A presente tese trata de espécies de drosofilídeos (Insecta, Diptera, Drosophilidae) associadas a flores, baseando-se em uma multiabordagem com informações morfológicas, ecológicas, biogeográficas, comportamentais e moleculares sobre estes organismos. Um inventário da biodiversidade de drosofilídeos associados a flores foi realizado em várias localidades do Brasil, com um amplo esforço amostral, que compreendeu amostras de flores de 125 espécies de plantas, de 47 famílias. Deste total, 56 espécies de plantas, de 18 famílias, se mostraram hospedeiras de drosofilídeos, revelando uma fauna ainda grandemente desconhecida. Das 28 espécies encontradas, 12 foram consideradas de ecologia restrita a flores, seis de biologia incerta e 10 como oportunistas. Cerca de 40% (12 espécies) da diversidade encontrada constituiu-se de espécies não descritas. Esta proporção sobe para 2/3 ao se excluir as espécies oportunistas. Entre as oportunistas foram encontradas nove espécies de Drosophila Fallén, 1823 e uma de Zaprionus Coquillett, 1901. Entre as de biologia incerta estão duas espécies de Cladochaeta Coquillett, 1900, uma de Rhinoleucophenga Hendel, 1917 e três de Scaptomyza Hardy, 1849. Já em relação às espécies de ecologia restrita a flores, estiveram representadas oito espécies do grupo bromeliae de Drosophila, duas espécies do subgênero Phloridosa Sturtevant, 1942, também de Drosophila, e duas espécies de Zygothrica Wiedemann, 1830. Uma lista completa das localidades onde foram encontradas cada uma das espécies é fornecida, incluindo vários novos registros. Também são listadas as plantas hospedeiras de cada espécie. Quatro espécies novas de Drosophilidae são formalmente descritas: Rhinoleucophenga joaquina sp. nov., Drosophila anaeterrae sp. nov., D. solani sp. nov. e D. jurubeba sp. nov. Adicionalmente, complementos de descrição nos moldes modernos são fornecidos para D. bromeliae Sturtevant, 1921 e D. bromelioides Pavan & Cunha, 1947. O grupo bromeliae de Drosophila foi o táxon mais representativo, tanto em número de espécies como em número de indivíduos. Oito espécies foram encontradas, seis das quais originalmente não descritas. Graus variados de amplitude de nicho foram observados, com espécies polífagas (D. bromelioides e D. bromeliae), oligófagas (D. anaeterrae sp. nov. e tipo III') e monófagas (D. solani sp. nov., D. jurubeba sp. nov., tipo IV' e tipo VI). As espécies monófagas apresentaram ecologia especializada em flores de Solanum. Estas diferenças ecológicas estiveram associadas a diferenças morfológicas, sendo observado um aumento de tamanho do ovipositor e uma redução (ou modificação) dos filamentos respiratórios dos ovos com o aumento do grau de especialização. As espécies deste grupo também puderam ser divididas em dois grupos geográficos: espécies de distribuição predominantemente meridional (D. bromelioides, D. anaeterrae sp. nov., D. solani sp. nov. e D. jurubeba sp. nov.) e espécies de distribuição predominantemente setentrional (D. bromeliae, tipo III', tipo IV' e tipo VI). Experimentos de cruzamento com três espécies do grupo (D. bromeliae, D. bromelioides e D. anaeterrae sp. nov.) demonstraram que estas apresentam isolamento reprodutivo completo e diferenças marcantes no padrão de som de corte do macho, fator que pode estar funcionando como mantenedor do isolamento pré-zigótico entre elas. Análises de barcode baseadas em seqüências de COI se mostraram bastante eficientes na correta discriminação de sete espécies do grupo bromeliae e duas espécies do subgênero Phloridosa (D. denieri Blanchard, 1938 e D. lutzii Sturtevant, 1916). Esta abordagem, portanto, fornece uma importante ferramenta para a identificação destas espécies, em especial de fêmeas, já que neste caso a diferenciação por morfologia se torna difícil. Análises filogenéticas realizadas com dados moleculares, obtidos para estas espécies pela primeira vez nesta tese, a partir de seqüências dos genes mitocondriais COI e COII, sugeriram que o subgênero Phloridosa tenha se originado na radiação immigrans-tripunctata do subgênero Drosophila Fallén, 1823, contrariando estudos anteriores baseados em caracteres morfológicos. Os resultados aqui obtidos, entretanto, encontram respaldo em uma reavaliação da morfologia destas espécies, baseada na terminália masculina. Por fim, análises filogenéticas com os mesmos marcadores para o grupo bromeliae sugerem a monofilia do grupo, sendo que as linhagens basais são representadas pelas espécies especialistas em Solanum, seguidas de um clado composto pelas espécies generalistas, onde as duas espécies polífagas formam as primeiras ramificações deste clado e as duas espécies oligófagas representam espécies-irmãs na extremidade terminal. A justaposição das relações filogenéticas das espécies deste grupo com as informações morfológicas e ecológicas sobre elas nos permitiram a formulação de um potencial cenário sobre a história evolutiva do grupo. / This thesis is a study on flower-breeding species of drosophilids (Insecta, Diptera, Drosophilidae) based on a multi-approach with morphological, ecological, biogeographic, behavioural and molecular information on such organisms. A biodiversity inventory of flowerbreeding drosophilids was carried out in several localities in Brazil, with a broad sampling effort, comprising samples of flowers of 125 plant species, from 47 families. Overall, 56 plant species, from 18 families, showed to be hosts for drosophilid species, revealing a fauna still mostly unknown. Twenty-eight species were found, 12 of them being considered restrict flower-breeding species, six of uncertain biology and 10 opportunists. Approximately 40% (12 species) of the diversity found comprised undescribed species. This proportion raises to 2/3 if opportunist species are excluded. Within the opportunist species, nine species of Drosophila Fallén, 1823 and one of Zaprionus Coquillett, 1901 were found. The species of uncertain biology were represented by two species of Cladochaeta Coquillett, 1900, one of Rhinoleucophenga Hendel, 1917 and three of Scaptomyza Hardy, 1849. The restrict flower-breeding drosophilids constituted of eight species of the bromeliae group of Drosophila, two species of the subgenus Phloridosa Sturtevant, 1942 of Drosophila and two species of Zygothrica Wiedemann, 1830. A complete list of localities where each species was found is provided, including various new records. A list of host plants is also presented for each species. Four species of Drosophilidae were formally described: Rhinoleucophenga joaquina sp. nov., Drosophila anaeterrae sp. nov., D. solani sp. nov. and D. jurubeba sp. nov. Additionally, complements of description in a modern taxonomic view are provided for D. bromeliae Sturtevant, 1921 e D. bromelioides Pavan & Cunha, 1947. The bromeliae group of Drosophila was the most representative