No description available.

This paper examined how Change Management and Transformational Leadership can be effective tools in transitioning towards sustainable agriculture in Europe. This paper starts with providing empirical evidence for climate change and shows that Northern and Southern Europe are impacted differently by climate change. Then this paper examined how climate change affects farmers in the different parts of Europe and what Societal, Environmental, Leadership and Organisational changes have to be made to transition towards sustainable agriculture in Europe. The qualitative analysis shows that, according to farmer associations, there is a need for a variety of options, a lack of communication and insufficient involvement of farmers on a policy making level. This paper ends with explaining how Change Management and Transformational Leadership can be used as tools to improve communication between stakeholders and improve the involvement of farmers in the co-creation process. Therefore, this paper concludes that Change Management and Transformational leadership will help the European Union in realising sustainable agriculture in Europe.

No description available.

La leucémie aigüe myéloïde est un cancer hautement létal notamment parce que le taux de rechutes est élevé, ce qui traduit l’importance du développement de nouvelles thérapies. Ces dernières peuvent tirer avantage du fait que les cellules leucémiques peuvent exprimer des antigènes qui ne sont pas exprimés par les tissus sains, soit les antigènes spécifiques aux tumeurs (TSA). À cet effet, nos collaborateurs ont découvert une source importante « d'aberrantly expressed TSA » (aeTSA) dans les régions non codantes de l’ADN. Ces aeTSA sont présentés par les molécules de CMH I et plusieurs ont provoqué la réactivité des lymphocytes T (LTs) in vitro. En plus d'être spécifiques aux cellules cancéreuses, ces aeTSA sont partagés entre plusieurs patients ce qui fait d'eux des cibles intéressantes dans le cadre d’immunothérapies. Sachant que c’est le récepteur de cellules T (TCR) qui confère la spécificité aux LTs, le but est d'isoler et de caractériser des TCR anti-aeTSA en vue de leur utilisation comme outils thérapeutiques. Pour ce faire, l’expansion de LTs CD8+ naïfs provenant de donneurs sains a été réalisée grâce à une co-culture avec des cellules dendritiques autologues chargées avec l'aeTSA d’intérêt. Les LTs CD8+ spécifiques du aeTSA ont été triés à l’aide d'un marquage dextramères et l’ARN a été isolé afin de réaliser le séquençage du TCR. Ce dernier a révélé que le répertoire de TCR anti-aeTSA est nettement oligoclonal, facilitant l'identification des séquences des chaînes α et β des clonotypes les plus abondants. En revanche, les répertoires de TCR anti-LMP2 426-434 (antigène viral) et anti-WT1 37-45 (antigène associé aux tumeurs) étaient plus diversifiés. De plus, des tests d'avidité fonctionnelle réalisés à l'aide d'ELISpot en concentrations décroissantes de peptides ont révélé que l'avidité fonctionnelle des LTs qui reconnaissent les aeTSA est similaire à celle du peptide LMP2 426-434, ce qui suggère que les aeTSA stimulent des réponses T de hautes avidités. Ensuite, la délétion du TCR endogène a été réalisée à l'aide de la technique CRISPR-Cas9, montrant plus de 90% d'efficacité. À des fins d'optimisation de protocoles, le TCR 1G4 spécifique de NY-ESO-1 a été introduit dans le locus TRAC et, simultanément, le knock-out de la chaîne α du TCR endogène a été réalisé afin de limiter les mésappariements et la compétition entre ces deux TCR. Les prochaines étapes seront d’introduire le gène codant pour le TCR spécifique d'aeTSA dans des LTs et de vérifier que les cellules éditées sont réactives envers ces aeTSA. Finalement, ce projet pourrait ouvrir la voie au ciblage d'aeTSA à l’aide de l’ingénierie du TCR pour rediriger un grand nombre de LTs envers les cellules leucémiques. / Acute myeloid leukemia is a highly lethal cancer for which effective immunotherapies are actively sought. These immunotherapies can take advantage of the fact that leukemia cells can express antigens that are not expressed by healthy tissues, namely tumor-specific antigens (TSA). In this regard, our collaborator's team has discovered an important source of aberrantly expressed TSA (aeTSA) in the non-coding regions of DNA. These aeTSAs are presented by MHC 1 molecules and can elicit T cells reactivity in vitro. In addition to being specific to cancer cells, these aeTSAs are shared between several patients, which makes them interesting targets in the context of immunotherapies. Knowing that the T cell receptor (TCR) is responsible for T cells specificity, the goal is to isolate and characterize anti-aeTSA TCRs for their use as therapeutic tools. To this end, we expanded aeTSA-specific T cells from naive CD8+ T cells obtained from healthy donors through co-culture with autologous dendritic cells loaded with the relevant aeTSA. The aeTSA-specific CD8+ T cells identified by dextramer staining were sorted for RNA extraction TCR sequencing. Amplicon sequencing reveals that the expanded anti-aeTSA TCR repertoire is markedly oligoclonal, facilitating the identification of dominant TCR α and β chains. In contrast, the anti-LMP2 426-434 (viral antigen) and anti-WT1 37-45 (tumor-associated antigen) TCR repertoires were more diverse. In addition, functional avidity tests, performed using ELISpot in decreasing concentrations of peptides, revealed that the functional avidity of T cells recognizing aeTSA is similar to LMP2 426-434 peptide, suggesting that aeTSAs stimulate high-avidity responses. Then, endogenous TCR knock-out was performed using the CRISPR-Cas9 technique, showing more than 90% efficiency. For protocol optimization purposes, the 1G4 TCR specific for NY-ESO-1 was introduced into the TRAC locus and, simultaneously, the knock-out of the α chain of the endogenous TCR was achieved in order to limit mismatches and competition between these two TCRs. The next steps will be to introduce the gene coding for the aeTSA-specific TCR into T cells and to validate that the edited cells are reactive toward these aeTSAs. Ultimately, this project could pave the way for targeting aeTSAs using TCR engineering to redirect large numbers of T cells toward leukemic cells.

