Introdução. A introdução dos antimicrobianos na prática clínica no século XX foi um grande avanço para a medicina. Entretanto, seu uso indiscriminado, tanto na medicina (humana e animal) quanto na agricultura e pecuária, possibilitou a seleção e disseminação de microrganismos resistentes. A transferência genética horizontal é um dos principais mecanismos responsáveis pela disseminação de genes que codificam resistência aos antimicrobianos, pois possibilita a transmissão da resistência de uma célula bacteriana (comensal ou patogênica) para outra. Genes codificadores de resistência a antimicrobianos de importância clínica são encontrados em microrganismos de origem ambiental, clínica e alimentar. Objetivo. O objetivo do presente estudo foi detectar genes que codificam resistência aos antibióticos -lactâmicos, Tetraciclinas e Quinolonas, em amostras de carne de frango, visando estudar a ocorrência da resistência antimicrobiana nesse produto considerado um alimento comum na dieta do homem. Materiais e Métodos. Foram utilizadas 30 amostras de carne de frango. Após a inoculação da carne de frango em caldo Luria 0,5 por cento , o DNA total das bactérias cultivadas nesse meio foi extraído por choque térmico e utilizado na pesquisa de genes de resistência pela técnica de PCR seguida de eletroforese em gel de agarose. Foi também realizada a pesquisa de Coliformes Termotolerantes por meio da técnica dos tubos múltiplos para estimar a qualidade higiênico sanitária das amostras. Resultados: Oito (26,7 por cento ) amostras apresentaram um ou mais genes codificadores de resistência à antimicrobianos -Lactâmicos, 28 (93,3 por cento ) amostras apresentaram um ou mais genes codificadores de resistência às Tetraciclinas e 28 (93,3 por cento ) amostras apresentaram um ou mais genes codificadores de resistência às Quinolonas. Conclusões: A realização deste estudo contribuiu com informações a respeito da circulação de genes de resistência na carne de frango e alerta as autoridades de Saúde Pública do Brasil quanto à disseminação da resistência bacteriana e a necessidade de mais estudos a respeito desse problema, já que esses são raros ou inexistentes no País. / Introduction. The introduction of antibiotics in clinical practice in the twentieth century was a breakthrough for medicine. However, their indiscriminate use in both medicine (human and animal) as in agriculture and livestock, enabled the selection and spread of resistant microorganisms. Horizontal gene transfer is a major mechanism responsible for the spread of genes encoding antimicrobial resistance, since it allows the transmission of resistance from one bacteria to another. Genes encoding resistance to antimicrobials of clinical importance are found in microorganisms present in food, environment and clinical sources. Objective. The aim of this study was to detect genes encoding resistance to -lactam antibiotics, tetracyclines and quinolones in meat samples from chicken samples, to study the occurrence of antimicrobial resistance in this product considered a common food in human diet. Materials and Methods. Thirty samples of chicken were used. After inoculation of chicken meat in Luria broth 0.5 per cent , the total DNA of the bacteria cultured was extracted by heat shock and used to search resistance genes by PCR followed by agarose gel electrophoresis. The search for thermotolerant coliforms was also conducted using the technique of multiple tubes in order to estimate the sanitary quality of the samples. Results: Eight (26,7 per cent ) of the samples had one or more genes encoding for resistance to -lactam antimicrobials, 28 (93,3 per cent ) had one or more genes encoding resistance to tetracyclines and 27 (93,3 per cent ) samples had one or more genes encoding resistance to quinolones. Conclusions: This study contributes to the scientific community and sanitary agencies, bringing information regarding the occurrence and distribution of resistance genes in chicken, alerting the Public Health authorities in Brazil about the spread of bacterial resistance and the need for more studies in this field, as these are rare or nonexistent in the country.

