilden på framsidan visar – ett arbetsområde vid sidan av vägen. När statlig infrastruktur ska anläggas finns legala möjligheter att ordna tillfällig markåtkomst tvångsvis. Tillfälliga officialnyttjanderätt kan tillskapas genom järnvägs- och vägplan enligt lagen om byggande av järnväg respektive väglagen. När kommunal infrastruktur ska anläggas är dessa lagar inte tillämpliga. Någon enskild lagstiftning för kommunal gatubyggnation finns inte. I speciallagstiftning som tillgodoser kommunala markbehov finns inte heller något uttryckligt stöd för tvångsvis tillfällig markåtkomst. I examensarbetet har en empirisk undersökning med intervjuer genomförts. Där har framkommit att kommuner i hög grad förlitar sig på frivilliga överenskommelser. I de fall avtal inte kan slutas, men behoven av tillfällig markåtkomst är stort, tvingas kommunen vända sig till lantmäterimyndigheten. Emellertid har lantmäterimyndigheten tvivelaktigt stöd i lag för att kunna bilda rättigheter av tillfällig natur. En lösning som har tillämpats i praktiken är bildande av tillfälligt officialservitut enligt 7 kap. 1 § FBL, för att tillgodose behov av arbetsområde. Denna lösning torde dock vara i strid med kravet på att ändamål med servitut måste vara av stadigvarande betydelse enligt 14 kap. 1 § JB. Det har även uppmärksammats att servitut för permanent slänt ibland används som tillfälligt arbetsområde under byggtiden av kommunala gator. Om ett släntservitutsområde använts för annat ändamål än slänt överskrids rättigheten. Ingen särskild prövning har gjorts av det andra ändamålet, dvs. arbetsområdet. Till följd av detta görs intrång i äganderätten utan prövning, vilket kan anses vara en kränkning av äganderätten. Sammanfattningsvis har inga tillfredsställande sätt hittats, som tvångsvist kan tillgodose behovet av tillfällig markåtkomst vid gatubyggnation. Därför föreslås att en ändring görs i 7 kap. 1 § FBL som medger avsteg från kravet om stadigvarande betydelse, i de fall ändamålet med servitutet tillgodoser ett angeläget allmänt intresse och är av tillfällig natur. Ett alternativ till detta är att tillfälliga officialnyttjanderätter kan tillskapas genom en detaljplan.

La tesis se enmarca en la relación entre espacios naturales protegidos, turismo y desarrollo sostenible. Y lo hace desde la óptica de la planificación de las prácticas turísticas, un tema bastante novedoso en nuestro país y que está de plena actualidad. Los objetivos fundamentales de la investigación son los siguientes:Determinar, de manera genérica y en clave de sostenibilidad, el papel del turismo en los ENP españoles.Estudiar con detalle dos instrumentos de planificación del turismo en las áreas protegidas españolas: la Carta Europea del Turismo Sostenible en los espacios protegidos y los Planes de Desarrollo Sostenible andaluces derivados de la Ley 2/1989.Evaluar el alcance de dichos instrumentos en dos territorios concretos: el Parque Natural de la Zona Volcánica de la Garrotxa (Girona) y el Parque Natural Cabo de Gata-Níjar (Almería). / The PhD thesis framework is the connection between protected areas, tourism and sustainable development. The main approach is the Tourism Planning, a quite new and current topic in our country. The research has got the following main aims:To set the role of tourism in the Spanish protected areas, both in general and under a key of sustainability.To study in great detail two Tourism Planning tools in the Spanish protected areas: the European Charter for Sustainable Tourism and the Sustainable Development Plans in Andalucía which are a requirement from Law 2/1989.To avaluate the scope of both tools in two specific territorios: the Zona Volcànica de la Garrotxa Nature Park (in Girona) and the Cabo de Gata-Níjar Nature Park (in Almería).