taxon, both in number of species and individuals. Eight species were found, six of them undescribed. Varying levels of niche breadth were observed, with polyphagous (D. bromelioides and D. bromeliae), olygophagous (D. anaeterrae sp. nov. and type III') and monophagous (D. solani sp. nov., D. jurubeba sp. nov., type IV' and type VI) species. The monophagous species showed a specialisation in Solanum flowers. Such ecological differences were linked with morphological differences, with bigger oviscapts and reduced (or modified) respiratory egg filaments with the increasing of the level of specialisation. Species of this group also could be divided in two geographic groups: species with a predominantly southern distribution (D. bromelioides, D. anaeterrae sp. nov., D. solani sp. nov. and D. jurubeba sp. nov.) and species with a predominantly northern distribution (D. bromeliae, type III', type IV' and type VI). Crossing-experiments with three species of the group (D. bromeliae, D. bromelioides and D. anaeterrae sp. nov.) demonstrated that they have complete reproductive isolation and marked differences in the pattern of male courtship songs, what can be keeping premating isolation between them. A barcode analysis based on COI sequences was successful in the correct discrimination between seven species of the bromeliae group and between two species of the subgenus Phloridosa (D. denieri Blanchard, 1938 and D. lutzii Sturtevant, 1916). This analysis, therefore, provides an important tool for the identification of these species, especially for females, which presents a difficult morphological discrimination. Phylogenetic analysis performed with molecular data, obtained for the first time for these species in this thesis, based on sequences of the mitochondrial genes COI and COII, suggested that the subgenus Phloridosa is related to the immigrans-tripunctata radiation of the subgenus Drosophila Fallén, 1823, contrarily to previous studies based on morphological characters. The results obtained in this study, therefore, find additional support on a re-evaluation of the morphology of these species, based on the male terminalia. Finally, phylogenetic analysis based on the same molecular markers for the bromeliae group suggested the monophyly of the group, with the basal lineages constituting the Solanum-specialised species, followed by a clade comprising the generalist species, with the polyphagous species representing the early offshoots and the olygophagous ones as a terminal pair of sister-species. The superimposition of the phlylogenetic relationships of this species with the information based on morphology and ecology of these species permitted a formulation of a potential scenario of the evolutionary history of the group.

Os elementos de transposição (TEs) são ubíquos e abundantes, presentes nos mais diversos genomas analisados até então. Neste trabalho foram estudadas duas famílias de elementos (hosimary e hobo) pertencentes à superfamília hAT de transposons que possui membros amplamente distribuídos. Descrevemos aqui uma nova família de TEs denominada hosimary que surgiu da análise de sequências inicialmente descritas por nosso grupo de pesquisa, e que foram denominadas hosim e hosec. Através de análise de PCR sequências homólogas a hosim e hosec foram buscadas no genoma de 51 espécies de drosofilídeos e foram detectadas apenas em espécies do subgrupo melanogaster de Drosophila e em Zaprionus indianus. Entre essas espécies o número de cópias observadas mostrou-se variável, sendo que a maioria das sequências mostrou-se potencialmente codificadora. A alta similaridade entre essas sequências de dois gêneros distintos, juntamente com inconsistências observadas entre a filogenia da espécie hospedeira e dos TEs, pode ser um indicativo de transferência horizontal desses elementos. Adicionalmente, as sequências apresentaram uma similaridade maior que 90%, e baixa similaridade com outros elementos descritos, o que nos levou a sugerir que essas sequências devam constituir uma nova família, a qual denominamos hosimary. A outra família analisada neste trabalho inclui os elementos hobo e hoboVA (ou hoboVAHS), que podem estar envolvidos em um fenômeno de hipermutabilidade observado por nosso grupo de pesquisa. Através da análise de expressão transcricional dos elementos foram detectados transcritos senso e antisenso, sugerindo a atuação de um mecanismo de interferência por RNA (iRNA) como controlador da atividade destes elementos. Através de hibridização in situ de embriões inteiros o padrão de expressão de hobo e hoboVAHS revelou similaridades com padrões observados para genes do desenvolvimento. Isso nos levou a sugerir a existência de sequências cis-reguladoras nos elementos que podem estar interagindo com genes do hospedeiro. A presença destas sequências cis-reguladoras em TEs pode ter implicações evolutivas, uma vez que podem ser geradoras de variabilidade genética. / Transposable elements (TEs) are ubiquitous and abundant in several analyzed genomes. In this work two TE families (hosimary and hobo), belonging to the hAT superfamily, were studied. Here is described a new family, called hosimary, that was arised of analyzes of two sequences initially described by our research group (hosim e hosec). By performing PCR analysis in 50 drosophilidae species, sequences homologous to hosim and hosec were detected in Drosophila species of the melanogaster subgroup and in Zaprionus indianus. The number of copies observed among these species showed to be variable and most sequences presented coding potential. High similarity between these sequences, which belong to two distinct genera, as well as some inconsistencies among the phylogeny of the host species and the TEs were observed. This can be an indicative of horizontal transfer of these elements. Additionally, the sequences presented more than 90% of mutual similarity and no significant similarity with other already described element. This led us to suggest this new transposon family, that we called hosimary. The other family analyzed in this work includes the hobo and hoboVA (or hoboVAHS) elements. These elements may be involved in a hypermutability phenomenon observed by our research group. Sense and antisense transcripts were detected by transcriptional expression analysis, which suggests an RNA interference mechanism (iRNA) controlling the activity of these elements. in situ hybridization of whole mount embryo analysis showed similarity of the hobo and hoboVAHS expression pattern with patterns observed in developmental genes. This led us to suggest the existence of cis-regulatory sequences into the elements that can be interacting with the host genes. The presence of these cis-regulatory sequences in TEs can be related to evolutionary issues since they can be responsible for genetic variability.