No description available.

[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de optimizar la técnica y probar su eficiencia en distintas dianas se modificaron dos genes implicados en LMA. Estos fueron el gen IDH2, en el cuál se buscó introducir la mutación R172, y el gen MYBL2. Finalmente, las eficiencias de edición obtenidas se compararon con el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR, muy utilizados por su alta eficiencia. Mientras que los complejos de ribonucleoproteínas presentaron una mayor eficiencia de corte, la eficiencia de edición de la mutación R172 fue similar en ambas estrategias. Mediante secuenciación masiva se confirmó y caracterizó esta edición y se comprobó que la maquinaria de edición no había producido cortes inespecíficos en regiones similares del genoma. Por tanto, la nueva metodología desarrollada permitió editar de forma precisa líneas celulares leucémicas con eficiencias similares a otras técnicas CRISPR más extendidas y sin producir efectos inespecíficos no deseados. Por otro lado, gracias a la gran conservación evolutiva del gen IDH2, los residuos R140 y R172 se encuentran conservados en la proteína idh-2 de Caenorhabditis elegans. Se empleó la estrategia co-CRISPR para desarrollar y seleccionar cepas mutantes con las mutaciones ortólogas a R140 y R172, y una cepa con ambas mutaciones. A pesar de la conservación, no se observó el aumento del oncometabolito 2-HG esperado en las cepas mutantes en comparación con la cepa salvaje control N2. Un estudio exhaustivo de las vías implicadas nos serviría para desarrollar modelos de investigación con las alteraciones moleculares observadas en los pacientes. Para concluir, la estrategia desarrollada de introducción de elementos CRISPR en líneas celulares, junto a los modelos producidos en C. elegans, permitirán en futuros estudios investigar en detalle los efectos moleculares de mutaciones detectadas en pacientes de LMA, su implicación en el desarrollo y pronóstico de la LMA y comprender su papel en la estratificación de los pacientes. / [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i provar la seua eficiència en diferents dianes es van modificar dos gens implicats en LMA. Aquests van ser el gen IDH2, en el qual es va buscar introduir la mutació R172, i el gen MYBL2. Finalment, les eficiències d'edició obtingudes amb la nova estratègia es van comparar amb l'ús de complexos ribonucleotproteïnes CRISPR, molt utilitzats per la seua alta eficiència. Mentre que els complexos de ribonucleoproteïnes van presentar una major eficiència de tall, l'eficiència d'edició de la mutació R172 va ser similar en les dues estratègies. Mitjançant seqüenciació massiva es va confirmar i caracteritzar aquesta edició i es va comprovar que la maquinària d'edició no havia produït talls inespecífics en regions similars del genoma. D'aquesta manera, la nova metodologia desenvolupada permet editar de manera precisa línies cel·lulars leucèmiques amb eficiències similars a altres tècniques CRISPR més esteses i sense produir efectes inespecífics no desitjats. D'altra banda, gràcies a la gran conservació evolutiva del gen IDH2, els residus R140 i R172 es troben conservats en la proteïna idh-2 de Caenorhabditis elegans. Es va utilitzar l'estratègia co-CRISPR per a desenvolupar i seleccionar ceps mutants amb les mutacions ortòlogues a R140 i R172, i un cep amb dues mutacions. Malgrat l'alta conservació, no es va observar l'augment del oncometabolit 2-HG esperat en els ceps mutants en comparació amb el cep salvatge control N2. Un estudi exhaustiu de les vies implicades ens serviria per a desenvolupar models d'investigació amb les alteracions