Submitted by Cleber Casali (clebercasali@ufv.br) on 2017-06-28T17:17:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 598650 bytes, checksum: 028a6d83725fd48a983ea2b8264aaa29 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T17:17:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 598650 bytes, checksum: 028a6d83725fd48a983ea2b8264aaa29 (MD5) Previous issue date: 2001-01-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho objetivou: 1) avaliar a resistência de acessos de Lycopersicon spp. a tospovírus; 2) estudar a herança da resistência em algumas dessas fontes e 3) clonar e caracterizar molecularmente alelos do loco Sw-5 provenientes de Lycopersicon spp. Plantas de 12 acessos de tomateiro, pertencentes às espécies L. peruvianum, L. chilense e L. hirsutum foram inoculadas com cinco isolados de tospovírus, pertencentes às espécies TSWV, TCSV, CSNV e GRSV. A reação das plantas foi avaliada periodicamente por 30 dias. Ao final desse período, as plantas assintomáticas foram confirmadas como resistentes, mediante DAS-ELISA. A resistência na maioria dos materiais foi de amplo espectro (efetiva contra todos isolados), porém em alguns casos a resistência foi do tipo isolado-es pecífica. Os materiais mais promissores foram os acessos PI 126928, LA 444/1, LA 371 e PI 126944 de L. peruvianum e LA 130 e LA 2753 de L. chilense. Esses materiais constituem fontes de resistência alternativas para o manejo das tospoviroses do tomateiro. O estudo de herança da resistência em L. hirsutum PI 134417 indicou que a resistência nessa fonte é condicionada por dois genes independentes, um dominante e um recessivo. Num teste de alelismo, o gene dominante segregou independentemente do gene Sw-5, indicando que são genes distintos. Em L. peruvianum PI 126928, a resistência segregou como uma característica condicionada por dois ou mais genes dominantes não ligados. Na terceira etapa do trabalho, comparou-se o nível de conservação de alelos do loco Sw-5 em Lycopersicon spp. Os alelos foram obtidos mediante PCR de longo alcance, utilizando-se o sistema ELONGASE TM (Gibco-BRL) para amplificação. Nas reações de amplificação foram utilizadas três combinações de oligonucleotídeos desenhados com base na seqüência do gene Sw-5. Como molde foi utilizado DNA extraído de plantas cuja reação a tospovírus já era conhecida. Foram obtidos 16 alelos do loco Sw-5, provenientes de quatro espécies do gênero Lycopersicon. Após uma pré-caracterização mediante clivagem com enzimas de restrição, 10 clones foram selecionados para seqüenciamento. A análise de seqüência dos alelos revelou identidade de nucleotídeos superior a 91% para a ORF completa. Quando a comparação foi realizada para os diferentes domínios que compõem o gene Sw-5, observou-se que as maiores divergências residem nas extremidades 5’ e 3’ do gene. A comparação entre as proteínas codificadas pelo alelo Sw-5 1 (confere resistência) e seu alelo sw-5 2 (confere suscetibilidade) revelou 53 substituições ao nível de aminoácidos. Destas substituições, 14 são não-sinônimas e se concentram na extremidade amino e nas LRR, indicando o provável envolvimento dessas regiões na especificidade da resistência. A análise funcional dos alelos do loco Sw-5 e a construção de quimeras entre os alelos Sw-5 e sw-5 2 estão em andamento e auxiliarão a estabelecer as bases moleculares da resistência do tomateiro a tospovírus. / Lycopersicon peruvianum, L. chilense and L. hirsutum germplasm was inoculated with five isolates from the tospovirus species Tomato spotted wilt virus , Tomato chlorotic spot virus , Chrysanthemum stem necrosis virus, and Groundnut ringspot virus. Several introductions showed resistance to all isolates. However, in some cases, resistance isolate-specific was also observed. PI 126928, LA 444/1, LA 371 and PI 126944 of L. peruvianum and LA 130 and LA 2753 of L. chilense were the most resistant materials. Inheritance studies showed that two independent genes, one dominant and one recessive, control the PI 134417 resistance. Allelism tests revealed that this dominant gene is not an allele of the Sw-5 locus. The resistance derived from PI 126928 segregated as a trait controlled by two or more non-linked dominant genes. Sixteen alleles of the Sw-5 locus were PCR-amplified from four Lycopersicon species, cloned and sequenced. The alleles possess more than 91% of identity at nucleotide level; the largest divergence was observed in the 5 ́and 3 ́ extremities. Sequence comparisons between the resistance allele Sw-5 1 and the susceptible allele Sw-5 2, revealed 53 amino acid substitutions; fourteen substitutions are non-synonymous and located at the amino and carboxi terminus of the protein. The functional analysis of the other alleles and the construction of chimeras between Sw-5 1 and Sw-5 2 will allow to identify the protein region involved in the resistance specificity.

Submitted by ÉRICA MENDES LOPES null (erica_mendeslopes@yahoo.com.br) on 2016-02-26T20:53:43Z No. of bitstreams: 1 tese_doutorado_Erica_Mendes_Lopes.pdf: 4795462 bytes, checksum: a765e5c29ecbc64ad68f0f7cc83e9aff (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 12 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 12 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-02-29T14:06:38Z (GMT) / Submitted by ÉRICA MENDES LOPES null (erica_mendeslopes@yahoo.com.br) on 2016-02-29T14:12:05Z No. of bitstreams: 2 tese_doutorado_Erica_Mendes_Lopes.pdf: 4795462 bytes, checksum: a765e5c29ecbc64ad68f0f7cc83e9aff (MD5) TESE_DOUTORADO_ERICA_MENDES_LOPES.pdf: 4723828 bytes, checksum: a8e56276b7a5792d04c2c59d7bcf6228 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: Foram submetidos 2 arquivos PDF’s, apenas 1 arquivo deve ser submetido Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-02-29T14:53:22Z (GMT) / Submitted by ÉRICA MENDES LOPES null (erica_mendeslopes@yahoo.com.br) on 