Este estudo analisou as características genéticas da região V3 e o uso de coreceptores dos subtipos de HIV-1 mais prevalentes no Rio Grande do Sul através de ferramentas genotípicas. Amostras de plasma de 105 pacientes infectados com os subtipos B (35), C (35) ou recombinantes BC (35) com base na sequência do gene pol foram selecionadas. Após nested PCR, a região V3 do gene env foi sequenciada e o tropismo foi determinado através das ferramentas genotípicas Geno2pheno_coreceptor 10%, WebPSSM e R5/X4-Pred. Um total de 90 amostras foram eficientemente amplificadas e sequenciadas. A análise do subtipo da região do gene env identificou 37 B e 53 C. A maior proporção de cepas X4 entre o subtipo B foi 16,2% (predita pela Geno2pheno10%) e entre o subtipo C foi 32,1% (predita pela WebPSSMSI/NSI(C)). A prevalência de cepas X4 em infecções recentes foi 18,7%, sendo identificadas exclusivamente no subtipo C. A análise da região V3 revelou diferenças e similaridades entre as sequências do subtipo B e C. Para ambos os subtipos o comprimento da alça V3 se mostrou conservado, sendo que a pequena variabilidade observada foi associada com uso de CXCR4. A perda do sítio de Nglicosilação foi raramente observada e não foi relacionada com o tropismo viral. Carga total aumentada e a presença de aminoácidos básicos nas posições 11/25 foram associadas ao uso de CXCR4 apenas no subtipo B. Entre as cepas do subtipo B, os tetrâmeros observados foram GPGR (43,2%), GWGR (16,2%), GFGR (16,2%) e APGR (13,5%). O tetrâmero GPGQ esteve presente em 84,9% dos isolados do subtipo C e o tetrâmero GPGR foi associado com o uso de CXCR4 nesse subtipo. Estes resultados reforçam prévias observações de diferenças subtipo-específicas no uso de co-receptores pelo HIV-1 e corrobora os relatos de evolução do HIV-1 subtipo C para uso de CXCR4. / This study analized the genetic characteristics of the V3 region and the co-receptor usage of the main HIV-1 subtypes from Rio Grande do Sul through genotypic tools. Plasma samples from 105 patients known to be infected with subtypes B (35), C (35) or BC (35) recombinants based on pol sequences were selected. After nested PCR, the V3 region of env gene was sequenced and the tropism inferred using the genotypic tools Geno2pheno_coreceptor 10%, WebPSSM and R5/X4-Pred. A total of 90 samples were successfully amplified and sequenced. Subtyping analyses of env gene identified 37 B and 53 C. The higher X4 strains proportions among subtype B was 16.2% (predicted by Geno2pheno10%) and among subtype C was 32.1% (predicted by WebPSSMSI/NSI(C)). X4 prevalence in recent seroconverters was 18.7%, being exclusively identified in subtype C. Analysis of the V3 region revealed both differences and similarities among subtype B and C sequences. Both subtypes showed a conserved V3 length and the small variability observed was associated with CXCR4 usage. Loss of the N-glycosylation site was rarely observed and did not correlate to viral tropism. Increased net charge and basic amino acids at positions 11/25 were associated to CXCR4 usage only in subtype B isolates. Among subtype B strains, the tetramers observed were GPGR (43.2%), GWGR (16.2%), GFGR (16.2%) and APGR (13.5%). The tetramer GPGQ was present in 84.9% of subtype C sequences and the GPGR motif was associated with CXCR4 usage in subtype C. These finds reinforce previous observations of subtype-specific differences in HIV-1 co-receptor usage and corroborate reports of evolution of subtype C viruses for CXCR4 usage.

A deficiência hereditária da enzima lisossômica G-galactosidase, codificada pelo gene GLB1, causa duas doenças humanas clinicamente distintas, a Gangliosidose GM1 e Morquio B. Clinicamente, pacientes com Gangliosidose GM1 mostram graus variados de neurodegeneração e anormalidades esqueléticas, enquanto que os com Mórquio B apresentam displasia esquelética e opacidade de córnea, sem envolvimento do sistema nervoso central. Neste trabalho foi realizada a análise da freqüência populacional das mutações mais comuns no Brasil para Gangliosidose GM1, e a tentativa de comprovação da hipótese de efeito fundador destas mutações. Também foi realizada a pesquisa clínica e molecular de pacientes com Gangliosidose GM1 na tentativa de caracterizar os pacientes brasileiros, identificando novas mutações e traçando um panorama clínico e genético dessa população. Com a intenção de compreender os efeitos das novas mutações encontradas entre os pacientes brasileiros sobre a estrutura da proteína codificada por GLB1, modelos tridimensionais foram gerados através de ferramentas de bioinformática. Neste estudo foi possível predizer as conseqüências biológicas destas mutações, correlacionando às mesmas com os achados fenotípicos dos pacientes. Um esforço na busca de novas terapias para a doença também foi realizado, visto que não existe tratamento eficaz contra a Gangliosidose GM1. Para tanto, três terapias foram testadas em fibroblastos de paciente com a mutação mais comum encontrada na população brasileira: a terapia de tradução alternativa com o uso de geneticina e cloranfenicol, e a terapia de chaperonas farmacológicas, através do uso de galactose. Nenhuma das terapias foi eficaz no aumento da atividade enzimática da G-galactosidase, mas um aumento da expressão gênica pode ser observado para o gene GLB1. / The inherited deficiency of the lysosomal enzyme G-galactosidase, encoded by the gene GLB1, causes two clinically distinct human diseases: GM1Gangliosidosis and Morquio B. Clinically, patients with GM1 Gangliosidosis show varying degrees of neurodegeneration and skeletal abnormalities, while Morquio B shows skeletal dysplasia and corneal opacity, without involving the central nervous system. This work was performed to analyze the population frequency of the most common mutations in Brazil for Gangliosidosis GM1, and the attempt to prove the hypothesis of a founder effect for these mutations. A clinical and molecular research in patients with Gangliosidosis GM1 was also performed, in an attempt to characterize Brazilian patients, identifying new mutations and drawing a picture of the clinical and genetic aspects of this population. Trying to understand the effects of new mutations found among Brazilian patients on the structure of the protein encoded by GLB1, threedimensional models were generated using bioinformatics tools. In this study it was possible to predict the biological consequences of these mutations, correlating them with the phenotypic findings of the patients. An effort in finding new therapies for the disease was also performed, since there is no effective treatment for GM1 Gangliosidosis. Therefore, three treatments were tested in fibroblasts from patients with the most common mutation found in Brazil: the alternative translation therapy using geneticin and chloramphenicol, and the pharmacological chaperone therapy, using galactose. None of these therapies was effective in increasing the enzyme activity of G-galactosidase, but an increase in gene expression could be observed in the GLB1 gene.