Throughout time, cities have been built in different ways and city structures can look different in different places in the world. The urban planning ideal has changed and small narrow alleys in the city have today been replaced by large roads adapted for cars. Streets can function as everything from transport routes to social meeting spaces depending on the design and experience. But the street, and the street space, which is the space that forms the surface between buildings, can today often be forgotten and experienced as tedious for many. In the work towards a more sustainable society, there is a lot that can be done in urban planning, and one of these is to design more attractive, safe and lively street spaces in order to meet the challenges that a growing city brings. Södertälje is a growing municipality in Stockholm County which will face these challenges while expanding. This study therefore aims to investigate Nygatan and Järnagatan in Södertälje's city centre based on their physical design, use and experiences of citizens and officials. This is to produce a basis for the design of a policy for sustainable improvement measures in the work to create a safe, lively and attractive street environment in Södertälje. To achieve the purpose of the study, a literature study was carried out together with the creation of a theoretical framework based on the various theories of Jan Gehl, Jane Jacobs and Warm in the Winter. In the theoretical framework, a model is developed with the five categories of urban form, mobility, environment, social and enjoyment, which were the basis for the various parts of the report. A spatial analysis was performed to obtain a physical description of Nygatan and Järnagatan. In addition, a document study was carried out to investigate which goals and strategies Södertälje municipality has. Furthermore, nine actors in Södertälje municipality were interviewed and a survey was carried out to investigate how the citizens experience and use the two streets in the city centre, whereas 188 citizens participated. The results from the spatial analysis showed that Nygatan had significantly more criteria that were considered poor than Järnagatan had. The interviews indicate that the officials and actors believe that Södertälje has good potential and that the two street spaces can be developed even more, especially Nygatan. The survey showed that citizens consider Nygatan to be a dull street with too much traffic and too little social activities, restaurants/shops and greenery. Järnagatan was experienced in a more positive way, but even there the range of restaurants/shops was poor and more greenery and social activities were desired. Even though a street can fulfil the theoretical criteria that exist, the street space may lack important aspects that can be vital and act as the last piece of the puzzle to make a street safe, lively and attractive. The conclusion is that it is the whole of the street space that makes it successful and that the interaction between different factors matters. A street should both look good, function well and feel good. Finally, different solutions and methods should be tried because no street space is the same. Södertälje is well on its way to exploring the various solutions to create better street space through the projects and events they initiate. / Genom alla tider har städer byggts på olika sätt och stadens strukturer kan se annorlunda ut på olika platser i världen. Stadsplaneidealet har förändrats och små trånga gränder i staden har idag ersatts av stora vägar anpassade för bilar. Gator kan fungera som allt från transportsträckor till sociala mötesrum beroende på utformning och upplevelse. Men gatan, och gaturummet, som är det rum som utgör ytan mellan byggnader, kan idag ofta glömmas bort och upplevas som trista för många. I arbetet mot ett mer hållbart samhälle finns det en hel del som kan göras inom stadsplaneringen, och ett av dessa är att utforma mer attraktiva, trygga och levande gaturum för att kunna möta de utmaningar som en växande stad för med sig. Södertälje är en växande kommun i Stockholms län som i och med expansionen kommer stå inför dessa utmaningar.  Denna studie syftar därför till att undersöka Nygatan och Järnagatan i Södertäljes stadskärna utifrån deras fysiska utformning, användning samt upplevelser av medborgare och tjänstepersoner. Detta för att ta fram ett underlag till utformningen av en policy för hållbara förbättringsåtgärder i arbetet med att skapa en trygg, levande och attraktiv gatumiljö i Södertälje. För att uppnå syftet med studien genomfördes en litteraturstudie i samband med skapandet av ett teoretiskt ramverk baserat på Jan Gehls, Jane Jacobs och Warm in the Winters olika teorier. I det teoretiska ramverket utvecklades en modell med de fem kategorierna stadsform, mobilitet, miljö, socialt och njutning som låg till grund för studiens olika delar. En rumslig analys utfördes för att få en fysisk beskrivning av Nygatan och Järnagatan. Dessutom genomfördes en dokumentstudie för att undersöka vilka mål och strategier Södertälje kommun har. Vidare intervjuades nio aktörer i Södertälje kommun och en enkätundersökning utfördes för att undersöka hur medborgarna upplever och använder de två gatorna i stadskärnan, där 188 medborgare deltog.  Resultatet från den rumsliga analysen visade att Nygatan hade betydligt fler undermåliga kriterier än vad Järnagatan hade. Intervjuerna tyder på att tjänstepersonerna och aktörerna anser att Södertälje har god potential och att de två gaturummen kan utvecklas ännu mer, i synnerhet Nygatan. Enkäten visade att medborgarna anser att Nygatan är en trist gata med för mycket trafik och för lite sociala aktiviteter, restauranger/butiker och grönska. Järnagatan upplevdes på ett positivare sätt men även där var utbudet av restauranger/butiker dåligt och mer grönska samt sociala aktiviteter önskades.  Trots att en gata och dess gaturum kan uppfylla de teoretiska kriterier som finns så kan gaturummet sakna viktiga aspekter som kan vara avgörande och den sista pusselbiten till att göra en gata trygg, levande och attraktiv. Slutsatsen dras om att det är helheten i gaturummet som gör det lyckat och att samspelet mellan olika faktorer spelar roll. En gata bör både se bra ut, fungera bra och kännas bra. Slutligen bör olika lösningar och metoder prövas eftersom inget gaturum är det andra likt. Södertälje är på god väg i att utforska de olika lösningarna för att skapa bättre gaturum genom de projekt och evenemang som de kontinuerligt arbetar med.