2016-02-29T16:05:00Z No. of bitstreams: 1 tese_doutorado_Erica_Mendes_Lopes.pdf: 4795462 bytes, checksum: a765e5c29ecbc64ad68f0f7cc83e9aff (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-29T16:58:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lopes_em_dr_jabo.pdf: 4795462 bytes, checksum: a765e5c29ecbc64ad68f0f7cc83e9aff (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-29T16:58:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lopes_em_dr_jabo.pdf: 4795462 bytes, checksum: a765e5c29ecbc64ad68f0f7cc83e9aff (MD5) Previous issue date: 2016-01-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os impactos ambientais causados por sucessivas extrações de minérios e compostos gerados dos resíduos tóxicos dessa atividade têm sido foco de preocupação dos ambientalistas, neste contexto há um grande esforço gerado para o desenvolvimento de metodologias eficientes e de baixo custo para remoção de metais pesados de solos e águas contaminadas. Os métodos biológicos surgem como uma alternativa aos métodos convencionais para o solo, um dos ecossistemas terrestre que apresentam uma infinidade de recursos naturais além da grande diversidade de microrganismos interagindo entre si. O mesmo constitui fonte de investimento para o isolamento de microrganismos e análises metagenômicas para prospecção de genes envolvidos em processos importantes para o equilíbrio metabólico e ecológico, pois, tanto de maneira isolada, como em interações, estes organismos desempenham papel importante no que diz respeito à produção de enzimas na biorremoção de metais e contaminantes do solo. Este trabalho teve como objetivo isolar, caracterizar e avaliar a biossorção e bioacumulação de metais por microrganismos originados de solos de ecossistemas de Sabará, uma região de mineradora desativada Minas Gerais. Adicionalmente buscou-se avaliar a diversidade metabólica funcional, para uma comparação da microbiota de, Sabará e Brumadinho, combinada com busca de genes que conferem resistência a cromo (crhA), cobre (copA, copB, cueO) e níquel (nixA). Os isolados obtidos foram classificados em gêneros como Burkolderia, Serratia, Bacillus, Stenotrophomonas e Artrobacter, que apresentam potencial para biorremediação de metais do solo e água. Entretanto, seis dos 32 isolados apresentaram resistência aos metais cobre, cromo e níquel, na concentração de 500 mgL-1. Destes isolados, dois deles, do gênero Burkolderia e Arthrobacter (CP15 e CR11) apresentaram capacidade metabólica de biossorver e interiorizar metais pesados em diferentes fases do desenvolvimento. Quanto a atividade metabólica, a comunidade microbiana dos solos do perímetro do quadrilátero ferrífero (MG) tem alta atividade na degradação de fontes de carbono importantes nos ciclos biogeoquímico e biorremediação, justificando a grande quantidade de ORFs encontradas nas anotações do metagenoma sequenciado. Destaca-se os ecossistemas canga e floresta que apresentaram maior número de sequências identificadas para todos os genes envolvidos no processo de resistência, influxo e efluxo de metais, sendo eles genes de resistência a cobre, multicooper oxidase ATPase (copA, copB, cueO), multicopper ATPase like (copA, copB), cromo oxidase (chrA), cromo transporte (chrB) e níquel oxidase (nixA). Os solos da região de Sabará e Brumadinho alocados no, quadrilátero ferrífero, apresentam diversidade funcional para degradação de fontes de carbono como aminoácidos e compostos fenólicos, e genes funcionais de grande importância em processos metabólicos de remoção de metais pesados por microrganismos, além de microbiota com capacidade remover e interiorizar metais oriundos dos resíduos de mineração sendo um indicativo para a aplicação na biorremediação de metais em áreas afetadas pela mineração. / The environmental impacts caused by successive extractions of minerals and compounds generated toxic waste of this activity have been the focus of concern for environmentalists in this context there is a great effort generated for the development of efficient methodologies and cost-effective to remove heavy metals from soils and contaminated water. Biological methods appear as an alternative to conventional methods for the ground of the earth's ecosystems have a multitude of natural resources beyond the great diversity of microorganisms interacting. The same is investment source for the isolation of microorganisms and metagenomic analyzes to search for genes involved in important processes for metabolic and ecological balance, since both in isolation, as in interactions, these organisms play an important role as regards the production of enzymes in biorremoção metal and soil contaminants. This study aimed to isolate, characterize and evaluate the biosorption and bioaccumulation of metals by microorganisms originating from Sabara ecosystems soil, a mining region of Minas Gerais disabled. In addition we sought to evaluate the functional metabolic diversity, for a comparison of the microbiota of Sabara and Brumadinho, combined with search of genes that confer resistance to chromium (CRHA), copper (copA, CopB, cueO) and nickel (Nixa). The isolates were classified into genres such as Burkolderia, Serratia, Bacillus, Stenotrophomonas and Artrobacter, which have the potential for bioremediation of metals from soil and water. However, six of the 32 isolates were resistant to metals copper, chromium and nickel, at a concentration of 500 mg L-1. Of these isolates, two of them, the genus Arthrobacter and Burkolderia (CP15 and CR11) had metabolic capacity to internalize biossorver and heavy metals at different stages of development. As metabolic activity, the microbial community of the perimeter of iron quadrangle soils (MG) has high activity in the degradation of important carbon sources in biogeochemical cycles and bioremediation, which explains the large amount of ORFs found