Os estudos sobre a resistência de Mycobacterium tuberculosis aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB), vêm sendo cada vez mais explorados com o objetivo de entender melhor como funcionam os mecanismos utilizados pela micobactéria. A partir do aumento da transmissão ativa de linhagens de M. tuberculosis resistentes às drogas, tanto no Rio Grande do Sul quanto em outras regiões do Brasil, fez-se necessário um estudo relativo à resistência de M. tuberculosis à pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB). Sabe-se até o momento que existem genes específicos que, possivelmente sejam alvos de alterações e podem proporcionar resistência ao M. tuberculosis, no entanto ainda não se têm relatos do tipo e da freqüência destas mutações nos isolados do nosso Estado e de outros locais do Brasil. Sendo assim, neste trabalho buscou-se estudar isolados de M. tuberculosis, fenotipicamente caracterizados como resistentes à PZA e/ou EMB e determinar seu perfil de susceptibilidade a partir de caracterização das mutações nos genes pncA e embB, envolvidos respectivamente com a resistência à PZA e EMB. A metodologia utilizada foi baseada primeiramente na caracterização dos isolados pelos métodos tradicionais (testes fenotípicos de susceptibilidade) seguida de extração de DNA, amplificação dos genes alvo e posteriormente seqüenciamento dos mesmos. A partir da análise das seqüências obtidas foi possível caracterizar 12 novas mutações no gene pncA, distribuídas ao longo de todo o gene, que possivelmente estejam envolvidas com a resistência dos respectivos isolados à PZA. A análise dos isolados resistentes à EMB demonstrou que nossos isolados apresentam alterações somente no códon 306 do gene embB de M. tuberculosis. Após este estudo, será possível avaliar a ocorrência das mutações nos genes específicos e inferir sobre a possível interferência das mesmas nos mecanismos relacionados com a resistência a essas drogas. Conhecendo melhor os isolados de nosso país, poderemos fornecer informações para o desenvolvimento de um melhor método de detecção da resistência. Este método, depois de adequadamente testado poderá colaborar de forma decisiva nos programas de controle da tuberculose. / Extensive research about Mycobacterium tuberculosis resistance to drugs used in tuberculosis (TB) treatment has been performed in order to have a better understanding of the mechanisms used by mycobacteria. Once active transmission of drug resistant strains of M. tuberculosis has been occurring both in Rio Grande do Sul State and in other regions of Brazil, it brought up the need of performing a study related to M. tuberculosis pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB) resistance. It is known that specific genes are targets of alterations, which can lead to M. tuberculosis resistance, however, up to this moment there are no records about types or frequencies of those mutations in isolates from Rio Grande do Sul State and other sites in Brazil. Thus, in this study we aimed to evaluate M. tuberculosis isolates phenotypically characterized as PZA and/or EMB resistant, in order to determine their susceptibility profile based on the characterization of mutations in pncA and embB genes, involved in PZA and EMB resistance, respectively. Methodology used in the study was primarily based on the characterization of isolates by conventional methods (phenotypic susceptibility tests) followed by DNA extraction, target genes amplification and DNA sequencing. Sequence analysis revealed 12 novel mutations in pncA gene distributed all along the gene and they are possibly involved with PZA resistance in those isolates. Analysis of EMB resistant isolates showed our isolates presented alterations at codon 306 of embB gene of M. tuberculosis only. From this study it will be possible to evaluate the presence of mutations in specific genes in order to establish a correlation between their occurrence and the effects in the mechanisms related to the emergence of resistance to those drugs. Improving our knowledge about the isolates in our country we will be able to provide information that can be useful for the development of a methodology for the early detection of resistance. This methodology, if properly tested and validated can be highly helpful for the improvement of TB control programs.