moleculars observades en els pacients. Per a concloure, l'estratègia desenvolupada d'introducció d'elements CRISPR en línies cel·lulars, al costat dels models produïts en C. elegans permetran en estudis futurs investigar detalladament els efectes moleculars de mutacions detectades en pacients, la seua implicació en el desenvolupament i prognosi de la LMA i comprendre el seu paper en l'estratificació dels pacients. / [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with the new strategy were compared with CRISPR ribonucleoproteins methodology, widely used for its high efficiency. Whereas ribonucleoprotein complexes showed higher cut efficiencies, the efficiency of edition of R172 mutation efficiency was similar in both strategies. These results were validated and characterized by means of next generation sequencing, and no off-target effects were found. Therefore, the new developed methodology allows precise gene editing in leukemic cell lines with similar efficiencies with other popular CRISPR techniques and without off-target effects. On the other hand, thanks to the high evolutive conservation of IDH2 gene R140 and R172 residues are conserved in Caenorhabditis elegans idh-2 protein. The co-CRISPR strategy was used to produce and select mutant strains with ortholog mutations to R140, R172 and one strain with both mutations. Despite the high conservation, the expected increase in oncometabolite 2-HG concentration was not detected in mutant strains compared to the N2 wild type strain. A comprehensive study of the pathways involved would help us to develop a research model with molecular alterations noticed in patients. In conclusion, the new developed strategy for CRISPR elements introduction in cell lines, together with C. elegans models, will allow an in-depth research of molecular effect of mutations detected in patients, its implication in AML progression and prognosis and understand their role in patient stratification. / González Romero, E. (2022). Investigación de la Leucemia Mieloide Aguda mediante el desarrollo de modelos in vitro e in vivo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181891

No description available.

Mutations in the SOD1 gene are the best characterized genetic cause of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and account for ~20% of inherited cases and 1-3% of sporadic cases. The gene-editing tool Cas9 can silence mutant genes that cause disease, but effective delivery of CRISPR-Cas9 to the central nervous system (CNS) remains challenging. Here, I developed strategies using canonical Streptococcus pyogenes Cas9 to silence SOD1. In the first strategy, I demonstrate effectiveness of systemic delivery of guide RNA targeting SOD1 to the CNS in a transgenic mouse model expressing human mutant SOD1 and Cas9. Silencing was observed in both the brain and the spinal cord. In the second strategy, I demonstrate the effectiveness of delivering both guide RNA and Cas9 via two AAVs into the ventricles of the brain of SOD1G93A mice. Silencing was observed in the brain and in motor neurons within the spinal cord. For both strategies, treated mice had prolonged survival when compared to controls. Treated mice also had improvements in grip strength and rotarod function. For ICV treated mice, we detected a benefit of SOD1 silencing using net axonal transport assays, a novel method to detect motor neuron function in mice before onset of motor symptoms. These studies demonstrate that Cas9-mediated genome editing can mediate disease gene silencing in motor neurons and warrants further development for use as a therapeutic intervention for SOD1-linked ALS patients.