in the notes of sequenced metagenome. the yoke ecosystems and forest that had a greater number of sequences identified for all the genes involved in the resistance process is noteworthy, influx and efflux of metals, and they copper resistance genes, multicooper oxidase ATPase (copA, copB, cueO) multicopper ATPase like (copA, CopB), chrome oxidase (chrA), chrome transport (chrB) and nickel oxidase (nixA). The soils of Sabara and Brumadinho region allocated to, iron quadrangle, have functional diversity for degradation carbon sources such as amino acids and phenolic compounds, and functional genes of great importance for metabolic processes of removing heavy metals by microorganisms, and microorganisms with ability to remove and internalize metals coming from the waste mining being an indication for use in the bioremediation of metals in areas affected by mining. / FAPESP: 2012/20022-6

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-29Bitstream added on 2014-06-13T21:03:51Z : No. of bitstreams: 1 silva_dcg_dr_jabo.pdf: 913437 bytes, checksum: aa269781e66dfd6e36870d5868db52c3 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A ferrugem asiática da soja é causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. Quatro genes de resistência à ferrugem da soja distintos, Rpp1 a 4, foram descritos. O objetivo deste trabalho foi mapear geneticamente os genes de resistência Rpp2 e Rpp4 e identificar genes induzidos pela resposta de defesa mediada pelo gene Rpp2. Duas populações F2:3 derivadas dos cruzamentos entre as linhagens resistentes PI 230970 (Rpp2) e PI 459025 (Rpp4) com a cultivar suscetível BRS 184, e marcadores SSR, foram utilizados neste estudo. Os locos Rpp2 e Rpp4 foram mapeados nos grupos de ligação J e G da soja, respectivamente, e os marcadores associados terão grande valor no processo de seleção assistida por marcadores para este caráter. Quatro bibliotecas de cDNA, derivadas de folhas do genótipo resistente PI 230970 (Rpp2) e do genótipo suscetível Embrapa 48, obtidas às 24 e 192 horas após a inoculação com esporos de P. pachyrhizi, foram geradas utilizando a metodologia SSH e tiveram seu padrão de expressão avaliado por análise de microarranjos de cDNA. Foram produzidas 3.807 sequências viáveis, das quais 670 foram sequências únicas, sendo 149 destas (22,2%) novas sequências da soja. A categoria funcional mais representativa para as quatro bibliotecas foi proteção celular, defesa e virulência. Apenas 65 trnascritos foram diferencialmente expressos, estando eles envolvidos na geração de espécies reativas de oxigênio, fitoalexinas e proteínas antimicrobianas, morte celular e senescência, modificação, estabilização e degradação protéica, controle da expressão gênica e reforço de parede celular. Este trabalho permitiu a identificação de novas seqüências da soja e contribuiu para a elucidação da estratégia de defesa mediada pelo gene Rpp2. / Asian soybean rust is caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi. Four resistance genes to this disease, Rpp1 to 4, were previously identified. The aim of this work was to identify SSR markers linked to Rpp2 and Rpp4, and to characterize genes up-regulated under soybean-Asian rust interaction. Two F2:3 populations derived from the crosses PI 230970 (Rpp2) x BRS 184 and PI 459025 (Rpp4) x BRS 184, and SSR markers were used for mapping. Rpp2 and Rpp4 loci were mapped on the soybean linkage groups J and G, respectively, and the associated markers will be highly valuable to assist the introduction of these genes into soybean cultivars. Four cDNA libraries derived from leaf samples of the resistant genotype PI 230970 and the susceptible genotype Embrapa 48, obtained at 24 and 192 hours after inoculation, were generated using SSH and evaluated by cDNA microarray analysis. A total of 3,807 reliable ESTs were obtained, 670 from them were unique. The most representative functional category in all libraries was “cell rescue, defense and virulence”. Only 65 transcripts were differentially expressed among treatments, and were involved in the generation of reactive oxygen species, phytoalexins and antimicrobial proteins; cell death and senescence; protein fate; gene expression control; and reinforcement of cell wall. This work produced novel soybean sequences and contributed to the comprehension of the soybean mechanism of resistance to Asian rust mediated by Rpp2.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA176.pdf: 1054714 bytes, checksum: 2d3299e450871e4e4ade3ebea0deb419 (MD5) Previous issue date: 2015-07-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Staphylococcus aureus is the major causative agent of bovine mastitis, the main disease affecting dairy cattle. The use of antibiotics is highly relevant for the control of mastitis cases in the properties, and the beta-lactam antibiotics (especially penicillin) and tetracycline are commonly used in animal and human health. Therefore, study of resistance is very important. For this test were selected 90 S. aureus isolated from subclinical mastitis to the characterization of ampicillin, penicillin and tetracycline through the disk diffusion test. Phenotypic characterization of the three antibiotics was determined by the minimum inhibitory concentration using the E-Test® and production of beta-lactamase by cefinase discs. Five resistance genes, blaZ, tet(K), tet(L), tet(M), tet(O) were investigated in all samples. PCR products were sequenced to confirm the results. The resistance was observed in 71%, 77% and 72% of the samples to ampicillin, penicillin and tetracycline, respectively. The MIC90 of the three antibiotics were 2 μg/mL (ampicillin), 1 μg/mL (penicillin), 64 μg/mL (tetracycline). Eighty six percent of beta-lactamase producing samples were identified. Of the 90 samples investigated, 97% amplified blaZ, 84% tet(K), 9% tet(L) and 2% tet(O) 