A mobilização dos elementos de transposição (TEs) está sujeita a um conjunto complexo de mecanismos regulatórios que envolvem não apenas proteínas codificadas pelos próprios transposons, mas também pela célula hospedeira. Entretanto, até o momento, se conhece pouco sobre os fatores que levam à mobilização de TEs nos genomas hospedeiros. De uma maneira geral, fatores que expõem um organismo a situações de estresse levam à mobilização de transposons. Em função disso, propomos a adaptação, a nossas condições de laboratório, de uma metodologia de transformação genética para ser utilizada como ferramenta, na tentativa de contribuir na elucidação dos mecanismos de mobilização do elemento transponível hobo. Para o estabelecimento desta metodologia utilizamos como ferramentas um microscópio óptico binocular e um micromanipulador adaptado LEITZ. Neste micromanipulador foi acoplado um sistema de compressão a ar, composto por uma seringa de vidro de 20 ml e um dispositivo para infusão endovenosa (butterfly), onde é encaixada uma ponteira de micropipeta. Na ponteira, foi colada, com adesivo instantâneo, uma agulha feita a partir de capilares de vidro. O processo de microinjeção ocorreu em uma lâmina de microscopia contendo uma fita adesiva dupla-face que serve de suporte para os ovos a serem injetados. Com o auxílio de uma agulha histológica, ovos do mutante white de Drosophila simulans, previamente desidratados, foram decorionados manualmente e colocados enfileirados sobre este suporte para evitar deslocamentos durante a injeção. Posteriormente, os embriões foram imersos em “óleo de halocarbono”, e, em seguida, foi realizada a microinjeção de DNA. Para esta etapa do trabalho foram testados vários vetores de transformação, sendo mais eficaz o elemento transponível piggyBac, com o vetor pBac[3xp3-GFPafm], o qual possui um promotor que conduz uma forte expressão da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) em tecidos do olho de moscas adultas, o que, sob luz laser azul, fluoresce com uma intensa cor verde. Com este vetor conseguimos a detecção de transformantes, e a comprovação da eficiência da metodologia estabelecida. A segunda etapa do trabalho teve como objetivo estudar a mobilização do transposon hobo por meio de microinjeção de DNA. Para isso foram utilizados os mutantes white, cuja mutação é causada pela inserção do elemento hobo “relic” (hoboVA) neste gene, e dpp-like de D. simulans. Como vetor de transformação foram utilizados, independentemente, os plasmídeos pHFL1 (hobo canônico), e BlueScript como controle. Os adultos microinjetados sobreviventes (G0) foram individualmente cruzados com outro da mesma linhagem, e, a partir deste cruzamento, foram estabelecidas cinco isolinhagens de cada G0 acompanhadas até a 3ª geração. Todos os indivíduos foram analisados quanto ao fenótipo, para possíveis eventos de reversão de mutação, e alguns, analisados molecularmente por Southern Blot. Foram observadas diversas alterações morfológicas, essencialmente nas asas, tanto em G0 como em seus descendentes. Na linhagem dpp-like foram observados eventos de reversão ao fenótipo selvagem, porém, essa característica não foi transmitida à descendência, indicando ausência de mobilização do elemento hobo, pelo menos em células germinativas. Para o mutante white, nenhum processo de reversão foi observado, sendo o número de indivíduos com alteração de asas menos pronunciado. No entanto, foi possível isolar uma nova isolinhagem dpp-like, provavelmente fruto de uma inserção de novo no gene dpp. Na análise molecular foi detectada a mobilização do elemento hobo em duas isolinhagens de dpp-like de um total de 27 isolinhagens analisadas, sugerindo uma taxa de mobilização do hobo canônico de 7,4%. Entretanto, não foi possível observar a mobilização de hoboVA através da reversão das mutações white e dpp-like. Isso mostra que a taxa de mobilização desse elemento deve ser inferior à do hobo canônico, e sugere que deve haver um mecanismo de regulação de transposição em hobo. / Transposable elements (TEs) mobilization depends on complex regulatory mechanisms that involve not only proteins codified by the transposons themselves, but also by the host cell. However, until the present, the factors that lead to the TEs mobilization in the host genomes are not well-known. Generally, factors that expose an organism to stress conditions lead to transposon mobilization. Therefore, we propose the adaptation of a transformation methodology to our laboratorial conditions, in order to investigate the mobilization mechanism of the hobo transposable element. To devise this methodology two tools were used: a binocular optic microscope and an adapted LEITZ micromanipulator. An air compression system comprising a 20 ml glass syringe and an intra-venous injection “butterfly” tube attached to a micro-pipette tip was coupled to the micromanipulator. A needle made of glass capillary tube was glued with instant adhesive to the micro-pipette tip. The micro-injection process was performed by using a microscope slide containing a double side adhesive band which served as support to the eggs to be injected. Aided by a histological needle, white mutant Drosophila simulans eggs, previously de-hydrated, were manually decorionied and lined up upon this support to avoid moving during the injection. After this step, the embryos were immersed in “halocarbon oil” and the DNA micro-injection was performed. In this part of the work several transformation vectors were tested, and the most efficient transposable element was the piggyBac with the pBac[3xp3-GFPafm] plasmid, which has a promoter that drives strong expression of the GFP (green fluorescent protein) in the eye-tissues of the adult flies; that fluoresce with a strong green color when exposed to blue laser light. With this vector we achieved the detection of transformants, as well as the proofing of the efficiency of the established methodology. The second step of the work was focused on the study of the hobo transposon mobilization by means of DNA microinjection. For this, white mutants, whose mutation is caused by the insertion of the hobo “relic” element (hoboVA) in this gene, and dpp-like of D. simulans, were used. The plasmids pHFL1 (canonical hobo) and BlueScript (control) were independently used as transformation vectors. The micro-injected adult survivors (Go) were individually crossed with other from the same line. From this crossing five isolines from each Go were obtained and observed until the 3rd generation. All individuals phenotype were analyzed in order to detect possible mutation reversion events, and some of them were molecularly analyzed by Southern Blot. Several morphological alterations were observed, essentially in the wings of the Go individuals as well as in their descendents. In the dpp-like line, events of reversion to wild phenotype were observed, however this characteristic was not transmitted to the descendents, indicating the absence of hobo element mobilization in the germ-line. No reversion process was observed for the white mutant, and the number of individuals with wings alterations was less expressive. However it was possible to insulate a new dpp-like isoline probably resulting of de novo insertion in the dpp gene. The molecular analysis showed the hobo element mobilization in two dpp-like isolines in a total of 27, suggesting a hobo canonic mobilization tax of 7.4%. Nevertheless, it was not possible to observe the hoboVA mobilization through white and dpp-like mutation reversion, showing that the mobilization tax of this element might be inferior to the canonic hobo and suggesting that may exist a regulatory mechanism of hobo transposition.