Cardiovascular diseases are among the leading causes of death worldwide and particularly in the developed World. The search for new therapeutic approaches for improving the functions of the damaged heart is therefore a critical endeavour. Myocardial infarction, which can lead to heart failure, is associated with irreversible loss of functional cardiomyocytes. The loss of cardiomyocytes poses a major difficulty for treating the damaged heart since terminally differentiated cardiomyocytes have very limited regeneration potential. Currently, the only effective treatment for severe heart failure is heart transplantation but this option is limited by the acute shortage of donor hearts. The high incidence of heart diseases and the scarcity donor hearts underline the urgent need to find alternative therapeutic approaches for treating cardiovascular diseases. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can differentiate into functional cardiomyocytes. Therefore the engraftment of ES cell-derived functional cardiomyocytes or cardiac progenitor cells into the damaged heart to regenerate healthy myocardial tissues may be used to treat damaged hearts. Stem cell-based therapy therefore holds a great potential as a very attractive alternative to heart transplant for treating heart failure and other cardiovascular diseases. A major obstacle to the realisation of stem cell-based therapy is the lack of donor cells and this in turn is due to the fact that, currently, the molecular mechanisms or the regulatory signal transduction mechanisms that are responsible for mediating ES cell differentiation into cardiomyocytes are not well understood. Overcoming this huge scientific challenge is absolutely necessary before the use of stem cell-derived cardiomyocytes to treat the damaged heart can become a reality. Therefore the aim of this thesis was to investigate the signal transduction pathways that are involved in the differentiation of stem cells into cardiomyocytes. The first objective was the establishment and use of cardiomyocyte differentiation models using H9c2 cells and P19 stem cells to accomplish the specific objectives of the thesis. The specific objectives of the thesis were, the investigation of the roles of (i) nitric oxide (ii) protein kinase C (PKC), (iii) p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) (vi) phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and (vi) nuclear factor-kappa B (NF-kB) signalling pathways in the differentiation of stem cells to cardiomyocytes and, more importantly, to identify where possible any points of convergence and potential cross-talk between pathways that may be critical for differentiation to occur. P19 cells were routinely cultured in alpha minimal essential medium (α-MEM) supplemented with 100 units/ml penicillin /100 μg/ml streptomycin and 10% foetal bovine serum (FBS). P19 cell differentiation was initiated by culturing the cells in microbiological plates in medium containing 0.8 % DMSO to form embryoid bodies (EB). This was followed by transfer of EBs to cell culture grade dishes after four days. H9c2 cells were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FBS. Differentiation was initiated by incubating the cells in medium containing 1% FBS. In both models, when drugs were employed, they were added to cells for one hour prior to initiating differentiation. Cell monolayers were monitored daily over a period of 12 or 14 days. H9c2 cells were monitored for morphological changes and P19 cells were monitored for beating cardiomyocytes. Lysates were generated in parallel for western blot analysis of changes in cardiac myosin heavy chain (MHC), ventricular myosin chain light chain 1(MLC-1v) or troponin I (cTnI) using specific monoclonal antibodies. H9c2 cells cultured in 1% serum underwent differentiation as shown by the timedependent formation of myotubes, accompanied by a parallel increase in expression of both MHC and MLC-1v. These changes were however not apparent until 4 to 6 days after growth arrest and increased with time, reaching a peak at day 12 to 14. P19 stem cells cultured in DMSO containing medium differentiated as shown by the timedependent appearance of beating cardiomyocytes and this was accompanied by the expression of cTnI. The differentiation of both P19 stem cells and H9c2 into cardiomyocytes was blocked by the PI3K inhibitor LY294002, PKC inhibitor BIM-I and the p38 MAPK inhibitor SB2035800. However when LY294002, BIM-I or SB2035800 were added after the initiation of DMSO-induced P19 stem cell differentiation, each inhibitor failed to block the cell differentiation into beating cardiomyocytes. The NF-kB activation inhibitor, CAPE, blocked H9c2 cell differentiation into cardiomyocytes. Fast nitric oxide releasing donors (SIN-1 and NOC-5) markedly delayed the onset of differentiation of H9c2 cells into cardiomyocytes while slow nitric oxide releasing donors (SNAP and NOC-18) were less effective in delaying the onset of differentiation or long term differentiation of H9c2 cells into cardiomyocytes. Akt (protein kinase B) is the key downstream target of PI3K. Our cross-talk data also showed that PKC inhibition and p38 MAPK inhibition respectively enhanced and reduced the activation of Akt, as determined by the phosphorylation of Akt at serine residue 473. In conclusion, PKC, PI3K, p38 MAPK and NF-kB are relevant for the differentiation of stem cells into cardiomyocytes. Our data also show that the PKC, PI3K and p38 MAPK signalling pathways are activated as very early events during the differentiation of stem cells into cardiomyocytes. Our data also suggest that PKC may negatively regulate Akt activation while p38 MAPK inhibition inhibits Akt activation. Our fast NO releasing donor data suggest that nitric oxide may negatively regulate H9c2 cell differentiation.