1% tet(M). Four samples showed together tet(L) and tet(K), one sample showed tet(K), tet(M) and tet(O) and 80 samples showed blaZ together with at least one tet gene. The results suggest high resistance rate for the three antimicrobials in the S. aureus samples and high values of MIC50 and MIC90. The blaZ and tet(K) genes investigated were widespread in the herds studied. More studies about phenotypic and molecular character of antimicrobial resistance in S. aureus should be done to provide appropriated control and therapeutic measures / Staphylococcus aureus é o principal agente causador de mastite bovina, principal doença que acomete bovinos leiteiros. O uso de antimicrobianos é de grande relevância para o controle dos casos de mastite nas propriedades, e os antimicrobianos betalactâmicos (principalmente penicilina) e tetraciclina são comumente usados em saúde animal e humana. Dessa forma, o estudo da resistência a esses princípios ativos é de grande importância. Neste trabalho, para caracterizar a resistência à ampicilina, penicilina e tetraciclina foram selecionadas através do teste de disco-difusão 90 amostras de S. aureus isoladas de mastite subclínica resistentes à penicilina ou/e ampicilina ou/e tetraciclina. A caracterização fenotípica aos três antimicrobianos foi determinada pela concentração inibitória mínima - método de E-TEST® - e produção de betalactamase através de discos de cefinase. Foram pesquisadas em todas as amostras cinco genes de resistência, blaZ, tet(K), tet(L), tet(M) e tet(O). Os produtos de PCR foram sequenciados para confirmação dos resultados. Foi observada a resistência em 71 %, 77 % e 72 % das amostras à ampicilina, penicilina e tetraciclina, respectivamente. A MIC90 dos três antimicrobianos foram 2 μg/mL (ampicilina), 1 μg/mL (penicilina), 64 μg/mL (tetraciclina). Foram identificadas 86 % de amostras produtoras de betalactamase. Do total, 97 % amplificaram blaZ, 84 % tet(K), 9 % tet(L), 2 % tet(M), 1 % tet(O). Quatro amostras apresentaram conjuntamente tet(K) e tet(L), uma amostra apresentou tet(K), tet(M) e tet(O) e 80 amostras apresentaram blaZ juntamente com pelo menos um dos genes tet estudados. Os resultados da CIM apontam para um alto índice de resistência dos isolados de S. aureus para os três antimicrobianos e altos valores de CIM50 e CIM90. Os genes blaZ e tet(K) encontram-se amplamente disseminados nos rebanhos estudados. Mais estudos sobre o caráter fenotípico e molecular da resistência aos antimicrobianos em S. aureus devem ser realizados para estabelecer medidas de controle e terapêuticas adequadas

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:30:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3565_1.pdf: 5205665 bytes, checksum: d3f5d67863a34c85659602984a49cb65 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Klebsiella pneumoniae é uma enterobactéria responsável por uma alta incidência de infecções hospitalares, causadas geralmente por linhagens portadoras de multirresistência e produtoras de -lactamases de amplo espectro (ESBL). Este trabalho teve como objetivo determinar os genes envolvidos na formação de beta-lactamases clássicas e ESBLs em isolados de K. pneumoniae de Recife-PE, Brasil, assim como investigar o efeito ultra-estrutural causado por diferentes concentrações de antibióticos beta-lactâmicos, em isolados de K. pneumoniae produtores de diferentes tipos de betalactamases. Foram analisados 52 isolados de K. pneumoniae quanto a presença dos genes blaSHVe blaTEM, originados da microbiota normal e de infecções na comunidade e hospitalares e para a investigação do gene blaCTX-M foram utilizados 19 isolados clínicos de K. pneumoniae que apresentaram resistência a cefalosporinas de terceira geração ou ao aztreonam. Os MICs dos isolados foram determinados frente aos antibióticos ceftazidima, cefotaxima e aztreonam. Dois isolados de infecção nosocomial de K. pneumoniae foram submetidos a diferentes Sub-MICs de ceftazidima, cefotaxima e aztreonam para a análise pela Microscopia Eletrônica de Transmissão e de Varredura (MET e MEV). O gene blaSHV foi detectado em 16 isolados hospitalares, 4 da comunidade e 9 da microbiota, enquanto o gene blaTEM foi detectado em 18 isolados hospitalares, 4 da microbiota e 2 da comunidade. Através do sequenciamento de DNA, o gene blaCTX-M2 foi detectado em três isolados resistentes tanto a ceftazidima quanto a cefotaxima. Adicionalmente, foi encontrada uma nova variante SHV em um dos isolados e a presença de duas variantes anteriormente relatadas a SHV-28 e a SHV-108. As análises dos 2 isolados de K. pneumoniae pela MET e MEV mostraram grandes alterações morfológicas e ultra-estruturais dos isolados, quando submetidos aos diferentes Sub-MICs de ceftazidima e cefotaxima. *Nossos resultados mostram que isolados de K. pneumoniae portadores de diferentes β-lactamases e resistentes a diferentes antimicrobianos podem sofrer alterações ultra-estruturais significativas quando submetidos a Sub-MICs da droga, o que poderia possibilitar uma melhor atuação do sistema imune de um paciente infectado com esta espécie bacteriana