A prevalência da obesidade tem aumentado em todo o mundo, alcançando proporções epidêmicas em muitos países desenvolvidos e de transição. A obesidade é uma doença complexa de origem multifatorial, a qual, em muitos casos, aparece como uma condição poligênica influenciada por fatores ambientais. Apesar da contribuição de fatores genéticos no desenvolvimento do ganho de peso ser amplamente reconhecida, a real contribuição quantitativa dos mesmos em fenótipos relacionados é ainda uma questão complexa que precisa ser esclarecida. Na presente dissertação, foi realizado um estudo de associação entre variantes em dois genes candidatos de susceptibilidade à obesidade e parâmetros de massa e de distribuição da gordura corporal em uma amostra da população euro-descendente de Porto Alegre. Esse trabalho teve a finalidade de verificar se esses polimorfismos estariam envolvidos na patogênese do excesso de massa corporal nessa população. Foram analisados dois polimorfismos localizados nos genes transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART) e no receptor canabinóide 1 (CNR1), sendo eles: CART - 156A>G e CNR1 1359G>A. Os genótipos para cada polimorfismo foram determinados pela técnica da reação em cadeia da polimerase e posterior clivagem com endonucleases de restrição específicas. Os fragmentos de DNA resultantes foram separados e identificados por eletroforese em gel de agarose. Dentre os indivíduos da amostra, a maioria deles (43%) apresentavam peso normal (IMC<25Kg/m2), enquanto que 36,8% foram classificados como sobrepeso e 20,2% como obesos (IMC≥30Kg/m2). As freqüências genotípicas observadas para o polimorfismo no gene CART foram A/A= 21,4%, A/G= 46,7% e G/G= 31,9%, enquanto que as alélicas foram A= 44,7% e G= 55,3%. Nesse gene, as médias do IMC e da WC foram significativamente maiores em homens portadores do alelo A (m= 26,9 e m= 96,6, respectivamente), quando comparados com aqueles homozigotos para o alelo G (m= 25,6 e m=93,7) (ANOVA, P=0,035 e P=0,038, respectivamente). Já para o gene CNR1, as freqüências dos alelos e dos genótipos observadas para o polimorfismo foram A= 22,2% e G= 77,8%; A/A= 5%, A/G= 34,5% e G/G= 60,6%. As médias do IMC e da WC foram significativamente maiores em homens portadores do alelo G (m= 26,5 e m= 95,7), quando comparados com os homozigotos para o alelo A (m= 23,8 e m= 87,7) (Mann-Whitney, P=0,037 e P=0,012). Esses resultados evidenciam que tanto o gene CART quanto o gene CNR1 estão associados com fenótipos da obesidade humana de uma forma gênero-dependente, já que em mulheres não foi encontrado algum resultado significativo. Os dados aqui apresentados reforçam as evidências de que os estudos de associação representam uma ferramenta poderosa na identificação de variantes genéticas que influenciam a susceptibilidade às doenças complexas, principalmente quando essas influências genéticas são analisadas dentro de seu contexto biológico e ambiental. / The prevalence of obesity is rising throughout the world and it is reaching epidemic proportions in many developed and transition countries. Obesity is a complex disease with multifactorial origin, which in many cases appears as a polygenic condition affected by environmental factors. Despite the contribution of genetic factors to the development of weight gain be widely recognized, the real quantitative contribution of them to related phenotypes is a complex question yet to be answered. In the present study, the association between two candidate gene variants and body fat mass-related phenotypes was evaluated in an European descent sample from Porto Alegre city. This work aimed to identify if those polymorphisms were involved in the etiology of obesity in this population. Two polymorphisms were investigated in the cocaine-amphetamine-regulated transcript (CART) and the cannabinoid receptor 1 (CNR1) genes, which are the following: CART -156A>G and CNR1 1359G>A. Genotypes for each variant were determinated by the polymerase chain reaction coupled to endonuclease restriction digestion. The DNA fragments generated were separated and identified by electrophoresis in agarose gel. Most individuals in our sample (43%) had a normal weight (BMI<25 kg/m2), while 36.8% could be classified as overweight and 20.2% were obese (BMI ³30 kg/m2). The genotype frequencies observed in the CART polymorphism were A/A= 21.4%, A/G= 46.7% and G/G= 31.9%, while the allele frequencies were A= 44.7% and G= 55.3%. In that same gene, both BMI and WC means were significantly higher in A-carrier males (m= 26.9 and m= 96.6, respectively) when compared to G-homozygote males (m= 25.6 and m=93.7) (ANOVA, P=0.035 e P=0.038, respectively). However for the CNR1 gene, the allele and genotype frequencies were A= 22.2% and G= 77.8%; A/A= 5%, A/G= 34.5% and G/G= 60.6%. The BMI and WC means were higher in G-carrier males (m= 26.5 and m= 95.7) than in A-homozygote males (m= 23.8 and m= 87.7) (Mann-Whitney, P=0.037 and P=0.012). This results show that either the CART or the CNR1 gene are associated with human obesity-related phenotypes in a gender-dependent way, since no significant result was found in females. The data revealed here reinforce evidence that association studies are a powerful tool to identify genetic variants with susceptibility to complex diseases, mainly when they are analyzed in a biological-environmental context.

A doença de Parkinson é freqüente no mundo todo, atingindo indivíduos de todas as idades e etnias. Embora comum e muito estudada, seus mecanismos causais ainda não são plenamente conhecidos e ainda não há tratamento curativo. Atualmente, são conhecidos alguns fatores ambientais e genéticos associados ao desenvolvimento da doença de Parkinson. Dentre os fatores genéticos, foram identificados diversos genes que podem, ou determinar a ocorrência da doença de forma mendeliana (genes principais), ou apenas aumentar o risco de seu surgimento (genes de suscetibilidade). Embora os fatores genéticos, em conjunto, sejam responsáveis por uma minoria dos casos, permanece relevante esta investigação, para promover um aconselhamento genético adequado para os portadores de formas mendelianas, para adequar medidas de tratamento e reconhecer características clínicas e de prognóstico, oportunizando, inclusive, ampliar o entendimento dessa condição. O presente estudo analisou pacientes portadores de doença de Parkinson em acompanhamento no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, que apresentavam baixa idade de início dos sintomas, história familiar positiva ou presença de manifestações atípicas da doença. Essas características foram utilizadas como critério de seleção dos pacientes por estarem associadas com maior probabilidade de detecção de causas genéticas. Os pacientes foram submetidos à avaliação clínica e à testagem molecular para diversos genes principais e de suscetibilidade. Foram, posteriormente, comparadas as características clínicas dos pacientes positivos com relação aos demais pacientes estudados. Os resultados são apresentados sob a forma de três artigos, que descrevem, respectivamente, os achados moleculares da investigação para os genes causais autossômicos recessivos (genes PARK2, PARK6, PARK7 e PARK8), autossômicos dominantes (genes SCA1, SCA2, SCA3, SCA6 e SCA7) e o gene de suscetibilidade (gene GBA).