Derived from and inspired by the adaptive immune system of bacteria, CRISPR has gone from basic biology knowledge to a revolutionizing biotechnological tool, applicable in many research areas such as medicine, industry and agriculture. The full mechanism of CRISPR-Cas9 was first published in 2012 and various CRISPR-Cas systems have already passed the first stages of clinical trials as new gene therapies. The immense research has resulted in continuously growing knowledge of CRISPR systems and the technique seems to have the potential to greatly impact all life on our planet. Therefore, this literature study aims to thoroughly describe the CRISPR-Cas system, and further suggest an undergraduate laboratory exercise involving gene editing with the CRISPR-Cas9 tool. In this paper, we describe the fundamental technical background of the CRISPR-Cas system, especially emphasizing the most studied CRISPR-Cas9 system, its development and applications areas, as well as highlighting its current limitations and ethical concerns. The history of genetic engineering and the discovery of the CRISPR system is also described, along with a comparison with other established gene editing techniques.  This study concludes that a deeper knowledge about CRISPR is important and required since the technique is applicable in many research areas. A laboratory exercise will not only inspire but also provide extended theoretical and practical knowledge for undergraduate students.

I detta examensarbete användes olika bildbehandlingstekniker för detektion och kvantifiering av DNA-mikrobollar, mer specifikt rolling circle amplification-produkter, på mikroskopibilder. Avsikten med detta arbete var att hjälpa Countagen AB utforska pipelines för bildbehandling för sin produkt där de analyserar utfallet av genredigeringsförsök på ett billigare och snabbare sätt än dagens konventionella sekvenseringsmetoder. Två olika metoder för objektdetektion användes i detta arbete. Big-FISH, som bygger på Laplacian of Gaussian och detektion av lokala maxima, samt LodeSTAR, en single-shot, self-supervised djupinlärningsmodell. Förbehandling av bilder var också en central del av detta projekt. DeepSpot, en djupinlärningsmodell för framhävning av punkter, användes för att framhäva mikrobollarna så att de lätt kunde upptäckas, och en top-hat-transform användes för att filtrera bort bakgrunden från bilderna. De olika metoderna utvärderades på ett dataset med manuellt annoterade bilder, en spädningsserie av prover samt prover med samma koncentration. Detta för att få värden på precision, recall och F1-score samt mäta hur robust modellen är när det gäller att detektera punkter. Den modell som presterade bäst var LodeSTAR, med en F1-score på 83% på det annoterade datasetet. / In this thesis project, different image processing techniques were utilized for the detection and quantification of DNA microballs on fluorescence microscopy images. These microballs consisted of rolling circle amplification products, of regions of interest. This was done to aid Countagen AB in exploring image processing pipelines for their product where they analyze gene editing efficiency in a cheaper and faster manner than today's conventional sequencing methods. Two different object detection methods: Big-FISH, which builds on Laplacian of Gaussian and local maxima detection, and LodeSTAR, a single-shot, self-supervised deep learning model, were evaluated for this task of detection and quantification. Image preprocessing was a central part of this project. DeepSpot, a deep learning model for spot enhancement was used to highlight the microballs, and a white top-hat transform was applied to the images for background subtraction. The different methods were evaluated on a test set of manually annotated images, a dilution series of samples, and samples with the same concentration to obtain precision, recall, and F1 scores, as well as gauge the robustness of the model in detecting spots. The best-performing model was LodeSTAR, with an F1-score of 83% on the test set.