Cana-de-açúcar é uma planta agrícola com grande importância econômica para o Brasil. Os cultivares modernos de cana-de-açúcar apresentam uma alta complexidade genômica, devido ao seu genoma ser poliploide e com número cromossômico variando entre 100-120. As plantas de cana-de-açúcar estão sujeitas ao ataque de diversos tipos de patógenos, e sua tolerância depende da ação de genes de resistência. Estes podem desencadear uma cascata de reações ou interagir diretamente com uma molécula efetora, resultando em tolerância por parte da planta à presença do patógeno. O genoma dos cultivares moderno apresentam inúmeros elementos de transposição posicionados em diferentes regiões do genoma. Devido a essa abundância, os elementos de transposição estão sendo usados como marcadores moleculares, por exemplo, RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism), que identifica polimorfismos baseado na inserção de elementos do tipo retrotransposons. Esta técnica é capaz de diferenciar a presença e a ausência de um elemento de transposição em uma determinada região do genoma. Para a aplicação em organismos poliploides foi desenvolvida a técnica RBIP-qPCR, permitindo dosar a presença e ausência de um elemento de transposição em um organismo poliploide. Sendo assim este trabalho tem como objetivo aplicar a técnica de RBIP-qPCR em elementos de transposição alocados adjacentes a genes de resistência a fim de, posteriormente, verificar a existência de associação entre genes de resistência e elementos de transposição. Para isso foram analisadas três famílias de genes de resistência, I2C-2, Xa21 e Pti1. Foram realizadas análises de composição genômica de cada uma das regiões, genômica comparativa entre as variedades de R570 e SP80-3280 para a região genômica que contém o gene I2C-2, além de uma análise de expressão de genes e elementos de transposição vizinhos neste loco. A partir destes estudos foi possível selecionar um elemento de transposição, scDEL 5.1, para aplicar a técnica de RBIP-qPCR. Os resultados das análises de reconhecimento do ambiente genômico determinou a escolha de um elemento para aplicação da técnica. Verificamos que na ausência de scDEL 5.1 a metodologia RBIPqPCR foi eficaz em todos os genomas testados. As análises de presença de scDEL 5.1 no loco revelaram que elementos com elevado número de cópias no genoma não são adequados para a aplicação da metodologia. / Sugarcane is an agricultural plant with great economic importance for Brazil. The modern cultivars of sugarcane present a high genomic complexity, due to their genome being polyploid and with chromosome number varying between 100-120. Sugarcane plants are targets of several types of pathogens, and their tolerance depends on the action of resistance genes. These can trigger a cascade of reactions or interact directly with an effector molecule, resulting in tolerance by the plant to the presence of the pathogen. The genome of modern cultivars presents several transposable elements allocated in different regions of the genome. Due to this abundance, transposable elements are being used as molecular markers, such as RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism), which identifies polymorphisms based on the insertion of retrotransposon. This technique is able to differentiate the presence and absence of a transposable element in a particular region of the genome. For the application in polyploid organisms the RBIP-qPCR technique was developed, allowing measuring the presence and absence of a transposable element in a polyploid organism. Therefore, the objective of this work is to apply the RBIP-qPCR technique to on a transposable element localized adjacent to resistance genes in order to, latterly, verify the existence of association between resistance genes and transposable elements. For this, three families of resistance genes, I2C-2, Xa21 and Pti1 were analyzed. Genomic composition analyzes of each region, comparative genomics between the R570 and SP80-3280 varieties for the genomic region containing the I2C-2 gene, as well as an analysis of genes and elements expression neighbors at this locus were performed. From these studies it was possible to select a transposition element, scDEL 5.1, to apply the RBIP-qPCR technique. The results of the genomic environment recognition analysis determined the choice the transposable element for the application of the technique. We verified that in the absence of scDEL 5.1 the RBIP-qPCR methodology was effective in all genomes tested. Analysis of the presence of scDEL 5.1 in the locus revealed that elements with high copy number in the genome are not suitable for the application of the methodology.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Pacientes transplantados de órgãos sólidos apresentam alto risco para infecção da corrente sanguínea. A instituição da terapia antimicrobiana apropriada guiada por um diagnóstico rápido e preciso das infecções da corrente sangüínea está relacionada a um resultado satisfatório. O objetivo deste estudo foi a detecção de bactérias Grampositivas e Gram-negativas em hemocultura automatizada (Bactec®, Becton Dickinson), com a utilização do multiplex para reação da polimerase em cadeia (PCR) em Tempo Real e detecção de genes de resistência. Métodos: Um total de 185 hemoculturas, 126 positivas e 59 negativas, foram obtidos de 117 pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos, dois centros de transplante na cidade de São Paulo, Brasil, Hospital São Paulo e Hospital do Rim e Hipertensão. DNA das culturas de sangue foi extraído pelo método fenol clorofórmio (Brazol®, LGC, Brasil). A detecção do DNA bacteriano foi realizada utilizando iniciadores universais do gene 16S rRNA. A diferenciação entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas foi feito por hibridização com sondas específicas por multiplex TaqMan em Tempo Real. Os genes de resistência: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB e mecA foram detectadas utilizando iniciadores específicos, em Tempo Real sitema SYBR Green. A adequação do tratamento antimicrobiano foi avaliada pela revisão do prontuário dos pacientes. Resultados: Cinqüenta e nove amostras foram positivas para bactérias Gram-positivas e sessenta e sete amostras foram positivas para bactérias Gram-negativas. Todas as amostras (100%) foram concordantes entre hemocultura e PCR. Trinta e duas amostras foram positivas para o gene mecA, cinco para o gene blaCTX-M, uma para o gene blaKPC, uma para o gene blaSHV e uma para blaTEM. Oitenta e oito foram negativas para todos os genes. A detecção de genes de resistência a antimicrobianos