O aumento da prevalência de obesidade em várias regiões do planeta vem se revelando como um dos mais importantes fenômenos clínico-epidemiológicos da atualidade. Fatores como a mudança do hábito alimentar e o estilo de vida sedentário, aliados a determinantes genéticos ainda pouco conhecidos, desempenham um papel relevante na patogênese desta doença. Nos últimos dez anos, desde o descobrimento do hormônio leptina, avanços consideráveis foram obtidos na caracterização dos mecanismos hipotalâmicos do controle da ingestão alimentar. Tais avanços têm revelado as particularidades de um sistema complexo e integrado, e têm oferecido novas perspectivas para abordagens terapêuticas específicas. Apesar da contribuição de fatores genéticos no desenvolvimento do ganho de peso ser amplamente reconhecida, a real contribuição quantitativa dos mesmos em fenótipos relacionados é ainda uma questão complexa que precisa ser esclarecida. Na presente Tese, foram avaliados onze polimorfismos em oito genes candidatos e suas possíveis influências sobre parâmetros de massa e de distribuição da gordura corporal em uma amostra da população da região metropolitana de Porto Alegre de ancestralidade predominantemente européia. Foram analisados polimorfismos localizados nos seguintes genes candidatos à obesidade: Proteína relacionada a agouti (AgRP), Transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART), Receptor canabinóide 1 (CNR1), Catecol-O-metil transferase (COMT), Receptor de dopamina D2 (DRD2), Monoamina oxidase A (MAOA), Receptor melanocortina 4 (MC4R) e Pro-opiomelanocortina (POMC). Os genótipos para cada polimorfismo foram determinados através da amplificação do DNA de cada indivíduo pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) e posterior clivagem com endonucleases de restrição específicas quando necessário. Os genótipos foram determinados após separação eletroforética em géis de agarose ou poliacrilamida. Dentre os indivíduos da amostra, a maioria deles (42,6%) apresentou peso normal (IMC<25Kg/m2), enquanto que 36,9% foram classificados como sobrepeso e 20,5% como obesos (IMC>=30Kg/m2). Os parâmetros corporais de gordura analisados foram influenciados pelas variantes dos genes CART, CNR1, COMT e DRD2. O polimorfismo CART -156A/G foi associado ao aumento da obesidade abdominal determinada através da razão cintura-quadril (WHR); interação com fumo anterior a correção de Bonferroni foi também observada. Da mesma forma, o polimorfismo CNR1 4895A/G e o haplótipo contendo os três alelos selvagens dos polimorfismos analisados nesse gene mostraram-se associados à presença de obesidade abdominal. Entretanto, tal efeito haplotípico não se sustentou após a correção de Bonferroni. O polimorfismo COMT 158G/A foi associado ao aumento do índice de massa corporal (IMC), embora tal associação também não tenha permanecido após correções para múltiplos testes. Já a variante DRD2 -141C Ins/Del mostrou-se associada à obesidade abdominal de um modo idade-dependente. Não foram observadas associações significantes para as demais variantes analisadas (AgRP 199G/A, CNR1 1359G/A, CNR1 3813A/G, DRD2 TaqIA, MAOA u-VNTR 30pb, MC4R -2745C/T e POMC 8246C/T). Os dados aqui apresentados reforçam as evidências de que os estudos de associação representam uma ferramenta poderosa na identificação de variantes genéticas que influenciam a susceptibilidade às doenças complexas, principalmente quando essas influências são analisadas dentro de seu contexto biológico e ambiental. / The worldwide increase in the prevalence of obesity is becoming one of the most important clinical-epidemiological phenomena at present day. Environmental factors such as changes in lifestyle and feeding behavior associated with poorly characterized genetic determinants are thought to play the most important roles in the pathogenesis of this disease. During the last ten years, since the discovery of leptin, great advances were obtained in the characterization of the hypothalamic mechanisms involved in food intake control. Such advances are unveiling a complex and integrated system and are opening a wide perspective for the finding of novel therapeutic targets for the treatment of this harming condition. Despite the contribution of genetic factors to the development of weight gain being widely recognized, the real quantitative contribution of them is a complex question yet to be answered. In the present study, we evaluated the influence of eleven variants at eight candidate genes on mass parameters and body fat distribution in an European derived sample from Porto Alegre metropolitan region. Polymorphisms were investigated in the following candidate genes related to obesity: Agouti-related protein (AgRP), Cocaine and Amphetamine-regulated transcript (CART), Cannabinoid receptor 1 (CNR1), Catechol-Omethyltransferase (COMT), Dopamine receptor D2 (DRD2), Monoamine oxidase A (MAOA), Melanocortin receptor 4 (MC4R) and Proopiomelanocortin (POMC). Genotypes for each variant were determined by the polymerase chain reaction (PCR) coupled with endonuclease restriction digestion when necessary. The genotypes were identified after electrophoresis in agarose or polyacrylamide gels. Most individuals in our sample (42.6%) had a normal weight (BMI<25 kg/m2), while 36.9% could be classified as overweight and 20.5% were obese (BMI >=30 kg/m2). The body fat parameters investigated were influenced by CART, CNR1, COMT and DRD2 gene variants. The CART -156A/G was associated with increased abdominal obesity determined through waist-to-hip ratio (WHR), as well as it showed an interaction with smoking habits only before Bonferroni correction for multiple tests. Similarly, the CNR1 4895A/G polymorphism was associated with the presence of central obesity. The haplotype derived from the three wild variants studied in this gene was associated with abdominal obesity, although this effect disappeared after Bonferroni correction. The COMT 158G/A was significantly associated with increased body mass index (BMI), but not after Bonferroni adjustments. Finally, the DRD2 -141C Ins/Del showed to exert an influence on central obesity in an age-dependent way. No significant associations were observed for the remaining variants (AgRP 199G/A, CNR1 1359G/A, CNR1 3813A/G, DRD2 TaqIA, MAOA u-VNTR 30pb, MC4R -2745C/T and POMC 8246C/T). The data revealed here reinforce evidence that association studies are a powerful tool to identify genetic variants for susceptibility to complex diseases, mainly when they are analyzed in a biological-environmental context.