favoreceria a adequação da antibioticoterapia, particularmente no descalonamento no tratamento de bacteremias causadas por bactérias Gram positivas e na adequação precoce no tratamento de bacteremias por bacilos Gram negativas multiresistentes em pacienetes tranplantados de órgãos sólidos. Conclusão: A PCR multiplex “in house” para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e detecção de genes de resistência aos antimicrobianos por PCR em Tempo Real poderia ser útil para o diagnóstico rápido da infecção da corrente sangüínea em pacientes submetidos a transplante de órgão sólidos. / Solid organ transplanted patients are at high risk for blood stream infection. The institution of appropriate antimicrobial therapy guided by a rapid and accurate microbiological diagnosis of blood stream infections is related to a successful outcome. The aim of this study was the detection of Gram-positive and Gram-negative bacteria from automated blood cultures (Bactec®, Becton Dickinson) with the use of the multiplex real-time polymerase chain reaction (PCR) and detection of antimicrobial resistance genes. Methods: A total of 185 blood cultures, 126 positive and 59 negative, were obtained of 117 patients submitted to solid organ transplant at two transplant centers in the city of São Paulo, Brazil, Hospital São Paulo and Hospital do Rim e Hipertensão. DNA from the blood cultures was extracted by phenol chloroform method (Brazol®, LGC, Brazil). The detection of bacterial DNA was performed using universal primers of 16S rRNA gene. The differentiation between Gram-positive and Gram-negative bacteria was done by hybridization with Gram-specific probes by multiplex real-time TaqMan. The resistance genes: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB and mecA were detected using specific primers by real-time SYBR Green. The adequacy of antimicrobial treatment was evaluated by reviewing the records of patients. Results: Fifty nine samples were positive for Grampositive and sixty seven samples were positive for Gram-negative. All samples (100%) were concordant between blood culture and PCR. Thirty two samples were positive for mecA gene, five for blaCTX-M gene, one for blaKPC gene, one for blaSHV gene and one for blaTEM. Eighty eight were negative for all genes. The detection of antimicrobial resistance genes could enhance the appropriateness of antibiotic therapy, particularly in descalation the treatment of bacteremia caused by Gram positive and early adequacy in the treatment of Gram negative bacteremia of solid organ transplanted patients. Conclusion: The in house multiplex PCR for Grampositive/ Gram-negative bacteria and detection of antimicrobial resistance genes by Real Time PCR could be useful for rapid diagnosis of bloodstream infection in patients undergoing solid organ transplant. / FAPESP: 2008/04761-8 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-04Bitstream added on 2014-06-13T20:03:25Z : No. of bitstreams: 1 morceli_tgs_dr_jabo.pdf: 699244 bytes, checksum: f1671e3db3a2b611f86d79aaccfe36e0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A ferrugem asiática da soja, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi (Sidow & P. Sidow) foi relatada no Brasil ao final da safra 2001 e já nas safras seguintes, ocasionou severas perdas de produtividade. Cinco genes de resistência à ferrugem asiática da soja (Rpp1 a Rpp5) estão descritos na literatura. O objetivo geral deste trabalho foi identificar marcadores moleculares microssatélites ligados ao gene de resistência a P. pachyrhizi presente na linhagem de soja PI 200526. Uma população de plantas F2 derivada do cruzamento entre esta linhagem e a cultivar suscetível Coodetec 208, foi artificialmente inoculada e avaliada quanto à sua reação de resistência à ferrugem. Marcadores microssatélites foram testados nos genitores e em dois bulks contrastantes para possibilitar a identificação de possíveis marcadores ligados. Os três marcadores polimórficos que foram caracterizados como potencialmente associados com a resistência à ferrugem asiática foram, posteriormente, avaliados em toda a população. A resistência comportou-se como governada por um gene com dominância completa. O gene de resistência da PI 200526 foi mapeado no grupo de ligação N da soja, estando próximo ao marcador Sat_166. Existe grande possibilidade de que o gene mapeado neste estudo corresponda ao novo loco de resistência à ferrugem asiática da soja, denominado de Rpp5, recentemente descrito. / The Asian soybean rust caused by the Phakopsora pachyrhizi (Sidow & P. Sidow) fungus was related in Brazil at the end of 2001 crop year, and already in the following seasons, caused severe losses in productivity. Five distinct resistance genes to Asian rust (Rpp1 to Rpp5) are described. The main objective of this work was to identify microsatellite markers linked to a resistance gene to P. pachyrhizi present in the soybean line PI 200526. One population of F2 plants originated from the cross between this resistant line and the suscetible cultivar Coodetec 208 was artificially inoculated and evaluated for the Asian rust resistance. Microsatellite markers were tested on parents and in the two contrasting bulks to enable the identification of linked markers. The three polymorphic markers that were identified potentially associated with resistance to Asian rust were then evaluated throughout the progeny. The resistance showed to be governed by a gene with complete dominance. The resistance gene of PI 200526 was mapped on the soybean linkage group N, being close to Sat_166 marker. Possibly, the gene mapped on this linkage group is part of the new locus of resistance to Asian soybean rust, called Rpp5, recently described.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA099.pdf: 1138079 bytes, checksum: 23aa8d31dd88f13180440d19ecde7625 (MD5) Previous issue date: 2012-08-21 / Salmonellosis is responsible for significant economic losses in poultry and serious harm to public health because they are involved in most cases of foodborne illness. Studies of these outbreaks in humans indicate that animal products, in particular poultry, are significant sources of contamination. It is observed that among isolates of Salmonella resistance to antimicrobial agents used routinely in poultry is increasing significantly, including the presence of multidrug resistance. The objective of this study was to investigate the genotypic and phenotypic profile of antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium from poultry products to Gentamicin, Ceftiofur and Enrofloxacin by the disk diffusion test, minimum inhibitory concentration (MIC) and search for resistance genes by PCR. Salmonella sp. from poultry samples were isolated in a private laboratory from the state of Parana. The isolation was performed as recommended by the Brazilian official methods. Isolates identified as Salmonella sp. were sent to the FIOCRUZ laboratory where they were serotyped. Of these samples, two were identified as S. Enteritidis and eleven as S. Typhimurium. Different levels of resistance were verified when compared diffusion test and MIC. S. Enteritidis was 100% sensitive for Enrofloxacin and Gentamicin and 50% resistant to Ceftiofur according to the diffusion test. As for S. Typhimurium there was resistance to all three antibiotics tested (18.1% for Ceftiofur, 45.4% for gentamicin and 18.1% for Enrofloxacin). In the MIC the isolates of S. Typhimurium were resistant to Ceftiofur (27.2%), Gentamicin (54.5%), and to Enrofloxacin (18.1%). These results were very similar to those observed in the diffusion test. However, the samples of S. Enteritidis had 100% resistance to Gentamicin and 50% for Enrofloxacin and Ceftiofur in the MIC test. Genotypic analysis by PCR showed that S. Typhimurium and S. Enteritidis, either resistant or susceptible to Enrofloxacin, presented at least three (out of four) of the genes responsible for resistance. Regarding Gentamicin and Ceftiofur, resistance genes were found mainly in samples with phenotypic resistance. Interestingly phenotypically resistant strains did not presented the resistance gene, as well as sensitive strains present the gene. These results demonstrate the high degree of resistance to the antibiotics routinely used in poultry, as well as the presence of multidrug resistance. In addition, the fact that some isolates already contain the resistance gene but are not phenotypically expressing it, stress out the possibility that these antimicrobials may become ineffective within a short period of time / As salmoneloses são responsáveis por significativas perdas econômicas na avicultura e por sérios danos à saúde pública, pois estão envolvidas na maioria dos casos de infecções alimentares. Estudos destes surtos em humanos indicam que produtos de origem animal, especialmente avícola, participam de forma significativa como fontes de contaminação. Observa-se que entre os isolados de Salmonella a resistência aos antimicrobianos utilizados rotineiramente na avicultura está aumentando significativamente, além da presença de multirresistência. O objetivo deste trabalho foi verificar o perfil fenotípico e genotípico de resistência antimicrobiana em isolados de Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium de origem avícola frente à Gentamicina, Enrofloxacina e Ceftiofur, através do teste de disco-difusão, concentração inibitória mínima (MIC) e pesquisa de genes de resistência por PCR. Amostras de diversas origens avícolas foram isoladas em um laboratório privado no estado do Paraná, o isolamento foi realizado de acordo com o preconizado pela normativa do MAPA. Os isolados identificados como Salmonella sp. foram enviados para o laboratório FIOCRUZ onde foram sorotipados. Destas amostras, duas foram identificadas como S Enteritidis e onze como S Typhimurium. Após esta etapa as amostras foram avaliadas quanto a sua sensibilidade fenotípica, para isto foram realizados os testes de concentração inibitória mínima e antibiograma. Os resultados desta avaliação mostraram diferentes níveis de resistência nas duas metodologias para os antimicrobianos testados. No antibiograma os isolados de S. Enteritidis foram 100% sensíveis aos antimicrobianos Gentamicina e Enrofloxacina e apresentaram resistência de 50% ao Ceftiofur. Já a S. Typhimurium apresentou resistência em graus variados aos três antimicrobianos testados, 18,1% para o Ceftiofur, 45,4% para Gentamicina e 18,1% para Enrofloxacina. No MIC os isolados de S. Typhimurium apresentaram resistência de 27,2% ao Ceftiofur, 54,5% à Gentamicina e 18,1% à Enrofloxacina, resultados esses muito semelhantes aos observados no antibiograma. Já as amostras de S. Enteritidis tiveram 100% de resistência à Gentamicina e 50% para a Enrofloxacina e Ceftiofur. Na análise genotípica observou-se que as amostras de S. Typhimurium e S. Enteritidis, independente de serem resistentes ou sensíveis fenotipicamente à Enrofloxacina, apresentaram senão os quatro, mas três dos genes responsáveis pela resistência. Com relação à Gentamicina e ao Ceftiofur, os genes de resistência foram encontrados principalmente nas amostras que apresentaram resistência fenotípica. Porém também foram encontradas amostras resistentes fenotipicamente mas que não tinham o gene de resistência, assim como amostras sensíveis que apresentavam o gene. Esses resultados demonstram o elevado grau de resistência das cepas isoladas aos antimicrobianos testados, assim como a presença de multirresistência. Soma-se a isso o fato de amostras possuírem o gene de resistência e não estarem expressando fenotipicamente, salientando que os antimicrobianos rotineiramente utilizados podem tornar-se ineficientes dentro de um curto período de tempo