O gênero Cunila D. Royen ex L. (Lamiaceae) encontra-se na América de forma disjunta, apresentando dois centros de distribuição de espécies, um na América do Norte e outro na América do Sul o qual apresenta três seções: Incanae, Incisae e Spicatae. As espécies do gênero Cunila são usadas na medicina popular com várias finalidades, o óleo essencial destas espécies apresenta atividades sobre microorganismos patogênicos e insetos. Os resultados obtidos neste trabalho, a partir do seqüenciamento de regiões nucleares e plastidiais, contribuem para elucidar a história evolutiva deste gênero, sendo este o primeiro relato filogenético para o gênero Cunila. Baseado nos resultados fortemente apoiados pelos diversos tratamentos estatísticos se pode observar a parafilia do gênero Cunila, sugerindo-se ainda a união de duas seções geneticamente muito similares, as seções arbustivas Incanae e Incisae. Paralelamente a este estudo, os marcadores moleculares ISSR foram aplicados visando contribuir para a classificação das espécies Sul-Americanas. Os resultados obtidos apontam para a separação destas espécies em dois grupos: arbustos e subarbustos, reforçando os resultados referentes à análise filogenética do gênero. O grupo de espécies arbustivas foi formado pelas seções Incanae e Incisae, enquanto que o grupo subarbustivo foi formado pela seção Spicatae. Os marcadores moleculares ISSR foram empregados, igualmente, no estudo de variabilidade genética dentro e entre populações de Cunila menthoides. Cada população foi caracterizada como um "pool" gênico distinto correspondendo a sua distribuição geográfica, apresentando baixa variabilidade intrapopulacional, e indicando que cada população é derivada de um limitado número de plantas com baixa troca gênica entre as populações. Diferentes populações de C. menthoides foram sujeitas à hidrodestilação por arraste a vapor e seu óleo essencial analisado em GS e GS-MS. Dois diferentes quimiotipos foram observados: pulegona e linalol, sendo que alguns indivíduos apresentaram variações relativas entre as percentagens de pulegona e mentona. Na rota biossintética dos monoterpenos, pulegona pode ser reduzido a mentona, pela ação da enzima pulegona redutase (PR). A alta ou baixa expressão da PR pode resultar no respectivo aumento ou diminuição de produção de mentona ou pulegona. O quimiotipo linalol foi formado unicamente por uma população, enquanto que todas as outras populações estudadas integraram o grupo caracterizado por pulegona. A seção Incanae é composta por uma única espécie: Cunila incana. A análise de seu óleo essencial demonstrou alta percentagem de sesquiterpenos, não sendo esta uma característica do gênero, sendo que todas as pesquisas realizadas com óleos essenciais de outras espécies do gênero indicaram altas concentrações de monoterpenos, e por conseqüência, poucos compostos sesquiterpênicos. Os resultados obtidos contribuem para o conhecimento químico e genético deste gênero com enorme potencial aromático e medicinal, o qual possui ampla distribuição no Rio Grande do Sul. / The genus Cunila D. Royen ex L. (Lamiaceae) is an american genus and presents two centers of distribution, one in North America and another in the southern of South America. It´s species are classified into three sections: Incanae, Incisae and Spicatae. Cunila species are used in folk medicine for a lot purposes, moreover, Cunila essential oils have compounds responsible for antibacterial, antifungal and insecticidal activity. The results obtained in this work, based on the sequencing from nuclear and chloroplast sets, contributed to clarify the origin and evolution of these species, being the first phylogenetic report for this genus. Based on the strongly statistical supported results the paraphyly of Cunila were reported and we suggest the union of the two South American sections formed by shrubs species (Incisae and Incanae). In addition, the molecular markers ISSR were applied to contribute with the classification of the South American species. The results showed two main clusters, one consisting of shrubs and the second by subshrubs species, which refforces the data showed in the phylogenetic study. The shrub group was composed by species representing Incanae and Incisae sections, meanwhile the subshrub group was characterized by the species from Spicatae section. The molecular markers ISSR were also applied to access inter and intrapopulational genetic variability of Cunila menthoides. Each population were characterized as a distinct genetic pool according with the geographic distribution, populations analyzed were genetically structured with low genetic variability, indicating that each population derives from a limited number of plants with low gene flow between populations. Air-dried samples of individual plants of different populations of C. menthoides were extracted by steam distillation and analyzed using GS and GS-MS. Two different chemotypes were observed: pulegone and linalool. Some samples showed a variation in the percentage of menthone/pulegone. In the monoterpenes biosynthetic pathway, pulegone can be reduced to menthone, by pulegone reductase (PR). Overexpression and cosuppression of PR can result in the respective increase or decrease in the production of menthone and pulegone. The linalool chemotype was formed by only one population; meanwhile all the other populations analyzed composed the group characterized by pulegone. The Incanae section is represented by C. incana. The essential oil obtained from this species showed high concentrations of sesquiterpenes, differing of the essential oil obtained from the other Cunila species, which is characterized by high concentration of monoterpenes and consequently low concentrations of sesquiterpenes compounds. The results obtained in this work, corresponding to a increase in the chemical and genetic knowledge of this genus which represent a great aromatic and medicinal potential, and show large distribution in the Rio Grande do Sul State.